Name: 기본 Murine 골격 근육 Microvascular 내 피 세포의 고립 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: 배우세요 생쥐 골격 근육에서 미세혈관 내피 세포를 고립하는 방법을. 효소 분해와 면역자기 분리를 통해 높은 순도의 세포를 얻어 근육-혈관 상호작용 및 면역 매개 근육 질환 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작품으로는 "다른 Kröner-Fresenius-재단"을 지원 했다 (2018_A03 TR), "혁신적인 Medizinische Forschung (IMF) Münster" (나-RU211811 TR에)와 독일 연구 재단 (DFG, INST 2105/27-1, 나 3283/5-1, 그리고 나 3283/6-1 SGM). 일러스트 이미지가 케 블 룸에서 제공 합니다.

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<li>Michiels, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell functions.</a> Journal of Cellular Physiology. 196 (3), 430-443 (2003).</li>
<li>Pierce, R. W., Giuliano, J. S. Jr, Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+function+and+dysfunction+in+critically+ill+children%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell function and dysfunction in critically ill children.</a> Pediatrics. 140 (1), Epub 2017 Jun 1 (2017).</li>
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<li>Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+isolation%2C+culture+and+transplant+of+mouse+skeletal+muscle+derived+endothelial+cells+with+angiogenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential.</a> PLoS One. 3 (3), e0001753(2008).</li>
<li>Pham, M. T., Pollock, K. M., Rose, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+vascularized+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Generation of human vascularized brain organoids.</a> Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).</li>
</ol>

저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

Microvascular 내 피 세포는 모든 조직에 장벽 기능과 관련된 장기 3의 질병에 그들의 기능 장애 결과 제공합니다. 또한, microvascular EC의 기관 특정 연구 새로운 치료 전략에 대 한 방법을 포장 수 있습니다. 따라서, microvascular EC 기능 생리 및 병 태 생리 조건 하에서 깊은 이해 큰 과학적인 관심입니다. 백혈구/endothelium 상호 작용의 모듈레이션 natalizumab, 림프 구 접착을 방지 하는 항 체와 다 발성 경화 증 환자를 치료 하는 성공적으로 및 그로 인하여 환생 6. 그러나, 여전히 염증 하위를 포함 한 다양 한 myopathies 남아만 날짜를 제대로 치료할 수 있다. 따라서, 골격 근육 endothelium에 특히 EC 속성의 myopathy 또는 소설 치료 접근에 결과를 사용할 수 있는 치료를 확장을 도울 수 있었다.
내 피 세포...

혈 류를 통해 , 세포와 장기 산소, 기판 및 다른 필요한 분자와 함께 제공 됩니다. 이 교환 모 세관, 작은 혈관에서에서 일어난다. 모 세관 내부 내 피 세포 (EC) 층이 누구의 무결성 유지 혈관 내 고 중간 공간 사이의 근육 항상성의 성공적인 규제에 조건 형성 된다. 수용 성 요소와 세포의 선택적 전환할 수 있도록, EC 꽉 연결 되어 단층 및 외화 접속점 1을 구성 합니다. 영양소 또는 대사 제품에 대 한 장벽으로 서의 역할 외 EC 염증 과정에서 백혈구의 채용을 통제 한다. 염증이 나 조직 손상 접착 분자의 최대 규정 EC 표면에 발산 촉진 백혈구 첨부 파일 및 대상 조직 2로 환생의 생산 리드. 따라서, EC 비판적으로 병원 체 또는 조직 복구에 대 한 방어와 같은 염증 성 프로세스의 규칙에서 포함 된다.
EC의 장애는 직접 관련 혈관 질환, 만성 신부전, 정 맥 혈전 증 심한 병원 체 감염 된. 또한, EC는 거의 항상 당뇨병 mellitus 또는 다 발성 경화 증 3같은 기관 특정 면역에 관여 하 고. 혈 류 및 기관 사이의 장벽 기능 따라서 다른 종류의 공동된 작용에 의해 제어 됩니다. 골격 근육 microvascular 내 피 세포 (MMEC) 근육 세포와 섬유 아 세포와 pericytes 형성 기능 단위, "myovascular 단위" (MVU). 따라서,는 MVU의 부전 myopathies의 이상에서 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다. 그러나, 이러한 규제 메커니즘에 대 한 깊은 이해는 여전히 누락 이며 현재 myopathies에 새로운, 긴급 하 게 필요한, 치료 대상의 식별을 방해.
복잡 한 생리 적 및 병 태 생리 기계 장치를 조사, 동물 모델은 일반적으로 사용 됩니다. 그러나, 생체 외에서 모델 제외 혼동 요인의 다양 한 관심 주제에 초점을 이점을 제공 합니다. 프로세스를 조사 하기 위해 생체 외에서 그것은 순수 하 고 가능한 1 차 셀을 분리 하는 데 필요한입니다. 셀 라인, 달리 1 차 셀 유전자 변형 동물에서 분리 가능 유전 수정은 체 외의 결과 조사
여기, 뒤에 자석 활성화 된 셀 정렬 기법 (MCS) 정화 기계 및 효소 분리를 사용 하 여 기본 murine MMEC를 분리 하는 방법을 설명 합니다. 이 목적을 위해 특정 표면 표식에 대 한 자석 구슬 사용 됩니다. 혈소판 내 피 성장 세포 접착 분자-1 (PECAM1, CD31)은 주로 EC에 표현 하 고이 셀 종류를 풍부 하 게 사용할 수 있습니다. 높은 셀 순도 보증 하기 위하여 원래 조 혈 모 세포 (PTPRC, CD45) 단백질 티로신 인산 가수분해 효소 수용 체 유형 C에 대 한 부정적인 선택에 의해 제외 됩니다. 또한, 품질 컨트롤, 기본 murine MMEC, 잠재적인 응용 프로그램 제한 뿐만 아니라 특별 한 고려의 재배 되 게 됩니다.

