Name: 내부 Omental 작은 섬이 식을 사용 하 여 h Omental 매트릭스 섬 작성 (유도) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: 학습하세요 hOMING 기술을 활용한 췌도 이식 방법으로, 수취체 쥐의 대사 환경을 최적화하여 혈당 조절 및 혈관화된 이식편 형성을 가능하게 하는 세포 치료 프로토콜입니다.

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이 작품은 지구의 알자스, CQDM-BioArtMAtrix-Pôle 알자스 Biovalley;에 의해 투자 되었다 53/14/C1입니다. 저자는이 혁신적인 기술 개발을 돕는 Hôpitaux Universitaires de 스트라스부르에서 팀의 홍보 Bruant-Rodier 감사.

모든 동물 실험 승인 번호와 국립 보건원의 지침에 따라 수행 했다: 알/60/67/02/13.
1. 받는 사람 준비
<ol><li>
받는 사람 쥐에 있는 당뇨병을 유도 하는 화학적으로.
	<ol>
<li>Intraperitoneally 쥐10에 streptozotocin (STZ, 살 균 0.1 M 구 연산 염 버퍼, pH 4)의 75 mg/kg을 주사. 참고: 이식 연구에 대 한 6 주 된 루이스 스트레인 쥐, 150-190 g 무게 사용 되었다.</li>
		<li>처음 4 일 동안 매일 혈액 포도 당 측정 하 여 당뇨병 상태를 확인 합니다. 긴-연기 인슐린 6 주사 U/일 쥐 당뇨병 합병증을 예방 하 고 체중 감소, 인슐린 펠 릿 이식까지 2 g/L 이상 glycemia를 전시 하는 때에 피하.</li>
		<li>코 호트에서 쥐를 꼬리 정 맥 혈당의 2 측정은 포함 &gt; 2 연속 일, 그리고 C-펩 티 드 수준에 대 한 4-5 g/L은 &lt; 200 오후. Glycemia 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA)에 의해 glucometer와 C peptidemia를 사용 하 여 측정 합니다.</li>
		<li>인슐린 알 약을 피부 아래 임 플 란 트 (1.2 참조). 참고: 만성 인슐린 치료 더 나은 glycemia 레 귤 레이 션을 허용 하 고 (이식 사이트에서 산화 스트레스를 악화) 당뇨병 합병증을 피할 수11. 또한, 치료 (평소 체중 감소는 당뇨병 동물에서 관찰) 없이 정상적인 성장 곡선 함께 당뇨병 상태를 보존 합니다. 이 이식 실시는 더 큰 omental 지방 패드에 발생할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
인슐린 알 약의 주입
	<ol>
<li>가스 마 취 (500 mL/min O2에서 3 %isoflurane)를 사용 하 여 쥐를 anesthetize 하 고 경향이 위치에 쥐를 놓습니다.</li>
		<li>반사 (발 곤란)의 부재를 확인 하 여 마 취 상태를 확인 합니다. 목 povidone 요오드를 사용 하 여 청소 하 고 면도날을 사용 하 여 영역을 면도. Povidone 요오드를 다시 적용 하 고 그것은 3 분 서 보자.</li>
		<li>장소 1.5 인슐린 펠 릿 (3 단위 (U) / 200 g 쥐) 산 탄 소독을 1:5 희석된 povidone 요오드 솔루션. 16 G trocar를 사용 하 여 목 피부를 관통 하 고 가구 가이드 stylet을 사용 하 여 펠 릿을 삽입 합니다. 가이드와 stylet을 검색 하 고 단일 포인트 스티치. Povidone 요오드를 사용 하 여 스티치를 청소. 참고: 아니 수술 후 통증 관리는 개입 했다 단일 피하 (SC) 주사에 비해 필요 했다.</li>
		<li>쥐 마 취에서 회복 하 고 쥐 저 혈당을 피하기 위해 음식에 대 한 액세스를 갖도록 하자.</li>
		<li>이식 후 glycaemia 감소를 측정 하 여 펠 릿의 효율성을 측정 합니다.</li>
		<li>1 달 동안 매주 glycemia 레벨을 모니터링 하 여 펠 릿 효율성을 확인 하십시오.</li>
		<li>꼬리 정 맥 혈액 C 펩 티 드 수준 정도의 200 미만 유지 되는 일대에 쥐를 포함 오후 인슐린 펠 릿 이식 후 1 개월. 참고: C-펩 티 드 수준 확인 하는 것은 필수 이식 하기 전에 기준선에서 동물을 평가 하 고 그들의 당뇨병 상태를 확인 하입니다. 낮은 C-펩 티 드 재생 항상 후속 발생합니다. 낮은 C-peptidemia 낮은 중생의 나타내는 것입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 유도: 내부 omental 매트릭스 섬 작성
<ol><li>
섬-매트릭스 혼합물 준비입니다.
	<ol>
<li>층 류 두건에 점성 섬 캐리어를 준비 합니다. 1.5%의 농도에서 살 균 PBS에 alginate 분말을 디졸브. 0.22 μ m 필터를 통해 통행에 의해 준비를 소독. 받는 사람 당 400 µ L를 준비 합니다. 참고: 21g 바늘을 통해 주입에 적합 한 점도와 하이드로 겔의 어떤 종류를 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>앞에서 설명한12건강 한 루이스 쥐 (200-250 g)에서 섬을 격리 합니다.</li>
		<li>섬 등가물 (IEQ) (한 IEQ 150 µ m의 직경을 가진 췌 장 섬 간주 됩니다)에 섬 개수13.</li>
		<li>층 류 흐름 후드, 1.5 mL 튜브에 7660 섬 상응 (IEQ)의 aliquots를 준비 합니다.</li>
		<li>소 태아 혈 청의 무료 CMRL (Connaught 의료 연구 실험실) 매체의 500 µ L로 독도 aliquots 세척.</li>
		<li>원심 (2 분 500 g x 4 ° C에서)에 의해 독도 작은. 폐기는 상쾌한.</li>
		<li>독도 alginate 히드로 캐리어의 150 µ L을 추가 하 고 아래로 pipetting으로 신중 하 게 믹스 얼음에 믹스를 놓습니다.</li>
		<li>Atraumatic 21 G 바늘과 죽은 볼륨 없이 1 mL 주사기 주사기에 빈 alginate의 150 µ L을 로드 하 여 준비 합니다.</li>
		<li>독도 alginate (150 µ L, 총 볼륨 300 µ L)의 혼합물으로 주사기를 채우십시오. 얼음에 주사기를 유지.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
외과 절차
	<ol>
<li>감기 균을 사용 하 여 수술 기구를 소독 (2% Steranios 20 분).</li>
		<li>Isoflurane 마 취를 사용 하 여 쥐를 anesthetize 하 고 경향이 위치에 쥐를 놓습니다.</li>
		<li>면도날을 사용 하 여 목 부분을 면도 하 고 소독 povidone 요오드 지역. 요오드 3 분 서 보자.</li>
		<li>메스를 사용 하 여 절 개 하 고 1.5 인슐린 펠 릿 집게를 사용 하 여 제거 합니다. 하나 또는 두 개의 단일 스티치 포인트를 사용 하 여 피부를 닫습니다. 마 취에서 쥐를 제거 하지 마십시오. 참고: 1 개월 후, 펠 릿 수 어렵다면 어떤 거리 조직 펠 릿;으로 해결할 수 있는 가 위를 사용 하 여 제대로 그것을 해 부.</li>
		<li>부정사 위치에 쥐를 놓습니다. 면도 하 고 복 막 지역 (povidone 요오드)와 소독. 요오드 3 분 서 보자.</li>
		<li>메스를 사용 하 여 흉 골 바로 아래 1.5 c m 개복 술을 만듭니다. 베인 주변 젖은 멸 균 거 즈를 놓습니다.</li>
		<li>뚱뚱한 패드 위 옆 지역화 omentum을 식별 합니다. 집게를 사용 하 여 신중 하 게 catch 하는 omentum, 복 막 구멍, 부드럽게 꺼내 거 즈에 그것을 확산. 참고: Omental 조직 십이지 장 비장에서 확장 되 고 복 부에 그것의 중간 지점에. 인슐린 요법을 받는 당뇨 쥐의 정상적인 omentum 때 거 즈에 확산 2 ² 약 이다.</li>
		<li>37 ° C에 미리 데워 진된 멸 균 식 염 수의 2 개 mL를 사용 하 여 잘 omental 조직 하이드 레이트. 작은 곡선된 집게를 사용 하 여 조작 하는 조직 고 omental 계층 간의 바늘 omental 가장자리를 침투. 바늘을 완전히 삽입 합니다.</li>
		<li>천천히 섬 준비의 주입을 시작 하 고 신중 하 게 바늘 주사 (선)으로 여러 장소에서 독도를 뒤로 이동 합니다. 바늘을 철수, 전에 히드로 분산 된 독도의 손실을 방지 하기 위해 바늘을 종료 중지 되었습니다 확인 하십시오.</li>
		<li>반복이 조작 omental 조직에 걸쳐 독도 배포를 다른 진입점을 사용 하 여 주사기의 전체 내용을 삽입 하는 데 필요한. 참고: 쥐, 4 ~ 5 주사는 일반적으로 필요 합니다.</li>
		<li>독도 주사의 끝에 주사기에 클러스터 되지 않은 확인 하십시오. 참고: 일부 독도 여전히 표시 되는 경우 주사기에서 바늘을 철회, 직접 빈 하이드로 겔의 100 µ L 주사기 채우기 및 바늘을 다시 연결 가능 하다. 나머지 독도를 플러시 주입의 두 번째 라운드를 할 수 있습니다.</li>
		<li>Omental 조직과 개복 술의 벽을 수 화를 다시 멸 균 식 염 수를 사용 합니다. 집게를 사용 하 여 신중 하 게 복 부 구멍에서 omentum 대체.</li>
		<li>쥐를 rehydrate 하 복 부 구멍으로 미리 데워 진된 멸 균 식 염 수의 2 개 mL를 주사.</li>
