Name: 유전 변이의 아미노산 수준 신호-잡음 분석을 사용 하 여 Variant Pathogenicity의 가능성 확인 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: 학습하세요 아미노산 수준 신호-잡음 분석을 사용하여 유전 변이의 병원성 가능성을 측정하는 방법을 배우세요. 이 기술은 질병 관련 돌연변이와 인구 기반 유전자 변이 데이터를 활용하여 변이 핫스팟을 식별하고 질병 관련 변이와 자연적 유전적 변이를 구분합니다.

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APL은 여는 국립 연구소의 건강 K08-HL136839 지원 하 고 있다.

1. 유전자와 특정 스플라이스 Isoform의 식별
참고: 여기, 우리가 관심 관련 된 관심의 질병의 병 인 유전자에 대 한 합의 순서를 식별 하기 위해 합15 의 사용 설명 (즉 KCNQ1 돌연변이 LQTS와 관련 된). 대안 합을 통해 생명 공학 정보 (NCBI)16 에 대 한 국립 센터와 캘리포니아 대학, 산타 크루즈 (UCSC) 인간 게놈 브라우저17 RefSeq 포함 ( 재료의 표참조).
<ol><li>합 홈페이지에 종 (즉 인간) 드롭다운 메뉴에서 선택한 관심 약어의 유전자 (즉 KCNQ1) 필드에 입력 합니다. "이동" 클릭</li>
	<li>관심사의 유전자에 해당 하는 링크를 선택 합니다 (예: "KCNQ1 (인간의 유전자)"</li>
	<li>관심 관심 ID의 사본에 "사본 테이블"에서 해당 링크를 선택 합니다 (즉, TranscriptID ENST00000155840.10, NM_000218 [RNA 사본], NP_000209 [단백질 제품의 RNA 사본]). 참고: 정확한 사본 합의 시퀀스 선택 되도록 관련 문학에의 검토 필요 합니다.</li>
	<li>참고 대 본 특정 NM와 나중에 참조할 "성적표 테이블"의 "RefSeq" 열에 있는 NP 식별 번호.</li>
	<li>NCBI 단백질 데이터베이스에서 새로운 웹 페이지를 열려면 NP ID 번호와 연결 된 링크를 선택 합니다.</li>
	<li>관심사의 유전자 사본에 대 한 단백질 (기본) 시퀀스를 "기원" 섹션으로 스크롤하십시오.</li>
	<li>단백질 기능 (기능 도메인, 바인딩 도메인, 포스트 번역 상 수정 사이트)의 목록을 "기능" 섹션까지 스크롤. 참고: NCBI 단백질 데이터베이스를 통해 또는 문학에서 기본 소스에서이 정보 또한 얻을 수 있습니다. 이 단계 5에서에서 더 논의 될 것입니다.</li>
</ol>2. 만들기 실험 유전자 변형 데이터베이스 ("신호")
참고: 여기, 관심 질병을 가진 개인 사이 질병 관련 된 이체의 주파수와 관심사의 유전자에서 질병 관련 된 이체의 데이터베이스를 만드는 방법을 설명 합니다. 이 데이터베이스는 많은 형태를 취할 수 하 고는 "신호" (긍정적인 표현 형 유전 변이) 제어 변형 데이터베이스에 대 한 정규화 됩니다 나타냅니다. 덧붙여 식별 단백질 2) VUSs, 등의 소설 기능 도메인 VUSs, 질병 관련 된 변종의 가능성을 확인 하기 위해 비교를 식별 하는 VUSs에 대 한 비교에 대 한 1) 질병 관련 된 변형 등이 있습니다. pathogenicity입니다. 질병 관련 된 변종 KCNQ1에 수 여 됩니다 그림; 그러나, 메서드는 덧붙여 식별 VUSs의 분석 또는 실험적인 이체의 다른 세트는 동일 합니다.
<ol><li>관심 있는 관심사의 유전자는 포괄적으로 모든 판단은 대 한 genotyped의 질병과 관련 없는 인덱스의 경우/판단은의 cohort(s)를 식별 (즉 연구 식별 24 없는 판단은 변종 KCNQ1 200에서 호스팅 개인 LQTS와 KCNQ1 유전자 심문을 복종 되었다). 참고: 이러한 동료 실험적인 유전 분석, 문학, 또는 둘 다의 조합에서 확인할 수 있습니다.<ol>
<li>코 호트 기반 되지 않은 연구를 제외 (즉, 단일 돌연변이 양성 개인 사례 보고서), 관심, 유전자에 대 한 개인 genotyped의 총 수를 제공 하지 않습니다 또는 포괄적으로 유전자 유전자 (분석 하지 않습니다 즉 만 KCNQ1 exons 2-4의 "대상된" 유전자 검사) 이러한 배제는 variant의 주파수의 계산.</li>
		<li>없는 판단은 하로이-변형 주파수 (LQTS 20 환자의 코 호트에서 KCNQ1 돌연변이와 4 없는 개인 식별즉, 연구를 예상할 수 있는 관련된 개인을 제외 하는 개인이 포함 합니다. 이러한 판단은 중 5 다른 돌연변이 양성 혈 연 가족의 일부입니다. 모든 가족 구성원을 제외 하 고 4 없는 판단은 포함).</li>
	</ol>
</li>
	<li>모든 실험 유전 이체 확인 된 cohort(s)에서 컴파일<ol>
<li>야생-타입 아미노산, 아미노산 위치 및 변형 아미노산 (즉, 알라닌 아미노산 번호 212 valine, Ala212Val 또는 A212V로 변경)을 포함 하는 명칭을 지정 합니다. 명명법에의 한 같은 종류는 그림 1에서 보여 줍니다.</li>
		<li>확인 모든 실험 유전 이체의 변형 명명법 1.4 단계에서 설명한 것 처럼 동일한 참조 유전자 사본에 기반 합니다. 실험적인 유전 이체는 동일한 참조 유전자 사본에 주석 처리 하지 경우 다음 사본 맞춤을 사용 하 여 참조 사본으로 변형 위치 reannotate (단계 1.2 참조)</li>
	</ol>
</li>
	<li>변종 탐험 되 고 질문에 따라 적용 되지 않는 제외 합니다.<ol>
<li>게놈의 단백질을 변경 하지 않는 변종 비 코딩 영역 지역화 제외 변종 동의어, intronic 이체, 5' 또는 3' 번역된 지역 [UTR], 그리고 intergenic 지역 등 변종 시퀀스 (즉, 보고는 pathologic 5 ' localizes KCNQ1에 변형 코딩 영역의 UTR 것 제외 하지 단백질 시퀀스 변경 예측으로).</li>
		<li>연구에 대 한 포함 기준을 충족 하지 않는 이체를 제외 합니다. 질병 관련 된 변종에 변종 이상 pathologic 간주 됩니다 포함 됩니다.<ol>
<li>각 variant 현재 고려 병원 성, 가능성이 확인 병원 성, 또는 하지 양성 적어도, 상호 ClinVar 데이터베이스와 변형에 의해 ( 재료의 표참조).</li>
			<li>유전자와 관심의 변종 (즉 KCNQ1 Y111C) ClinVar 검색 필드에 입력 하십시오, "검색"을 선택</li>
			<li>"변형/위치" 열 아래 관심의 변종을 식별 합니다.</li>
			<li>"임상 의미" 열 아래 pathogenicity의 합의 해석 참고 (즉 KCNQ1 Y111C 해석으로 "병원").</li>
			<li>이체는 포함 "가능성이 병원 성" 또는 "병원 성"</li>
			<li>"충돌 해석 pathogenicity 의"의 명칭으로 변형을 포함 "불확 실한 의미," 기록을 사용할 수 있는 경우 ("제공 되지 않음") 또는 연구 보증 하는 경우.</li>