<table><tbody><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Thermo Fisher</td><td>25200-056</td><td>즉시 사용 가능한</td></tr><tr><td>ACK 버퍼</td><td></td><td></td><td>150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA pH에서 pH 7.3</td></tr>의 <tr><td>물에서 안티 마우스 CD31-FITC (클론 MEC13.3)</td><td>Biolegend</td><td>102506</td><td>Isotype control: FITC Rat IgG2a, &kappa; 아이소타입 Ctrl</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD45-PE (클론 30-F11)</td> <td>바이오 레전</td>드 <td>103106</td><td>아이소 타입 제어 : PE 쥐 IgG2b, &kappa; Isotype Ctrl</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>염기성 섬유아세포 성장 인자</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>CD31 MicroBeads 마우스</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-418</td><td></td></tr><tr><td>CD45 MicroBeads 마우스</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-301</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase-Dispase</td><td>Roche</td><td>10269638001</td><td>V. alginolyticus의 콜라겐분해효소, B. polymyxaCorning의 Dispase</td></tr> <tr><td>Costar TC 처리 다중 6웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-conjugated anti-rat IgG 항체</td><td>dianova</td><td>712-166-153</td><td></td></tr><tr><td>DAPI(DAPI를 사용한 ProLong Gold 퇴색 방지 시약)</td><td>Thermo Fisher</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Desoxyribonuclease</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4513</td><td>소 췌장에서 Deoxyribonuclease I</td></tr><tr><td>Diethylpyrocarbonat 처리 된 물</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9916</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 글루타민 보충제 및 피루브 산염 함유</td><td>Thermo Fisher</td><td>31966-021</td><td>37 &deg까지 예열; C 사용 전</td></tr><tr><td>dNTP Mix (10 mM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0192</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>FACS 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>551,579</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 70 &mu; m 세포 여과기</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>FC 버퍼</td><td></td><td></td><td>0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA</td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6178</td><td>태아 송아지 혈청</td></tr><tr><td>고정 생존도 염료 eFluor780</td><td>Thermo Fisher</td><td>65-0865-14</td><td></td></tr><tr><td>집게(톱니, 직선, 12cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11002-12</td><td></td></tr><tr><td>겸자(톱니형, 직선형, 12cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11009-13</td><td></td></tr><tr><td>인슐린 주사기 100 솔로 1mL(Omnifix)</td><td>Braun</td><td>9161708V</td><td></td></tr><tr><td>대형 자기 컬럼(LS 컬럼)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>CD45-MACS-step</td></tr><tr><td>MCS 완충액</td><td></td><td></td><td>0.5% BSA, 2mM EDTA pH 7.2에서 PBS 중간</td></tr><tr><td>자성 컬럼(MS 컬럼)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td>for CD31-MACS-step</td></tr><tr><td>Nuclease free water</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0581</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>Phosphate buffered saline, 바로 사용 가능한</td></tr><tr><td>PCR buffer (5x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>EP0742</td> in <td>a kit with the reverse transcriptase</td></tr><tr><td>Pecam1 rat &alpha;-mouse</td><td>SantaCruz</td><td>Sc-52713</td><td>100 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>시그마 알드리치</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>일차 쥐 근육 세포</td><td>셀프로겐</td><td>66066-01</td><td></td></tr><tr><td>프라이머 Cdh15 (M-Cadherin)</td><td>써모 피셔</td><td>Mm00483191_m1</td><td>FAM 라벨</td></tr><tr><td>프라이머 Cldn5 (클라우딘-5)</td><td>써모 피셔</td><td>Mm00727012_s1</td><td>FAM 라벨</td></tr><tr><td>프라이머 Ocln (오클루딘)</td><td>써모 피셔</td><td>Mm00500912_m1</td><td>FAM labeled</td></tr><tr><td>Primer Pax-7</td><td>Thermo Fisher</td><td>Mm01354484_m1</td><td>FAM labeled</td></tr><tr><td>Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1)</td><td>Thermo Fisher</td><td>Mm00493699_m1</td><td>FAM labeled</td></tr><tr><td>Primer 18s rRNA (진핵생물 내인성 대조군)</td><td>Thermo Fisher</td><td>4310893E</td><td>VIC labeled</td></tr><tr><td>qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>K0231</td><td>2 x 1,25 mL; 각 200회 반응의</td></tr><tr><td>경우, 단일 가닥 프라이머의 무작위 혼합물</td>, <td>Thermo Fisher</td><td>SO142</td>, <td>무작위 헥사머 프라이머</td></tr>, <tr><td>역전사 효소(200 U/&mu; L) + PCR 완충액 (5x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>EP0742</td><td></td></tr><tr><td>Rnase 억제제 (40 U/&mu; L)</td><td>Thermo Fisher</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>가위(절삭날 23mm, 날카로움/날카로움)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14088-10</td><td></td></tr><tr><td>가위(절삭날 42mm, 날카로움/뭉툭한)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14001-13</td><td></td></tr><tr><td>스피드 코팅 솔루션</td><td>PeloBiotech</td><td>PB-LU-000-0002-00</td><td></td></tr></tbody></table>