		<li>지속적인 스레드 봉합 사를 사용 하 여 근육 벽을 닫습니다. 그런 다음 단일 스티치 포인트 (포인트-) 피부 레이어를 바느질.</li>
		<li>주사 meloxicam (1.5 mg/kg) 피하는 진통제로 5 일 하루에 한 번.</li>
		<li>마 취에서 복구까지에 생리대에 쥐를 놓습니다. 모든 받는 사람 쥐에 대 한 절차를 반복 합니다.</li>
		<li>이식 매일 후에 혈당을 측정 합니다. Glycemia 경우 &gt; 2 g/L, 주사 6 U 긴-연기 인슐린의 피하는 하루에 한 번.</li>
		<li>Glycemia 및 c-peptidemia 1 또는 2 개월 이상 모니터링에 의해 이식 기능을 평가 합니다. 참고: 성공적인 이식의 경우, glycemia, 이식 후 2-5 일 이내 안정 해야 하 고 쥐 인슐린을 벗을 수 있다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. omental 이식 Explantation
참고: 이 절차는 좋은 이식 기능 확인을 허용 됩니다. 검색 기능 이식의, 후 쥐가 당뇨병 상태로 반환 해야 합니다. 이 단계는 대사 속 행의 1 또는 2 개월 후 수행 됩니다.
<ol><li>Anesthetize 가스 마 취와 함께 쥐와 부정사 위치에 놓습니다.</li>
	<li>복 막 영역을 면도 하 고 3 분 povidone 요오드를 사용 하 여 소독.</li>
	<li>메스를 사용 하 여 흉 골 바로 아래 1.5 c m 개복 술을 만듭니다. 베인 주변 모든 젖은 멸 균 거 즈를 놓습니다.</li>
	<li>위장은 omentum을 식별 합니다. 집게를 사용 하 여 거 즈에 신중 하 게 그것을 확산.</li>
	<li>가 위를 사용 하 여는 omentum 소비 세. 췌 장 꼬리 (비장) 옆에 준수 하는 부분에서 시작 합니다. 출혈이 발생 하면, 건조 멸 균 거 즈를 사용 하 여 그것을 막으려고.</li>
	<li>복 부에 연결 된 부분을 따라 절단을 계속 하 고는 omentum 검색 합니다. 참고: 이 위치에 gastroepiploic 동맥 (그림 1) 그들은 실수로 잘립니다 경우 출혈의 큰 금액을 일으킬 수 있습니다. 동맥 절 개 이식, 검색 불가피 하지만 집게와 거 즈를 사용 하 여으로 출혈 관리할 수 있습니다. 실수로 잘라 경우 마른 거 즈로 단단히 압축 하 고 적어도 1 분 동안 압축을 유지 합니다. 출혈이 중지 해야 합니다. 그렇지 않으면, 클립을 사용 하거나 전기 bistoury를 사용 하 여 혈관을 부식.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58898/58898fig1.jpg"> 그림 1: Omental 동맥 분포. Omentum 이식 explantation에 대 한 gastroepiploic 동맥의 구성 하는 중요 한 영역 파란색으로 표시 됩니다. 이 부분의 omental 조직 절제, 동안 관심 오른쪽 gastroepiploic 동맥 섹션에 지불 하 여야 합니다. 압축, 합자, 또는 열화 출혈 제한 사용할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58898/58898fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<ol start="7"><li>출혈이 지속 되는지 확인 합니다. 그렇지 않으면, 미리 데워 진된 염의 2 개 mL를 주입, 쥐, 닫고 이전 설명으로 처리.  Explanted 동물 당뇨병 상태를 반환합니다. 인슐린 주입 (6 U/SC/day)은 동물의 복지를 보장에 필수.</li>
	<li>안락사는 쥐 explantation pentobarbital (182.2 mg/kg)의 과다를 사용 하 여 10 ~ 12 일.</li>
</ol>4. 조직학 분석: Hematoxylin 및 오신 얼룩
<ol><li>4 %paraformaldehyde (PFA)를 사용 하 여 검색 된 omenta를 해결 하 고 파라핀에 포함.</li>
	<li>섹션 4 µ m 두께에서 고 이식의 형태 평가 되며 고 오신 얼룩을 적용.</li>
</ol>5. 통계 분석
<ol><li>사용 하 여 통계 분석 소프트웨어와 반복된 측정 분산 분석 (ANOVA) Tukey의 정직한 의미 차이 테스트 포스트 hoc 시험으로 통계적 의미를 확인 합니다. P 값으로 나타내는: *p &lt; 0.05; p &lt; 0.01; p &lt; 0.001입니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜에 몇 가지 중요 한 단계를 강조 수 있습니다. 첫째, 그것은 깨지기 쉬운 사람이 수술을 수행 하 고 조직 조작 지방 조직으로 섬세 한 수 있어야 합니다. 분쇄 또는 손상 된 omentum 피할 필요가 있다. 방어 조직으로 omentum, 대 식 세포 및 다른 백혈구에 농축입니다. 이러한 면역 세포 과도 한 조작에 의해 활성화 될 수 있다 고는 이식에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 둘째, 이식 (섬-히드로 혼합물) 로드은 또한 중요 합니다. 절차를 수행 하는 사람 죽은 볼륨을 피해 야 한다 그리고 모든 히드로 섬 혼합물의 주입 장치 로드 해야 합니다. 이 단계 후에 즉시 또 다른 중요 한 포인트는 주입 자체 이다. 주사 치료, 그리고 섬세 하 게 천천히, 수행 되어야 합니다. 주사기는 모든 나머지 독도 검색을 처음 로드 하는 빈 히드로에서 플러시됩니다 해야 합니다. 셋째, 봉합 이루어져야 합니다 신중 하 고 2 단계에서. 근육 계획 해야 될 봉합 먼저, 근육, omentum 봉합 하지 않도록 주의 복용 하 고 피부를 별도로 봉합 한다. Omental 이식에 대 한 explantation 절차에 대하여 특별 한 주의 때 위 (gastroepiploic 동맥)에 가까운 동맥 베는 순간에 취해야 한다. 그것은 몇 일 내의 동물 죽음에 어떤 지속적인 출혈 리드로 동물을 봉합 하기 전에 그들을 중지 발생 하는 모든 출혈에 주의 해야 합니다.
문제 해결 필요할 수 있습니다 매체에 관한 운반 독도; 하이드로 겔의 선택은 히드로 주 사용으로 실험, 최대입니다. 다른 재료를 사용 하 여 변수에서 발생할 수 있습니다 (또는 보충, 예 제외) 기능을 접목. 여기 설명 하는 방법을 7660 IEQ/kg의 섬 비율로 불활성 공동 이식 재료의 효율을 입증 했다.
현재 메서드 omental 크기와 히드로 속성에 의해 제한 될 수 있습니다. 당뇨병 쥐 모델을 사용 하려면 인슐린 치료는 충분 한 접목 영역을 제공 하기 위해 섬 이식 전에 필수입니다. 당뇨병 설치류 무게와 STZ 유도 당뇨병으로 인해 체 지방 량을 많이 잃게됩니다. 이 연구에 등록 하는 동물의 작은 무게, 고려도 작은 영역에 접목 수는 없습니다.
(전에 이식 펠 릿을 사용 하 여 그리고 그 후 오랫동안 행동 인슐린을 사용 하 여) 적절 한 glycemia 관리의 절약은 필수입니다. 여기, 우리가 여러 가지 이유로 이식의 날까지 인슐린 펠 릿을 보존 하기로 결정 했다. 첫째, 적절 한 glycemic 통제의 유지 보수 상당히 섬 이식11 해로운 수 있는 연속의 집중적인 인슐린 치료 및 받는 사람 수 받는 사람 기관에서 당뇨병에 의해 유도 된 산화 스트레스를 감소 클리닉12에서 관찰 하는 준비. 둘째, 우리는 쥐에 대 한 마 취 절차의 최대 수를 제한 하 고 싶었다. 긴-연기 인슐린을 사용 하 여 신진 대사 후속 동안 인슐린 치료의 구현에 관한 사용 되는 체계 피해 대규모 합병증 "진짜" glycemia 값을 절약 하 고 glucotoxicity (이식 파괴할 수 있다)이 때문.
이식 효율을 모니터링 하려면 glycemia 되지 않습니다 관련 매개 변수는 처음 몇 일에 쥐 펠 릿을 사용 하 여 인슐린 치료를 받고 있다. 이 때문에 C-펩 티 드 여러 번 이전 이식 하는 필수 검사입니다. 이 시대는 STZ 주입 후 동물을 선택 하는 연구의 시작과 다음 그냥 이식, 쥐 당뇨병 유지 하 고 재생은 최소한의 앞에 포함 됩니다.
하이드로 겔 속성은 또한 중요 하다. 액체 히드로 omental 조직에서 누출 됩니다 하 고 높은 점성 하이드로 겔 주 사용 되지 않습니다. 하이드로 겔 점도 injectability는 사용 하기 전에 테스트를 하지만 또한 섬 또는 생체 외에서 다른 세포 생존의 평가 의해 직접 재료를 테스트 필수 나타납니다. 여기, 독도 hypoxia과 높은 점성 캐리어의 사용에 매우 민감한 산소 보급을 발생할 수 있습니다.
기존의 방법에 대해 설명 하는 방법의 중요성의 측면에서이 내부-조직 이식 기술 재현성의 기간에서 장점이 있습니다. 또한 조직에 대 한 atraumatic 이며, 외 혈관 위치, 출혈 및 혈전 증 위험을 피 한다. 또한, 섬 이식 때, 인스턴트 혈액 중재 염증 반응은 피할된14이다. 또한, 유도 간 기능15점에서 위험 포즈 간으로 이식 달리 비 중요 한 장기로 독도 이식 수 있습니다.
최적의 성능, 생산 하는 하이드로 겔 수행 한다 하는 셀에 적용할 수 있다. 성장 인자 또는 특정 단백질의 사용은 이식된 세포16,17에 긍정적인 영향을 가질 수 있습니다.
결론,이 기술을 사용할 수 있습니다 다른 세포 유형에 하이드로 겔의 vivo에서 유효성 검사를 위해 독도 관해서는 활성 대사 환경 필요 하는 경우에 특히. 또한,이 수술 기술은 여러 응용 프로그램에 적용 됩니다 그리고 급속 하 게 인 간에 게 양도 그것 실행 될 수 있다 쉽게 강경을 사용 하 여 미래에 있을 수 있습니다.

