Name: 자발적인 형성 및 바인딩과 그물에 대 한 상향식 모델로 인공 지질 나노튜브 네트워크의 재배치 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-22T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: 학습하세요 인공 지질 나노튜브 네트워크를 이용한 상향식 내소포체 모델 구축 방법을. 이 기법은 단백질 없이 고체 지지 이중 인지질 이중막을 활용하여 세포 내소포체의 동적 조직을 연구하는 데 활용됩니다.

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원고에 대 한 그의 귀중 한 의견에 감사 스웨덴에서 Chalmers 기술 대학에서에서 교수 알도 Jesorka 하 고. 이 작품에서 노르웨이의 연구 협의회 (Forskningsrådet) 프로젝트 그랜트 274433, UiO 얻은 금융 지원을 통해 가능 하 게 되었다: 생명과학 융합 환경, 스웨덴 연구 위원회 (Vetenskapsrådet) 프로젝트 그랜트 2015-04561, 뿐만 아니라 시작 자금 센터 분자 의학 노르웨이 & 교수의 수학 및 자연과학 오슬로의 대학에 의해 제공.

1입니다. 인지질 기 현 탁 액의 준비
참고: 모든 자료에 대 한 언급으로 "깨끗 한"이이 프로토콜에서 철저 하 게 소 프로 파 놀 뒤에 이온된 수로 그들을 씻어과 질소로 그들을 타격 건조. 일반적으로 고체 기판에 지원된 지질 영화에 대 한 준비 프로토콜에 적용 되는 강력한 산화 제 산 성 (피 솔루션)와 함께 유리 기판의 치료 Al2O3에 수행 하지 않도록 주의-코팅 항공사입니다.
<ol><li>깨끗 한 10 mL 라운드 하단 또는 거꾸로 배 모양의 유리 플라스 크에 장소: 간장 L-α phosphatidyl 콜린 (PC, 69 %w / w), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (마약, 30 %w / w), 그리고 지질 활용 fluorophore의 선택 [예를 들어, 텍사스 레드 1, 2- dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine triethylammonium 소금 (TR-DHPE, 1 %w / w)]에서 클로 프롬. 대 한 지질 10 mg/mL의 최종 농도에 따른 클로 프롬의 300 µ L에서의 µ g 3000의 총 양. 참고: 청소, 유리, 소계 plungers 때 클로 프롬을 포함 하는 화합물을 처리와 함께 가스 꽉 주사기 사용 합니다. 주의: 클로 프롬 독성과 높은 휘발성 이며 항상 관련된 개인 보호 장비와 증기 두건에서 처리 해야 합니다.</li>
	<li>로터리 증발, 45 °의 기울기와 위치에 플라스 크를 연결 하 고 천천히 감소 된 공기 압력을 가진 6 h 23 ° C에서 물 욕조 안에 24 rpm 회전 완전히 제거 하는 클로 프롬. 그것은 20 kPa (150 하루, 80% 진공)에 도달할 때까지 20 kPa 마다 2 분의 단계에 의해 회전을 시작한 후 압력 오른쪽 감소 시작. 참고: 준비 선박에서 균일 한 두께의 균질 성 지질 필름 형성은 rotavap 절차에 대 한 가장 중요 한 요구 사항. 지질 준비는 회전 속도, 급속 한 압력 변화와 최종 압력 값; 따라서, 엄격 하 게 최종 압력 및 회전 속도 뿐만 아니라 느린 감소 단계 따릅니다. 탈수 지질 케이크 플라스 크의 벽에는 영화로 균등 하 게 형성 되도록 45 °의 기울기로 플라스 크를 배치 합니다. 너무 빨리 회전의 소란 하 고 너무 느린 회전의 리드 (때문에 중력) 플라스 크의 바닥에 액체의 두꺼운 층의 축적에 지도 한다. 프로세스는 매우 동 질 지질 붓기 후속 하룻밤 동안 질량 최종 쥡니다 단계에 잘 반응 하지 않는 생산 되며 결과 분수 다른 작곡의. 압력 및 메서드에 지정 된 범위 내의 시간 느린 desolvation을 보장 합니다. 용 매로 서 클로 프롬와 너무 압력에 있는 하락의 급속 한 증가 점도 및 집계 및 고르지 못한 영화 형성의 결과로 혼합물을 아래로 냉각 한다. 6 h의 오랜 기간 재 시 지질 소재에 유기 용 매 파티션으로 가능한 최고의 범위에 용 매를 제거 하려면 것이 좋습니다.</li>
	<li>6 h 후 회전을 중지 하 고 20 kPa 100 kPa에 도달할 때까지 2 분 마다의 단계에 의해 다시, 점차적으로, 공기 압력을 증가. 로터리 증발 기에서 플라스 크를 제거 하 고 PBS의 3 mL 및 글리세롤의 30 µ L 추가. 부드럽게 글 리세 린을 해산 하기 위해 플라스 크를 소용돌이 친다. 지질을 포함 하는 플라스 크를 밀봉 밀폐 유리 스 토퍼를 사용 합니다. 참고:는 글리세롤 지질 영화의 완전 한 탈수를 방지 하는 데 사용 하 고 bilayer 분리12를 수 있습니다. 그것은 화합물의 처리를 용이 하 게 그것의 점성을 감소를 사용 하기 전에가 열 한다. 따뜻하게 글리세롤은 여전히 즉시 PBS 버퍼와 혼합 됩니다. 부드러운 소용돌이 글리세롤 완전히 해산 될 때까지 필요 합니다.</li>
	<li>재에 대 한 숙박 및 지질 영화의 붓기 4 ° C에서 냉장고에 플라스 크를 저장 합니다.</li>
	<li>다음 날, 유니폼, 약간 탁 한 지질 정지 달성까지 실내 온도 (RT, ~ 21 ° C)와 35 kHz 주파수 초음파 물 목욕으로 지질을 sonicate. 참고: 쥡니다 주위 걸릴 수 있습니다 10-30 s. 장기간된 쥡니다 (~ 1 분) 열을 생산 하 고 소포 형성에 해롭습니다.</li>
	<li>단계 1.1-1.5 수익률 두 유형의 나노미터 구조를 포함 하는 서 스 펜 션: multilamellar 소포 (MLV)와 거 대 한 unilamellar 소포 (우두머리) (그림 1A-1 층).</li>
	<li>저장용, 지질 정지 30 microcentrifuge 튜브의 총을 사용 하 여 100 µ L aliquots에 분열과-20 ° c.에 냉동 실에 보관 참고: 액체 질소로 냉동 플래시는 없습니다 필요 하 고 저장 하기 전에 사용 되지 않습니다. 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다. 원인은 지질 세포의 용 해 시간 연장에 대 한 지질 정지 4 ℃ 냉장고에서 떠나, 어떤 막 구성을 영향을 줍니다.</li>
</ol>2입니다. 기판의 준비
참고: 다음 프로토콜 ISO 14644-1 표준 규격에서 ISO 8로 분류 하는 클린 룸에서 수행 됩니다. 원자 층 증 착 (ALD) 알루미늄2O3 기판 조작 하는 데 사용 됩니다. 지정 된 프로세스 매개 변수는 악기 및 장비의 서로 다른 모델 사이 다를 수 있습니다. 그들은 개발 과정 초기 매개 변수로 사용할 수 있습니다.
<ol><li>ALD 반응 기의 온도 200 ° c.를 설정</li>
	<li>나중을 기준 면으로 증 착의 두께 결정 하에 의해 사용 됩니다 ellipsometry 실리콘 웨이퍼와 함께 샘플 챔버에 유리 표면 (예를 들어, 유리 coverslips)를 로드 합니다. 참고: 유리 기판 사용된 아웃-의-더-박스 했다 및 증 착 하기 전에 용 매 청소 했다. 그들은 입자를 제거 하는 질소 가스와 함께 플러시됩니다만 했다.</li>
	<li>400 로드 챔버를 철수 Pa (3 torr) 주요 반응 챔버로 샘플을 전송 하 고 200 철수 아빠 참고: 반응 기의 온도 200 ° C 적절 한 증 착에서 유지 되어야 합니다. 온도 동요 후 샘플 로드는 증 착을 시작 하기 전에 equilibrated 따라서 해야 합니다 약 실 압력을 어떤 선구자 챔버 외부 확산을 피하기 위해 원자로 압력 보다 높은 것으로 설정 됩니다.</li>
	<li>원자 필름을 입금을 시작 합니다. 150 ms 펄스 유통 알루미늄 노출, 1 s 퍼지 그리고 그 후, 1 s 제거 다음 200 ms의 H2O 노출 뒤 1 사이클에 의하여 이루어져 있다. 참고: 실과 반응 기 압력을 포함 한 모든 설정, 주기, 및 제거의 길이 자동 증 착의 정의 된 속도 달성 하기 위해. 이 매개 변수는 장비의 다양 한 모델 중에서 달라질 수 있습니다. 미리 구성 된 조리법 자주 공급 업체 또는 도구 클린 룸에 책임에 의해 준비 하 고 시간 단위 당 예금 된 필름 간격으로 사용자에 게 전달.</li>
	<li>10에 도달 100 사이클 과정을 반복 하는 기판에 Al2O3 의 nm. 사이클의 수는 다른 조리법 또는 장비 마다 다를 수 있는 증 착 속도에 따라 달라 집니다.</li>
	<li>원자로에서 샘플을 제거 하려면 첫 번째 환기 챔버의 압력이 대기 압력에 도달할 때까지 예제를 제거 합니다.</li>
