Name: 루시퍼 옐로우 - 인간 혈액-뇌 장벽의 세포 모델에서 강력한 파라셀룰러 투과성 마커 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: 배우세요 인간 혈액-뇌 장벽 세포 모델에서 루시퍼 옐로우 형광 분석을 이용한 밀착 연결부 형성 및 장벽 무결성 평가 방법을. 이 기법은 hCMEC/D3 단층에서 Papp 계산을 통해 신속하게 장벽 기능을 모니터링합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자는 약국의 미국 협회에서 2017 새로운 조사자 상, Duquesne 대학에서 Hunkele 공포 질병 상과 Manickam 실험실에 대한 약학 창업 기금의 학교에서 재정 지원에 감사드립니다. 우리는 서부 블로팅 지원과 오디세이 16 비트 이미저의 사용을 허용 누출 실험실 (Duquesne 대학)에 감사드립니다. 우리는 또한 칸다프 데이브 (Manickam 실험실)에 대한 감사의 특별한 메모를 포함하고 싶습니다 서부 블로팅에 대한 도움.

<ol><li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+Of+Disease%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the blood-brain barrier.</a> Neurobiology Of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).</li>
<li>Griep, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BBB+on+chip%3A+microfluidic+platform+to+mechanically+and+biochemically+modulate+blood-brain+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function.</a> Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).</li>
<li>Camos, S., Mallolas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+for+assaying+microvascular+endothelial+cell+pathophysiology+in+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Experimental models for assaying microvascular endothelial cell pathophysiology in stroke.</a> Molecules. 15 (12), 9104-9134 (2010).</li>
<li>Cucullo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+human+brain+endothelial+cells+and+flow-based+vascular+modeling%3A+a+marriage+of+convenience+for+rational+neurovascular+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 28 (2), 312-328 (2008).</li>
<li>Wolff, A., Antfolk, M., Brodin, B., Tenje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Blood-Brain+Barrier+Models-An+Overview+of+Established+Models+and+New+Microfluidic+Approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">In vitro Blood-Brain Barrier Models-An Overview of Established Models and New Microfluidic Approaches.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (9), 2727-2746 (2015).</li>
<li>Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hCMEC%2FD3+cell+line+as+a+model+of+the+human+blood+brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16(2013).</li>
<li>Ohtsuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+targeted+absolute+proteomic+analysis+of+transporters%2C+receptors+and+junction+proteins+for+validation+of+human+cerebral+microvascular+endothelial+cell+line+hCMEC%2FD3+as+a+human+blood-brain+barrier+model%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model.</a> Molecular Pharmaceutics. 10 (1), 289-296 (2013).</li>
<li>Tornabene, E., Brodin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stroke+and+Drug+Delivery--In+vitro+Models+of+the+Ischemic+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Stroke and Drug Delivery--In vitro Models of the Ischemic Blood-Brain Barrier.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (2), 398-405 (2016).</li>
<li>Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hCMEC%2FD3+cell+line+as+a+model+of+the+human+blood+brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16(2013).</li>
<li>Llombart, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+secretomes+from+a+human+blood+brain+barrier+endothelial+cells+in-vitro+model+after+ischemia+by+stable+isotope+labeling+with+aminoacids+in+cell+culture+%28SILAC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Characterization of secretomes from a human blood brain barrier endothelial cells in-vitro model after ischemia by stable isotope labeling with aminoacids in cell culture (SILAC).</a> Journal of Proteomics. 133, 100-112 (2016).</li>
<li>Weksler, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> The FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).</li>
<li>Avdeef, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+well+can+in+vitro+brain+microcapillary+endothelial+cell+models+predict+rodent+in+vivo+blood-brain+barrier+permeability%3F%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">How well can in vitro brain microcapillary endothelial cell models predict rodent in vivo blood-brain barrier permeability?</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 43 (3), 109-124 (2011).</li>
<li>Rahman, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+endothelial+cell+lines+for+in+vitro+blood-brain+barrier+models%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: A systematic review.</a> Brain Research. 1642, 532-545 (2016).</li>
<li>Cecchelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+and+reproducible+human+blood-brain+barrier+model+derived+from+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells.</a> PLoS One. 9 (6), e99733(2014).</li>
<li>Shao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+blood-brain+barrier+model+in+a+membrane-based+microchip+for+characterization+of+drug+permeability+and+cytotoxicity+for+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Development of a blood-brain barrier model in a membrane-based microchip for characterization of drug permeability and cytotoxicity for drug screening.</a> Analytica Chimica Acta. 934, 186-193 (2016).</li>
<li>Walter, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+lab-on-a-chip+tool+for+modeling+biological+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators+B%3A+Chemical%22%5BJournal%5D)">A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 222, 1209-1219 (2016).</li>
<li>Cecchelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+model+for+evaluating+drug+transport+across+the+blood%E2%80%93brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">In vitro model for evaluating drug transport across the blood–brain barrier.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 36, (1999).</li>
<li>Cecchelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+of+the+blood%E2%80%93brain+barrier+in+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+Drug+discovery%22%5BJournal%5D)">Modelling of the blood–brain barrier in drug discovery and development.</a> Nature reviews Drug discovery. 6 (8), 650(2007).</li>
<li>Reichel, A., Begley, D. J., Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aReichel%2C+A+%22The+Blood-Brain+Barrier%22">The Blood-Brain Barrier</a>. , Springer. 307-324 (2003).</li>
<li>Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+Studies+on+In+vitro+Blood%E2%80%93Brain+Barrier+Models%3A+Physiology%2C+Pathology%2C+and+Pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Permeability Studies on In vitro Blood–Brain Barrier Models: Physiology, Pathology, and Pharmacology.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 59-127 (2005).</li>