세포 치료 뜨거운 주제는 재생 의학에 따라 질병을 치료 하는 것을 목표로 합니다. 생물 재료를 이용한 세포 치료 최근 몇 년 동안, 특히 세포 이식 자주 받는 사람에 게 문화 접시에서 셀의 전송을 위한 운반대를 요구 하기 때문에 점점 공부 되었습니다 했다. 소재 건설 기계는 잠재적으로 귀중 한 셀 사업자 충족 여러 가지 역할1. 유능한 캐리어는 기계적인 긴장에서 세포를 보호 하 고 필수 성장 요인, 대사 폐기물 배설, 영양 물질과 산소2의 교환 호의 베푸는 성장 조건을 제공 해야 합니다.
세포 치료에 사용 되는 생체 재료의 종류 들 사이 hydrogels 많은 이점이 있다. 그들은 생체, 생 분해성, 쉽게 처리 하 고 용이 하 게 산소 보급3입니다. 또한, 현재 기술 세포 생존과 성장 인자 또는 세포 외 매트릭스 단백질4예, 보완과 engraft 수 있도록 hydrogels의 사용을 수 있습니다.
하이드로 겔 사업자 포함 하는 줄기 세포 치료로 주입 수 있습니다 예를 들면, 뼈 재생5 및 신 경계 질환6. Metabolically 활성 세포의 주입이 필요 합니다. 접근의 생체 외에서 확인이 가능, 도구와 기술을 vivo에서 유효성 검사에 대 한 세련 된 것을 남아 있다.
셀 및 히드로 이식 쉽게 수행할 수 있습니다 밖으로 피하 주입에 의해 생체 적합성 테스트를 실시 하는 경우. 그러나, 이식할된 세포는 그들의 신진 대사 활동에 의해 조직 요인 통제 의미,이 피하 지역화 최적의 정 맥 배수7점에서 본질적으로 않습니다. 따라서, 신속, 안전 하 게, 그리고 효율적으로 평가 하이드로 겔의 유익한 효과를 현재 도구가 있다. 호르몬 응답 혈액 포도 당 수준으로 이식에서 혈 류로 출시 될 필요, 섬 이식의 예에 따라 우리 vivo에서 세포/히드로 이식 위한 새로운 방법을 개발.
첫 번째 단계 셀 하이드로 겔을 받아들일 수 있는 수락자 이식 사이트를 식별 하는 것 이었다. 위한 큰 공간을 제공 하는 omentum 주입, 높은 플라스틱 이며 그것의 조밀한 vascularization 복 설정을 함께 공부 하는 데 높은 신진 대사 활동8셀에 대 한 흥미로운. 우리는 다음 수술 기법에는 omentum 전지와 히드로의 전송 허용 설정 필요 합니다. Lipofilling 성형 수술9에서 사용에 의해 영감, 우리 개발 (귀환) 접근을 채우는 h Omental 매트릭스 섬. 하이드로 겔에 포함 된 독도 omental 조직 안에 주입 됩니다. 기술은 또한 omental 조직, 혈관의 많은 수는 또한 이식 산소 향상으로 셀과 히드로 혼합물의 여러 증언을 활용 하 여 최대 engraftment를 제공 목적.
현재 연구에서 우리는 섬 이식 혈관에 가장 가까운 지방 조직 내부 omental 시트 사이 대 한 간단 하 고 혁신적인 기술을 설명합니다. 이 마이크로-수술, 복 강경 수술에서 완료 될 수 있는 지방 조직으로는 하이드로 겔에 포함 된 독도의 주입으로 이루어져 있다. 이 기술은에서 테스트 하는 데 필요한 모든 히드로 및 셀 조합에 쉽게 적용 가능 하다는 metabolically 기능 환경에서.