	<li>RT에 공기가 꽉 컨테이너 사용까지 샘플을 저장 합니다. 참고: 더 이상 청소 사용 하기 전에 것이 좋습니다. 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다. 참고: 샘플 이상적으로 증 착 후 즉시 사용 해야 합니다. 최적의 스토리지 폴 리 프로필 렌 웨이퍼 캐리어, 질소-플러시되어야 진공 씰링 전에 클린 룸 호환 비닐 봉지에 운반대를 뒤 덮 었 다음 내부 표면에 위치 해야 합니다. 목적은 부담 공기 오염 물질에 표면 노출 방지 하는 것입니다. 필요한 경우 5 일에 대 한 표면 최대 RT에 공기가 꽉 용기에 보관 수 있습니다. 더 이상 저장 하지는 것이 좋습니다. 사용자를 하거나 하지 않는, 클린 룸에 쉽게 액세스할 및 구매 해외에서 서피스를 얻기 위해, 다시는 기판 산소 플라즈마 또는 오존 처리에 의해 산화 하는 것은 대안 솔루션13있을 수 있습니다.</li>
</ol>3. 분자 인지질 영화 관 네트워크의 변화
<ol><li>지질 정지를 해 동 하 고 깨끗 한 유리 현미경 슬라이드/coverslip에 서 스 펜 션의 4 µ L 작은 물방울 전송.</li>
	<li>20 분에 대 한 방울만 드롭릿에 지질 평면 원형 필름으로 건조, 후 눈에 보이지는 붕괴 됩니다.</li>
	<li>HEPES 버퍼의 1 mL와 함께 지질 영화 rehydrate ( 재료의 표참조) 3 분. 참고: rehydration 버퍼의 볼륨 이후에 관찰 실로 전송 소포 정지 (소포 단위 부피 당 수)의 밀도를 영향을 줍니다. 관측 실과 원하는 기 밀도의 볼륨에 따라 재 볼륨은 0.5-1에 조정 될 수 있다 mL. 깨끗 한 붕 슬라이드 최대 몇 백 microliters의 방울을 지원 해 경향이 문제 없이 1.5 mL. 이후는 coverslip 이동할 필요는 없습니다,이 기술적인 문제에 연결 되지 않습니다. 수-8 폴리머-코팅 슬라이드, 같은 더 소수 성 표면에도 1.5 mL 입금된12될 수 있습니다. 참고: 지질 수 갓 준비 한다, RT에서 20 분 이상 rehydrated 지질 영화 노출 버퍼의 증발 및 이전 rehydrated 소포, 제대로 하는 리드 정의 구성의 부분 탈수를 리드.</li>
	<li>관측 실 준비: 버퍼 교환 하는 데 필요한 응급실 변환 시작, 자동 피 펫을 사용 하 여 허용 하는 오픈 탑으로 관찰 챔버를 사용 되었다. 입니다 (PDMS) 프레임 크기 1.5 x 1.5 x 0.5 c m, 알루미늄2O3 입금 coverslip에 준수와 함께이 약 실에 의하여 이루어져 있다. 탑재 된 관측 챔버의 구조는 그림 1G에 표시 됩니다. 다음 단계는 PDMS 프레임을 조작 하 여 관찰 챔버 조립 수행 했다:<ol>
<li>100 mL의 얼음 목욕에서 비 커에 소 프로 파 놀과 코의 100 g을 혼합 하 여 코 솔루션을 준비 합니다. 10 h 이상는 코 자력과 자기 저 어 접시를 사용 하 여 완전히 해산 될 때까지 저 어. 주의: 코 솔루션 부식성 이며 피부 화상, 그래서 항상 적절 한 개인 보호 장비와 처리 발생할 수 있습니다. 참고: 소 프로 파 놀 코의 용 해도 물으로 높은. 해산 발열 이다입니다. 연속 교 반 용 해 전에 코 펠 릿을 분쇄 하는 것이 좋습니다.</li>
		<li>잠수함 유리 페 트리 접시 (d = 6 m) RT와 계속 코 솔루션에 하룻밤.</li>
		<li>다음 날, 솔루션에서 유리 접시를 제거, 5 분에 대 한 이온된 수와 컨테이너에 담가, 물으로 여러 번 씻어 그리고 안으로 배치 건조 오븐 1 h. 타격 80 ° C에서 그 부분을 보장 하기 위해 질소의 흐름과 함께 짧게 표면 icles 제거 됩니다.</li>
		<li>표면 passivate 및 PDMS 결합 방지, 가중치 보트 같은 깨끗 한 플라스틱 용기에 사용 플라스틱 주사기와 dimethyldichlorosilane의 200 µ L을 전송.</li>
		<li>1 시간에 대 한 실 란과 페 트리 접시 유리는 대피 desiccator (낮은 진공, ~ 20 kPa)에 저장 합니다. 주의: Dimethyldichlorosilane 독성 이며 항상 관련된 개인 보호 장비와 증기 두건에서 처리 해야 합니다.</li>
		<li>사라지고 나머지 dimethyldichlorosilane 증기에서 페 트리 접시를 수집 하기 전에 15 분 기다립니다. 페 트리 접시는 지금 silanized, 그리고 표면 소수 이다. 참고:이 단계의 성공 테스트 하는 빠른 방법은 silanized 페 트리 접시에 물방울을 배치 하는. 표면과 물방울의 접촉 각은 눈에 띄게 치료 유리에 비해 증가 해야 한다.</li>
		<li>250 mL 플라스틱 용기 (투명 플라스틱 컵 패키지에서 신선한), 실리콘 탄성 중합체 경화제 (10:1)의 1 g 10 g 기본 실리콘 탄성 중합체의 혼합. 플라스틱 교 반기/플라스틱 주걱을 사용 하 여 5 분 동안 저 어. 참고: 기포 교 반, 따라 형성 되 고 있는 PDMS 창백한 흰색을 볼 것 이다.</li>
		<li>모든 확장 공기 거품 붕괴 때까지 < 20 kPa에 드 혼합물만 (높은 진공 가속 과정). Silanized 페 트리 접시에 degassed 혼합물을 부 어.</li>
		<li>65 ° c 오븐에서 2 시간에 대 한 치료. 참고: 그것은 > 95 ° c 온도 증가 시켜 경화 속도 두 배로 증가 경화 온도 재료의 강성 증가 발생합니다.</li>
		<li>Rt 치료 PDMS 가득 페 트리 접시 아래로 냉각 하 고 주걱으로 PDMS 슬 래 브를 제거.</li>
		<li>메스, 잘라 프레임 크기 및 형상으로 현미경 단계에서 사용 가능한 개방에 대 한 적절 한. 1.5 (길이) x 1.5 x 0.5 (높이) cm (폭)의 크기는 대부분의 설정에 적합 합니다.</li>
		<li>부드러운 측면 (페 트리 접시 접촉 했다 밑바닥 측)를가지고 PDMS의 표면의 적극적인 측면에 접촉으로 Al2O3 영화 있는 프레임과 부드럽게 프레임을 밀어 하 고 서로 대 한 표면에 압력을 적용 하 게 준수. 참고: PDMS 구조 및 Al2O3 기판 사이의 접착은 약 합니다. 연락처 인터페이스에서 공기 방울의 존재는 드 첨부 파일 및, 따라서, 버퍼 및 관련된 내용을 누설 될 수 있습니다. PDMS 프레임 사용 그것은 소 프로 파 놀, 씻어 서 다음에 디 물으로 헹 구 고 질소로 타격은-건조 직후 고 각 하기 전에 여러 번 사용할 수 있습니다. Silanized 페 트리 접시 또한 다시 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>캘리포니아2 +-HEPES 버퍼에 채워 관찰 챔버 ( 재료의 표참조). 참고: 표면 즉시 패키지를 개봉한 후 사용 해야 합니다. 공기 접촉 표면 활동을 점차적으로 감소 하는 오염 물질의 흡착 이끌어 낸다. 챔버 조립 후 즉시 버퍼 가득 해야 합니다. 후속 단계에서 rehydrated 지질의 추가 수 있도록 전체 챔버 볼륨을 채우지 않습니다.</li>
	<li>Confocal 현미경 스테이지에 챔버를 놓습니다. 전송 rehydrated 지질 소재, 플라스틱 피 펫 파스퇴르 (그림 1A-1 G) 상공에 거 대 한 소포를 포함 하는 정지 지금.</li>
	<li>기판에 준수 하 고 (그림 1H 1J) 표면에 걸쳐 확산 소포를 10-20 분을 기다립니다. 참고: 퍼지기의 표면에 지질 증 착 후 즉시 시작 됩니다. 확산의 속도 수 있습니다 약간 따라 지질 구성, Al2O3 증 착 기술 (ADL, RF 스퍼터 링, 화학 기상 증 착, 등.), 고 기판, divalent 양이온 농도의 신선도 버퍼입니다. 14패치는 확산의 파열 하기 전에 버퍼 exchange 수행 됩니다 확인 합니다.</li>
	<li>관찰 후 여러 지질 스프레드, 천천히 제거 자동 피 펫을 통해 주변 버퍼 같은 얇은 버퍼 영화 바닥에 남아 있다. 참고: 버퍼의 급속 한 제거 perturbs 표면에 지질 구조.</li>
	<li>천천히 chelator HEPES 버퍼 관찰 챔버를 작성 하 여 주변 버퍼 교환 진행 ( 재료의 표참조)는 자동 피 펫 (그림 1K)를 사용 하 여. 참고: 버퍼의 갑작스러운 추가 perturbs 표면에 지질 구조.</li>
	<li>이 마지막 단계는 chelator 유도 depinning 고 철회 MLV4 (그림 1L-1 년)에 DLBM의 결과로 형성 된 동적 nanotubular 네트워크를 생성 합니다.</li>
</ol>4. 현미경 관찰
<ol><li>595에서 텍사스 레드 DHPE 자극 화이트 라이트 레이저 소스는 거꾸로 레이저 confocal 현미경 400 Hz. 고용의 스캐닝 주파수와 오일 (1.3 없음) 침수 목표 X 40을 사용 하 여 스캔 이미지를 취득 nm. 700 605에서 방출 수집 nm 하이브리드 광자 검출기를 사용 하 여. 참고: 또는, 피 형광 현미경 사용할 수 있습니다 이미징. 사용할 수 있는 가벼운 소스에 따라 적절 한 지질 염색 공액을 선택 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