<li>Ren, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+General+Method+To+Increase+Stokes+Shift+by+Introducing+Alternating+Vibronic+Structures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A General Method To Increase Stokes Shift by Introducing Alternating Vibronic Structures.</a> Journal of the American Chemical Society. 140 (24), 7716-7722 (2018).</li>
<li>Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+development+of+polymers+for+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Design and development of polymers for gene delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (7), 581-593 (2005).</li>
<li>Oupický, D., Konák, C., Ulbrich, K., Wolfert, M. A., Seymour, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+delivery+systems+based+on+complexes+of+DNA+with+synthetic+polycations+and+their+copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">DNA delivery systems based on complexes of DNA with synthetic polycations and their copolymers.</a> Journal of Controlled Release. 65, (2000).</li>
<li>Couraud, P. O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCouraud%2C+PO+%22The+hCMEC%2FD3+CELL+LINE%3A+IMMORTALIZED+HUMAN+CEREBRAL+MICROVASCULAR+ENDOTHELIAL+CELLS+As+a+model+of+human+Blood-Brain+Barrier%22">The hCMEC/D3 CELL LINE: IMMORTALIZED HUMAN CEREBRAL MICROVASCULAR ENDOTHELIAL CELLS As a model of human Blood-Brain Barrier</a>. , Institut Cochin, INSERM U1016. France. (2012).</li>
<li>Youdim, K. ureshA., A, A. A. aN. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+trans-monolayer+permeability+calculations%3A+often+forgotten+assumptions%5BTitle%5D)+AND+%22research+focus+reviews%22%5BJournal%5D)">In vitro trans-monolayer permeability calculations: often forgotten assumptions.</a> research focus reviews. 8, (2003).</li>
<li>Eigenmann, D. E., Xue, G., Kim, K. S., Moses, A. V., Hamburger, M., Oufir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+four+immortalized+human+brain+capillary+endothelial+cell+lines%2C+hCMEC%2FD3%2C+hBMEC%2C+TY10%2C+and+BB19%2C+and+optimization+of+culture+conditions%2C+for+an+in+vitro+blood-brain+barrier+model+for+drug+permeability+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Fluid+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies.</a> Fluid and Barriers of the CNS. 10 (33), (2013).</li>
<li>Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G. E., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+drug+permeability+and+prediction+of+drug+absorption+in+Caco-2+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2111-2119 (2007).</li>
<li>Balda, M. S., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+classes+of+tight+junctions+are+revealed+by+ZO-1+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Physiological+Society%22%5BJournal%5D)">Two classes of tight junctions are revealed by ZO-1 isoforms.</a> The American Physiological Society. , (1992).</li>
<li>Brown, R. C., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Modulation+of+Adherens+and+Tight+Junction+Function%3A+A+Potential+Mechanism+for+Blood-Brain+Barrier+Disruption+After+Stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Calcium Modulation of Adherens and Tight Junction Function: A Potential Mechanism for Blood-Brain Barrier Disruption After Stroke.</a> Stroke. 33 (6), 1706-1711 (2002).</li>
<li>Gorodeski, G., Jin, W., Hopfer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Ca2%2B+directly+regulates+tight+junctional+permeability+in+the+human+cervical+cell+line+CaSki%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Extracellular Ca2+ directly regulates tight junctional permeability in the human cervical cell line CaSki.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 272 (2), C511-C524 (1997).</li>
<li>Stuart, R. O., Sun, A., Panichas, M., Hebert, S. C., Brenner, B. M., Nigam, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+Role+for+lntracellular+Calcium+in+Tight+Junction+Biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Critical Role for lntracellular Calcium in Tight Junction Biogenesis.</a> Journal of Cellular Physiology. 159, (1994).</li>
<li>Tobey, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-switch+technique+and+junctional+permeability+in+native+rabbit+esophageal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Calcium-switch technique and junctional permeability in native rabbit esophageal epithelium.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. , (2004).</li>
<li>Tobey, N. A., Argote, C. M., Hosseini, S. S., Orlando, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-switch+technique+and+junctional+permeability+in+native+rabbit+esophageal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Calcium-switch technique and junctional permeability in native rabbit esophageal epithelium.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 286, (2004).</li>
<li>Posimo, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viability+assays+for+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Viability assays for cells in culture.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (83), e50645(2014).</li>
<li>Cipolla, M. J., Crete, R., Vitullo, L., Rix, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcellular+transport+as+a+mechanism+of+blood-brain+barrier+disruption+during+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Transcellular transport as a mechanism of blood-brain barrier disruption during stroke.</a> Frontiers in Bioscience. 9 (3), 777-785 (2004).</li>
<li>Kreuter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+the+surface+properties+on+nanoparticle-mediated+transport+of+drugs+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+nanoscience+and+nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Influence of the surface properties on nanoparticle-mediated transport of drugs to the brain.</a> Journal of nanoscience and nanotechnology. 4 (5), 484-488 (2004).</li>
<li>Markoutsa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+and+permeability+studies+of+BBB-targeting+immunoliposomes+using+the+hCMEC%2FD3+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Uptake and permeability studies of BBB-targeting immunoliposomes using the hCMEC/D3 cell line.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (2), 265-274 (2011).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