			<li>변종으로 지정 제외 "가능성이 양성" (즉 KCNQ1-A62T).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>각 실험 변형 위치의 사소한 대립 유전자 주파수 (MAF)를 계산 합니다.<ol>
<li>어떻게 어떤 대립 유전자 (즉 KCNQ1 Y111C heterozygous 돌연변이 2 없는 개인, 변종-긍정적인 대립 유전자의 수에서 발견 되는 2 경우) 각 해당 variant에 대 한 긍정적인 했다 계산 합니다.</li>
		<li>코 호트 내에서 시퀀싱 하는 대립 유전자의 총 수를 계산<ol>
<li>각 코 호트 연구 (2.1 단계)에 순서가 개인의 총 수를 note</li>
			<li>2 대립 유전자의 총 수를 결정 하 여 개인의 총 수를 곱하면. 참고:이 추정 2 중 게놈에 의하여 각 대립 유전자의 각 개별 호스트 2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>각 아미노산 위치 (단계 2.4.2에서에서 단계 2.4.1/alleles에서 대립 유전자)에 대 한 변종-긍정적인 개인의 총 수를 계산 합니다. 예를 들어, 2 없는 각 개인 각각, 100 및 200 LQTS 괴로움 개인의 동료에서 heterozygous KCNQ1 Y111C 돌연변이 호스트 다음 아미노산 위치 111에서 실험적인 이체의 주파수는 2 변종/((100+200 individuals ) * 2 대립 유전자/개별) (즉, MAF 0.0033 결합).</li>
		<li>각 실험 이체의 각각 농림 부로 각 변형에 대 한이 값을 계산 합니다. 대 한 자세한 내용은 단계 4.2를 참조 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 만들기 제어 유전자 변형 데이터베이스 ("잡음")
참고: 여기, 통제 인구에 관련 된 주파수 관심사의 유전자에 제어 이체의 데이터베이스를 만드는 방법을 설명 합니다. 이 데이터베이스는 "잡음을" (형 부정, 인구 기반 유전 변이)는 실험 변형 데이터베이스 정규화 될 배경입니다 나타냅니다. 이것을 "제어" 변화 라고 합니다.
<ol><li>건강 하 고, 없는 판단은의 cohort(s)를 식별 하거나 사용 하는 큰 인구 기반 연구를 주어진된 인구 사이 희소 한 이체를 식별. 참고:이 데이터베이스에 대 한 소스는 다양 하 고 포함: 1) 건강 한 개인 또는 그렇지 않으면 표현 형 부정 개인 대상이 생어 시퀀싱, 또는 공개적으로 개최 데이터베이스는 문제의 질병은 인구 기반 개인의 2와 같은 주파수에서 드문) 1000 게놈 프로젝트 (N = 1094 과목)18, 3) 국가 심 혼, 폐, 혈액 연구소 이동 Exome 시퀀싱 프로젝트 (ESP, N 5,379 과목)19, 4) Exome 집계 컨소시엄 (ExAC, N 60,706 과목)13 , 또는 5) 게놈 집계 데이터베이스 (GnomAD, N = 138,632 개인)13 ( 재료의 표참조). GnomAD 데이터베이스 설명 예로 활용 될 것입니다.<ol>
<li>(즉 KCNQ1) GnomAD 홈페이지에 검색 상자에 관심사의 유전자를 입력 합니다.</li>
		<li>브라우저 선택 올바른 유전자 및 관심 (1.4 단계)의 성적 확인.</li>
		<li>"말은 범위"와 "보험 줄거리."를 검토 하 여 시퀀싱의 소재 시의 적절 한 범위 인지 확인</li>
		<li>"Missense + LoF."를 선택 하 여 코딩 하는 유전자 변형 시퀀스 선택</li>
		<li>선택 "내보내기 테이블을 CSV," 텍스트 편집기 파일을 생성 하는 "알 수 없음." 라는</li>
		<li>클럭이 파일 하 고 새로운 확장 "*.csv" (즉 "KCNQ1 제어 Variation.csv")를 포함 합니다.</li>
		<li>( 테이블의 자료참조) *.csv 파일의 분석을 위한 적절 한 소프트웨어 프로그램을 사용 하 여 파일을 엽니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>"단백질 결과." 표시 된 열에 있는 유전 변이 변경 단백질 식별</li>
	<li>실험적인 유전 이체 (2.3.1 단계)으로 이러한 제어 유전자 변형 같은 제외 기준 적용 됩니다.</li>
	<li>각 제어 variant의 MAF를 식별 합니다.<ol>
<li>Variant를 항구를 발견 하는 대립 유전자의 수를 나타냅니다 "대립 유전자 개수" 열을 찾습니다.</li>
		<li>아미노 산 성 위치를 주어이에 시퀀싱 하는 대립 유전자의 총 수를 나타냅니다 "대립 유전자 번호" 열을 찾습니다. 참고: 대립 유전자 시퀀싱의 총 수는 범위 해당 위치에 따라 달라 집니다. 높은 적용의 지역 2 접근 합니다 * GnomAD 내에서 개인의 총 수 (즉, 138,632 개인에 대 한 완전 한 범위 포함 genotyped 277,264 총 대립 유전자).  반대로, 낮은 범위의 영역 감소 총 대립 유전자 수 있을 것 이다</li>
		<li>농림 부는 미리 "대립 유전자 주파수" 열에서 계산 되 고 "대립 유전자 수" "대립 유전자 수입니다."로 나눈 값을 나타내는 variant를 찾습니다 참고: 인간의 유전자는 각 대립 유전자의 2 개의 (즉 1 발견 10 명 heterozygous 변형이 있는 것은 1/20의 농림 부)</li>
		<li>각 제어 이체의 각각 농림 부로 각 변형에 대 한 농림 부 note. 참고: GnomAD 구성 된 각 인종/민족적인 그룹에 대 한 변형 특정 농림 부는 "대립 유전자 주파수."의 오른쪽 열에서 볼 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>희소 한 이체는 제어 변종 "일반."로 제외 됩니다에 대 한 농림 부 임계값을 적용<ol>
<li>MAF 임계값 임계값 아래 모든 진정한 질병 관련 된 변종 (단계 2 참조) 또한 제어 데이터베이스에서 관찰 포함 최대 값을 설정 (즉, 모든 질병 관련 KCNQ1 변종 또한 GnomAD에서 발견 중에 가장 일반적인 이체 MAF는 0.009, 0.01의 임계값 이상 모든 GnomAD 변종 제외 되어야 하는 다음).</li>
	</ol>
</li>
	<li>실험 변형 명명법 제어 동일 인지 확인 (단계 2.2 참조).</li>
	<li>파일을 저장 합니다. 어떤 경우에이 파일 형식 확장명을 변경 해야 합니다.</li>
</ol>4. 아미노산 수준 신호 대 잡음 계산 및 매핑
<ol><li>각 아미노산 위치 제어 변종에 대 한 농림 부를 계산 (예 KCNQ1 GnomAD 이체를 포함 된 그림 1 참조).<ol>
<li>그래프 지원 스프레드시트에서 모든 실험적인 이체의 위치의 열을 만듭니다.</li>