다음 토론에서 중요 한 단계, 가능한 수정 및 프로토콜의 제한 사항을 설명 합니다. 첫 번째 중요 한 단계는 Al2O3 표면에 PDMS 프레임의 접착은 본질적으로 약한 관찰 챔버의 적절 한 어셈블리입니다. 어디 프레임 준수 하지 않는 기판에 제대로 하는 경우, 콘텐츠는 관찰 실에서 누출 됩니다 하 고 실험 중단 올 것 이다. 적절 한 방해 하는 주요 요인 1) (재사용된) PDMS 프레임의 철저 한 청소의 부족 이며 2) 가끔 프레임와 기판 사이의 갇힌 얻을 거품 공기 표면와 프레임의 씰링. 새로 준비 나 철저 하 게 청소 PDMS 프레임을 사용 해야 합니다. 프레임 전과 소 프로 파 놀, 디 물으로 rinsing 및 질소로 타격은-건조와 각 사용 후 씻어 서 해야 합니다. Al2O3 표면 필요 하지 않습니다 어떤 사전 청소 이후 클린 룸 환경에서 조립 되며 사용까지 밀폐 용기에 보관. Al2O3의 amphoteric 특성, 그것은 강하게 산 성 또는 기본적인 솔루션에 노출 한다. 관측 실에 대 한 다른 디자인 개별 설정의 접근에 따라 사용할 수 있습니다. 이 챔버의 중요 한 기능 오픈 탑 사용된 솔루션 및 샘플 구조 물자의 inertness에서 액체 샘플 무료 있습니다. 챔버 크기는 또한 중요 한 요인으로 그들은 1 mL에 0.5에서 볼륨을 수용 한다. 사용 하는 표면 일반적으로 표준 크기 coverslips (24 x 60 m m) 이기 때문에, 챔버의 볼륨 프레임의 두께 의해 주로 결정 됩니다. 우리의 지식, 일반적으로이 프로토콜에서 처리 하는 샘플 볼륨을 수용할 수 있는 깊이와 크기 스페이서 상업적으로 사용할 수 있습니다. 우리는 제조의 세부 사항 및 샘플 챔버 프레임의 어셈블리에 따라서 프로토콜에서 섹션을 전담 했다.
이 프로토콜에서 다른 중요 한 단계는 버퍼 교환 이다. 이 단계에서 과제 수행이 교환 하는 데 필요한 타이밍 이다. Al2O3 기판와 접촉 시 MLV의 확산은 즉시, 그리고는 DLBM의 연속 확장 (그림 2A, B) 실험을 종료의 파열, 리드. 따라서, 확산 한다 지속적으로 모니터링, 그리고 버퍼 교환 적시에 수행 해야 합니다. 교환 하지 확산, 막 패치는 최적의 크기 (직경에 있는 100-200 µ m)에 도달 할 수 있도록의 초기화 후 너무 빨리 수행 되어야 한다. 다른 한편으로, 지속적인 접착 표면에 높은 막 긴장 파열에 이르게 발생 합니다. 따라서, 모든 막 패치 결국 파열 경우 확산을 중단 되지 않습니다. 파열의 타이밍 각 패치 이후 거기에 크기와는 MLV의 내부 구조와 지질의 접근에 따라 다릅니다. 따라서, 교류의 순간은 최적의 크기와 유엔 파열 패치 전체 인구의 대다수를 대표 한 timepoint에 배열 되어야 한다. 버퍼 교환 단계에서 또 다른 도전을 제거의 속도 버퍼의 추가 이다. 너무 급속 하 게이 대체를 수행 하는 것은 최종 막 구조 (그림 2C-E)에 해로운 영향. 캘리포니아2 +-HEPES 버퍼의 기판에 박막 액체를 떠나지 않고 과도 한 추출 말리 고 irreversibly 변형 막 패치 (그림 2C)에서 발생 합니다. 적절 한 양의 액체 표면에 유지 하는 경우에 Chelator HEPES 버퍼의 갑작스러운 추가 막 구조의 섭 동을 발생 합니다. 그림 2 D,E hydrodynamically 방해 막 패치의 전형적인 모습을 보여줍니다. 전반적인 형태학 중단 최종 구조 (즉, 나머지 지역에 관 재배열 여전히 발생)의 동적 속성의 영향을 반드시 줄 하지 않습니다. 그러나, 그것은 변형된 구조에 소재 변화를 관찰 하기 어려운 될 것입니다. 예를 들어 그림 2D, 그것은 어려울 것 이다 MLV는 DLBM 버릴 수 있는 쪽으로 방향을 결정 하.
프로토콜의 한 가능한 수정 사용 지질 구성입니다. 주요 초점은 포유류에서 응급실 구성 지배 하 고 효 모16 인지질에 왔다 (e. g., phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamine (PE) 및 phosphatidylinositol (PI). 원래 실험 PC와 PI 혼합물4를 사용 하 여 수행 했다. 제시 결과에서 PC와 진한 액체의 혼합물 및 PE의 파생 사용 되었다. 그러나, 모든 임의의 지질 작곡이이 프로토콜을 통해 얻은 관 구조를 만들 발견 되었습니다. 몇 가지 다른 실험적 조사 지질 혼합물 포함 총 심장 추출, 극 지 간장 콩 추출 물, 대장균 추출 북극, 다양 한 비율에서 stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoinositol (Lyso-PI)와 PC의 혼합물 및 혼합물 다양 한 비율에서 PE, PC, Posphatidyl, PI 떠들고 (PS)의 관 막 구조 높은 곡률을가지고 있기 때문에 필요한 개별 지질 분자의 특별 한 배열, 관찰 된 현상 지질 구성 관련은 예상 된다.
다른 수정이이 프로토콜에 적용 되는 표면 제작 방법입니다. 여기, Al2O3 코팅 coverslips를 조작 하는 ALD 사용 되었다. 이 원래 보고 된 증 착 방법, 반응성 스퍼터 링4에서 다릅니다. 이 나타냅니다 다른 표면 제작 방법 ER 같은 tubulation 여전히 발생할 수 있습니다, 한 가지 중요 한 제한 표면 소재의 특이성 나타납니다. 확산의 모드와의 접착 강도 높은 정전기 상호 작용, 습윤, hydrophobicity, 및 표면 거칠기 등의 요인에 영향을 미치는 표면 재료의 특성에 의존 합니다. Al2O3 표면 제공 최적의 접착 강도, 그리고 지질 영화 둘 다에 연결할 수 있는 충분히 강하게 이중 지질 bilayer 막으로 확산 및 캘리포니아2 + 이온의 제거에 따라 양식 관 네트워크를 분리. 우리는 이전 SiO2, multilamellar 소포 이중 지질 bilayer 막으로 확산 하지만 전혀 관 네트워크 형성 chelators17의 추가 따라 관찰 되었다와 같은 실험 테스트. Al2O3 에 드 첨부 파일 및 관 형성 관찰 된다 또는 플라즈마 에칭 알18. 우리의 조사 기여 매개 변수 같은 현상이 이어지는 제타는 공개는 알 한 알2O3 0 (mV) 가까이 했다 표면의 잠재력 및 SiO2 크게 부정적인. 붕 규 산의 zeta 잠재력 SiO219;와 비슷합니다. 따라서, 붕 규 산에 지질 필름의 접착은 동등 하 게 강력 하 고 돌이킬 수 없는. 사실, 붕 규 산 표면 multilamellar 지질 저수지 접촉 즉시 파열 및 단일 지질 bilayers20의 형성에 일반적으로 지도 한다. 이 프로토콜에 필요한 알루미늄2O3 표면 쉽게 또는 상업적으로 사용할 수 있습니다. 그러나 그들은,, 수 특수 유리 기판 제조 업체에서 사용자 지정 정렬. 박막 제조 장비와 클린 룸 시설 매우는 것이 좋습니다.
ER 같은 관 네트워크2,10 조작 하 다른 기존의 상향식 방법 포함 단백질 뿐만 아니라 화학 에너지의 입력 (예., GTP와 ATP). Rapoport와 동료2 인지질와 GTP 응급실에 구 부리는 막 단백질을 혼합 하 여 유리 coverslips에서 시험관에 에 ER 네트워크의 형성을 보도 했다. 작품 Bachand 외. 10 같은 동적 관 네트워크 분자 모터와 ATP 에너지 원으로 사용 하 여 만들 수 있습니다 방법을 보여 줍니다. 이 프로토콜 제시 에너지에 대 한 막 단백질 이나 유기 화합물의 가수분해 필요 하지 않습니다. 꼭 필요한 구성 요소는 고체 기질과는 인지질. 정화 및 단백질의 추출 필요 하지 않습니다. 이 프로토콜을 제공 합니다, 단순 구성 분자의 관점에서 가장 기본적인 ER 모델을.
이 기본, 지질 기반 ER 모델 설립, 응급실 관련 구성 요소를 추가 하 여 복잡도를 건물은 관심, 이후 시스템에서 개별 영향의 조사 수 있습니다. 실제 응급실 네트워크와 마찬가지로, 튜브 모델에서은 동적입니다. 레이블이 지정 된 막 단백질, 또는 관 네트워크를 통해 형광 입자의 마이그레이션 및 활용을 막 운동의 방향에 대 한 정보를 제공할 수 있습니다. 캡슐화 및 변환 및 intratubular 콘텐츠 전송의 가능한 매핑 동안 DLBM 및 튜브 형광 액체의 모니터링 다른 초점으로 봉사 할지도 모른다. 마지막으로, 3 차원 매끄러운 ER 모형으로이 프로토콜에서 발생 하는 2D ER 모델에서 히드로 아키텍처 네트워크의 캡슐화를 통해 채택 될 수 있습니다.