<table><tbody><tr><td>알긴산염 (PRONOVA UP LMV)</td><td>노바매트릭스</td><td>4200206</td><td>하이드로겔 캐리어</td></tr><tr><td>외상성 바늘 (블런트)</td><td>B.Braun</td><td>9180109</td><td></td></tr><tr><td>CMRL (FBS 없음</td>) <td>Gibco</td><td>11500576</td><td></td></tr><tr><td>C-펩타이드 ELISA 키트</td><td>Mercodia</td><td>10-1172-01</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Leica Microsystems</td><td>3801592E</td><td></td></tr><tr><td>Ethilon 4/0</td><td>Ethicon</td><td>F2414</td><td>외과용 봉합사</td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Leica Microsystems</td><td>3801562E</td><td></td></tr><tr><td>인슐린 펠릿</td><td>Linshin</td><td>INS-B14</td><td></td></tr><tr><td>Isofluorane</td><td>Centravet</td><td>ISO007</td><td></td></tr><tr><td>Lantus (Insulin-Glargin)</td><td>Sanofi Adventis</td><td>Lantus SoloStar</td><td>장기형 인슐린</td></tr><tr><td>Metacam</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>MET019</td><td>항염증제</td></tr><tr><td>NaCl (식염수 0.9 % 용</td>) <td>시그마</td><td>10112640</td><td></td></tr><tr><td>바늘 26g</td><td>TERUMO</td><td>050101B</td><td></td></tr><tr><td>산소</td><td>린데</td><td>2010152</td><td>이소 플루란 사용</td></tr><tr><td>나트륨 펜토 바르 비탈</td><td>베토 퀴놀</td><td>돌 레탈</td><td>안락사</td></tr><tr><td>용 Steranios 2 %</td> <td>Anios</td><td>11764046</td><td></td></tr><tr><td>Streptozotocin</td><td>Santa-Cruz</td><td>SC-200719A</td><td></td></tr><tr><td>주사기 &ndash; Injekt-F</td><td>B.Braun</td><td>9166017V</td><td></td></tr><tr><td>투관침 및 탐침 (linshin)</td><td>Linshin</td><td>G12-SS</td><td>펠릿 삽입용</td></tr></tbody></table>

