Name: 수명이 긴 플라즈마 세포에 인간의 정상적인 메모리 B 세포의 체 외 분화 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: 학습하세요 인간 기억 B 세포의 체외 분화 모델을 통해 장수 플라즈마 세포 형성 과정을 탐구하는 방법을. 멀티스텝 배양 시스템과 오픈 접근 바이오정보학 도구를 활용하여 B2 플라즈마 세포 분화 단계를 재현합니다.

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이 작품은 프랑스 잉카 (인 국가 뒤 암)에서 교부 금에 의해 지원 되었다 연구소 (PLBIO15-256), ANR (넥타이-건너뛰기) 및 ITMO 암 (m M & TT).

프로토콜은 헬싱키의 선언 및 계약 몽펠리에 대학 병원 센터의 생물 자원에 대 한 지침을 따릅니다.
1. 체 외 일반 플라즈마 세포 차별화 모델에
참고: Pc 4 단계 문화11,,1213를 통해 생성 됩니다.
<ol><li>
B 세포 증폭 및 분화
	<ol>
<li>메모리 B 세포 정화에 대 한 건강 한 자원자에서 말 초 혈액 세포를 사용 합니다.</li>
		<li>RPMI 1640 매체의 24.5 mL와 함께 혈액의 7.5 mL를 희석.</li>
		<li>살 균 50 mL 원뿔 튜브에 실내 온도 밀도 그라데이션 (예: Ficoll)의 12.5 mL를 추가 합니다. 부드럽게 희석된 혈액의 32 mL와 함께 밀도 그라디언트 오버레이. 두 단계를 혼합 하 여 최소화 합니다.</li>
		<li>해제 브레이크 500 x g 에서 20 분을 원심. 희석된 플라즈마/밀도 그라데이션 인터페이스는 PBMCs를 수집 하 고 셀 살 균 50 mL 튜브에 놓고 45 mL 행 크의 균형 소금 솔루션을 완료 합니다.</li>
		<li>500 x g에 5 분에 대 한 셀 원심 조심 스럽게 제거는 상쾌한 고 펠 릿을 유지.</li>
		<li>500 x g에서 RPMI1640/10% 송아지 태아 혈 청 (FCS) 및 원심 분리기 5 분의 45 mL를 추가 합니다. 조심 스럽게 제거는 상쾌한 고 펠 릿을 유지. PBS/2% FCS의 30 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>
C d 2 + 자석 구슬 안티-c d 2를 사용 하 여 셀을 제거 합니다. 4 구슬 한 목표 셀에 대 한 추가 합니다. 4 ° c.에 30 분을 품 어
		<ol>
<li>별도 구슬 바인딩된 셀 셀 분리 응용 프로그램에 대 한 자석을 사용 하 여 바인딩되지 않은 셀에서. 바인딩되지 않은 세포를 수집 하 고 셀 펠 릿으로 CD19 APC 안티 및 CD27 PE 항 체 안티 4 ° C (106 셀에 대 한 항 체의 2 µ L)에서 15 분 동안 품 어.</li>
			<li>PBS/10% 염소 혈 청에 두 번 세척.</li>
			<li>FSC 그리고 SSC 플롯에 오염 이벤트를 제거 합니다. FSC-A vs FSC-H와 SSC A 대 SSC-H 플롯 파편을 제거 하 고 총 백혈구 채우기 선택에 singlets을 플롯 합니다. CD19/CD27와 CD19 메모리 B 셀 선택+CD27+.</li>
			<li>95% 순수성을 가진 셀 정렬을 사용 하 여 MBCs를 정화.</li>
		</ol>
</li>
		<li>10%와 IMDM FCS, 50 mg/mL 인간의 올려진다 고 5 mg/mL 인간의 인슐린 보충을 사용 하 여 모든 문화 단계를 수행 합니다.</li>
		<li>
6 잘 배양 배지에서 MBCs를 정화 하는 플레이트 (1.5 x 105 MBCs/mL에 5 mL/잘), 일리노이-2와 4 일 동안 (20 U/mL), IL-10 (50 ng/mL), 및 IL-15 (10 ng/mL).
		<ol>
<li>Phosphorothioate CpG ODN 2006, 히스티딘 태그 재조합 인간 성 CD40L를 추가 (sCD40L; 50 ng/mL) 및 MBCs 활성화 (그림 1)에 대 한 안티 polyhistidine mAb (5 mg/mL). 낮은 확대12같은 cytokine 칵테일 수익률 만으로 sCD40L 또는 ODN 활성화. 여기의 최대 수에 납을 첨가 하는 활성화 신호를 설명의 조합 활성화 B 세포와 PrePBs11,12 (그림 1).</li>
			<li>진 식 프로 파일링, CD38 정화-/CD20- PrePBs, 4, 일에서 셀 정렬 (그림 2)를 사용 하 여.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Plasmablastic 셀 생성
	<ol>
<li>4 일에는 셀을 계산 합니다.</li>
		<li>2 mL/잘에서 105/mL x 2.5에서 12-잘 배양 배지에서 플레이트 세포.</li>
		<li>CpG oligonucleotides 및 sCD40L의 제거 및 추가와 새로운 cytokine 칵테일 일리노이-2를 포함 하 여 새로운 문화 매체의 차별화를 유도 (20 U/mL), 일리노이-6 (50 ng/mL), IL-10 (50 ng/mL) 및 IL-15 (10 ng/mL) (그림 1). 3 일 (4 일) 하루 7 37 ° c.에 대 한 문화 셀</li>
		<li>진 식 프로 파일링, CD38 정화+/CD20- PBs, 하루 7에서 셀 정렬 (그림 2)를 사용 하 여.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
초기 플라즈마 세포 생성
	<ol>
<li>7 일에는 셀을 계산 합니다.</li>
		<li>셀 2 mL에 5 x 105/mL에서 12-잘 문화 접시에 접시/잘.</li>
		<li>일리노이-6와 신선한 문화 매체를 사용 하 여 초기 Pc에 PB를 차별화 (50 ng/mL), 일리노이-15 (10 ng/mL)와 IFN-α (500 U/mL) 37 ° c.에 3 일 동안 CD20 정화 진 식 프로 파일링,-/CD38+/CD138+ 초기 Pc, 하루 10에서 셀 정렬 (그림 2)를 사용 하 여.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