ER는 단백질 폴딩, 지질 합성, 그리고 칼슘 규정1,2를 포함 하 여 생물 세포에 중요 한 작업을 수행 합니다. ER 형태학은 그것을 수행 하는 기능을 내장. 그것은 결합 평면 스택 및 조밀한 동적 관 도메인을 지속적으로 골격과 상호 작용 하 고 지속적인 운동 및 재배치를 받 다. 일부 응급실 구조 받을 리 모델링의 평면 시트 튜브, 소포 형성에서 또는 응급실 루멘, 기존의 튜브, 튜브 철회, 퓨전, 그리고 파손3의 신장에 퓨전 사이 연속 변환을 포함 합니다. 관 네트워크의 독특한 구조는 정력적으로 호의 베푸는. 경로 및 메커니즘은 응급실 생성 하 고이 조직 뿐만이 그것의 기능에 관한 방법 이다 유지 하지 아직 완전히4,5이해.
응급실 오작동 항상성 상태로 잃을 때 ER 스트레스, 단백질 합성, misfolded 단백질의 축적의 증가 또는 캘리포니아2 + 그리고 산화 균형의 변화에 의해 발생 하는 조건에서에서 결과로 알려져 있다. 어 스트레스 차례로 하면 변형, 세포 기관이의 자연 형태의 구체적으로 방해 하는 네트워크 조직6,7. 응답으로, 셀 항상성 상태로 돌아가려면 복구 메커니즘을 활성화 합니다. 복구에 실패 응급실 유도 세포 apoptosis,7알 츠 하이 머 병, 2 형 당뇨병, 파 킨 슨 병, 루 경화 증, 그리고 여러 다른 등 여러 대사 및 퇴행 성 질환에 기여, 이어질 수 있습니다. 8. 현재 연구 대상 관 ER 네트워크의 조직 그리고 여러 연구2 체 외에서응급실을 재구성에 초점을 맞추고 있습니다. 몇 가지 기존 모델2,,910 단백질을 시작 하 고 고 막 곡률3,11 을 유지 하 고 세포 기관이 그것의 모양에 도달 도움이 필요. 명확 하 게, 응급실의 주요 구조 및 조직 기능 중 일부를 거울 및 고급 실험 연구에 대 한 액세스를 제공 하는 모델 시스템은 큰 수요에 있다.
우리는 현재 여기는 ER 모델 에너지 무료, 동적 생체 외에서 손쉬운, 단백질/화학의 준비에 대 한 절차 응급실 형태학 및 관련된 기능4를 공부 하는 기본 플랫폼을 제공 하. 이 방법에서는 ER 모델은 상향식 접근을 사용 하는 추가 복잡성을 관심의 분자 통합 수 있습니다만 몇 가지 요소를 사용 하 여 조작. 네트워크는 ER 구조와 역동성을 나타냅니다. 또한, 평면 막과 튜브 사이 가역 변환, 튜브, 튜브 퓨전, 슬라이딩 및 철회에서 소포 형성 모두 관찰할 수 있습니다. 불완전 하 게 이해 셀룰러 응급실에 대 한 상향식 모델로 봉사, 이외에 지질으로이 프로토콜에서 설명 하는 나노튜브 네트워크 연구원 nanofluidics, 단일 분자와 콜 로이드 자기 조립, 공부에 대 한 적용 가능할 수 있다 전송 현상, 연수 흐름, 및 기타 관련 분야. 단 분자 빌딩 블록 우리의 방법에 사용 되는 인지질입니다. 프로토콜 작은 실험실 작업 및 기본 장비 이며의 추가 요소에 액세스할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>배 모양 플라스크 10 mL</td><td>Lenz Laborglasinstrumente</td><td>3.0314.13&nbsp;</td><td>지질 혼합물이 제조되는</td></tr> 곳<tr><td>Hamilton 5 mL 유리 주사기 (P/N)</td><td>Hamilton</td><td>P/N81520</td><td>클로로포름을 비커로 옮기기 위해</td></tr><tr><td>맞춤형 대형 허브 바늘 게이지 22 S</td><td>Hamilton</td><td>7748-18</td><td>3행에 지정된 주사기용 탈착식 바늘</td></tr><tr><td>Hamilton 250 &micro; L 유리 주사기</td><td>Hamilton</td><td>7639-01</td><td>클로로포름의 지질을 플라스크로 전송하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>대형 허브 게이지 22 S</td><td>Hamilton</td><td>7780-03</td><td>주사기용 제거 가능한 바늘 지정&nbsp; 5행에</td></tr><tr><td>Hamilton 50 &micro; L 유리 주사기</td><td>Hamilton</td><td>7637-01</td><td>플루오로폼 접합 지질을 플라스크로 옮기는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>작은 허브 게이지 22 S</td><td>Hamilton</td><td>7770-01</td><td>7열에 지정된 주사기용 탈착식 바늘</td></tr><tr><td>클로로포름 무수 (&ge; 99%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>288306</td><td>총 300 &마이크로에 지질 혼합물을 완료하기 위하여 이용해; L</td></tr><tr><td>콩 L-&알파; 포스파티딜 콜린 지질(대두 PC)</td><td>Avanti Polar Lipids Inc</td><td>441601</td><td>총 조성/혼합물의 69%에 기여하는 인지질 종</td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE)</td><td>Avanti Polar Lipids Inc</td><td>850725</td><td>지질 조성/혼합물 L-&alpha의 30%에 기여하는 인지질 종</td></tr><tr><td>; 포스파티딜 이노시톨 지질(대두 PI)</td><td>Avanti Polar Lipids Inc</td><td>840044</td><td>지질 조성/혼합물의 30%에 기여하는 변성 인지질 종(원문 기사 Bilal and G&ouml; zen, Biomaterials Science, 2017)</td></tr><tr><td>Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine,triethylammonium salt (Texas Red DHPE)</td><td>Invitrogen (Thermo Fisher Scientific)</td><td>T1395MP</td><td>Fluorescent-lipid conjugate, 1% of the lipid composition/mixture</td></tr><tr><td>Digital Dry Baths/Block Heaters</td><td>Thermo Fischer</td><td>88870006</td><td>점도를 낮추기 위해 글리세롤을 데우기 위해</td></tr><tr><td>분자생물학을 위한 글리세롤( &지; 99%)</td><td>Sigma Life Science</td><td>G5516</td><td>지질 제제용</td></tr><tr><td><강한>PBS 완충액&nbsp; (pH=7.8); 아래 성분은 17-21 줄에 있습니다 < / 강></td><td></td><td></td> <td>지질 현탁액을 준비하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>TRIZMA 염기, 1차 표준물질 및 완충액(&ge; 99%)</td><td>Sigma Life Science</td><td>T1503</td><td>PBS 완충액</td></tr><tr><td>Potassium phosphate tribasic, 시약 등급(&ge; 98%) (K3PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5629</td><td>PBS 완충 성분</td></tr><tr><td>황산마그네슘 헵타하이드레이트, BioUltra (&ge; 99,5%) KT(MgSO47H2O)</td><td>Sigma Life Science</td><td>63138</td><td>PBS 완충 