전기 화학 및 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 양성자 펌프 막 효소의 연구에 대 한 단일 Liposome 측정

이 방법은 자연 지질 이중 층 환경에서 시토 크롬 BO3와 같은 호흡기 막 효소의 양성자 수송 활성을 연구 할 수 있습니다. 이 단일 효소 기술의 주요 장점은 전기 화학을 사용하여 언제든지 효소 반응을 시작하고 중지 할 수있는 가능성입니다. 에스키치아 대장균추출물의 엽록소 육수 200마이크로리터를 유리 바이알로 유리 바이옴으로 유리 주사기 로 옮기는 유리 주사기 를 사용한다.

지질에 1-100 유비퀴논 10의 최종 비율을 만들기 위해 밀리리터 유비퀴논 10당 1밀리그램의 50 마이크로리터를 추가합니다. 혼합물에 밀리리터 긴 파길이 형광염료 라벨이 부착된 지질 약식 FDLL당 1밀리그램의 20마이크로리터를 첨가한다. 짧은 소용돌이에 의해 클로로폼 용액을 균질화하고 부드러운 질소 또는 아르곤 흐름 하에서 대부분의 클로로포름을 증발시다.

적어도 한 시간 동안 진공 상태에서 추가 증발에 의해 클로로폼 흔적을 완전히 제거하십시오. 지질 유비퀴논 10 FDLL 드라이 믹스의 알리쿼트에 40 밀리머걸러 MOPS pH 7.4 버퍼의 312.5 마이크로리터를 추가합니다. 지질 필름이 완전히 다시 중단 될 때까지 소용돌이를 혼합하고 초음파 목욕에서 치료의 2 분 다음.

다음으로 25 밀리머 HPTS의 125 마이크로 리터를 추가, 리포솜 내부에 캡슐화 됩니다 pH 민감한 형광 염료. 이제 250 밀리머 OGP 계면 활성제의 137.5 마이크로 리터를 추가합니다. 소용돌이를 사용하여 혼합 한 후, 모든 지질이 계면 활성제 미젤로 용해되도록 10 분 동안 초음파 수조에서 혼합물을 초음파 처리합니다.

그런 다음 분산을 1.5 밀리리터 플라스틱 튜브로 옮킨다. 필요한 양의 사이토크롬 BO3를 추가하고 초순수수를 추가하여 총 50마이크로리터를 만듭니다. 롤러 믹서에서 10 분 동안 섭씨 4도에서 재구성 혼합물을 배양합니다.

다음 무게 50 폴리스티렌 마이크로 비드의 각 에 1.5 밀리 리터 튜브 캡. 그런 다음 100 밀리그램의 폴리스티렌 마이크로비드를 또 다른 두 개의 1.5 밀리리터 튜브 캡에 넣습니다. 파라핀 필름으로 캡을 닫아 건조를 방지합니다.

1.5 밀리리터 플라스틱 튜브에 폴리스티렌 마이크로비드가 있는 캡을 준비된 분산과 함께 넣어 재구성 혼합물에 폴리스티렌 마이크로비드 의 첫 50 밀리그램을 추가합니다. 그런 다음 몇 초 동안 짧은 스핀을 수행하여 마이크로비드를 튜브 바닥에 가져옵니다. 폴리스티렌 마이크로비드가 계면 활성제를 30분 동안 흡수할 수 있도록 롤러 믹서에서 섭씨 4도에서 서스펜션을 배양합니다.

다음과 같이 폴리스티렌 마이크로비드와 인큐베이션의 추가를 반복합니다. 50 밀리그램의 마이크로비드를 60분 동안 첨가하세요. 그런 다음 100 밀리그램의 마이크로비드를 60분 동안 배양합니다.

그리고 마지막으로, 120 분 동안 100 밀리그램의 마이크로비드를 추가하십시오. 얇은 팁이 있는 마이크로파이프를 사용하여 폴리스티렌 마이크로비드와 프로테오올리포솜 용액을 분리합니다. TI 45 초센심분리기 튜브에서 90밀리리터의 MOPS 버퍼에서 분산을 희석시하십시오.

125, 000배 G에서 타입 45 TI 로터를 사용하여 분산을 1시간 동안 발동성포생을 펠릿화한다. 초원심분리에 따라, 상체를 버리고 펠릿을 다시 중단하지 않고 MOPS 버퍼로 펠릿을 헹구십시오. 헹구는 버퍼를 폐기한 후, 1.5 밀리리터 플라스틱 튜브로 서스펜션을 전송하기 전에 얇은 기울어진 마이크로파이프로 앞뒤로 파이펫을 사용하여 MOPS 버퍼의 500 마이크로리터에서 프로테오올리포좀을 다시 중단합니다.

12, 000회 G에서 5분간 원심분리를 거쳐 잔해를 제거하고, 재구성된 프로테오폴좀인 상체를 새로운 유리병으로 옮긴다. 이중 성분 저형 에폭시를 사용하여 증발된 금 표면에 최대 9개의 유리 커버 미끄러짐을 붙입니다. 접착제를 섭씨 80도에서 4시간 동안 치료합니다.

자체 조립 된 모노 레이어로 수정하기 직전에 실리콘 웨이퍼에서 유리 커버 슬립을 블레이드로 분리하십시오. 커버 슬립의 얇음으로 인해 커버 슬립을 분리하여 유리 슬라이드를 깨뜨리거나 부서지지 않도록 주의하십시오. 갓 분리된 골드 코팅 커버 슬립을 6-마카토헥사놀 솔루션에 담그고 하룻밤 사이에 섭씨 20~25도에 그대로 두어 조립된 모노층을 형성합니다.