BBB의 주요 역할은 신경 미세 환경의 지혈을 유지하기 위해 전신 순환과 뇌 사이의 비 필수 이온 및 독성 물질의 교환을 방지하는 것입니다. BBB의 특징적인 특징 중 하나는 모세관 내피 세포가 수송의 파라셀룰러 경로를 효과적으로 밀봉하는 단단한 접합부(TJs)를 형성하는 능력이다. 우리는 배양 된 hCMEC / D3 단층에서 TJ 장벽 형성의 명백한 역학을 결정하는 정량적 방법으로 LY P앱 분석법을 입증했습니다. 서양 블로팅을 통해 검출된 ZO-1 발현은 다음 단락에서 상세히 논의된 바와 같이 LY P앱 연구에서 데이터를 정형화하여 검증했다. 개발된 분석법의 추가 유틸리티로서, 우리는 DNA NP 형질감염이 실험 설정에서 TJ 장벽 특성의 변화를 결정하기 위해 이 분석법의 적합성을 나타내는 LY P앱을 측정 가능하게 변경하지 않았다는 것을 더 입증하였다.
웨스턴 블롯 데이터는 3일째, 5일, 7포스트 파종및 10일사후...

혈액-뇌 장벽 (BBB) 뇌 조직에 플라즈마 구성 요소의 유입을 제한 하는 보호 장벽 이며 pericytes 같은 지원 세포와 함께 뇌 내 피 세포로 구성. BBB의 주요 역할은 말초 혈액과 중추 신경계(CNS) 사이의 공간을 밀봉하여 신경 미세 환경의 지혈을 유지하는 장벽역할을한다1,2. 뇌 모세관 내피 세포효과적으로 세포 간 단단한 접합부 (TJs)의 형성을통해 paracellular 통로를 밀봉 1. 이 보호 장벽은 포도당과 선택한 영양소가 뇌에 들어가는 것을 허용하며 대부분의 이온, 독성 물질 및 약물이 이 단단한 장벽을 통과하는 것을 방지합니다. BBB의 보호 역할 외에도, BBB의 자연 장벽 기능은 CNS를 대상으로 하는 약물 전달 시스템 개발에 심각한 도전을 제기합니다.
BBB의 체외 세포 배양 모델은 생물학을 연구하고 TJ 장벽 무결성에 대한 약물 치료의 효과를 이해하는 데 유용한 도구입니다. 우리는 인간 뇌 내피 의 허용 모델이기 때문에 인간 뇌 미세 혈관 내피 세포주 (hCMEC / D3)를 시험관 내 모델로 사용3 인간 BBB의 많은 기능을 재현. hCMEC/D3is 는 시험관 내 BBB 모델링에 가장 일반적으로사용되는 세포주 중 하나 이며, 5, 5,6,7,8,9. 피질 전기 저항의 비교적 낮은 값에도 불구하고 (TEER), 장벽 압박감의 측정, 이 세포주는 뇌 내피 세포의 형태학적 및 기능적 특성의 대부분을 유지, 심지어의 부재에서 단일 배양으로 교양 세포6,7. hCMEC/D3 세포주 들은 불안정한 표현형6,7,9에 대한 분화를 거치지 않고 대략 통로 35까지 활성 수송기 및 수용체를 포함한 다중 BBB 마커를 발현합니다. ,10,11. 체외 BBB 모델로 hCMEC/D3 세포주의 가장 눈에 띄는 특징은 TJs5,9,11,12를형성하는 능력입니다. 줄기 세포 유래 BBB 모델은 hCMEC/D3 세포주와 비교하여 많은 연구에서 더 높은 투과성을 보였고 일부 BBB 마커를 발현하지만, 그들은 아직 가장 일반적인 BBB 세포 모델13으로진화하지 못하고 있다는 점에 유의해야 한다. 중요하게도, 줄기세포 유래 BBB 모델은 세포가 안정적인 BBB 표현형을 유지할 수 있도록 하는 최대 통로 수에 대하여 특징지어지도록 남아있다 14.
세 가지 주요 방법은 일반적으로 TER의 측정, 자당, 이눌린, 루시퍼 옐로우와같은 작은 친수성 추적자 분자의 명백한 투과성 계수(P app)의 측정을 포함하여 TJ 장벽 무결성을 결정하는 데 일반적으로 사용되며, 클라딘-5, ZO-1, 옥클루딘 등과 같은 TJs의 공지된 분자 마커의면역 염색 등 5. TEER는 다공성 멤브레인 기판에서배양된 세포 단층 전반에 걸쳐 전기 저항을 측정하는 비교적 간단하고 정량적인 방법 5. 그러나 TEER 값은 배양 배지의 조성 및 측정 기기의 유형과 같은 실험 변수에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 이러한 요인의 가능성이 조합은 2-21일 동안 배양된 hCMEC/D3 세포주에서 2~1150Ω cm2에 이르는 TEER 값의 광범위한 분포를 13일 동안 이끈다. 