성분</td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기성, 무수, 자유 유동, Redi-Dri, ACS(KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795488</td><td>PBS 완충 성분</td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산, 이나트륨염 이수화물 ACS 시약, 99.0-101.0 % (Na2EDTA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td>PBS 및 Chelator-HEPES 완충 성분</td></tr><tr><td>초음파 세척기 USC-TH</td><td>VWR</td><td>142-0084</td><td>수화 지질의 초음파 처리</td></tr><tr><td>회전 증발기&nbsp; -&nbsp; B&uuml; chi 회전 증발기 모델 R-200&nbsp;</td><td>시그마</td><td>Z626797&nbsp;</td><td>클로로포름의 증발을 위해</td></tr><tr><td>압력계 - 진공 조절기 IRV-100</td><td>SMC</td><td>IRV10/20</td><td>지질 탈수 중 압력 값 제어</td></tr><tr><td>용HEPES-buffer (pH=7.8); 아래 26-27열 성분</td><td></td><td></td><td>지질 재수화에 사용됩니다. 내용: 초순수 탈이온수에 희석된 100m NaCl이 포함된 10mM HEPES</td></tr><tr><td>&nbsp; 헤페스 &ge; 99.5% (적정)</td><td>Sigma Life Science</td><td>H3375</td><td>HEPES 완충액</td></tr><tr><td>성분 분자생물학용 염화나트륨, DNase, RNase 및 프로테아제, 검출되지 않음, &ge; 98% (적정) (NaCl)</td><td>Sigma Life Science</td><td>S3014</td><td>HEPES 완충 성분</td></tr><tr><td><강>칼슘-HEPES 완충액(pH=7.8); 29열 이하의 유효 성분</td><td></td><td></td><td>지질 확산에 사용됩니다. 함량 : 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 4 mM CaCl 2 초순수 탈 이온수</td></tr> 염화<tr><td>칼슘 무수, BioReagent, 곤충 세포 배양에 적합, 식물 세포 배양에 적합, &ge; 96.0 % (CaCl 2 )</td> <td>Sigma Life Science</td><td>C5670</td><td>칼슘 - HEPES 완충액</td></tr> <tr><td>< 강> 킬레이터 - HEPES 완충액 (pH = 7.8)을 준비하기 위해; 31 행 아래의 유효 성분 < / 강력 ></td><td></td><td></td><td>관 네트워크의 형성을 촉진하는 데 사용됩니다. 내용: 초순수 탈이온수에 희석된 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA 및 7 mM BAPTA</td></tr><tr><td>; 1,2-Bis (2-aminophenoxy) ethane-N, N, N&prime, N &prime; - 테트라 아세트산 테트라 나트륨 염 &ge; 95% (HPLC) (BAPTA-Na4)</td><td>Sigma Life Science</td><td>14513</td><td>킬레이터-HEPES 완충 성분</td></tr><tr><td>수산화나트륨&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>30620</td> 버퍼 pH 측정기 accumet&trade<td>의 pH를 조정하는 데 사용되는 기본 솔루션</td></tr><tr><td>; AE150 pH</td><td>Fisher Scientific</td><td>1544693</td><td>모든 버퍼의 pH를 측정하는 데 사용됩니다.</td></tr> 유리 <tr><td>페트리 디쉬&nbsp;</td><td>VWR</td><td>HECH41042012</td><td>6cm, PDMS 시트</td></tr><tr><td>수산화칼륨 ACS 시약을 만드는 데 사용, &ge; 85%, 펠릿 (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473</td><td>PDMS 시트 제조를 위한 유리 페트리 접시를 청소하기 위한 KOH 솔루션을 만들기 위해</td></tr><tr><td>이소프로판올 프리마 렌 99.5%</td><td>Antibac AS</td><td>600079</td><td>KOH 용액 성분</td></tr><tr><td>가열 및 건조 오븐 - venticell</td><td>MMM Medcenter Einrichtungen GmbH&nbsp;</td><td>MC000714</td><td>실란화 후 유리 페트리 접시의 건조 및 PDMS</td></tr><tr><td>Dichlorodimethylsilane &ge를 치료하기 위해; 99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440272</td><td>PDMS 시트가 준비된 유리 페트리 접시의 실란화에 사용됩니다</td></tr>. <tr><td>진공 펌프</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-79202-05</td><td>데시케이터에 연결됨&nbsp;</td></tr><tr><td>Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 경화제</td><td>Dow corning</td><td>24236-10</td><td>PDMS 용액을 만드는 키트</td></tr><tr><td>Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 베이스</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>일회용 메스</td><td>Swann-Morton</td><td>11798343</td> PDMS 커버 슬립을 <td>절단하는 데 사용</td></tr><tr><td></td><td>Menzel -Gl&auml; 세르&nbsp;</td><td>&nbsp; MEZ102460</td><td>24x60 mm. Al<2O3</td></tr><tr><td>Atomic Layer Deposition system</td><td>Beneq</td><td>TFS200 (모델 번호)</td><td>의 박막을 증착하는 데 사용되는 원자층 증착 시스템 Alsub>2O3의 박막을 증착</td></tr>하는 데 사용됩니다.<tr><td></td><td>JA Woollan (주)</td><td>Alpha-SE (모델명)</td><td>유리 표면에 증착된 필름의 두께를 문자화하는 데 사용되는</td></tr><tr><td>시스템 레이저 스캐닝 컨포칼&nbsp; 현미경&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica TCS SP8 X</td><td>실험 시각화에 사용되는 현미경</td></tr><tr><td>Objective 40x, 1.3 NA</td><td>Leica Microsystems</td><td>1550635</td><td>실험 시각화에 사용</td></tr><tr><td>백색광 레이저 소스</td><td>Leica</td><td>Microsystems Leica TCS SP8 X</td><td>멤브레인 형광단의 여기용</td></tr></tbody></table>