		<li>떠나야만 변형 위치 변형 텍스트를 제거 합니다. 참고: 다양 한 기능/수식 자동으로 세포 (그림 1, C 열, 참조 테이블의 재료) 내에서 이러한 텍스트 요소를 삭제 하려면 활용할 수 있습니다.</li>
		<li>정렬 오름차순 값 식별 위치는 (그림 1, E; 열 연관 1 이상의 변종에 변종 즉, 아미노산 위치 10에에서 나열 됩니다 두 번 위치에서 2 독특한 변종 나타냅니다 열 전자).</li>
		<li>지정 된 위치 (그림 1, G 및 H 열)에 대 한 모든 MAFs의 합계를 복용 함으로써 주어진된 위치와 관련 된 각 변형에 대 한 농림 부를 결합 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>각 아미노산 위치는 실험 변종에 대 한 농림 부 계산 (모의 KCNQ1 pathologic 이체를 포함 된 그림 2 참조).<ol>
<li>4.1.1에 유사한 유행에서 아미노산 위치는 실험적인 이체 (그림 2, B 열)의 열을 만듭니다.</li>
		<li>각 변형 위치 단계 2.4 (그림 2, 열 C G)에서 그 위치와 관련 된 모든 이체의 MAF 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>회전 만들기 실험 둘 다에 대 한 농림 부 및 제어 이체의 평균.<ol>
<li>4.1와 4.2를 농림 부로 아무 변형 있는 아미노산 위치에 대 한 셀을 포함 하도록 만든 열 확장 = 0. (그림 3)입니다.<ol>
<li>(즉 1 676 KCNQ1, 그림 3, 열 C와 나)의 유전자에서 모든 아미노산 위치를 포함 하는 열을 만듭니다.</li>
			<li>제어 및 실험 데이터 집합에 대 한 변형 하지 않은 모든 위치에 대 한 0의 농림 부를 추가 합니다. 참고:이 일반적으로 사용된 하는 소프트웨어 프로그램 (그림 3, 열 D와 J, 재료의 표참조)에 "VLOOKUP" 기능을 이용 하 여 자동으로 할 수 있습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>회전을 만들고 각에 대 한 평균 실험 및 제어 유행 열. 참고:이 인접 위치 pathogenicity의 유추에 대 한 수 및 수 수 변경, 또는 심지어 제외, 연구의 요구에 맞게.<ol>
<li>모두에 농림 부의 압 연 평균을 나타내는 열 만들기는 제어 및 실험 데이터 세트 (그림 3, E 및 K 열).</li>
			<li>압 연 평균 열에서 N 맨끝 및 5 변형 된 위치에 C-터미널 위치 5 다른 위치에 대 한 각각 농림 부의 평균을 놓습니다. 참고:이 회전 만듭니다 + 5의 평균. 미만 5 아미노산 잔류물, 앞으로 또는 다음, 압 연 평균 위치 (즉, N 또는 C terminus) 위치에 대 한 압 연 평균 걸릴 것입니다만 계정에 존재 하는 그 잔류물 (즉, 회전에서 평균 3만 8, 아미노산 위치 1에서 농림 부의 평균 것 아미노산 위치 계산 이러한 MAFs 8로 나눈 값의 합으로).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>2 낮은 롤링 MAF 나누어 최소 제어 주파수를 계산 합니다.<ol>
<li>신호 대 잡음 비율을 계산할 때 0으로 나누기를 방지 하려면 최소 주파수를 제어 0의 MAF와 셀을 변경 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>(그림 4) 아미노산 수준 신호 대 잡음 비율을 계산 합니다.<ol>
<li>각 아미노산 위치 평균 평균 롤링 각각 제어 하 여 압 연 실험을 나눕니다.</li>
		<li>이 비율 (y 축) 대 아미노산 위치 (x 축) 그래프.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 단백질 도메인 토폴로지 오버레이
<ol><li>기능 도메인/기능, 합의 아미노산 위치 또는 포스트 번역 상 수정, 관심 (단계 1.7)의 단백질의 영역을 식별 합니다. 참고: 이러한 도메인을 식별 하는 다양 한 자료를 활용할 수 있습니다. 이러한 리소스, 뿐만 아니라 새로운 단백질에 상 상속 도메인을 식별 하는 데 리소스는 문학20에 잘 검토 되었습니다 했습니다. 이 프로토콜은 NCBI, 널리 이용 되 고 강력한 ( 재료의 표참조)를 통해 사용할 수 있는 단백질 데이터베이스를 설명 합니다.</li>
	<li>단백질 도메인/기능과 관련 된 아미노산 위치를 식별 합니다.<ol>
<li>NCBI의 웹 페이지를 엽니다.</li>
		<li>관심사의 단백질의 NP 검색 필드에 입력 합니다.</li>
		<li>알려진된 단백질 도메인을 식별 하 고 기능을 "기능"에서 카탈로그</li>
		<li>식별 하 고 도메인 이름/유형 및 아미노산 위치 합니다.</li>
		<li>관심 주 시퀀스의 단백질에 영역을 시각화 하는 기능에 해당 하는 링크를 선택 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>도메인/특징의 경계를 포함 하는 열을 만듭니다.<ol>
<li>아미노산 위치 열 수 있도록 신호: 소음 열 다음 열을 만듭니다 (그림 5A, C 열)를 참조.</li>
		<li>각 도메인/기능의 N 맨끝 또는 C 터미널 측면에서 해당 셀을 식별 하 고 (즉 KCNQ1의 S1 막 횡단 도메인의 N 맨끝 도메인은 아미노산 위치 122, C 터미널 도메인 이며 위치 하는 경우 각 셀에 1을 배치 142, 다음 1에에서 배치 됩니다 아미노산 위치 122 142에 대 한 행).</li>
		<li>도메인/기능, 중복에 대 한 다른 값 (예: 1.5, 2, 2.5); 1을 변경 하 여 여러 도메인을 표시 이 도메인을 구별에 지원할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>(그림 5B) x 축에서 y 축과 아미노산 위치 이러한 경계는 그래프를 만듭니다.</li>
	<li>4.4 단계에서 만든 신호-잡음 그래프와이 그래프를 오버레이 합니다.</li>
	<li>알려진된 단백질 도메인/기능 및 신호-잡음 분석 간의 상관 관계를 식별 합니다.</li>
</ol>6. 변형 위치 오버레이
<ol><li>4.4 및 5.4 단계에서 생산 하는 그래프의 오버레이 대 한 개별 변형 위치를 매핑하십시오.<ol>
<li>행 열에 것 이다 아미노산 위치 (그림 5A, 열 D)에 해당 하는 도메인/기능 열 다음 열을 만듭니다.</li>
		<li>각 이체를 포함 하는 위치에 해당 하는 추가 행에서 각 셀에 1을 놓습니다.</li>
		<li>(그림 5C) x 축에서 y 축과 아미노산 위치로이 열 그래프를 만듭니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>신호 대 잡음 그래프 4.4 단계에서 만든 및 단계 5.4에서에서 만든 도메인 그래프와이 그래프를 오버레이 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