면역염색은 항체를 사용하여 표적 단백질에 라벨을 붙임으로써 TJ 단백질의 존재를 결정하는 시각적 방법이다. 그러나, 면역 염색은 실험적인 유물 귀착될 수 있는 세포를 고치고 침투할 필요를 포함하여 일련의 실험 단계를 관련시키고 형광 신호는 시간이 지남에 따라 퇴색할 수 있습니다. 위의 요인으로 인해 데이터 품질에 영향을 미치는 주관적인 오류가 발생할 수 있습니다.
이 작업의 주요 초점은 LY 기반 명백한 투과성 분석이 배양 된 hCMEC / D3 세포에서 동시 단일 층 형성의 역학을 결정하는 것입니다. 공동 배양 시스템, 미세 유체 시스템과 같은 다른 고급 시험관 내 BBB 시스템은 생리적으로 더 관련성이 높지만 장벽 기능15,16,17,hCMEC/D3 transwell 설정은 TJ 형성의 역학을 추정하고 신속하게 장벽 기능에 다른 약물 제형의 효과를 스크리킹하는 간단하고 신뢰할 수있는 모델입니다. 일반적으로 P앱 값은 hCMEC/D3 단층의 다양한 친수성 용정에 대해 일관됩니다. 예를 들어, 다양한 저분자 질량 용출체(예: 자당, 만니톨, LY 등)에 대한 보고된 P앱 값은 상이한 시험관 내 BBB 모델에서 10-4 cm/min 5,18,19의 순서로 , 20. 우리의 실험 설정에서, 뇌 내피 세포는 생체 내 장벽을 모방하는 세포 부착 및 단층 형성을위한 콜라겐 코팅 미세 다공성 멤브레인에 시드된다. 정점 측에 첨가된 LY는 세포간 단단한 접합을 통과하고 basolateral 측에 축적될 것으로 예상된다. basolater측에서 LY의 더 큰 농도는 미성숙하고 완전하지 않은 기능 장벽을 나타내고 낮은 농도는 성숙한 장벽의 결과로 기능성 TJ의 존재로 인해 제한된 수송을 반영합니다.
LY는 뚜렷한 여기/방출 피크를 가진 친수성 염료이고 자당, 만니톨 또는 이눌린과 같은 추적자 분자를 방사성 표지하는 필요를 방지합니다. 따라서, LY의 형광 값은 BBB 단층전반에 걸쳐 의 파라셀룰러 투과성을 직접 계산하는데 사용될 수 있다. 또한, 형광과 같은 작은 스토크스 교대로 고통받는 생물 의학 분야에서 사용되는 많은 상용염료와 비교하여, LY의 스토크스 시프트는 충분한 스펙트럼 분리를 가진 약 108 nm이며, 따라서 LY 형광 데이터를 강력한 판독을 통해 파라셀룰러 투과성을 결정합니다. 우리는 접합 마커 단백질, ZO-1의 발현의 변화를 보여주기 위해 직교 기술로 서양 블로팅을 사용했습니다. 서양 블로팅을 통해 검출된 ZO-1 발현은 LY P앱 데이터를 보충하는 데 사용되며, 이러한 데이터는 LY P앱 값의 관찰된 변화가 점진적인 증가와 함께 단층의 형성을 반영한다는 것을 시사한다. 타이트 한 접합 마커, ZO-1의 표현.
앞서 지적했듯이, 이 작업의 중심은 기능적 단단한 접합부가 있는 결합단층의 형성을 모니터링하는 간단한 기법으로서 LY 분석법을 입증하는 것이다. 그러나, 개발된 분석법의 추가적인 유용성을 입증하기 위해, 우리는 DNA 나노입자 형질감염된 hCMEC/D3 단층에서 LY P앱을 측정했다. 핵산은 중합체의 양전하 그룹과 음전하인 인산의 중화기 그룹(22) 사이의 정전기 적 상호 작용을 통해 직경 100-200nm의 다연화 나노 입자로 응축 될수있다. 23. 우리는 이 복합체를 우리의 일에서 DNA 나노 입자 (DNA NPs)로 지칭합니다. 우리의 의도는 세포를 트랜스펙트하고 원하는 단백질을 표현하는 것이지만, 우리는 hCMEC/D3 단층의 장벽 특성이 손상되지 않도록 해야 합니다. 우리의 데이터는 표준 4 시간 luciferase 유전자 형질감염 정권이 TJ 장벽 무결성에 있는 변경을 결정하기 위하여 LY Papp 분석의 유용성을 입증하는 LY 투과성을 측정가능하게 바꾸지 않는다는 것을 건의합니다.