수명이 긴 플라즈마 세포 생성
	<ol>
<li>문화 상태를 변경 하 여 초기 Pc 오래 살았던된 Pc로 차별화.</li>
		<li>5 x 1052 ml에서 /mL에서 12-잘 배양 배지에서 셀 문화/잘 또는 24-잘 배양 배지 1 mL/37 ° C에서 4 월의 매체를 조절 하는 일리노이-6와 stromal 세포를 사용 하 여 (200 ng/mL).</li>
		<li>Stromal 세포 배양과 5 일 배양 여 stromal 세포 조절 매체를 가져올. Stromal 세포 배양 표면에 뜨는 (0.2 µ m) 필터 및 고정.</li>
		<li>매주 갱신 PC 문화를 stromal 세포 조절 미디어의 50%를 추가 합니다. 생성 된 긴 Pc 개월13유지 될 수 있습니다. Pc의 긴 기간 생존 보고13으로만 일리노이-6와 4 월 얻을 수 수 있습니다.</li>
		<li>Cytometry에서 측정 Ig 분 비 Pc 정렬.</li>
		<li>24 h에 대 한 106 셀/mL에 Pc 문화 고 문화 상쾌한 수확. IgG 및 IgA 인간 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 키트11,,1213를 사용 하 여 측정 합니다. 메디아 IgG 일 10 ~ 17 세/셀/일 하루 6013에서 10 pg/셀/일에서 240 분 비.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 분자 아틀라스 PC 차별화에 B의
참고: 우리는 편리 하 고 오픈 액세스 생물 정보학 도구를 추출 하 고 PC 차별화 (GenomicScape)15에 관련 된 Affymetrix GEP 데이터에서 가장 눈에 띄는 정보 시각화를 내장. GEP 순화 MBCs, PrePBs, PBs와 Epc를 포함 하 여 ArrayExpress 데이터베이스 (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/)에서 공개적으로 사용할 수 있습니다: 전자-MTAB-1771, E-MEXP-2360 및 E-MEXP-3034 BMPC E-MEXP-236014,15. Genomicscape는 자유롭게 사용할 수 webtool을 이다.
<ol><li>
PC 데이터 집합 B의 선택
	<ol>
<li>GenomicScape 오픈 액세스 bioinformatic 도구 (http://www.genomicscape.com) 라는 인간의 B 세포 플라스마 세포에서에서 데이터 찾아보기 메뉴에서 PC 데이터 집합에 B를 선택 합니다. 시각화의 독특한 유전자의 유전자 식 프로필 또는 유전자의 목록이 분석 도구 홈 페이지에서 사용할 수 있는 식 Coexpression 보고서 도구를 사용 하 여 이용하실 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
감독된 분석 및 주성분 분석 (PCA)
	<ol>
<li>선택 분석 도구 | webSAM SAM 도구를 로드.</li>
		<li>플라스마 세포 인간 B 세포 데이터 집합을 선택 하 고 샘플 비교의 그룹을 선택 합니다.</li>
		<li>관심의 필터링 옵션을 적용할 수 있는 다른 필터를 사용 합니다.</li>
		<li>샘 도구로 유전자 표현 프로 파일 비교를 배 변경, 순열, 거짓 검색 속도 비교의 종류의 수를 포함 하 여 필터링 옵션을 수정 합니다. GenomicScape는 분석을 계산 하 고 차동 선택한 그룹 사이 표현 하는 유전자를 제공.</li>
		<li>주요 구성 요소 분석 분석 도구 메뉴에서 선택 하 여 주성분 분석을 실행 합니다.</li>
		<li>플라즈마 세포 인간 B 세포 데이터 집합을 선택 하 고 관심의 그룹을 선택 합니다.</li>
		<li>관심사의 유전자 또는 분산에 따라 선택 유전자 목록을 붙여 넣습니다. 유전자의 목록을 붙여 넣습니다, 유전자/ncRNAs 목록을 분석 하 고 여기를 클릭... Genomicscape 선택 PCA 시각화 하 고 다운로드 수를 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Shapiro-Shelef, M., Calame, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+plasma-cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of plasma-cell development.</a> Nature Reviews Immunology. 5 (3), 230-242 (2005).</li>
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<li>Shaffer, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blimp-1+orchestrates+plasma+cell+differentiation+by+extinguishing+the+mature+B+cell+gene+expression+program%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Blimp-1 orchestrates plasma cell differentiation by extinguishing the mature B cell gene expression program.</a> Immunity. 17 (1), 51-62 (2002).</li>
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<li>Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XBP1+mRNA+is+induced+by+ATF6+and+spliced+by+IRE1+in+response+to+ER+stress+to+produce+a+highly+active+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor.</a> Cell. 107 (7), 881-891 (2001).</li>