자발적인 형성 및 바인딩과 그물에 대 한 상향식 모델로 인공 지질 나노튜브 네트워크의 재배치

Spontaneous Formation and Rearrangement of Artificial Lipid Nanotube Networks as a Bottom-Up Model for Endoplasmic Reticulum

우리는 편리한 메서드 바인딩과 그물 (ER)에 대 한 상향식 구조 세포 기관이 모델을 제시. 모델은 고집적 lipidic 나노튜브의 구성, 형태와 역동성, 응급실의 연상. 네트워크는 인지질 이중 bilayer 막 패치 준수 하는 투명 한 알2O3 기판에서에서 파생 됩니다. 접착은 캘리포니아2 + 주변 버퍼에 의해 중재 됩니다. BAPTA/EDTA에 의하여 캘리포니아2 + 의 후속 고갈 자연 지질 나노튜브 네트워크 형성에 따른 막의 철회를 하면 됩니다. 메서드는만 인지질 및 ER 모델의 간단한 형성 ﹙ 표면 구성 하 고 단백질 또는예를 들어, GTP (ATP) 화학 에너지의 추가 요구 하지 않습니다. 세포질 바인딩과 그물의 3D 형태, 달리 모델은 2 차원 (이기는 하지만 나노튜브 치수, 형상, 구조, 및 역학 유지 됩니다). 이 독특한 생체 외에서 ER 모델만 몇 가지 구성 요소로 구성 되어, 쉽게 생성, 그리고 가벼운 현미경 관찰 될 수 있다. 결과 구조 응급실 관련 단백질 또는 튜브 중 교통 현상을 공부 하는 입자의 추가 등의 추가 기능에 대 한 추가 장식 하실 수 있습니다. 여기에 설명 된 인공 네트워크는 응급실, 그 독특한 특성 형태학 보였다 그것의 생물학 기능에 관련 된 반면 관 도메인의 형성에 관한 내용을 휴대에 적합 한 구조 모델 및 내에서 재배열 아직 완전히 이해 된다. 우리는이 방법은 Al2O3 얇은 필름 코팅 현미경 coverslips, 상업적으로 사용할 수 있지만 특별 한 주문 필요 사용 주의. 따라서, 그것이 준비를 위한 제작 시설에 대 한 액세스 권한이 좋습니다.