기본 murine 골격 근육 microvascular 내 피 세포의 고립

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

골격 근육의 모세 혈관 (근육 microvascular 내 피 세포, MMEC)의 내 피 세포 혈 류 감염에 대 한 면역 반응 뿐만 아니라 체액과 영양분의 교류를 통제 하는 골격 근육 사이 장벽을 구축합니다 면역 세포 이동 제어 하 여 대리인입니다. 이러한 기능에 대 한 MMEC 형성 기능 "myovascular 단위" (MVU), 더 세포 유형, 섬유 아 세포, pericytes 및 골격 근육 세포 등으로. 따라서, MMEC 및 MVU는의 역 기능 다양 한 myopathies에 기여 한다. 그러나, 건강과 질병에 있는 MMEC의 규제 메커니즘 충분 이해 남아 있고 그들의 설명 앞 myopathies에 대 한 좀 더 구체적인 치료. 분리와 기본 MMEC 함수는 MVU의 맥락에서의 심층 조사 이러한 프로세스의 더 나은 이해를 용이 하 게 수 있습니다.
이 문서는 골격 근육의 기본 murine MMEC 정화 및 문화 유지 보수 단계를 포함 하 여 기계 및 효소 분리 하 여 격리 프로토콜을 제공 합니다.

절연, 기본 murine MMEC 및 잔여 후에 1 일 다른 셀 대기업을 형성 하며 문화 요리 (그림 1A 주 1)의 하단을 준수 합니다. 제 7 일에,에서 평평 하 고 길쭉한 세포를 관찰할 수 있습니다. 그러나, 다른 사람, 주로 회전 타원 체 세포의 오염 여전히 표시 됩니다 (그림 1A 주 7). 따라서, CD31 긍정적인 선택을 통해 MCS가 필요의 다른 주기. 여기서 부터는, 기본 murine MMEC 약 80-90%의 밀도를 확산. 합류에 그들은 일반적으로 경도 정렬 셀 (그림 1A 하루 14) 겹치지 않는 단층을 형성합니다. 확산 합류 접촉 금지 때문에 중지합니다. 14 일에 대 한 후 5-10 105 셀 x 수 추가 수사를 위해 사용 될.
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Microvascular 내 피 세포 골격 근육 (MMEC)의 근육 모세 혈관의 안 벽을 형성 하 고 둘 다 조절 근육 조직과 혈액 사이 (면역) 세포의 마이그레이션 및 체액/분자의 교환. 기본 murine MMEC의 격리, 여기에 설명 된 대로 "myovascular 단위"의 종합 체 외 조사 수 있습니다.