<li>Shaffer, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XBP1%2C+downstream+of+Blimp-1%2C+expands+the+secretory+apparatus+and+other+organelles%2C+and+increases+protein+synthesis+in+plasma+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">XBP1, downstream of Blimp-1, expands the secretory apparatus and other organelles, and increases protein synthesis in plasma cell differentiation.</a> Immunity. 21 (1), 81-93 (2004).</li>
<li>Reimold, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+cell+differentiation+requires+the+transcription+factor+XBP-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Plasma cell differentiation requires the transcription factor XBP-1.</a> Nature. 412 (6844), 300-307 (2001).</li>
<li>Jourdan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+transitional+preplasmablast+population+in+the+process+of+human+B+cell+to+plasma+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a transitional preplasmablast population in the process of human B cell to plasma cell differentiation.</a> Journal of Immunology. 187 (8), 3931-3941 (2011).</li>
<li>Jourdan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+differentiation+of+memory+B+cells+into+plasmablasts+and+plasma+cells+including+detailed+phenotypic+and+molecular+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of differentiation of memory B cells into plasmablasts and plasma cells including detailed phenotypic and molecular characterization.</a> Blood. 114 (25), 5173-5181 (2009).</li>
<li>Jourdan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-6+supports+the+generation+of+human+long-lived+plasma+cells+in+combination+with+either+APRIL+or+stromal+cell-soluble+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">IL-6 supports the generation of human long-lived plasma cells in combination with either APRIL or stromal cell-soluble factors.</a> Leukemia. , (2014).</li>
<li>Kassambara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+miRNA+expression+analysis+identifies+novel+key+regulators+of+plasma+cell+differentiation+and+malignant+plasma+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Global miRNA expression analysis identifies novel key regulators of plasma cell differentiation and malignant plasma cell.</a> Nucleic Acids Research. 45 (10), 5639-5652 (2017).</li>
<li>Kassambara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GenomicScape%3A+an+easy-to-use+web+tool+for+gene+expression+data+analysis.+Application+to+investigate+the+molecular+events+in+the+differentiation+of+B+cells+into+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">GenomicScape: an easy-to-use web tool for gene expression data analysis. Application to investigate the molecular events in the differentiation of B cells into plasma cells.</a> PLOS Computational Biology. 11 (1), 1004077(2015).</li>
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</ol>