<table><tbody><tr><td>hCMEC/D3 세포주</td><td>Cedarlane Laboratories</td><td>102114.3C-P25</td><td>인간 대뇌 미세혈관 내피 세포주&nbsp;</td></tr><tr><td>gWizLuc</td><td>알데브론&nbsp;</td><td>5000-5001</td><td>플라스미드 DNA 인코딩 루시퍼라제 유전자</td></tr><tr><td>루시퍼 옐로우 CH 디리튬 염&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>155267</td><td></td></tr><tr><td>Transwell 인서트는 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET) 트랙 에칭 멤브레인이 있는</td><td>Falcon</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Flask&nbsp;</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-207</td><td></td></tr><tr><td>24웰 플랫 바텀&nbsp;</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>블랙 96-웰 면역 플레이트&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>437111</td><td></td></tr><tr><td>S-MEM 1X</td><td>Gibco</td><td>1951695</td><td>Spinner-minimum essential medium (S-MEM)</td></tr><tr><td>EBM-2</td><td>Clonetics</td><td>CC-3156</td><td>Endothelial cell basal medium-2(EBM-2)&nbsp;</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 1X</td><td>HyClone</td><td>SH3025601</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 타입 I&nbsp;</td><td>디스커버리 Labware, Inc.</td><td></td><td></td>354236</tr><tr><td>Pierce BCA 단백질 분석 키트&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 용해 5X 시약&nbsp;</td><td>Promega</td><td>E1531</td><td></td></tr><tr><td>딱정벌레 루시페린, 칼륨 소금&nbsp;</td><td>프로메가</td><td>E1601</td><td></td></tr><tr><td>스펙트라맥스 i3&nbsp;</td><td>분자 장치</td><td></td><td>형광 플레이트 리더</td></tr><tr><td>Trypan 블루 솔루션, 0.4%</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 다클론 항체&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>61-7300</td><td></td></tr><tr><td>항-GAPDH 항체</td><td>abcam</td><td>ab8245</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor680-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG(H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Inc</td><td>128817</td><td></td></tr><tr><td>12-well, Flat</td><td>Bottom Olympus Plastics</td><td>25-106</td><td></td></tr><tr><td>RIPA buffer (5X)</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62524</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP2503-10</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey CLx 이미저</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td>웨스턴 블롯 멤브레인 스캐닝</td></tr></tbody></table>