기본 Murine 골격 근육 Microvascular 내 피 세포의 고립

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

이 프로토콜은 골격 근육에서 미세 혈관 내피 세포를 분리하는 플랫폼 기술을 설명합니다. 이 세포는 혈액 근육 장벽 기능에 추가 통찰력을 얻기 위하여, 예를 들면, 이용될 수 있습니다. 기존 방법에 비해이 기술의 주요 장점은 높은 순도로 1 차적인 미세 혈관 내피 세포를 격리할 수 있다는 것입니다.이 기술은 건강과 질병에 있는 근육과 내피 세포 사이 상호 작용과 같은 면역 매개 근육 질병의 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 첫째, 프로토콜에 설명된 대로 필요한 모든 솔루션과 6웰 플레이트를 준비합니다. 실용적인 절차를 시작하려면 외과 날카로운 / 무딘 가위, 수술 날카로운 / 날카로운 가위 한 쌍, 직선 및 곡선 집게 한 쌍을 가져옵니다.70%에탄올로 모든 수술기구를 소독합니다. 안락사 성인 남성 마우스를 등에 놓고 다리를 70% 에탄올로 적시시습니다. 날카로운 / 무딘 수술 가위를 사용하여, 엉덩이 관절에서 절단하여 각 다리를 절단.사지를 폐쇄된 세포 배양 접시에 놓습니다. 접시를 멸균 라미나르 플로우 후드로 옮겨주세요. 날카로운 가위와 구부러진 집게를 사용하여 엉덩이에서 발가락 끝까지 피부를 자른다.구부러진 집게를 사용하여 발가락에서 엉덩이까지 피부를 벗겨내는 동안 발가락 또는 발 패드를 고정하기 위해 직선 집게를 사용합니다. 근육 사분면 페모리스를 분리하려면 무릎에서 힘줄을 자르고 대퇴골을 따라 근육을 엉덩이로 절단합니다. 아킬레스건을 세워 근육삼두근 수라를 분리한다.다음으로, 경골을 따라 포틸라이트 포사로 자르고 근육을 제거합니다. 해리할 수 없는 힘줄을 제거하려면 구부러진 집게로 근육을 잡고 적절한 힘줄을 잘라냅니다. 준비된 소화 용액 2, 445 마이크로리터를 신선하고 라벨이 붙은 세포 배양 접시에 넣고 무게를 결정합니다.이 요리에 근육 조각을 모두 전송합니다. 그런 다음 무게를 결정합니다. 측정된 두 값의 차이는 1그램을 초과해서는 안 되는 근육 조직의 건조 중량을 제공합니다.외과 날카로운 가위를 사용하여 전체 근육 조직을 작은 조각으로 자른다. 1.5시간 동안 37°C의 티슈 서스펜션을 5%의 이산화탄소로 배양하여 서스펜션을 약 5분 동안 20분마다 1밀리리터 인슐린 주사기와 신중하게 혼합하십시오. 인큐베이션 후 서스펜션을 50밀리리터 라벨튜브에 배치된 70마이크로미터 나일론 스트레이너로 옮기고 흐름을 수집합니다.DMEM의 8 밀리리터로 셀 스트레이너를 세척하고 흐름을 수집합니다. 조각이 스트레이너를 연결하는 경우 분리된 솔루션을 다시 일시 중지합니다. 셀 스트레이너를 버리고 서스펜션을 300배, 섭씨 20도에서 10분 동안 폐기하십시오.상체를 조심스럽게 제거하고 적혈구의 용액에 대한 암모늄 염화 칼륨 분해 버퍼의 1 밀리리터에서 세포 펠릿을 다시 분리합니다. 실온에서 30초 동안 배양하세요. 그런 다음 10%의 FCS를 포함하는 DMEM의 9밀리리터를 추가하여 반응을 중지합니다.