다음 날, 용액에서 금 코팅 커버 슬립을 제거하고 물이나 메탄올로 간략하게 씻은 다음 이소프로파놀로 간략하게 씻습니다. 부드러운 가스 흐름 아래에서 금코팅 커버 슬립을 건조시다. 텍스트 프로토콜에서 다이어그램으로 분광 전기 화학 전지에 금 코팅 커버 슬립을 조립합니다.

고무 O 링에 의해 정의 된 영역 외부 의 평평한 와이어와 금에 접촉하고 단단히 그것의 상단에 전기 화학 셀아래로 나사. 전해질 버퍼 용액의 2밀리리터를 추가하고 셀에 참조 및 보조 전극을 배치합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 자체 조립된 모노 레이어의 품질을 확인하고 공백을 실행합니다.

밀리리터 최종 지질 농도당 0.5 밀리그램의 전기화학적 세포에 프로테오올리포좀을 추가하고 파이펫과 약간 섞어드린다. 전극 표면에 프로테오폴좀의 흡수가 완료될 때까지 실온에서 30~60분 정도 기다립니다. 버퍼 용액을 10회 이상 변경하여 셀을 세척하지만 전극 표면이 완전히 건조하게 되는 것을 피하십시오.

지금, 금 전극에 자기 조립 된 단층을 확인하기 위해 오픈 셀 잠재력에서 전기 화학 임피던스 분광기를 실행 변경되지 않은 남아있다. 경추형 voltammograms를 스캔 속도 10 및 100 밀리볼트초당 실행하여 전기 화학 퀴논 감소의 발병 잠재력에서 시토크롬 BO3에 의한 쌍경 유비퀴놀 산화 및 산소 감소를 관찰합니다. 이전과 같이 금 전극을 수정하지만 밀리리터 프로테올리푸좀당 5 마이크로그램을 사용한다.

단일 효소 연구의 경우 시토크롬 BO3를 지질 비율을 0.1에서 0.2%로 감소시키는 데, 침수 오일한방울을 정한 다음, 전기화학전지는 역형 현미경의 60배 오일 목표에 놓는다. FDLL 형광에 적합한 필터를 사용하여 전극 표면에 초점을 맞춥니다. 단일 리포솜은 현미경 목표의 회절 한계에 밝은 반점으로 나타나야 한다.

FDLL 플로레시전의 이미지를 가져 가라. HTPS 플로레시엔스가 배경과 명확하게 표시되고 구별되는지 확인하기 위해 현미경에 HPTS 플로레시네이션 필터 세트 중 하나로 전환합니다. 그렇지 않은 경우 광 강도를 증가시면 광 강도를 높입니다.

두 개의 HTPS 필터 세트를 번갈아 하여 시간 제한 된 이미지 수집을 수행 하는 현미경 소프트웨어를 프로그래밍 합니다. 이렇게 하려면 1초 노출을 설정한 다음 메뉴 응용 프로그램으로 이동합니다. 그런 다음 ND 인수를 정의/실행하고 두 개의 HTPS 채널을 선택합니다.

이미지 수집 간의 지연을 최소한으로 설정합니다. 이 실험에서는 0.3초 지연 및 총 5분 지속 시간을 사용합니다. potentiostat의 설정을 조정하여 텍스트 프로토콜에 표시된 대로 이미지 수집 중에 잠재력을 변경합니다.

이제 두 측정을 동시에 수동으로 시작하여 현미경 및 전위 시퀀스에 대한 시간 제한 된 이미지 수집을 동시에 실행합니다. 여기에 표시된 리포솜의 형광 이미지는 세 가지 다른 범위에서 전극에 흡수된다. 리포솜을 함유한 염료는 이미지에서 밝은 반점으로 볼 수 있습니다.

이미지의 중앙 부분은 배경 꽃집 수준을 밝히기 위해 사진 표백되었습니다. 두 HTPS 채널의 이미지는 두 채널 간의 비율이 이 실험에서 사용되는 7.4의 pH에 해당하는 매우 침전할 수 없습니다. 더 많은 수의 리포솜이 FDLL 채널과 함께 표시되며, 이는 HPTS캡슐이 없는 리포솜의 존재를 나타냅니다.

HPTS와 FDLL 채널의 차이는 더 높은 범위에서 더 두드러집니다. 아마도 높은 리포솜 커버리지에서 리포솜이 표면에 파열되거나 융합될 가능성이 더 높기 때문일 수 있습니다. 여기서, 두 HTPS 채널에 대한 리포솜 플로르시엔스의 변화는 실험300초 동안 해당 영역의 3D 표면 플롯으로 도시된다.

환원 잠재력은 60초에서 180초 사이에 적용되었습니다. 두 HPTS 채널의 볼륨 미터강도 비율과 시간의 해당 플롯이 표시됩니다. 여기에 도시된 사이토크롬 BO3 함량이 1.3%인 경우 단일 이미지 내에서 모든 소포 pH 변경의 중앙값이 0.1~0.3볼트 사이의 전위가 적용될 때 pH의 증가가 선명하게 나타난다.

사이토크롬 BO3 함량이 0.1%의 훨씬 낮은 값일 때 중앙값 곡선은 빈 리포솜과 거의 구별할 수 없게 됩니다. 잔류가 양성자에 리포솜의 투과성을 증가시킬 수 있기 때문에 리포솜 경륜의 시대에서 계면활성제의 완전한 제거를 보장하는 것이 중요하다. 이러한 방법을 사용하면 자주 사용되는 수용성 퀴논 유사체와 는 달리 천연 리포필성 퀴논 기판에 대한 구체적인 질문을 할 수 있습니다.

또한, 단일 효소 실험은 단백질이 양성자가 자유롭게 거꾸로 흐르는 양성자 채널의 역할을 하는 이전에 알려지지 않은 누출 상태를 확인하였다.