높은 처리량 유전자 검사는 고급 극적으로 그것의 응용 프로그램 및 가용성에서 지난 10 년간. 그러나, 잘 설립 유전 토대, cardiomyopathies, 등 많은 질병에 확장 테스트 실패 했다 진단 수율21개선. 또한, 많은 확인 된 이체의 진단 유틸리티에 대 한 상당한 불확실성이 있다. 이것은 부분적으로 말하자면 확인 된 희귀 변종 WES에 WGS misdiagnosis22이어질 수 있는 발견의 증가. 아미노산 수준 신호-잡음 분석 예측 변형 pathogenicity 확고 전략에 근거 하 고 변형 해석 수정 대규모 인구 기반 게놈 연구 활용의 이점을 제공 한다.
이 프로토콜의 가장 중요 한 단계 중 하나는 다양 한 제어 및 실험 동료는 다음과 같습니다. 많은 공개적으로 사용 가능한 큰 게놈 연구의 현재 날짜에서 138,632 개인 만큼 큰 것이 프로토콜 제어 동료 대표에 대 한 수 수 있는...

접근성 및 약에 있는 유전학의 역할 유전자 시퀀싱 플랫폼의 급속 한 향상 혁명을 했다. 일단, 단일 유전자 또는 유전자의 소수에 국한, 비용에서 감소 및 시퀀싱 유전자는 게놈의 전체의 일상적인 시퀀싱 주도하 고 있다 다음 세대의 속도 증가 순서 (전체 exome 시퀀싱, WES) 코딩의 전체 게놈 ( 전체 게놈 시퀀싱, WGS) 임상 설정에서. 웨스와 WGS 사용 되었습니다 자주 비판적으로 아픈 신생아와 유전 증후군에 대 한 우려와 함께 어린이의 설정에서 어디 그것은 임상 관리1,2를 변경할 수 있습니다 입증 된 진단 도구입니다. 유전 증후군과 관련 된 가능성이 병원 성 변이의 증가 식별을 주도하 고 있다, 하는 동안 그것은 또한 극적으로 덧붙여 발견된 유전 이체, 또는 예기치 않은 긍정적인 결과 알 수 없는 진단의 수를 증가 중요성 (VUS)입니다. 이 이체의 일부는 무시 하 고 보고 되지, 변종에 지역화 하는 동안 잠재적으로 치명적인 또는 매우 병 적인 질병와 관련 된 유전자는 자주 보고. 현재 지침에 부수적 변종 갑자기 심장 죽음 predisposing 질병 cardiomyopathies 등의 개발과 관련 된 유전자를 포함 하 여 환자에 게 의료 혜택의 수 있습니다 특정 유전자에 발견의 보고 하는 것이 좋습니다, channelopathies3. 이 권장 사항은 SCD predisposing 질병의 위험에 개인을 캡처 하도록 설계 되었습니다, 비록 변형 검출의 감도 훨씬 특이성을 초과 합니다. 이 VUSs의 증가에 반영 되 고 덧붙여 불분명 진단 유틸리티까지 주어진된 인구4에 각각 질병의 주파수를 초과 하는 이체를 확인. 같은 하나의 질병, 긴 QT 증후군 (LQTS), 심장 이온 채널을 부호화 하는 유전자를 지역화 하는 돌연변이 의해 발생 하는 정식 심장 channelopathy 또는 단백질, 그 결과 상호 작용 하는 채널 지연 심장 repolarization5. 심전도, 휴식에 장기간된 QT 간격으로 본이 지연된 repolarization torsades de pointes등 잠재적으로 치명적인 심 실 부정맥을 전기 경향에 발생 합니다. 다양 한 유전자 돌연변이 KCNQ1에서이 질병의 개발에 연결 된 동안-난에 인코딩Ks 칼륨 채널 (KCNQ1, Kv7.1) 이며 LQTS 1 형의 원인6아래 예제로 활용 됩니다. 변형 해석에 복잡성을 보여주는, LQTS 관련 유전자, 소위 "배경 유전 변이" 희소 한 이체의 존재는 앞에서 설명한7,8되었습니다.
알려진된 병원 성 이체의 큰 대 요-스타일 데이터베이스, 뿐만 아니라 여러 전략 효과 다른 이체를 생산할 예정 이다 예측에 대 한 존재 합니다. 일부는 선별 등 Polyphen 2, deleteriousness,910예측을 소설 아닌 동의어 이체의 많은 수를 필터링 할 수 있는 알고리즘을 기반으로 합니다. 이러한 도구의 광범위 한 사용에도 불구 하 고 낮은 특이성 "호출" 임상 VUSs11에 관해서 그들의 적용을 제한 합니다. "신호 대 잡음" 분석 문제의 loci에서 알려진된 pathologic 변이의 주파수는 인구에서 희소 한 유전 변이 대 한 정규화에 따라 질병와 관련 된 되 고 variant의 가능성을 식별 하는 도구입니다. 변종 유전자 loci를 지역화 그곳에 높은 신호-잡음, 인구 기반 유사에 비해 질병 관련 돌연변이의 높은 보급은 더 높습니다 스스로를 해야하는 질병 관련. 더, 희귀 한 변종 발견 덧붙여 희귀 인구 이체의 높은 주파수를 가진 유전자에 지역화 질병 관련 된 주파수, 낮은 신호-잡음에 비해, 질병 관련 될 가능성이 있을 수 있습니다. 신호 대 잡음 분석의 진단 유틸리티 cardiomyopathies 및 channelopathies;에 대 한 유전자 검사에 대 한 최신 가이드라인에 그림 되었습니다. 그러나, 그것은 전체 유전자 수준 또는 도메인-특정 레벨12에서 고용만 있다. 최근, 주어진 pathologic 변종은 (질병 데이터베이스, 문학에서 코 호트 연구) 및 인구 기반 제어 변종 (Exome 집계 컨소시엄, ExAC 및 게놈 집계 데이터베이스, GnomAD13)의 증가 가용성 이 단백질의 기본 시퀀스 내에서 개별 아미노산 위치에 적용 되었습니다. 아미노산 수준 신호-잡음 분석 보다는 가능성이 "배경" 유전자 변형으로 LQTS와 관련 된 질병 관련 유전자에 덧붙여 확인 된 변종 분류에 유용한 입증 했다. KCNQ1를 포함 하 여, LQTS와 관련 된 세 가지 주요 유전자 들이 우연히 발견 된 변종 부족 개별 아미노산 위치에이 이체의 주파수 드문 반영 제안 중요 한 신호 대 잡음 비율, 인구 변화 질병 관련 돌연변이 보다는. 또한 때 단백질 도메인 토폴로지 높은 신호 대 잡음, pathologic 돌연변이 단백질14의 주요 기능 도메인으로 "핫스폿"의 영역에 대 한 중첩 되었다. 이 방법론 1) 가능성 variant는 질병 또는 인구 관련 결정 하 고 2) 인간의 질병과 관련 된 단백질의 중요 한 새로운 기능 도메인 식별 약속을 보유 하고있다.