루시퍼 옐로우 - 인간 혈액-뇌 장벽의 세포 모델에서 강력한 파라셀룰러 투과성 마커

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

혈액-뇌 장벽 BBB 는 비필수 이온및 독성 물질의 교환을 방지하기 위해 전신 순환과 뇌 사이의 장벽을 형성하는 내피 세포로 구성됩니다. 단단한 접합부(TJ)는 단층의 파라셀룰러 공간을 효과적으로 밀봉하여 손상되지 않은 장벽을 생성합니다. 본 연구는 명백한 투과성 계수(P 앱)를 결정하는 데 사용될 수 있는 LY기반 형광 분석(P app)을 설명하고, 그 결과로 인한 단층 형성의 역학을 결정하는 데 사용될 수 있다. hCMEC/D3 단층의 장벽 무결성. 우리는 또한 형질감염된 세포에 있는 TJ 기능 무결성을 결정하기 위하여 이 분석의 추가 유용성을 보여줍니다. LY P앱 분석에서 우리의 데이터는 트랜스웰 설정에서 시드된 hCMEC/D3 세포가 LY 파라셀룰러 수송을 효과적으로 제한한다는 것을 보여준다 7 일 포스트 배양. 제시된 분석의 추가 유틸리티로서, 우리는 또한 DNA 나노 입자 형질감염이 hCMEC/D3 단층에서 LY 파라세포 수송을 변경하지 않는다는 것을 입증한다.

첫째, 우리는 TJ 형성의 명백한 역학을 결정하기 위해 LY 투과성에 배양 시간의 효과를 결정했다. 1일째부터 10일까지의 평균 LY P앱 값은 그림 2a에나와 있습니다. 1일차 의 평균 P 앱은 4.25 x 10-4 cm/min이었고, 2일째에는 3.32 x 10 -4cm/min로 약간 떨어졌습니다. 평균 P앱 값은 3일째에 3.93 x 10-4 cm/min로 약간 증가했으며 6일째까지 큰 변동없이 변동했습니다. P앱 값은 7일째(P&lt; 0.05)에 비해 2.36 x 10-4 cm/min으로 크게 감소하여 장벽이 더 엄격해졌을 것입니다. P앱 값은 7일째부터 10일째까지 2.14 x 10-4 및 2.36 x 10<su...

우리는 루시퍼 옐로우 (LY)가 hCMEC/D3 세포 단층의 명백한 paracellular 투과성을 결정하는 강력한 마커, 인간 혈액 뇌 장벽의 체외 모델임을 입증하기 위해 형광 분석방법을 제시합니다. 우리는 배양 된 hCMEC / D3 세포에서 동시 단일 층 형성의 역학을 결정하기 위해이 분석기를 사용했습니다.

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...