내부 omental 작은 섬이 식을 사용 하 여 h omental 매트릭스 섬 작성 (유도)

Intra-Omental Islet Transplantation Using h-Omental Matrix Islet filliNG (hOMING)

세포 치료에 따라 재생 의학 질병 치료에 대 한 새로운 희망을 나타냅니다. 현재 장애물 적절 한 생체 내에서 유효성 검사는 치료의 효율성을 포함 한다. 받는 사람 몸에 전송, 셀 종종 생체 재료, 특히 hydrogels와 결합 될 필요가 있다. 그러나, 이러한 이식의 효능의 유효성 검사는 오른쪽, 오른쪽 히드로 환경과 바로 받는 사이트 필요합니다. omentum 같은 사이트 수 있습니다. 우리 섬 이식 및 생존 향상 omental 레이어 사이 조직 안에 이식의 주입으로 구성 된 귀환 (Omental h 행렬 섬 작성) 기술, 개발 섬 이식의 예에 따라. 이 위해 독도 atraumatic 바늘을 사용 하 여 그것의 주입을 가능 하 게 한 점도와 히드로에 포함 해야 합니다. 주사기는 히드로 독도의 조합으로 로드 됩니다. 여러 가지 주사는 다른 진입점에서 omental 조직 내부 수행 그리고 섬/히드로 혼합물의 증 착 라인을 따라 이루어집니다. 우리는 dextran 비즈를 사용 하 여이 혁신적인 접근의 타당성을 테스트. 구슬 잘 omental 조직, 혈관에 가까운 근접에서에 걸쳐 확산 되었다. 이식의 효능을 테스트 하려면 우리 독도 당뇨병 쥐에 이식 하 고 대사 후속 2 개월 동안 수행. 이식된 독도 주위와 독도, 안으로 다시 vascularization의 높은 비율을 전시 하 고 당뇨병을 반전. 유도 기술을 다른 유형의 세포 높은 신진 대사 활동에 대 한 하이드로 겔 또는 세포 치료에 대 한 적용할 수 있습니다.