저자 공개할 게 없다

인간, PC 희귀 세포 분화 단계 전체 생물 학적 특성을 방해 해 부 장소에서 일어나는. 우리 개발 활성화 분자와 cytokines의 다양 한 조합에서 발생 하는 순차 세포 분화를 재생 하기 위하여 적용 이후에 다단계 문화 시스템을 사용 하 여 PC 차별화 모델에 생체 외에서 B는 vivo11,,1213에 다른 기관/조직.
Pc 차별화 모델에 다른 효율적인 생체 외에서 B 보고18,19했다. Le Gallou 개발한 모델 외. CD19에서 시작 하는 2 단계 문화 방법론 PC 차별화에 T 세포 의존 B 탐험+/CD27- 순진한 B 세포. Cocco ...

플라즈마 세포 (Pc) B 세포의 분화는 체액 성 면역에 대 한 필수적 이며 감염1에 대 한 호스트를 보호. B PC 차별화를 주요 변화 항 체 분 비에 맞게 전송 용량 및 신진 대사에 연결 됩니다. B PC 차별화를 제어 하는 전사 인자 광범위 하 게 연구 하 고 밝혀 독점 네트워크 B 및 PC 관련 전사를 포함 하 여 요인 (TFs)2. B 세포, PAX5 BCL6, BACH2 TFs에 B 세포 정체성2,3의 수호자. 유도 IRF4, PRDM1 인코딩 BLIMP1 및 XBP1 PC TF의 B 세포 유전자를 소화 하 고 유도 조정된 항 체 은닉 세포 transcriptional 프로그램3,,45. 이러한 조정된 transcriptional 변화는 secreted 형태의 면역 글로불린 무거운 체인2,3, 막 바인딩 폼에서 스위치 함께 Ig 유전자 녹음 방송 활성화와 관련 4. B PC 차별화를 바인딩과 그물에 관련 된 유전자의 유도로 연결 기능과 Golgi 기구 펼쳐진된 단백질 응답 (UPR) 활성화의 합성을 수용 하 여 PC에서 핵심적인 역할을 담당할 것으로 알려져 수 반하는 은닉 면역 글로불린6,7. TF XBP1이 셀룰러 적응8,,910에서 주요 역할을 한다.
B 세포와 Pc는 체액 성 면역의 중요 한 선수. 이해 하는 생물 학적 제어 생산과 정상 혈장 세포의 생존은 효율적인 면역 반응 및 면역 또는 면역 결핍을 방지 하는 치료 내정간섭에 중요 하 처리 합니다. PC는 전체 생물 학적 특성, 특히 인간에서에서 방해 해 부 위치에서 일어나는 초기 분화 단계와 희귀 세포 이다. 다단계 문화 시스템을 사용 하 여, 우리 PC 차별화 모델에는 생체 외에서 B를 보고 있다. 이 모델 재현 순차 세포 분화 및 성숙 vivo11,12,13. 에 다른 장기에서 발생 첫 번째 단계에서 메모리 B 세포 처음 CD40 ligand, oligodeoxynucleotides 및 cytokine 조합 하 여 4 일에 활성화 하 고 preplasmablasts (PrePBs)으로 차별화 합니다. 두 번째 단계에서 preplasmablasts는 CD40L oligodeoxynucleotides 자극을 제거 하 고 cytokine 조합을 변경 하 여 plasmablasts (PBs)로 분화를 유도. 세 번째 단계에서 plasmablasts는 cytokine 조합11,12변경 하 여 초기 Pc로 차별화를 유도. 네 번째 단계 이러한 초기 Pc 골 수 기질 세포 조절 매체와 경작 하 여 완전히 성숙한 Pc를 소개 했다 또는 성장 요인13을 선택. 이러한 성숙한 Pc 생체 외에서 몇 달 동안 살아남을 수 있고 분 비 면역 글로불린 (그림 1)의 높은 양의. 흥미롭게도, 우리의 생체 외에서 모델이 조정 transcriptional 변화와 감지 vivo에서11,12,13,14 수 있는 PC 단계에 다른 B 형 ,15. Pc는 희귀 세포 및 우리의 체 외 분화 모델 인간의 B PC 차별화를 연구 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>항-CD2 자석 비즈</td><td>Invitrogen</td><td>11159D</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD138-APC</td><td>Beckman-Coulter&nbsp;</td><td>B49219</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD19-APC</td><td>BD</td><td>555415</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD20-PB</td><td>Beckman-Coulter&nbsp;</td><td>B49208</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD27-PE</td><td>BD</td><td>555441</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD38-PE</td><td>Beckman-Coulter&nbsp;</td><td>A07779</td><td></td></tr><tr><td>안티 히스티딘</td><td>R & D Systems</td><td>MAB050</td><td></td></tr><tr><td>CpG ODN(PT)</td><td>시그마</td><td></td><td>T*C*G*T*G*T*T*G*T*C* G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T</td></tr><tr><td>인간 전사</td><td>시그마-알드리치</td><td>T3309</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&알파;</td><td>Merck</td><td>Intron A</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>31980-022</td><td></td></tr><tr><td>Recombinan Human CD40L-hi</td><td>R& D 시스템</td><td>2706-CL</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 APRIL</td><td>R & D 시스템</td><td>5860-AP-010</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 IL-10</td><td>R& D 시스템</td><td>217-IL-</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 IL-15</td><td>Peprotech</td><td>200-15-10ug</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 IL-2 단백질</td><td>R& D 시스템</td><td>202-IL-</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 IL-6</td><td>Peprotech</td><td>200-06</td><td></td></tr></tbody></table>