세포 현탁액을 15 밀리리터 튜브로 옮기. 그런 다음 Neubauer 세포 계수 챔버를 사용하여 세포 수를 결정합니다. CD45 양성 세포를 고갈하기 시작하려면 서스펜션을 300배, 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리합니다.상체를 완전히 제거하고 MCS 버퍼의 90 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 분리하십시오. CD45 마이크로비드 10마이크로리터를 추가하고 서스펜션을 혼합합니다. 냉장고에 4~8도의 인큐베이션을 15분간 사용해 보임.이 후 MCS 버퍼의 밀리리터 1밀리리터를 추가합니다. 원심분리기는 중력의 300배, 섭씨 4도에서 10분 동안. 상체를 완전히 제거하고 MCS 버퍼의 500 마이크로리터에서 셀을 다시 분리합니다.분리기의 자기장에 큰 자기 컬럼을 배치합니다. MCS 버퍼의 세 밀리리터로 컬럼의 저장소를 헹노게 합니다. 그런 다음 컬럼 아래에 15밀리리터 원내 튜브를 배치하여 흐름을 수집합니다.전체 셀 서스펜션을 열에 적용하고 완전히 흐르게 합니다. 각 세척 단계에 대해 MCS 버퍼 3밀리리터를 저장소에 추가하고 다음 세척 단계를 시작하기 전에 기둥의 저장소가 비어 있는 때까지 기다리면서 컬럼을 세 번 세척합니다. 추가 분리 단계에서 사용하기 위해 컬럼을 통과하는 레이블이 없는 셀을 수집합니다.CD31 양성 세포를 축적하기 시작하려면 Neubauer 세포 계수 챔버를 사용하여 세포 수를 결정합니다. 그 후, 10 분 동안 300 배 중력과 섭씨 4도에서 라벨이 없는 세포를 원심 분리합니다. 상체를 완전히 제거하고 MCS 버퍼의 90 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 분리합니다.CD31 마이크로비드 10마이크로리터를 추가하고 전체 서스펜션을 혼합합니다. 냉장고에 4~8도의 인큐베이션을 15분간 사용해 보임. 그 후, MCS 버퍼와 원심분리기의 밀리리터를 300배, 섭씨 4도에서 10분간 추가합니다.상체를 제거하고 MCS 버퍼의 500 마이크로 리터에서 셀을 다시 일시 중지합니다. 분리기의 자기장에 중간 자기 열을 배치합니다. MCS 버퍼의 500 마이크로리터로 컬럼을 헹구는 다.다음으로, 컬럼 아래에 15밀리리터 원내 튜브를 배치하여 흐름을 수집합니다. 전체 셀 서스펜션을 열에 적용하여 완전히 흐르게 합니다. 각 세척 단계에 대해 500 마이크로리터의 MCS 버퍼를 저장소에 추가하여 컬럼을 세 번 세척하고 다음 세척 단계를 시작하기 전에 기둥의 저장소가 비어 있습니다.열을 전달하는 레이블이 지정되지 않은 셀은 CD45-음수, CD31-음수 분획을 나타냅니다. 추가 품질 관리를 위해 저장합니다. 그런 다음 분리기에서 컬럼을 제거하고 적절한 수집 튜브에 놓습니다.파이펫 은 열에 MCS 버퍼의 두 밀리리터. 즉시 플런저를 컬럼으로 밀어 자석으로 표지된 세포를 플러시합니다. 이 CD45-음수, CD31 양성 분획은 농축된 기본 뮤린 IC를 나타냅니다.원심 분리는 350 배 중력과 5 분 동안 섭씨 20도에서 세포 현탁액을 분리합니다. 