추적 메서드는 기관에 있는 혈관 내 주입의 회피와 독도의 감 금 허용합니다. 8-10 분 최대 시간이 마 취를 포함 하 여 전체 섬 이식 절차에 대 한 필요는 타임 라인 클래식 간 이식에 비해.
공부 하 고 독도 omental 조직 내부에 배포 되는 방법, dextran 구슬 유도 방법 (그림 2)를 사용 하 여 이식 했다. 주입, 후에 1 일 쥐 희생 했다, 그리고 omental 조직 조직학 분석에 대 한 검색. 되며 고 오신 얼룩 (그림 2오른쪽 아래) 조직에 걸쳐 구슬의 균일 한 분포를 밝혔다. 매우 자주, 구슬 혈관 가까이 되었고 지방 조직에 잘 설치 되지 않았습니다. 이식, 직후 염증 반응 결과 조직에 독도 중첩 하려면 조직 재편에 구슬 주위 발생 합니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58898/58898fig2.jpg"> 그림 2: 유도 기술과 비드 배포 omental 조직을 통해 이식 후에 1 일의 설명. 유도 기술의 (A) 그림. 장기 노출 (A, 왼쪽), 섬-히드로 믹스 (대체 여기 더 나은 시각화를 위한 블루 색 dextran 구슬) 신중 하 게 atraumatic 바늘 (A, 중간)을 사용 하 여 조직에 주입 했다. 조직에 이식 하는 구슬 (A, 오른쪽) 볼 수 있습니다. (B) 되며 고 오신 omentum의 얼룩 explanted 비드 주입 후 1 일. 구슬 균일 한 분포와 조직에서 발견 된다. 눈금 막대 = 100 m m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58898/58898fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
이 방법의 유효성을 검사 하기 위해 루이스 쥐를 사용 하 여 isogenic 연구를 수행 했습니다 (n = 8). 당뇨병 쥐 유도 사용 하 여 쥐 몸 무게 kg 당 섬 이식 (7660 섬 해당, IEQ)를 받고 두 달 동안 glycemia와 C-peptidemia에 대 한 감시 되었다. Glycemia ( 그림 3A에서 관찰 하는 glycemia에서 첫 번째 드롭 다운을 증명)으로 펠 릿 인슐린의 주입에 의해 통제 되었다. 이식 기능 약 2 g/L 및 C-peptidemia의 glycemia에 의해 반영 되었다 &gt; 500 오후. 이식 전에 쥐 했다 당뇨병 (glycaemia &gt; 5 g/L 및 C-peptidemia &lt; 200 오후). 이식 후 인슐린 펠 릿 검색, glycemia 유지 보수 및 정규화 불과 3 일 후 이식 귀환 관찰 했다 하 고 이식 검색 (p &lt; 0.05 미리 이식 수준에 비해)까지 유지 되었다. Omental explantation 후 glycemia 다시 귀환에 의해 이식 된 시리즈의 기능을 증명 사전 이식 수준으로 상승 (그림 3A). C-peptidemia 패턴은 정확히 반대, 이식, 증가 및 연구 과정을 통해이 증가 수준 유지 보수 하기 전에 발견할 수 없는 수준 낮은 (p &lt; 0.05), 그리고, omental explantation, 후 한 감소 전 이식 수준 (그림 3B). 조직학으로 explanted omentum의 분석 혈관 (그림 3C)에 그들의 근접 결과로 가장 가능성이 매우 vascularized 다시 독도를 밝혔다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58898/58898fig3.jpg"> 그림 3: 추적 및 이식 평가 받은 쥐의 2 개월 대사 후속. (A) Glycemia 측정 및 섬 캐리어로 alginate를 사용 하 여 유도 후 (B) C-펩 티 드 평가 (Tx: 이식 및 인슐린 펠 릿 검색; Explantation:는 omentum의 Explantation). 이식 기능, 같이 normoglycemia의 유지 보수에 의해 인슐린 펠 릿 검색 후 고 섬 이식 후 C-peptidemia에서 증가. 회색 음영된 지역 각 시간 지점에서 최소 및 최대 기록 된 값을 나타냅니다. (C) 되며 고 오신 유도 방법을 사용 하 여 작은 섬 이식 후 omental 섹션의 얼룩. 독도 어떤 주변 거리 조직 없이 주입 후 2 개월 조직으로 통합 된. 혈관 고, 화살표로 표시 된 것 처럼 주위와 독도, 안으로 성장 했다 따라서 섬 기능을 완전히 복원. 독도의 형태 또한 잘 보존 된 것 같다. 스케일 바 = 50 µ m. (n = 8) (*p &lt; 0.05; * * p &lt; 0.01; * * * p &lt; 0.001 Tukey의 정직한 의미 차이 테스트 반복된 측정 분산 분석 (ANOVA)을 사용 하 여 포스트 hoc 테스트로 결정). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58898/58898fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

여기, 우리는 히드로 기반 세포 치료, 섬 이식의 예에 의해 그림의 vivo에서 유효성 검사에 대 한 프로토콜을 제시. h Omental 매트릭스 섬 작성 (귀환) 이식 혈관, 적절 한 변화 환경에서 engraftment를 극대화 하기 위해 가까이 omental 레이어 사이 셀 하이드로 겔 혼합물의 주입 수 있습니다.

내부 Omental 작은 섬이 식을 사용 하 여 h Omental 매트릭스 섬 작성 (유도)

Regenerative medicine based on cell therapy represents a new hope for curing disease. Current obstacles include proper in vivo validation of the ...