이 프로토콜은 인간의 혈액-뇌 장벽의 세포 모델에서 세포 간 단단한 접합의 기능적 무결성을 결정하는 강력한 기술입니다. 이것은 더 긴 운동 분석기를 실행하는 대신 짧은 기간에 명백한 투과성을 계산할 수 있는 간단하고 상당히 저렴한 프로토콜입니다. 이 방법은 또한 중합체 DNA 나노 입자로 전감염된 뇌 내피 세포에서 단단한 접합의 기능적 무결성을 결정하는 데 사용될 수 있다.세포 도금을 시작하려면 미세 다공성 멤브레인을 가진 조직 배양 삽입물을 24웰 배양 판에 넣습니다. 각 조직 배양 삽입에 밀리리터 당 0.15 밀리그램당 콜라겐 타입 1의 400 마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 섭씨 37도, 이산화탄소 인큐베이터 5%로 1시간 동안 배양합니다.조직 배양 물자의 미세 다공막 위에 콜라겐 용액의 확산을 허용하기 위해 24웰 플레이트를 부드럽게 흔들어 놓습니다. 한 시간 후, 콜라겐 용액을 제거하고 부드럽게 1X PBS 버퍼의 0.4 밀리리터와 미세 다공성 멤브레인을 세척. 지금, 플레이트 hCMEC/D3 세포의 밀도50, 세포 삽입에 있는 평방 센티미터 당 000 세포.세포 부착 및 증식을 허용하기 위해 인큐베이터에 조직 배양 설정이 있는 24웰 플레이트를 배치합니다. 세포가 100 %의 합류에 도달 할 수 있도록 7 일 동안 플레이트를 배양. 격일 마다 성장 매체를 제거하고 조직 배양 삽입에 미리 따뜻하게 된 신선한 매체의 0.5 밀리리터를 전송합니다.DNA 나노 입자 트랜스펙트에 대한 ZO-1 발현의 변화를 결정하기 위해 서양 블로팅에 대한 도금 절차를 반복하고, ATP 분석이 전감염된 세포에서 세포 생존가능성을 결정한다. 루시퍼 옐로우 명백한 투과성을 결정하기 위해, 매일 파종 후, 성장 매체를 제거하고 우물의 바칼랄 측에 사전 따뜻하게 전송 버퍼의 1.5 밀리리터를 추가합니다. 이제 각 트랜스 웰 인서트의 정점에 20 마이크로 몰러 루시퍼 옐로우 용액의 58.3 마이크로 리터를 추가합니다.형광 측정을 위해 50 마이크로리터를 저장합니다. 정물 측에서 잔류 PBS 버퍼를 완전히 제거한 후 루시퍼 옐로우 용액을 가능한 한 빨리 추가하여 셀건조를 방지합니다. 정황 측에서 루시퍼 옐로우 용액의 정확한 볼륨을 보장합니다.모든 인서트와 동일한 정확한 볼륨의 루시퍼 옐로우 솔루션을 추가해야 합니다. 세포를 건조하지 않도록 신속하게 작업하십시오. 회전 판 셰이커에서 세포를 100 RPM및 섭씨 37도에서 60분 동안 배양합니다.그런 다음 각 정량구에서 루시퍼 옐로우 샘플 30마이크로리터를 제거합니다. 20 마이크로몰러 루시퍼 옐로우 용액과 미리 표지된 튜브에 대한 apical 측 샘플을 전송합니다. 이제 전송 버퍼를 사용하여 샘플을 10배 희석합니다.각 바소포탈 구획에서 500마이크로리터를 제거하고 샘플을 미리 표지된 튜브로 옮킵니다. 표준 곡선에 대한 일련의 루시퍼 옐로우 표준을 준비합니다. 각 표준 apical 및 바소포탈 샘플 100마이크로리터를 블랙 96웰 플레이트의 각 웰에 중복합니다.형광 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 루시퍼 옐로우 형광 강도를 측정하고 원고 텍스트에 설명된 바와 같이 명백한 투과성을 계산합니다. 루시퍼 옐로우 투과성에 대한 배양 시간의 효과는 단단한 접합 형성의 명백한 운동성을 결정하는 데 사용되었습니다. 명백한 투과성 값은 장벽이 더 단단해졌다는 것을 시사하는 첫날에 비해 7일째에 크게 감소했습니다.명백한 투과성 값은 10일째까지 안정화되었습니다. 이것은 장벽 형성이 완전하고 기능적임을 암시하여 루시퍼 옐로우 초세포 수송을 감소시켰습니다. 서양 블로팅은 시간이 지남에 따라 단단한 접합 단백질 ZO-1의 발현의 변화를 검출하기 위해 사용되었다.두 밴드는 두 개의 ZO-1 동소형태를 나타냅니다. 밀도 분석 결과 ZO-1의 픽셀 값이 3일부터 7일까지 증가하여 단단한 접합 단백질 ZO-1이 3일부터 7일까지 지속적으로 형성되었다는 것을 시사합니다. 종전 후 7일째칼슘 고갈 처리 후 ZO-1의 대역은 거의 검출할 수 없었기 때문에 ZO-1은 칼슘 이온이 없는 상태에서 형성할 수 없었음을 나타냅니다.결과에 나타난 바와 같이, ZO-1 단백질의 서양 블로팅은 루시퍼 옐로우 기반 기능 활성 데이터를 보완하여 단단한 접합 단백질의 발현 수준의 변화를 결정하기 위해 수행될 수 있다. 우리는 또한 인간의 뇌 내피 세포에서 단단한 접합의 기능적 활동이 DNA 나노 입자 형질에 의해 영향을받지 않았다는 것을 발견했습니다.

lucifer-yellow-robust-paracellular-permeability-marker-cell-model

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 비디오는 플루오레세인나트륨 분자를 사용하여 체외 혈액-뇌 장벽의 투과성을 평가하기 위한 투과성 분석에 대해 설명합니다.

Blood-Brain Barrier 모방 투과성 분석: 추적자 분자에 대한 BBB 모방의 투과성을 평가하기 위한 체외 분석

본 연구의 목적은 쥐의 동계 내피 세포와 성상 세포의 공동 문화를 포함하는 생체 BBB 모델의 재현성을 확인하는 것이 었습니다. 내피 세포 단일 층은 높은 봉사자 낮은 LY 투과성을 발표했다. 특정 TJ 단백질의 발현은 염증과 운송 및 수용체의 기능에 기능적인 응답은 평가했다.

설정 - 업<em&gt; 체외</em쥐 뇌 혈관 벽의&gt; 모델 (BBB)​​ : BBB 불 침투성 및 수용체 매개 운송에 초점

프로토콜의 목표는 생체 외에서 혈액-뇌 장벽 (BBB) 기반 모델 기본 돼지 뇌 내 피 세포 (pBECs)의 설립에 대 한 최적화 절차를 제시 하는입니다. 모델 쇼 높은 재현성, 높은 견고, 전송 및 세포내 매매 신약의 연구에 적합.