<table><tbody><tr><td>1000 게놈 프로젝트</td><td>N/A</td><td>www.internationalgenome.org</td><td></td></tr><tr><td>ClinVar</td><td>N/A</td><td>www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar</td><td></td></tr><tr><td>Ensembl 게놈 브라우저</td><td>N/A</td><td>uswest.ensembl.org/index.html</td><td></td></tr><tr><td>엑셀</td><td>Microsoft</td><td>office.microsoft.com/excel/</td> <td>모든 예제 수식 및 함수에 사용됨</td></tr><tr><td>Exome Aggregation Consortium& 주의;</td><td>해당 사항 없음</td><td>www.exac.broadinstitute.org</td><td></td></tr><tr><td>게놈 집계 데이터베이스&nbsp;</td><td>N/A</td><td>www.gnomad.broadinstitute.org</td><td></td></tr><tr><td>미국 국립생명공학센터(National Center for Biotechnology) 정보 도메인 및 구조 데이터베이스</td><td>해당 사항</td><td>없음 www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/domains-structures/</td><td></td></tr> <tr><td>국립생명공학정보센터(National Center for Biotechnology Information) 유전자 데이터베이스</td><td>해당 없음</td><td>www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/</td><td></td></tr> <tr><td>미국 국립생명공학정보센터(National Center for Biotechnology Information) 단백질 데이터베이스</td><td>해당</td> <td>없음www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/</td><td></td></tr> <tr><td>National Heart, Lung, and Blood Institute GO 엑솜 염기서열분석 프로젝트</td><td>해당 없음</td><td>www.evs.gs.washington.edu/EVS/</td><td></td></tr> <tr><td>SnapGene</td><td>GSL Biotech LCC</td><td>www.snapgene.com</td><td></td></tr><tr><td>University of California, Santa Cruz Human Genome Browser 해당</td><td>없음</td><td>www.genome.ucsc.edu</td><td></td></tr></tbody></table>