프로토콜의 1 단계에서 얻은 고 실험에서 사용 되는 지질 정지 포함 소포의 두 가지 주요 유형: MLVs 및 GUVs. 그림 1 A-1 층 레이저의 3 차원에서 건설 초기 샘플에 소포 confocal 현미경 검사를 보여 줍니다. 그림 1 A-1_C xyz, xz, yz 평면에 각각 MLV (지질 예금) 보여줍니다. 그림 1 D-1 층 거 대 한 unilamellar 소포 (우두머리)의 비슷한 플레이 보여줍니다. Multilamellarity 부족, GUVs의 내부 부분은 빈; 따라서, 확산을 위한 지질 자료 크게 제한 됩니다. 따라서,이 방법만 유용한 지질 저수지는 MLVs.
지질 정지 캘리포니아2 +-HEPES 버퍼 (그림 1G)을 포함 하는 관찰 실로 전송 될 때 MLVs (그림 1A-1_C) Al2O3 표면에 정착을 시작 합니다. 접촉, 시는 소포 표면에 고착 하 고 원형 평면 이중 지질 bilayer 막 (DLBM) 고체 지원 (그림 1H 1J)에 각 MLV에서 확산 하기 시작 합니다. MLV 지속적으로 확장 하는 DLBM에 대 한 지질을 제공 하는 저수지 역할을 합니다. 단단한 지원에 관하여 원심 (상단) bilayer 막, (그림 1나) 롤링 모션을 수행 원형 모서리의 둘레를 따라 근 위 (아래) bilayer 막에 연결 되어 있습니다. 두 bilayers 위치 단호하게 서로,만 데 액체 박막 그들 사이 캡슐화 합니다. 확산, 동안 근 막 지속적으로 준수, 아래 지원 표면에 동안 원심 막 확장 근 막 가장자리 가장자리에 옆으로 당 겼 다. DLBM의 확산 캘리포니아2 +, 근 막에서 지질 머리 그룹 및 고체 기질4사이 fusogenic 에이전트의 역할에 의해 중재 됩니다.
장기간 동안 계속 확산, 막 긴장 증가, (그림 2A 와 2B) 파열으로 이어지는. 그 시점, 후 막 철회, 응급실 관 형태를 만드는 데 필요한는 유도 이상 수 있다. 따라서, 그것은 파열된 막 인식 하는 것이 중요입니다. 우리의 실험에 지질 붙일 셔 서, 이후는 파열 관찰할 수 있습니다 직접. 파열의 주요 지표는 (그림 2A 와 2B) 파열된 지역14에서 형광 강도에 상당한 드롭. 파열은 증가 긴장 및 말 초 막에서 후속 기 공 형성의 결과 이다. 형광 현미경 파열된 지역 따라서 절반 방출 (단일 인접 bilayer)의 강도 unruptured 지역 (더블 bilayer)14 (그림 2B)을 전시할 것 이다. 기 공 형성 동안 처음 파열된 지역에 위치한, 막 소재, 확산 패치의 가장자리를 마이그레이션합니다. 차례로 전체 패치 영역의 성장을 발생합니다. 따라서, 원형 패치의 윤곽선의 급속 한 확장 파열 하는 동안 또한 관찰할 수 있습니다.
원형 패치 지역에 100-200 µ m를 도달 하는 후에 즉시 패치, 파열으로 이어지는 광범위 한 성장을 피하기 위해, 캘리포니아2 +-HEPES 버퍼 박막 표면에 액체 유지까지 자동 피 펫으로 부드럽게 제거 됩니다. Chelator HEPES 버퍼는 부드럽게 시작 철회 (그림 1K)를 챔버에 추가 됩니다. (그림 2C) 샘플의 완전 한 탈수 또는 버퍼 (그림 2D 와 2E)의 신속한 교환 소요, 파열, 또는 패치 변형 발생 합니다. Chelators의 추가 점차적으로 제거 합니다 Ca2 + 표면 막 사이 공간에서. Chelator HEPES 버퍼 점차적으로 지질 막 패치의 주변에서 시작 하는 남북 bilayer 기판 공간에 액세스 합니다. 따라서, 고정 사이트 제거 원형 패치의 가장자리에서 시작 하 고 안쪽으로 전파 (그림 1K-1 분기). Depinning, 결과로 지질 막 분리 하 고 중심에 MLV 향해 진행 가장자리 안쪽에서 철회 하기 시작 합니다. 철회 과정 lipidic 관 네트워크4 (그림 1L-1 년)을 동적으로 개발의 새로운 인터페이스를 이끌어 낸다. 막 완전 하 게 분리를 허용 하지 않는, 고정, 영구 지역 선도 표면 및 핵 집계에 남아 나노튜브의 긴 분기 네트워크. (그림 1L-1 년). 연속 드 고정 및 추가 지질 나노튜브의 철회 점진적 chelation 과정 결과로 시간이 지남에 따라 관찰 된다. 이 coarsening 및 네트워크의 재배치 매끄러운 ER을 닮는 관 네트워크의 동적 행동에 주요 역할을 하고있다.
그림 1 L-1 년 보여줍니다 프로토콜에서 얻은 나노튜브 네트워크의 현미경 사진. 그림 1 L 은 그림 1M 에 지역의 근접 흰색 프레임에 표시 합니다. 그림 1L 와 1m 에서 연속 밝은 빨간색 영역 ( 그림 1M에 파란색 파선으로 표시 되는) DLBM의 retracting 분수입니다. 그림 1N 에 1O 관 네트워크의 현미경 사진 대비 증가 반전 이다. 그림 1 P 와 1 분기 3 h 20 분에 걸쳐 막 지역에 관 밀도의 감소를 보여 줍니다. 관 밀도의 감소 때문에 점진적 depinning는 실험 기간 동안 표면에서 철회 된 DLBM의 다음 발생 합니다. 이상 시간 증가, 재배열 및 튜브 (그림 1P 와 1 분기)에 의해 보호 지역의 감소를 고정에서 해방 하는 점의 수입니다. 관 재배열 두 고정된 지점 사이의 일시 중지는 지질 나노튜브의 표면 자유 에너지 최소화에 의해 좌우 됩니다. 그것은 확고 한 나노튜브의 표면 에너지를 최소화 하는 가장 효율적인 방법을15그것의 길이 줄이기 위해 하는 것입니다. 따라서, 표면에는 나노튜브를 처음 잡아 fusogenic 지역, 인 드 고정는 나노튜브 슬라이드 하 고 배열 한다을 자발적으로, 최소 길이 채택. 이 재배열 발생 (그림 1P 와 1 분기) 나노튜브에 의해 표면의 점차적으로 감소 된 범위.
우리는 시각화 수 없습니다 캘리포니아2 +-고정 포인트, 중재 하지만 우리 튜브 터미널 또는 날카로운 회전에 있는 지점으로 그들의 위치를 설정. 날카로운 회전 이라고 하 V-접속점15 또는 터 닝 포인트 튜브의 정렬 (녹색 화살표 그림 1R 에 1 X)의 방향으로 갑자기 변화 때문에. 끝점 튜브, 튜브 (주황색 화살표 그림 1X)을 제거 하지 못하도록의 종점을 나타냅니다. 개편, "Y-교차점" 또는 "3 방향 접합"로 식별 하는 튜브의 정력적으로 호의 베푸는 처리 하는 동안 나타납니다. Y 접점 각 관, 가장 짧은 총 관 길이 보안 할 수 있습니다 사이 약 120 ° 각도와 3 개의 튜브를 연결 합니다. 끝점을 소유 하지 않는, 대신 여러 나노튜브 사이 위치는 Y-접합, 고정 하지는. (파란색 화살표, 그림 1R) 슬라이딩 수행할 수 있는 유일한 Y 접점 유형입니다. 그림 1R 1에 같이 두 명의 개별 Y 접속점 (파란색 화살표 그림 1S)의 형성에 매우 불안정 교차로 결과 따라 Y 접합의 슬라이딩. 그림 1S 에 겹쳐 흰색 점선 그림 1R관 네트워크 조각의 윤곽을 나타냅니다. Y-접합의 일부는 시간이 지남에, 결국 철회 (그림 1U) 끝 단자를 (노란색 화살표 그림 1T) 소유한 다. 하나의 V 접점의 변화, 직선 튜브 두 선 세그먼트의 교차점의 depinning 및 V 모양을 형성 하는 튜브의 철회는 그림 1V 및 1W 및 에서 관찰 될 수 있다 그림 1X 와 1 년, 각각.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58923/58923fig1v3.jpg"> 그림 1 : ER 같은 관 네트워크에 변화의 지질 예금. (A-F) 레이저 3d에서 건설 초기 샘플에 소포의 confocal 현미경 검사. (A-C) Xyz, xz, yz multilamellar 지질 소포 (MLV, 지질 예금) 비행기, 각각. (D-F) 거 대 한 unilamellar 소포 (우두머리)의 유사한 전망. GUVs의 내부 부분은 크게 제한 확산을 위한 지질 자료 게 빈, 이다. 이 방법에 대 한 유용한 지질 저수지는 그러므로 MLVs. (G)는 버퍼와 지질 예금는 거꾸로 한 현미경에 장착 된 관찰 챔버의 그림. 챔버는 PDMS의 구성 프레임 오픈 볼륨 탑을 제공 하는 알2O3 코팅 coverslip에 준수. (H-J) 캘리포니아2 +존재 MLV의 확산 현상의 그림. (H) 알루미늄2O3와 접촉, 시는 MLV 저절로 원형, 이중 지질 bilayer 막 (DLBM)의 형태로 확산. (I)는 peripheries 롤링 모션을 수행할 xz 평면에 DLBM의 도식 측면 보기. MLV (d = 5 ~ 15 μ m) 및 DLBM (두께 = 10 nm) 하지 그려집니다 규모. (탑 뷰에서 확산 DLBM의 현미경 J)는 confocal 사진 (K)는 버퍼 1 포함 캘리포니아2 + 킬레이트 화 대리인, 확산 억제, MLV에 있는 DLBM의 철회를 일으키는 및 지질 나노튜브의 형성으로 이어지는 교환 되이 프로토콜의 주요 단계를 설명 합니다. (L-Y) 설명 된 방법으로 얻은 나노튜브 네트워크의 현미경 사진. (L) (M)에 지역의 근접 한 프레임에 표시 됩니다. (L과 M)에서 연속 밝은 빨간색 영역 DLBM을 (또한 M에 파란색 파선으로 표시)을 나타냅니다. (N과 O) 관 네트워크의 현미경 사진 대비 증가 반전 이다. (P와 Q) 3 h와 20 분 (R-Y) 대표 관 재 준비의 과정을 통해 막 지역에 관 밀도의 감소 묘사 (R, S) 슬라이딩, (T 그리고 U) 전환점의 한 끝점, 그리고 (V와 W) 드 고정의 철회에 의해 V 접점을 Y 접합의 전환, V 접점의 박멸에 결과. (X 및 Y) 한 끝점의 철회입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58923/58923fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58923/58923fig2.jpg"> 그림 2 : 잠재적인 부정적인 결과. (A와 B) 때문에 긴 말 초 막의 파열 버퍼 교환 하기 전에 대기 시간. 어디 근 막 표시 됩니다, 파열된 지역 unruptured 말 초 막 지역에 비해 어두운 영역으로 나타납니다. 패널 B 인세트는 현미경 사진에 파란색 화살표를 따라 빛의 강도 보여줍니다. 막의 파열 영역의 강도 (인접/단일 bilayer 표시 됩니다) unruptured 막 (원심/더블 bilayer)의 절반 강도에 해당. (C) 건조 지질 패치의 모양을 관찰 실에서 모든 액체의 제거 결과로 형성 했다. (D 및 E) 버퍼를 통해 자동 피 펫의 급속 한 교환에 의해 막의 교란 한다. (D)는 MLV는 비 원형, 변형 지질 패치로 이어지는 2 MLVs로 분할 됩니다. (E), (화살표), 흐름의 패턴 chelator HEPES 버퍼의 강한 주입에 의해 만들어진 tubulated 막 구조에 반영 됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58923/58923fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

솔리드-지원, 단백질-무료, 이중 인지질 bilayer 막 (DLBM) 복잡 하 고 동적 지질 나노튜브 네트워크로 변형 될 수 있다 고 바인딩과 그물의 2D 상향식 모델로 사용할 수 있습니다.

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense ...