이 방법은 hOMING 수술 기술에 의해 최적화될 수 있는 섬세 이식과 같은 세포 치료 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니까? 이 기술의 주요 장점은 간단하고 빠르며 튜닝 할 수 있으며 생체 재료 검증도 매우 빠르다는 것입니다. 바늘 배치의 시각적 데모는 잘못 배치 된 바늘이 섬 누출을 초래할 수 있기 때문에 omentum 내부에 적절한 이식 주입을 보장하는 것이 중요합니다.당뇨병을 유도하기 위하여는, 각 6 주 나이, 150 에서 190 그램 루이스 수신자 쥐에 연쇄상 조토신의 킬로그램 당 75 밀리그램을 주입하고, 주사 후에 첫번째 4 일 동안 매일 혈당 측정을 통해 당뇨병 상태를 확인하십시오. 쥐는 리터 당 2 그램 에 걸쳐 글리혈을 전시 할 때, 피하 당뇨병 합병증과 체중 감소를 방지하기 위해 하루에 긴 행동 인슐린의 여섯 단위를 주입. 200 picomolar 미만C-펩티드 수준으로 2일 연속 리터당 4~5그램 이상의 꼬리 정맥 혈당 수치의 두 가지 측정값이 있을 때 실험 코호트에 쥐를 포함한다.펠릿 이식의 경우 마취 당뇨병 수혜자 동물의 발가락 핀치에 대한 반응부족을 확인하고 포비단 요오드로 목을 청소하십시오. 이식 부위를 면도하고 노출된 피부를 추가 포비도요오드로 청소하십시오. 3분 후, 1~5개의 포비단 요오드 용액에 1/2 인슐린 펠릿 1개를 살균하고 16 게이지 트로카를 사용하여 노출된 목 피부를 관통합니다.그런 다음 가이드와 스타일트를 사용하여 펠릿을 삽입하고 개구부를 단일 점으로 봉합합니다. 더 많은 포비도요오드로 스티치를 청소하고 쥐가 저혈당을 피하기 위해 모니터링 및 음식케이지에서 회복 할 수 있도록합니다. 펠릿의 효율을 측정하기 위해, 인슐린 펠릿 이식 후 한 달 에 꼬리 정맥 혈액 C-펩티드 수준의 측정이 200 picomolar 이하로 유지될 때 실험 코호트에서 쥐를 포함하여 이식 후 1 개월 동안 매주 글리혈 감소를 측정한다.인탈 매트릭스 섬 채우기의 경우, 섬 등가물에서 건강한 기증자 쥐로부터 분리 된 섬의 수를 계산하고 개별 1.5 밀리리터 튜브에서 받는 사람의 킬로그램당 7, 660 개의 섬을 준비합니다. 각 알리코에 500 마이크로리터의 CMRL 배지를 태아소 세럼 없이 세척하고 튜브당 갓 준비된 알지네이트 하이드로겔 캐리어 150마이크로리터에 섬 펠릿을 재차 놓는 후 튜브를 얼음에 배치합니다. 다음으로, 150 마이크로리터의 빈 알기네이트가 있는 외상성 21게이지 바늘을 장착한 1밀리리터 주사기를 적재하고, 그 다음으로 150마이크로리터의 알기네이트 플러스 섬이 있습니다.주사기를 얼음 위에 놓고 첫 번째 수령인 동물의 목을 방금 시연한 대로 준비합니다. 메스를 사용하여 오래된 상처를 절개하고 집게를 사용하여 펠릿을 제거하십시오. 하나 또는 두 개의 단일 스티치 포인트로 스티치를 닫고 쥐를 척추 위치에 놓습니다.각막 부위를 살균하고 면도합니다. 메스를 사용하여 흉골 바로 아래에 1/2 센티미터 복강경 을 만듭니다. 절개 주위에 젖은 살균 거즈를 놓고 위 옆에 있는 오멘탈 지방 패드를 식별합니다.집게를 사용하여 복막 구멍에서 지방 패드를 부드럽게 당겨 거즈에 퍼뜨리십시오. 오멘탈 조직을 미리 데운 37도 의 멸균 식염수의 두 밀리리터로 잘 수화하고, 한 손에 작은 곡선 포셉으로 조직을 잡고, 다른 한 손으로 섬로드 주사기의 바늘과 오멘탈 층 사이의 오멘탈 가장자리를 관통한다. 바늘을 삽입 할 때, 주사를 시작하기 전에 오멘트 조직의 얇은 층에 둘러싸여 있는지 확인하십시오.주입된 섬이 조직 전체에 퍼질 수 있도록 바늘을 완전히 삽입하고 천천히 섬 제제를 주입하기 시작합니다. 주사 하는 동안, 조직의 가장자리에 바늘을 철회, 바늘이 거의 밖으로 때 주사를 중지. 그런 다음 다음 위치에서 새 주입을 시작하기 전에 5초 동안 기다립니다.그리고 입증 된 바와 같이 또 다른 3 ~ 4 개의 알리쿼트주입. 모든 하이드로겔이 분배되면 주입된 섬의 손실을 피하기 위해 바늘을 조심스럽게 철회하고, 주사가 끝날 때 주사기에 섬이 군집되지 않는지 확인한다. 모든 섬이 전달되었을 때, 조심스럽게 복강에 오멘티드 조직을 반환하기 전에 복강경의 연고와 벽을 수화.쥐를 수분을 공급하기 위해 복강에 미리 따뜻워진 멸균 식염수 2밀리리터를 복강에 주입합니다. 그런 다음 연속 스레드 봉합사로 근육 벽을 닫고 단일 스티치 점으로 큐탄 층을 스티치합니다. 신진 대사 후속의 1 ~ 2 개월 후, 입증 된 대로 각 받는 사람의 외과 절개를 열고, 조심스럽게 절개 옆에 배치 된 거즈의 식염수 에 오멘타를 확산하는 집게를 사용합니다.췌장 꼬리에 부착 된 지역에서 시작, 오멘티브 조직을 소비하고 입증 된 대로 각 동물을 닫기 전에 미리 따뜻하게 식염수의 두 밀리리터를 주입하는 가위를 사용합니다. 파라핀에 포함하기 전에 4% 파라포름알데히드에 회수된 오멘타를 수정합니다. 그런 다음, 마이크로톤에 조직의 4 마이크로미터 두께의 섹션을 획득하고 이식의 형태학적 평가를 위해 헤마톡슬린과 에오신 얼룩을 적용한다.입증된 바와 같이 hOMING 방법을 사용하여 이식된 Dextran 구슬은 혈관 에 가깝게 자주 관찰되었고 지방 조직 내에 잘 이식되었다. 이 대표적인 동종 제 연구에서, 글리혈은 먼저 1/2 인슐린 펠릿1의 이식에 의해 입증된 바와 같이 이식된 다음, 리터당 약 2그램의 글리혈과 500개 이상의 피코몰라의 C-펩티드미아에 의해 입증된 것으로 서 게 이식하여 조절되었다. 또한, 이식 된 영양의 조직학적 분석은 혈관에 근접한 결과로 매우 재해석 된 섬을 밝혔습니다.개발 후, 이 기술은 세포 치료 분야의 연구원들이 전임상 모델에서 생체 공학적 세포 미세 환경을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