유전 변이의 아미노산 수준 신호-잡음 분석을 사용 하 여 variant pathogenicity의 가능성 확인

Determining the Likelihood of Variant Pathogenicity Using Amino Acid-level Signal-to-Noise Analysis of Genetic Variation

비용 및 다음 세대 유전자 시퀀싱의 속도 발전 임상 전체 exome 및 전체 게놈 테스트의 폭발이 생성. 유전 증후군과 관련 된 가능성이 병원 성 변이의 증가 식별을 주도하 고 있다, 그러나 그것은 또한 극적으로 증가 수 알 수 없는 의미 (VUS)의 유전 이체를 우연히 발견. 이 이체의 임상적 의미를 결정 하는 것은 과학자와 임상에 대 한 주요 도전 이다. Pathogenicity의 가능성을 결정에서 원조 하는 접근 방식을 단백질 시퀀스 레벨에서 신호 대 잡음 분석 이다. 이 프로토콜에서 알려진된 단백질의 높은 가능성과 기본 시퀀스의 영역을 식별 하기 위해 토폴로지를 단백질의 각 아미노산 위치에 변형 주파수를 활용 하 여 아미노산 수준 신호-잡음 분석 하는 방법을 설명 합니다. (상대적인 인구 "배경" 변이) pathologic 변화. 이 메서드는 다음 세대 유전 테스트에 의해 확인 된 그들 같이 VUSs의 진단 무게를 구체화 하는 데 사용할 수 있습니다 높은 pathologic 신호의 아미노산 잔류물 위치 "핫스팟"를 식별할 수 있습니다.

아미노산 수준 신호 잡음 분석을 위한 KCNQ1 대표 결과 그림 6에서 묘사 된다. 이 예제에서는 드문 이체 GnomAD 코 호트 (제어 코 호트)에서 식별 된 덧붙여 식별 웨스 이체 (실험 일대 #1), 그리고 LQTS 케이스 관련 된 변종 간주 가능성이 질병 관련 (실험 일대 #2) 묘사 된다. 또한, 웨스와 LQTS 일대 변형 주파수를 비교 하는 신호 대 잡음 분석 GnomAD 변형 주파수 묘사에 대 한 정규화. LQTS 관련 된 변종 채널 기 공, 선택 필터와 KCNE1 바인딩 도메인에 해당 도메인에서 높은 신호 대 잡음 비율을 설명 했다. 비교에서는, 웨스 코 호트에서 우연히 발견 된 변종 않았다 명확 하 게 설명 하지 이러한 변종 배경 유전 변이 반영 하는 것을 건의 높은 신호-잡음 상승의 특정 지역. 이 예제에서는 변종 MAFs; 위에 언급 된 대로 사용 되지 않았다 그러나, 그것은 보여줍니다 모든 동일한...

아미노산 수준 신호-잡음 분석 주어진 인구의 유전 변이 배경으로 정규화는 주어진된 아미노산 위치에 유전 변이의 보급을 결정 합니다. 이 인구 (잡음)에 희소 한 이체의 주파수 이상으로 상승 하는 단백질 시퀀스 (신호) 내에서 변형 "핫스폿"의 확인에 대 한 수 있습니다.

유전 변이의 아미노산 수준 신호-잡음 분석을 사용 하 여 Variant Pathogenicity의 가능성 확인

Advancements in the cost and speed of next generation genetic sequencing have generated an explosion of clinical whole exome and whole genome testing. ...