상체를 완전히 제거하고 내피 세포 배지의 1 밀리리터에서 세포를 다시 분리합니다. 내피 세포 배지의 1 밀리리터를 포함하는 코팅된 6웰 배양판의 단일 웰로 세포를 이송한다.재배를 위해 멸균 인큐베이터에 이산화탄소5%를 사용하여 섭씨 37도에서 세포를 배양하여 2~3일마다 배지를 새로 고치십시오. 세포가 80~90%의 합류에 있을 때, 두 번 연속 세척 단계에서 PBS의 2밀리리터로 세포를 두 번 함유하는 각 우물을 헹구는다. 그런 다음 800 마이크로리터의 트립신 EDTA 용액을 각 우물에 추가하고 37도에서 37도의 배양하고 멸균 인큐베이터에 이산화탄소를 5%로 배양합니다.그 후, 효소 활성을 중지하기 위해 최소 10%의 FCS를 포함하는 DMEM의 1, 200 마이크로리터를 추가합니다. 원심분리기는 중력의 350배, 섭씨 20도에서 5분간. 이어서, 순도를 증가시키기 위해 이전에 설명된 바와 같이 CD31 세포를 축적한다.20% 배율 및 0.35 렌즈 숫자 조리개와 함께 밝은 필드 또는 표준 상 계약 현미경을 사용하여 세포 결합을 관찰한다. 이 연구에서는, 1 차적인 뮤린 골격 근육 미생물 내피 세포는 고립된다. 고립 후 하루, 기본 뮤린 MMEC 및 잔류 다른 세포는 대기업을 형성하고 문화 요리의 바닥을 준수합니다.7일부터 평평하고 길쭉한 세포가 관찰될 수 있지만, 다른 대부분 스페로이드 세포의 오염은 여전히 볼 수 있다. 따라서 MCS를 통한 CD31 양성 선택의 또 다른 주기가 필요합니다. 이하, 1차 뮤린 MMECs는 약 80~90%의 밀도로 증식하여, 종로정렬세포의 겹치지 않는 단층을 형성한다.접촉 억제로 인해 인플루엔자에 대한 증식이 중단됩니다. 유동 세포측정을 통한 품질 관리는 격리 직후 세포에 대해 각각 약 70%에 이르는 생존력과 순도 에 대한 값을 보여줍니다. MCS를 통해 또 다른 CD31 양성 선택 후 재배된 세포는 순도뿐만 아니라 생존가능성에 대한 만족스러운 값을 보여주며, 각각 최대 95%에 이르는 것으로 나타났다.얻어진 세포는 양적 PCR에 의하여 mRNA 수준에 있는 근육 위성 세포 마커 유전자의 유전자 발현을 위해 그 때 조사된다. 예상대로, CD45-음성, CD31-음성 분획뿐만 아니라 분화된 원발성 뮤린 근육 세포발현 박스 단백질 7 및 M-cadherin, CD45-네거티브, CD31 양성 및 1차 뮤린 MMEC는 이러한 마커에 대해 부정적이다. 제2 CD31 MCS 단계 후, qPCR은 컨쿼티 원골 뮤뇨 MMEC에서 단단한 접합 단백질의 발현을 평가하는 데 사용된다.1차 뮤린 MMEC는 클라우디넨-5, 클로글딘, 조눌라 클로글렌스-1의 높은 수준을 표현하는 반면, pmMC는 조눌라 클로들렌스-1의 낮은 발현만 을 보여준다. 이 기술은 5~6시간 안에 수행될 수 있다. 이 프로토콜에 따라 마이그레이션 분석 또는 저전단 응력 실험과 같은 다른 방법을 수행하여 추가 질문에 답할 수 있습니다.이 비디오를 시청 한 후, 당신은 역학 및 효소 해리 및 자기 세포 분류에 의해 골격 근육에서 기본 미세 혈관 내피 세포를 분리 할 수 있어야합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