수명이 긴 플라즈마 세포에 인간의 정상적인 메모리 b 세포의 체 외 분화 모델

In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells

플라즈마 세포 (Pc)는 많은 양의 항 체를 분 비 하 고 활성화 된 B 세포에서 개발. Pc 희귀 세포 골 수 또는 점 막에 위치 하 고 체액 성 면역을 확인 합니다. 그들의 낮은 주파수 및 위치, Pc의 연구는 어려운 인간에서. 우리 PC에는 B를 보고 선택한 조합의 vivo에서 발생 하는 순차 세포 분화를 재현할 수 있도록 하는 cytokines 및 활성화 분자를 사용 하 여 체 외 분화 모델. 그리고 마지막으로, 긴에이 체 외 모델, 메모리 B 세포 (MBCs) (PBs), 초기 Pc 사전 plasmablasts (prePBs), plasmablasts로 차별화에 Pc는 표현 형 가까운 건강 한 개인. 에서 그들의 대응에 우리 또한 오픈 액세스 생물 정보학 GEP 데이터 PC 분화에 관련 된에서 가장 눈에 띄는 정보를 분석 하는 도구를 만들었습니다. 인간의 B PC 차별화 하 고 현재 연구에 연구를 이러한 리소스를 사용할 수 있습니다, 그리고 우리 인간의 B PC 차별화를 하는 동안 후 요인의 유전자 표현 규제 조사.

생체 외에서 정상적인 PC 차별화의 전반적인 절차는 그림 1에 표시 됩니다. 여기에 제시 된 프로토콜을 사용 하 여, 우리 수 얻을 수 없는와 ex vivo 인간의 샘플 셀의 충분 한 수량을 생성할 수 있습니다. PC 분화에 관련 된 녹음 방송 요인의 복잡 한 네트워크의 역할을 조사 하지만 키 PC 차별화 전사 네트워크 규제 메커니즘 가난 하 게 알려진 남아 있습니다. 세포질 감 별 법은 주로 transcriptional epigenetic 변화에 의해 구동 됩니다. 우리는 epigenetic 요인 정상 플라즈마 세포 차별화에의 식을 변화 조사 우리의 생체 외에서 모델과 PC GEP 아틀라스 B를 사용 하 여.
정상적인 플라스마 세포 분화에 epigenetic 요소 식 우리는...

생체 외에서 B 세포 플라즈마 세포 차별화 모델을 보고 다단계 문화 시스템을 사용 하 여, 우리.

수명이 긴 플라즈마 세포에 인간의 정상적인 메모리 B 세포의 체 외 분화 모델

Plasma cells (PCs) secrete large amounts of antibodies and develop from B cells that have been activated. PCs are rare cells located in the bone marrow or ...