아미노산 수준 신호-잡음 분석, 유전 변이체가 질병 상태와 연관되거나 인구 내의 자연 유전 적 변이의 일부일 가능성을 측정합니다. 이 기술은 2개의 큰 유전 자원, 질병 관련 돌연변이, 문헌에서 유효합니다, 또는 희소한 유전 적 분산을 확인하는 인구 기지를 둔 exsome 및 게놈 연구 결과 와 공공 도메인에서 이용합니다. 관심있는 특정 유전자와 스플라이스 이소형태를 식별하려면 Ensembl 홈페이지를 열고 드롭다운 메뉴에서 종을 선택합니다.관심 유전자의 약어를 입력하고 이동을 클릭합니다. 관심 유전자및 전사적 관심에 해당하는 링크와 성적증명서 테이블에서 관심 있는 ID를 선택합니다. 향후 기준을 위해 성적증명서 테이블의 기준 서열 컬럼에서 RNA 전사체 식별 번호의 성적증명서 특이적 RNA 전사 및 단백질 생성물을 유의한다.RNA 전사자 ID 번호의 단백질 생성물과 관련된 링크를 선택하여 국립생명공학정보센터 또는 NCBI 단백질 데이터베이스로부터 새로운 웹페이지를 열고, 원산지 섹션으로 스크롤하여 관심 있는 유전자 성적증명서에 대한 1차 단백질 서열을 얻습니다. 그런 다음 기능 섹션으로 스크롤하여 단백질 특징 목록을 가져옵니다. 제어 변형으로 각 아미노산 위치에 대한 사소한 송내 주파수를 계산하려면 그래프 링 가능한 스프레드시트를 열고 모든 실험 변형의 위치의 열을 만듭니다.변형 텍스트를 제거하여 변형 위치만 남기고 변형을 오름차순 값에 정렬하여 둘 이상의 관련 변형이 있는 위치를 식별합니다. 주어진 위치에 대한 모든 사소한 진상주 주파수의 합을 획득하고, 주어진 위치와 관련된 각 변이체에 대한 사소한 진상분석 주파수를 결합하고, 각 아미노산 위치에 대한 경미한 진열 주파수를 실험이체와 계산한다. 다음으로, 실험적인 변이체가 있는 아미노산 위치의 컬럼을 만들고, 모든 변종 위치에 대해 해당 위치와 관련된 모든 변이체의 사소한 알레일 주파수를 계산한다.실험 및 제어 변이체 모두에 대한 사소한 알레일 주파수의 롤링 평균을 생성하려면 관심 유전자에서 모든 아미노산 위치를 포함하는 컬럼을 만들고, 제어 및 실험 데이터 세트 모두에 대한 변이체가 없는 모든 위치에 대해 0의 사소한 알레일 주파수를 추가한다. 각 실험 및 제어 보급 열에 대한 롤링 평균을 만들려면 제어 및 실험 데이터 세트 모두에 대한 사소한 송계 주파수의 롤링 평균을 나타내는 열을 만들고, 롤링 평균 컬럼에서 각 위치에 대한 5개의 변형 위치 N 단말 및 C 단자에 대한 각각의 사소한 송내 주파수의 평균을 배치한다. 코호트 최소 주파수를 계산하려면 식별된 가장 낮은 사소한 본인을 2개로 나누고 컨트롤 의 사소한 알렐 주파수가 0인 모든 셀에 이 값을 입력합니다.신호 대 잡음 비율을 계산할 때 0으로 구분되지 않습니다. 아미노산 수준 신호 대 잡음 비율을 계산하려면, 각 아미노산 위치 실험 압연 평균을 각각의 제어 압연 평균으로 나누고, 아미노산 위치에 비해 이 비율을 그래프로 분석한다. 기능적 영역 및 기능의 컨센서스 아미노산 위치, 또는 관심 있는 단백질의 번역 후 변형 영역을 식별하려면 단백질 영역 및 기능과 관련된 아미노산 위치를 식별하고 NCBI 웹 페이지를 엽니다.관심 있는 단백질의 RNA 성적증명서의 단백질 생성물을 검색장으로 입력하고, 기능 하에서 알려진 단백질 도메인 및 특징을 식별한다. 도메인 이름 및 유형 및 아미노산 위치를 식별하고 기록하고 관심 있는 1차 서열의 단백질에 영역을 시각화하기 위해 기능에 해당하는 링크를 선택한다. 신호-잡음 열 옆에 컬럼을 만들어 아미노산 위치 열을 참조할 수 있도록 하고 각 도메인 및 피처의 N 또는 C 단말 측면에 대응하는 셀을 식별합니다.그런 다음 각 셀에 하나를 배치하고, y축에 이러한 경계와 x축의 아미노산 위치를 가진 그래프를 만들고 이 그래프를 신호-잡음 그래프로 오버레이한다. 신호 대 잡음 비율 및 단백질 도메인 토폴로지 그래프의 오버레이에 대한 개별 변형 위치를 매핑하려면 열의 행이 열의 행에 해당하고, 아미노산 위치에 해당하며, 각 셀에 각각의 변종을 포함하는 위치에 대응하는 도메인 피처 컬 옆에 컬럼을 생성합니다. 그런 다음 이 열을 x축의 y축 및 아미노산 위치로 그래프를 만들고 이 그래프를 신호-잡음 및 단백질 도메인 토폴로지 그래프와 오버레이합니다.여기서, 칼륨 전압 게이트 채널 서브패밀리 Q 부재에 대한 아미노산 수준의 신호-잡음 분석을 위한 대표적인 결과가 1개의 유전자를 묘사한다. 대조군에서 확인된 희귀 한 분산, 실험 부수적으로 확인된 전체 exsome 시퀀싱, 및 긴 QT 증후군 케이스 관련 된 이체관련 질병 관련 될 가능성이 있는 것으로 간주 된다. 전체 외음 시퀀싱및 긴 QT 증후군 코호트 이체 주파수를 비교하는 신호 대 잡음 분석도 대조군 변이체 주파수에 대해 정규화되어 표현된다.본 실험에서, 긴 QT 증후군 관련 변이체는 채널 부어, 선택성 필터 및 칼륨 전압 게이트 채널 서브패밀리 E 부재 1개의 결합 도메인에 대응하는 도메인에서 높은 신호 대 잡음 비율을 입증하였다. 이에 비해, 전체 exsome 시퀀싱 코호트에서 부수적으로 확인된 변이체는 높은 신호 대 잡음 고도의 특정 영역을 명확하게 보여주지 않았으며, 이러한 변이체가 배경 유전 적 변이를 반영한다는 것을 시사합니다. 이 방법론은 임상 유전 시험 도중 생기는 알려지지 않은 중요성의 이체의 진단 무게를 측정하기 위하여 적용될 수 있었습니다.

determining-likelihood-variant-pathogenicity-using-amino-acid-level

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

유전자 단체는 종종 기능 수준에서 설명할 남아있다. 이 방법은 베꼈는데 SNPs에 대한 heterozygous 세포를 분석하여 유전자 발현에 대한 표현형 - 관련 유전자 마커의 효과를 평가하는 것을 목표로하고있다. 이 기술은 allele 특정 뇌관 확장 제품을 수치 든 - TOF 질량 분석법에 의해 정확한 측정이 가능합니다.