생체 외에서 혈액-뇌 장벽 돼지 뇌 내 피 세포를 기반으로 하는 모델의 설립에 대 한 방법 개선

여기 우리는 마우스 뇌 혈관 침투성 분석 결과 형광 추적기 관류 뇌혈관 장애의 동물 모델에 적용 되는 다음의 복 주사를 사용 하 여 현재. 한 반의 두뇌 양적 침투성을 평가 하 고 추적 프로그램 시각화/immunostaining에 대 한 다른 사용 됩니다. 절차 10 쥐에 대 한 5-6 시간 걸립니다.

Vivo에서 혈액-뇌 장벽 침투성 분석 결과 사용 하 여 마우스에 붙일 추적기 표시

여기에 우리가 현재에 cellulo BBB (혈액 뇌 장벽)의 설정을 설명 하는 프로토콜-Minibrain 폴리에스터 다공성 막 문화 인간의 BBB에 걸쳐 생체 또는 전염 성 요원의 전송 평가 시스템 삽입 및 그들의 이웃 뇌 세포에 생리 적 영향입니다.

병원 체 또는 의약품 및 두뇌와 그들의 상호 작용에 의해 장벽 횡단 연구를 인간의 혈액-뇌 인터페이스 모델

마약 중추 신 경계 종양을 대상으로 하는 것은 주요 도전 이다. 여기는 murine 및 인간의 세포를 사용 하 여 혈액 뇌종양 장벽의 생체 모방을 생산 하 고 중추 신 경계 종양 vivo에서 대상의 예측 가능성에 대 한 그들의 관련성을 토론 하는 프로토콜에 설명 합니다.

예측의 Vivo 페이로드 배달 접시에 혈액 종양-배리어를 사용 하 여

혈액 뇌 장벽 (BBB) 단단히 뇌 항상성을 조절 하는 다세포 신경 혈관 단위. 인간 iPSCs와 오르간 온 칩 기술을 결합하여 질병 모델링 및 CNS 약물 침투성 예측에 적합한 맞춤형 BBB 칩을 생성했습니다. BBB 칩의 생성 및 작동에 대해 상세한 프로토콜이 설명된다.

인간 iPSC 기반 혈액-뇌 장벽 칩 생성

여기에서, 우리는 장 장벽 기능, 투과성 및 수송을 연구하기 위한 인간 오가노이드 유래 장 상피 단층의 제조를 기술한다. 오가노이드가 외부 자극에 대한 원래의 상피 조직 반응을 나타내기 때문에, 이들 모델은 세포주의 확장성과 일차 조직의 관련성 및 복잡성의 이점을 결합한다.

오가노이드 유래 상피 단층: 장 장벽 기능을 위한 임상적으로 관련된 시험관내 모델

이 프로토콜은 인간 혈액-뇌 장벽(BBB) 시험관내 모델을 확립하는 방법을 설명합니다. 내피 세포와 혈관주위세포는 삽입 필터의 양쪽(혈액 구획)에 파종되고 성상세포는 하단 웰(뇌 구획)에 파종됩니다. 상기 모델 특성화는 나노입자 수송 실험에 사용되었다.

인간 혈액-뇌 장벽을 모델링하는 삼중 배양 세포 시스템

본 프로토콜은 장 투과성을 결정하기 위해 정점 엔터로이드 모델에서 루시퍼 옐로우를 활용하는 방법을 간략하게 설명합니다. 이 방법은 괴사 성 장염과 같은 염증성 장 질환을 모델링하는 장내 세포에서 세포 투과성을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

정점 장내구 모델에서 루시퍼 옐로우를 사용한 장 투과성 측정

이 보고서는 혈액-뇌 장벽 모델 구축을 위한 μSiM 플랫폼의 조립, 세포 배양 및 분석을 위한 프로토콜을 제공합니다.

혈액-뇌 장벽 모델링을 위한 MicroSiM(μSiM) 장벽 조직 플랫폼 사용

배우세요 인간 혈액-뇌 장벽 세포 모델에서 루시퍼 옐로우 형광 분석을 이용한 밀착 연결부 형성 및 장벽 무결성 평가 방법을. 이 기법은 hCMEC/D3 단층에서 Papp 계산을 통해 신속하게 장벽 기능을 모니터링합니다.

루시퍼 옐로우 - 인간 혈액-뇌 장벽의 세포 모델에서 강력한 파라셀룰러 투과성 마커

더 많은 동영상 탐색