내과 성 망상은 지속적으로 세포 골격과 상호 작용하는 동적 관 도메인이 일정한 움직임과 재배열을 겪는다. ER이 이 조직을 생성하고 유지하는 방법은 아직 완전히 이해되지 않습니다. 여기서 우리는 복잡한 지질 나노튜브 네트워크로 옮겨질 수 있는 고체 지원 단백질 없는 멤브레인 시스템으로 구성된 ER용 상향식 구조 세포지 모델을 형성하는 편리한 물질을 제시한다.친수성 유수 의 화합물은 에너지를 위한 유기 화합물. 단백질 정제 및 단백질 추출은 필요하지 않습니다. 유일한 필수 구성 요소는 가장 기본적인 ER 모델을 제공하는 고체 기판 및 인지질입니다.용존 지질 용액을 10 밀리리터 반전 배 모양플라스크로 옮기면 총 3, 000 마이크로그램의 지질과 300 마이크로리터의 엽록소를 추가합니다. 그런 다음 플라스크를 회전 증발기에 연결하고 45도 기울기로 배치합니다. 24 RPM에서 수조 내부의 플라스크를 6시간 동안 섭씨 23도에서 회전하여 공기 압력이 감소하여 클로로폼을 천천히 완전히 제거합니다.압력이 20킬로파스칼에 도달할 때까지 2분마다 20킬로파스칼의 단계로 회전을 시작한 직후 압력을 줄이기 시작합니다. 6시간 후, 회전을 멈추고 100킬로파스칼에 도달할 때까지 2분마다 20킬로파스칼의 단계로 서서히 공기 압력을 증가시다. 회전 증발기에서 플라스크를 제거하고 PBS의 3 밀리리터와 글리세롤 30 마이크로 리터를 추가합니다.플라스크를 부드럽게 소용돌이치면 글리세롤을 녹입니다. 통풍이 꽉 찬 유리 스토퍼를 사용하여 지질이 들어있는 플라스크를 밀봉하십시오. 지질 필름의 재수화와 붓기를 위해 밤새 냉장고에 플라스크를 섭씨 4도에 보관하십시오.다음 날, 실온에서 초음파 수조와 35 킬로 헤르츠 주파수에서 지질을 초음파 처리하여 균일한 약간 탁한 지질 현탁액을 달성하십시오. 초음파 처리는 약 10~30초가 걸릴 수 있습니다. 장기간 초음파 처리는 열을 생성하고 vesical 형성에 해롭습니다.이러한 단계는 두 가지 유형의 vesicular 구조를 포함하는 현탁액을 생성합니다. 다발성 멜라 소포와 거대한 유니라멜라 소포. 보관을 위해 지질 현탁액을 총 30마이크로센트심립지 튜브를 사용하여 100개의 마이크로리터 알리코크로 나눕니다.알리코를 영하 20도의 냉동고에 보관합니다. 액체 질소로 플래시 동결이 필요하지 않습니다. 지질 현탁액을 해동하고 깨끗한 유리 현미경 슬라이드 또는 커버 슬립에 서스펜션의 네 마이크로 리터 액자를 전송합니다.20분간의 건조 후, 액적들은 눈에 보이는 지질의 평평한 원형 필름으로 붕괴됩니다. 3 분 동안 HEPES 버퍼의 1 밀리리터로 지질 필름을 다시 수분. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 ER 변환을 시작하는 데 필요한 자동 파이펫을 통해 버퍼 교환을 허용하도록 열린 상단으로 관측 챔버를 준비합니다.주걱으로 경화 된 PDMS 슬래브를 제거 한 후 메스를 사용하여 프레임을 현미경 단계에서 사용 가능한 개구부에 적합한 치수 및 형상으로 자른다. 1.5 x 1.5 x 0.5센티미터의 치수는 대부분의 설정에 적합합니다. 알루미늄 산화물 필름이 있는 표면의 활성 면과 접촉하도록 PDMS 프레임의 매끄러운 면을 가져와서 프레임을 서로 밀어 붙이도록 압력을 부드럽게 가집니다.즉시 칼슘 HEPES 버퍼로 관측실을 채웁니다. 후속 단계에서 재수화 된 지질을 첨가 할 수 있도록 전체 챔버 볼륨을 채우지 마십시오. 공초점 현미경 단계에 챔버를 놓습니다.거대한 소포가 들어있는 현탁액인 수분화 된 지질 물질을 플라스틱 목초지 파이펫으로 챔버로 옮킨다. 10-20분 동안 기다린 후 소포가 기판에 부착되어 표면을 가로질러 퍼질 수 있습니다. 확산은 표면에 지질의 증착 직후에 시작됩니다.지질이 확산되기 전에 버퍼 교환은 표면의 지질 구조를 가능한 한 빨리 제거하거나 신속하게 첨가해야 한다. 여러 지질 스프레드를 관찰한 후 자동 파이펫을 통해 주변 버퍼를 천천히 제거합니다. 따라서 얇은 버퍼 필름만 바닥에 남아 있습니다.신속한 제거를 피하기 위해 주의하십시오. 자동 파이펫을 사용하여 셀라토르 HEPES 버퍼로 관측챔버를 천천히 채우면 주변 버퍼 교환으로 진행한다. 갑작스러운 추가를 피하십시오.마지막 단계는 다각형 소포에 DLBM의 분해 및 철회 유도의 결과로 형성된 동적 나노관형 네트워크를 산출합니다. 여기에 프로토콜에서 얻은 나노튜브 네트워크의 현미경 그래프가 나와 있다. 이 이미지에서 연속 밝은 빨간색 영역은 파란색 파선으로 표시된 DLBM의 후퇴 부분입니다.여기에 표시, 대비를 높이기 위해 반전 된 관 네트워크의 현미경 그래프입니다. 여기서, 관 밀도의 감소는 3시간 20분 동안 멤브레인 영역에 도시된다. 관 밀도의 감소는 표면에서 DLBM의 후퇴 뒤에 점진적인 디핀으로 인해 발생합니다.칼슘 매개 고정 점의 위치는 튜브가 단말 또는 날카로운 회전을 갖는 지점으로 확립 될 수있다. 날카로운 회전은 튜브 정렬의 방향이 급격히 이동하기 때문에 v 접합또는 전환점이라고합니다. 끝점은 튜브가 후퇴하는 것을 방지하는 튜브의 종단을 나타냅니다.확산이 장기간 계속되면 막 장력이 증가하여 파열됩니다. 지질은 형광으로 표시되기 때문에, 파열은 직접 관찰 될 수있다. 파열의 주요 지표는 파열 된 지역에서 형광 강도의 상당한 하락이다.샘플의 완전한 탈수 또는 버퍼의 빠른 교환은 패치의 방해, 파열 또는 변형을 유발합니다. 모델의 복잡성은 지질 단백질과 같은 ER 관련 성분을 추가하여 구축될 수 있다. 그리고 이 모형은 또한 자기 조립, 나노 유체학, 마랑고니 흐름 및 수송 현상을 연구하기 위하여 암시될 수 있습니다.클로로폼은 독성이 높고 휘발성이 매우 높으며 항상 연기 후드와 폴리 비닐 아세테이트 실험실 장갑, 실험실 코트 및 안전 안경을 포함한 관련 개인 보호 장비로 취급해야합니다.

spontaneous-formation-rearrangement-artificial-lipid-nanotube

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 코어에 자체 조립 나노 구조를 포함하는 지질 입자의 운동 안정화를 위한 탄소 나노튜브의 스마트 응용에 대해 보고합니다. 지질 입자의 준비에는 약물 전달과 같은 생물 의학 응용 분야에 사용할 수 있는 다소 낮은 농도의 탄소 나노튜브가 필요합니다.

탄소 나노 튜브에 의해 안정화 내부 자기 조립 된 지질 입자의 용이 한 제조

우리는 유체 지질 이중층에 둘러싸여 나노 단백질 패치 유리를 기능화하는 프로토콜을 제시한다. 이 기판은 첨단 광학 현미경과 호환 및 세포 부착 및 이동 연구를위한 플랫폼 역할을 할 것으로 예상된다.

지원되는 지질 이중층에 리간드 나노 클러스터의 배열

셀에 많은 단백질을 감지 하 고 막 곡률을 유도. 곡선된 막 체 외단백질 또는 어떤 곡률 활성 분자의 상호작용을 연구 하는 지질 소포에서 막 나노튜브를 당겨 하는 방법을 설명 합니다.

거 대 한 Unilamellar 소포에서 막 나노튜브를 당기

우리 제공 프로토콜 시험관에 마음과 나의 자기 조직 분석 오픈 챔버에 지원된 지질 bilayer에. 또한, 우리는 vivo에서 조건 반응 감 금에 의해 모방 PDMS microcompartments 지질 입은에 분석 결과 포함 하는 방법을 설명 합니다.

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글라이딩 키네신 운동성 분석을 이용한 다성분 지질 나노튜브 네트워크 제작

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체외 거대한 Unilamellar 소포 내부의 Actin Cytoskeleton 재구성

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