유전자 협회의 기능 기초를 테스트하는 Allele 특정 유전자 발현 분석

현재 문서는 RNA 바이러스 및 조직 문화의 충실도 변경 사항을 확인하는 돌연변이 주파수 데이터를 사용하는의 RNA 중합 효소의 충실도 변종을 분리하고 특징하는 데 필요한 단계를 설명합니다.

바이러스 변이 주파수의 RNA 바이러스 및 특성화의 피델리티 변종의 분리

세포 생물학의 기본적인 탐구는 진핵 세포를 만드는 organelles의 신원을 기초 메커니즘을 정의하는 것입니다. 여기 형광 현미경과 차세대 시퀀싱 도구를 사용하여 식물 organelles의 형태학의 기능적인 무결성에 대한 책임 유전자를 식별하는 방법을 제안합니다.

형광 - 현미경 검사와 차세대 장면 : Organelle 무결성에 관련된 유전자의 식별을위한 유용한 도구

우리는 전사 인자(TF) DNA 결합에 영향을 미치는 비암호화 유전적 변이를 식별하기 위한 전략적 계획과 프로토콜을 제시합니다. 유전자형 의존성 TF DNA 결합의 전기영동 이동성 이동 분석(EMSA) 및 DNA 친화성 침전 분석(DAPA) 분석을 위한 자세한 실험 프로토콜이 제공됩니다.

전기 영동 이동성 분석 (EMSA) 및 Shift 키를 사용하여 기능 비 코딩 유전자 변형에 대한 심사 DNA 화성 강수 분석 (DAPA)

타겟된 다음-세대 시퀀싱 질병 연구 및 임상 진단에서 점점 인기 끌고있다는 시간 및 비용 효율적인 접근 이다. 여기에 설명 된 프로토콜 시퀀싱에 필요한 복잡 한 워크플로 및 질병을 유전 이체를 식별 하는 데 사용 하는 생물 정보학 과정을 제공 합니다.

다음-세대 시퀀싱과 생물 정보학 파이프라인 헌법 질병의 유전 결정 요인 평가 대상

차세대 시퀀싱 (NGS) 플랫폼 (~0.5–2.0%)의 높은 오류 속도 의해 제한 되는 genomic 특성 분석을 위한 강력한 도구입니다. NGS 오류율을 제거 하 고 변형 대립 유전자 분수 0.0001 희귀에서 변이 감지 수 있는 오류 수정 시퀀싱의 우리의 방법을 설명 합니다.

드문 이벤트 감지 오류 수정 DNA와 RNA 시퀀싱을 사용 하 여

여기서, 우리는 많은 인간과 모형 유기체 데이터베이스에 효율적으로 액세스하고 분석하기 위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 차세대 염기서열 분석 노력에서 확인된 후보 질병 유발 변이체를 분석하기 위해 MARRVEL의 사용을 보여줍니다.

인간 유전체학 및 모델 유기체 유전학 정보를 통합하는 웹 기반 도구인 MARRVEL 탐색

이 프로토콜의 목표는 인간 질병과 관련된 희귀 유전자 변이체의 기능적 결과를 평가하기 위해 Drosophila melanogaster에서 생체 내 실험의 설계 및 성능을 설명하는 것입니다.

Drosophila를 사용하여 질병 관련 희소한 인간 이체의 생체 내 기능적인 연구

우리는 유전자 조작 마우스 모델에서 발생하는 종양과 해당 인간 종양 유형에서 발생하는 종양의 치료 표적을 식별하고 비교하기 위해 게놈 분석 및 기능적 게놈 스크리닝을 활용하는 종간 비교 종양유전체학 접근 방식을 개발했습니다.

악성 말초 신경초 종양의 마우스 모델에서 치료 표적을 식별하기 위한 유전자 프로파일링 및 게놈 규모 드롭아웃 스크리닝

이 연구는 DNA에서 단백질 기능 및 신경 행동에 이르는 다중 스케일 프레임워크를 소개합니다. 이 연구는 GABAA 수용체 소단위체에서 예측된 병원성 돌연변이를 조사하기 위한 새로운 접근 방식을 제시하며, 병원성으로 예측되는 간질 유발 돌연변이와 근위 돌연변이가 CA1 피라미드 뉴런 모델에 유사한 효과를 일으킬 수 있다는 가설을 세웁니다.

Identification and Classification of Position-specific GABA A Receptor Subunit Missense Variants for Their Role In Hippocampal Pyramidal Neurons(해마 피라미드 뉴런에서의 역할에 대한 위치별 GABAA 수용체 소단위 미스센스 변이체의 식별 및 분류)

학습하세요 아미노산 수준 신호-잡음 분석을 사용하여 유전 변이의 병원성 가능성을 측정하는 방법을 배우세요. 이 기술은 질병 관련 돌연변이와 인구 기반 유전자 변이 데이터를 활용하여 변이 핫스팟을 식별하고 질병 관련 변이와 자연적 유전적 변이를 구분합니다.

유전 변이의 아미노산 수준 신호-잡음 분석을 사용 하 여 Variant Pathogenicity의 가능성 확인

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