intra-omental-islet-transplantation-using-h-omental-matrix-islet

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

절연 아일 레츠의 이식은 제 1 형 당뇨병에 대한 잠재적인 치료로 제안되었습니다. 여기 마우스 pancreata에서 아일 레츠를 분리하고 신장의 subcapsular 공간을 이식하는 방법을 설명합니다.

Murine 아일릿 절연 및 Subcapsular 신장 이식을위한 방법

이 비디오는 생체 내에서 인간 췌장 이식편의 혈관 재생화를 모니터링하기 위해 인간 췌장도를 마우스 눈의 전방에 이식하는 프로토콜을 설명합니다. 또한 이식편의 캡슐화 및 혈관화를 촉진하는 데 있어 수용자 세포와 기증자 세포의 기여도를 이해하는 데 도움이 됩니다.

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이 프로토콜은 murine islet isolation과 decellularized scaffold상의 seeding을 증명합니다. Scaffold-supported 랑게질을 streptozotocin (STZ) 유도 당뇨병 생쥐의 부고환 지방 패드에 이식 하였다. 아일 레트는 이식 부위에서 생존하고 고혈당 상태를 역전시켰다.

당뇨병 쥐의 부고환 지방 세포에 이식 된 지지체 지지대 지지대

마우스에 독도의 omental 이식 하는 방법을 소개 합니다. 격리 된 독도 히드로와 혼합 하 고 혼합 당뇨 마우스의 omental 주머니에 배치 됩니다. 그리고, 혈액 포도 당 감시 면역 조직화 학적인 분석을 수행 합니다.

마우스에 Omentum 작은 섬 이식 하는 방법

췌 장 섬 이식 타입-1 당뇨병에 normoglycemia를 달성 하는 방법입니다. 이 문서는 당뇨병 쥐의 정상적인 포도 당 수준을 유지 하는 intraportal 경로 통해 이식 기술에 초점을 맞추고.

Intraportal 이식 마우스 모델에서 췌 장 독도의

이 프로토콜에서, 뮤린 아일렛 분리 및 인추니얼 피하 백색 지방 조직내로이식하는 방법이 기재되어 있다. 분리된 합성 뮤린 섬은 지하 막 하이드로겔을 사용하여 뮤린 수용자로 이식된다. 수령인의 혈당 수준을 모니터링하고, 아일렛 이식의 학력 분석이 수행됩니다.

뮤린 아일렛의 인과 피하 백색 지방 조직 (ISWAT) 이식 모형

이 프로토콜의 목표는 인간 췌장 이식 과정과 기여 숙주 대 기증자 세포의 역학을 지속적으로 모니터링하는 것입니다. 이것은 NOD의 눈의 전방 챔버 (ACE)에 인간 섬을 이식하여 달성된다. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-마우스 수신자가 반복된 2광자 이미징을 수행합니다.

생체 내 눈 챔버에서 인간 췌장 이식 및 기여 호스트 세포의 생체 내 이미징 및 정량화

이 지방으로 덮인 췌도 이식 방법은 복강 내 이식 된 섬의 검출에 적합합니다. 특히, 생체 결합제의 사용 또는 봉합이 필요하지 않습니다.

부고환 백색 지방 조직을 이용한 지방으로 덮인 췌도 이식

여기서 우리는 마우스에서 임상적으로 관련이 있지만 기술적으로 도전적인 수술 절차 인 포털 내 섬 이식을 성공적으로 수행하는 세련된 수술 절차를 제시합니다.

마우스에서 간내 섬 이식 중 주입 후 포털 정맥 출혈 최소화

우리는 인간 줄기세포에서 유래한 췌장 줄기세포 섬을 면역결핍 쥐에 근육 내 이식하여 생체 내 이식과 후속 분석을 위한 최소 침습 프로토콜을 제공합니다.

쥐에서 인간 다능성 줄기세포 유래 췌장 내분비세포의 근육 내 이식

학습하세요 hOMING 기술을 활용한 췌도 이식 방법으로, 수취체 쥐의 대사 환경을 최적화하여 혈당 조절 및 혈관화된 이식편 형성을 가능하게 하는 세포 치료 프로토콜입니다.

내부 Omental 작은 섬이 식을 사용 하 여 h Omental 매트릭스 섬 작성 (유도)

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