플라즈마 세포는 특히 인간에서 완전한 생물학적 특성을 손상시키는 해부학 위치에서 일어나는 30 개의 분화 단계를 가진 희귀 세포입니다. 당사의 시험관 내 B2 혈장 세포 분화 모델은 생체 내의 상이한 기관에서 발생하는 순차적 세포 분화 및 성숙을 재현합니다. 이러한 시험관 내 모델은 생체 내에서 검출될 수 있는 상이한 B2 혈장 세포 단계의 조정된 전사 변화 및 표현형을 재구성한다.또한 플라즈마 세포 분화와 관련된 탐사 데이터에서 가장 눈에 띄는 정보를 분석하기 위해 개방형 생체 정보 도구를 구축했습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 포스트 닥, 위그 드 Boussac 될 것입니다. 시작하려면, 메모리 B 세포 정화를 위한 건강한 자원봉사자에게서 말초 혈액 세포를 얻습니다.RPMI 1640 배지의 24.5 밀리리터로 7.5 밀리리터의 혈액을 희석시하십시오. 다음으로, 멸균 50 밀리리터 원물 튜브에 실온 밀도 그라데이션 12.5 밀리리터를 추가합니다. 밀도 그라데이션을 희석된 혈액의 32 밀리리터와 부드럽게 오버레이하여 두 단계의 혼합을 최소화합니다.원심분리기는 500배의 중력으로 20분 동안 브레이크를 벗습니다. 희석된 플라즈마 및 밀도 그라데이션 인터페이스에서 말초 혈액 단핵 세포를 수집합니다. 세포를 멸균 50 밀리리터 튜브로 옮기고 행크의 균형 잡힌 소금 용액으로 튜브를 최대 45 밀리리터까지 채웁니다.5분 동안 500배의 중력에서 원심분리기. 상체를 조심스럽게 제거하고 펠릿을 유지합니다. 그런 다음 10%의 FCS로 보완된 RPMI 1640 배지의 45밀리리터를 추가합니다.5분 동안 500배의 중력에서 원심분리기. 상체를 조심스럽게 제거하고 펠릿을 유지합니다. 2%의 FCS로 보완된 PBS 30밀리리터를 추가합니다.안티 CD 자기 구슬을 사용하여 하나의 대상 셀에 4 개의 구슬을 추가하여 CD2 양성 세포를 제거하십시오. 섭씨 4도에서 30분간 배양하세요. 세포 분리 응용 을 위해 자석을 사용하여 비드 바운드 셀과 비드 바운드 셀을 분리합니다.언바운드 세포를 수집하고 항 CD19 APC 및 항 CD27 PE 항체를 섭씨 4도에서 15분 동안 배양합니다. 10%의 염소 세럼을 함유한 PBS에서 셀을 두 번 세척합니다. 그런 다음 셀 선별기를 사용하여 메모리 B 세포를 95%순도로 정화합니다.그 후, 메모리 B 세포 활성화를 위한 용해성 CD40 리간드 및 항 폴리히스티딘 단일 클론 항체를 추가한다. 정제된 메모리 B 세포를 인터류인-2, 인터류빈-10 및 인터류빈-15와 함께 4일 동안 6웰 배양 판에 플레이트한다. 유전자 발현 프로파일링을 위해, 세포 선별기를 사용하여 4일째에 CD38-음수 CD20-음수 프리플라즈마블라스트를 정화한다.4일째에, 세포를 계산하고 각 우물에 세포 현탁액의 2 밀리리터를 추가하여 밀리리터 당 250, 000 세포의 세포 밀도에서 12웰 배양 판으로 그들을 플레이트. 분화를 유도하기 위해 CPG 올리고뉴클레오티드 및 수용성 CD40 리간드를 제거하고 인터류킨-2, 인터류킨-6, 인터류킨-10 및 인터류킨-15를 포함한 새로운 사이토카인 칵테일을 함유한 새로운 배양 배지를 추가한다. 섭씨 37도에서 3 일 동안 세포를 배양합니다.유전자 발현 프로파일링을 위해, 7일째에 CD38 양성, CD20-음극을 정화하기 위해 세포 선별기를 사용한다. 7일째에 셀을 세어보라고 합니다. 12웰 배양 판에서 세포를 잘 당 500, 000 세포의 세포 밀도로 플레이트, 각각의 우물에 세포 현탁액의 2 밀리리터를 첨가하여.혈장 폭발을 인터류킨-6, 인터류킨-15 및 인터페론 알파를 포함하는 신선한 배양 배지를 사용하여 초기 혈장 세포로 37도에서 3일간 분화한다. 유전자 발현 프로파일링을 위해, 세포 선별기를 사용하여 10일째에 CD20-음성, CD38 양성, CD138 양성 조기 혈장 세포를 정화한다. 