여기, 우리는 murine 폐동맥 내피 세포의 격리와 문화 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 정비사 및 효소 폐 조직 분리뿐만 아니라 안티 - PECAM - 1과 대부분 microvascular 원산지 순수한 내피 세포 인구를 생산 자성 비즈에 복합 백신 ICAM - 2 항체를 사용하여 2 단계 정화 과정으로 구성됩니다.

신생아 마우스의 폐 내피 세포의 분리 및 문화

우리는 원시 그대로의 미세 혈관 내피 세포의 칼슘 신호를 시각화하고 조작하기위한 준비를 제시한다. 내피 튜브 갓 골격 근육 주위의 세포 내와 사이에 생체 형태와 동적 신호의 유지 공급 마우스 저항 동맥에서입니다. 내피 튜브는 다른 조직 및 기관의 미세 혈관으로부터 제조 될 수있다.

마우스 저항 동맥의 미세 혈관 내피 튜브의 분리

정지 위성 세포의 순수 인구의 분리 및 배양은 근육 줄기 세포 집단은 근육 줄기 세포 생물학 및 재생뿐만 아니라, 근육 퇴행 위축 및 기타 퇴행성 질환의 치료를위한 줄기 세포 이식의 이해에 중요하다.

근육 위성 세포의 분리, 문화, 및 이식

재생 애플리케이션에 이상적이다 인간의 골격 근육 항구 여러 멀티 혈통 전구체 집단 내에서 혈관. 내막 근육 조직에서 혈관 내피 세포, 혈관 주위 세포 매체 및 외막 세포 외막에서이 분리 방법은 혈관의 세 층 구조에서 각각 세 능성 전구 세포 집단의 동시 정제를 허용한다.

인간의 골격 근육에서 혈관 유래 다 능성 전구체의 분리

심장 판막 내피 세포(VEC)를 분리하는 능력은 판막 발달, 유지 및 질병의 메커니즘을 이해하는 데 매우 중요합니다.  여기에서는 FACS를 사용하여 배아 및 성인 Tie2-GFP 마우스에서 VEC를 분리하는 방법을 설명하며, 이를 통해 발달 및 질병 과정에서 VEC의 기여도를 결정하는 연구를 수행할 수 있습니다.

쥐과 밸브 내피 세포의 분리

뇌 미세혈관 내피 세포(BMEC)는 혈액과 중추신경계(CNS), 이른바 혈액-뇌-장벽(BBB)을 분리하는 고도로 조절되는 장벽을 형성하는 특정 접합 단백질에 의해 상호 연결되어 있습니다. 이 프로토콜에서 논의된 바와 같이 1차 쥐 뇌 미세혈관 내피 세포의 분리는 BBB의 상세한 체외 연구를 가능하게 합니다.

차 설치류 뇌 미세 혈관 내피 세포의 분리

혈관 내피 세포는 많은 중요한 심혈관 질환에서 중요한 역할을 합니다. 이 기사에서는 특별한 장비를 사용하지 않고 쥐 대동맥에서 내피 세포를 분리하고 확장하는 간단한 방법을 설명합니다. 당사의 프로토콜은 내피 세포 생리병리학에서 메커니즘을 식별하는 효과적인 수단을 제공합니다.

분리 및 마우스 대동맥 내피 세포의 차 문화

이 프로토콜의 목적은 관상 동맥에서 뮤린 주 혈관 평활근 세포의 분리 및 배양 방법 (혈관 평활근 세포)을 보여주는 것이다. 혈관 평활근 세포가 분리되고 나면, 이들은 많은 표준 배양 기술에 사용될 수있다.

쥐 관상 동맥 혈관 평활근 세포의 분리

이 연구는 골격근에서 I 형 및 II 형 혈관 주위 세포를 쉽고 동시에 격리 할 수있는 FACS 기반 프로토콜에 대해 설명합니다.

마우스 골격근에서 I 형과 II 형 Pericytes 분리

이 기사에서는 신생아 마우스에서 일차 폐 내피 세포를 분리하고 배양했습니다.

일차 마우스 폐 내피 세포의 분리

이 프로토콜은 조직 해리, 순차적 여과, 사전 플레이트 및 정의된 배양 조건을 통해 성체 및 신생아 마우스 골격근에서 1차 근모세포를 분리하고 농축하는 표준화된 방법을 제공하여, 위성 세포 유래 근아세포 배양을 하위 실험 응용으로 구축하고 유지할 수 있게 합니다.

시험관 내 근형성 연구를 위한 골격근 위성 세포 분리

배우세요 생쥐 골격 근육에서 미세혈관 내피 세포를 고립하는 방법을. 효소 분해와 면역자기 분리를 통해 높은 순도의 세포를 얻어 근육-혈관 상호작용 및 면역 매개 근육 질환 연구에 활용할 수 있습니다.

기본 Murine 골격 근육 Microvascular 내 피 세포의 고립

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