첫째, 배양 기질 세포는 배양 배지를 가진 5 일 동안.0.2 마이크로리터 필터를 사용하여 기질 세포 배양 상수체를 필터링하여 기질 세포 조절 배지를 얻고 사용할 준비가 될 때까지 동결하십시오. 다음으로, 12웰 배양판에서 초기 혈장 세포를 배양하고, 인터류빈-6 및 4월의 세포 밀도에서 인터류빈-6 및 4월을 각각 양단에 세포 현탁액의 2밀리리터를 첨가함으로써 이전에 수득된 기질 세포 배지를 이용하여 배양한다. 섭씨 37도에서 배양하여 매주 기질 세포 조절 배지를 갱신합니다.이어서, 혈류 세포 분석 선별 플라즈마 세포로부터 면역글로불린 분비를 측정한다. 24 시간 동안 밀리리터 당 백만 세포의 밀도로 플라즈마 세포를 배양하고 배양 상류체를 수확한다. ELISA 키트를 사용하여 면역글로불린 G 및 면역글로불린 A.First를 측정하여 유전체학 오픈 액세스 생물정보학 웹 도구를 시작합니다.찾아보기 데이터 메뉴에서 인간 B 셀이라는 데이터 집합을 플라즈마 셀로 선택합니다. 독특한 유전자 또는 유전자 목록의 유전자 발현 프로파일의 시각화는 분석 도구에서 발현/공동발현 보고서 도구를 사용하여 사용할 수 있다. 다음으로 분석 도구 웹SAM을 선택하여 SAM 도구를 로드합니다.인간 B 세포를 플라즈마 세포 데이터 집합에 선택하고 비교할 샘플 그룹을 선택합니다. 관심 있는 필터링 옵션을 적용하려면 사용 가능한 다양한 필터를 사용합니다. 유전자 발현 프로파일을 SAM 도구와 비교하려면 접이식 변화, 순열 수, 거짓 발견 률 및 비교 유형을 포함한 필터링 옵션을 수정합니다.이 소프트웨어는 분석을 계산하고 선택한 그룹 간에 분화된 유전자를 제공합니다. 이 연구에서는 정상적인 혈장 세포 분화에서 후성 유전학 적 요인의 발현 변화가 조사됩니다. 다류 SAM 분석을 이용하여, 71개의 유전자는 메모리 B 세포, 전혈소, 플라즈마 폭발, 초기 혈장 세포 및 골수 혈장 세포 사이에 5%의 거짓 발견율을 가진 현저하게 분화되는 것으로 보이며, 메모리 B 세포 단계는 그의 39.13%를 포함한 23개의 후생유전학적 플레이어 유전자의 과발현을 특징으로 한다.33그의 세틸아테아제30%의 유전자를 포함한다. , 히스톤 데메틸라제 21.74%, 메틸 결합 단백질4.35%, 히스톤 디스티틸라스 4.35%.14 후생유전학적 플레이어 유전자는 프리플라즈마블라스트 단계에서 크게 과발현되며, 여기에는 히스톤 메틸 트랜스퍼라아제의 50%, DNA 메틸 트랜스퍼라제의 14.28%, 히스톤 디아틸라스 21.43%, 그의 톤 데메틸라스 7.14%, 그의 세톤 아질 트랜스포메이아의 17.14%를 포함하였습니다. 이 절차에 따라, 이러한 B2 플라즈마 세포 분화 동안 크로마틴 구조 및 아키텍처의 수정을 식별하고 이해하기 위한 여러 분석이 수행될 수 있었다. 이 체외 분화 모델은 B2 플라즈마 세포 분화 중 이 전체 모델링과 다운스트림 전사 영향에 관련된 경로와 다운스트림 전사 적 영향을 모두 밝히기 위해 이 분자 분석을 완료하기에 충분한 세포를 생성할 수 있게 합니다.이 연구에서 파생 된이 지식은 다발성 골수종의 경우와 같은 혈장 세포 질환에 대한 진단 및 치료 전략을 알리고 지시 할 수 있으며, 더 나은 예후와 개선 된 치료 전략이 비판적으로 필요한 확실한 치료법이없는 암. B2 플라즈마 세포 분화 시 크로마틴에 영향을 미치는 후성 유전학 리모델링 구조 및 건축 적 변화를 특성화하고 이해하는 것은 특히 흥미로할 것입니다. 이것은 유전자 염기서열 분석, ERRBS, ATAC 염기서열 분석, IC 및 RNA 순서를 사용하여 행해질 수 있었습니다.적당한 이질성은 건강한 기증자의 혈액에 따라 활성화된 B 세포, 전혈전 폭발, 혈장 폭발 및 혈장 세포의 백분율에서 관찰될 수 있었습니다, 메모리 B 세포 정화를 위해 이용된.

in-vitro-differentiation-model-human-normal-memory-b-cells-to-long

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 엡스타인 - 바 바이러스를 사용하여 변형 B 세포 라인을 생성하는 방법을 설명합니다. 우리는 또한 감염 후 삼일 빠르면 변환을 받다 운명 B 세포를 식별할 수있는 소설 분석을 설명합니다.

엡스타인 - 바 바이러스 성장 변화 Lymphoblastoid 전지 라인 구축

인간 단클론 항체의 합성은 자가 항체 매개 면역 반응의 병태생리학적 메커니즘을 밝히는 것을 목표로 하는 연구의 첫 번째 단계입니다. 당사는 B 세포 분리, 항체 클로닝 및 체외 합성을 포함하여 혈액 분류 B 세포에서 재조합 인간 면역글로불린 G(IgG) 단클론 항체를 생성하는 프로토콜을 개발했습니다.

정렬 된 불멸화 된 B 세포로부터 재조합 인간 IgG 단일 클론 항체의 생성

인간의 말초 혈액은 일반적으로 체액성 면역 반응의 평가에 사용됩니다. 여기에서는 말초 혈액에서 인간 B 세포를 분리하고, 배양에서 인간 B 세포를 항체(Ab) 분비 B 세포(ASC)로 분화하고, ELISpot 분석을 통해 총 IgM- 및 IgG-ASC를 열거하는 방법에 대해 설명합니다.

분리는 차별화 및 정량화 인간의 혈액에서 B 세포를 항체가 분비 : ELISPOT을 체액 면역의 기능 판독으로

이 프로토콜은 체외 나이브 CD4 + T 세포로부터 재생 가능한 생성 유도 인간 T 조절 세포 (iTregs)의 표현형을 설명한다. Foxp3의 유도를위한 다른 프로토콜은 각각의 프로토콜로 얻은 특정 iTreg의 표현형 연구를 허용합니다.

TGF-β 함유 프로토콜을 사용하여 나이브 CD4 + T 세포에서 인간의 CD4 + Foxp3의 + 유도 규제 T 세포 (iTregs)의 체외 분화

B-LCLS을 설정하기위한 간단한 적혈구 용해 방법은 소량의 혈액을 필요로하고 동결 보존 개시로부터 시간을 절약 불멸화 높은 효율로 발전되었다.

B 임파 세포 라인의 설립에 대한 간단한 적혈구 용해 방법

인간의 혈액에서 회람 하는 드문 B 세포에서 시작 인간 항 체의 항 원에 대 한 특정의 생산 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 자연 항 체의 생성은 효율적이 고 신속한, 그리고 얻은 항 체 매우 관련된 항 원 사이 차별 수 있습니다.

희귀 한 항 원 특정 B 세포 혈액 순환에서 구별 인간 단일 클론 항 체의 생성

본 문서에서는 3차원(3D) 흉선 배양 시스템에 의해 종양 항원 특이적 유도 만능 줄기 세포 유래 흉선 이주자(iTE)를 생성하는 새로운 방법을 설명한다. iTE는 증식, 기억 형성 및 종양 억제 능력을 가진 순진한 T 세포와 밀접하게 관련된 T 세포의 균질한 서브세트이다.

뮤린 유도 만능 줄기 세포 유래 종양 항원 특이적 흉선 유이주자를 생성하는 3차원 흉선 배양 시스템

인간 말초 혈액 단핵 세포로부터 개별 항원 특이적 항체를 식별하고 회수하는 BSelex 방법은 유세포 측정과 단일 세포 PCR 및 복제를 결합합니다.

농축 된 인간 기억 B 세포 집단에서 원하는 특이성을 가진 항체의 선택 및 회복을위한 단세포 스크리닝 방법

본 명세서에 의한 복막, 비장 및 골수 조직에서 뮤린 면역 B 세포 구획의 이질성에 대한 간단한 분석을 설명한다. 프로토콜을 다른 마우스 조직으로 조정하고 확장할 수 있습니다.

뮤린 B 세포 발달의 유동 세포 측정 특성화

이 프로토콜은 in vitro에서 naive CD4+ T 세포를 병원성 Th17 세포로 분화하는 과정을 설명합니다. 특히, 다중 파라미터 유세포 분석 기반 접근법과 결합하면 이 분화 방법을 사용하여 naïve CD4+ T 세포에서 병원성 Th17 세포의 90% 순도를 얻을 수 있습니다.

마우스에서 Naive CD4+ T 세포를 병원성 Th17 세포로 체외에서 분화

CD8 T 세포의 분화 및 기능을 시험 관 내에서 연구하기 위해, CD8 T 세포를 마우스에서 분리하여 기존에 형성된 감염된 쥐 질 상피 유기체와 장기간 공동 배양할 수 있습니다. 여기서는 이 과정을 설명하고 공동 배양 시 상주 기억 T 세포 표지자의 획득을 평가합니다.

시험관 내 상피 오가노이드-T 세포 공동 배양 시스템을 이용한 상류 기억 CD8 T 세포 분화

학습하세요 인간 기억 B 세포의 체외 분화 모델을 통해 장수 플라즈마 세포 형성 과정을 탐구하는 방법을. 멀티스텝 배양 시스템과 오픈 접근 바이오정보학 도구를 활용하여 B2 플라즈마 세포 분화 단계를 재현합니다.

수명이 긴 플라즈마 세포에 인간의 정상적인 메모리 B 세포의 체 외 분화 모델

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