수명이 긴 플라즈마 세포에 인간의 정상적인 메모리 B 세포의 체 외 분화 모델

플라즈마 세포는 특히 인간에서 완전한 생물학적 특성을 손상시키는 해부학 위치에서 일어나는 30 개의 분화 단계를 가진 희귀 세포입니다. 당사의 시험관 내 B2 혈장 세포 분화 모델은 생체 내의 상이한 기관에서 발생하는 순차적 세포 분화 및 성숙을 재현합니다. 이러한 시험관 내 모델은 생체 내에서 검출될 수 있는 상이한 B2 혈장 세포 단계의 조정된 전사 변화 및 표현형을 재구성한다.

또한 플라즈마 세포 분화와 관련된 탐사 데이터에서 가장 눈에 띄는 정보를 분석하기 위해 개방형 생체 정보 도구를 구축했습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 포스트 닥, 위그 드 Boussac 될 것입니다. 시작하려면, 메모리 B 세포 정화를 위한 건강한 자원봉사자에게서 말초 혈액 세포를 얻습니다.

RPMI 1640 배지의 24.5 밀리리터로 7.5 밀리리터의 혈액을 희석시하십시오. 다음으로, 멸균 50 밀리리터 원물 튜브에 실온 밀도 그라데이션 12.5 밀리리터를 추가합니다. 밀도 그라데이션을 희석된 혈액의 32 밀리리터와 부드럽게 오버레이하여 두 단계의 혼합을 최소화합니다.

원심분리기는 500배의 중력으로 20분 동안 브레이크를 벗습니다. 희석된 플라즈마 및 밀도 그라데이션 인터페이스에서 말초 혈액 단핵 세포를 수집합니다. 세포를 멸균 50 밀리리터 튜브로 옮기고 행크의 균형 잡힌 소금 용액으로 튜브를 최대 45 밀리리터까지 채웁니다.

5분 동안 500배의 중력에서 원심분리기. 상체를 조심스럽게 제거하고 펠릿을 유지합니다. 그런 다음 10%의 FCS로 보완된 RPMI 1640 배지의 45밀리리터를 추가합니다.

5분 동안 500배의 중력에서 원심분리기. 상체를 조심스럽게 제거하고 펠릿을 유지합니다. 2%의 FCS로 보완된 PBS 30밀리리터를 추가합니다.

안티 CD 자기 구슬을 사용하여 하나의 대상 셀에 4 개의 구슬을 추가하여 CD2 양성 세포를 제거하십시오. 섭씨 4도에서 30분간 배양하세요. 세포 분리 응용 을 위해 자석을 사용하여 비드 바운드 셀과 비드 바운드 셀을 분리합니다.

언바운드 세포를 수집하고 항 CD19 APC 및 항 CD27 PE 항체를 섭씨 4도에서 15분 동안 배양합니다. 10%의 염소 세럼을 함유한 PBS에서 셀을 두 번 세척합니다. 그런 다음 셀 선별기를 사용하여 메모리 B 세포를 95%순도로 정화합니다.

그 후, 메모리 B 세포 활성화를 위한 용해성 CD40 리간드 및 항 폴리히스티딘 단일 클론 항체를 추가한다. 정제된 메모리 B 세포를 인터류인-2, 인터류빈-10 및 인터류빈-15와 함께 4일 동안 6웰 배양 판에 플레이트한다. 유전자 발현 프로파일링을 위해, 세포 선별기를 사용하여 4일째에 CD38-음수 CD20-음수 프리플라즈마블라스트를 정화한다.

4일째에, 세포를 계산하고 각 우물에 세포 현탁액의 2 밀리리터를 추가하여 밀리리터 당 250, 000 세포의 세포 밀도에서 12웰 배양 판으로 그들을 플레이트. 분화를 유도하기 위해 CPG 올리고뉴클레오티드 및 수용성 CD40 리간드를 제거하고 인터류킨-2, 인터류킨-6, 인터류킨-10 및 인터류킨-15를 포함한 새로운 사이토카인 칵테일을 함유한 새로운 배양 배지를 추가한다. 섭씨 37도에서 3 일 동안 세포를 배양합니다.

유전자 발현 프로파일링을 위해, 7일째에 CD38 양성, CD20-음극을 정화하기 위해 세포 선별기를 사용한다. 7일째에 셀을 세어보라고 합니다. 12웰 배양 판에서 세포를 잘 당 500, 000 세포의 세포 밀도로 플레이트, 각각의 우물에 세포 현탁액의 2 밀리리터를 첨가하여.

혈장 폭발을 인터류킨-6, 인터류킨-15 및 인터페론 알파를 포함하는 신선한 배양 배지를 사용하여 초기 혈장 세포로 37도에서 3일간 분화한다. 유전자 발현 프로파일링을 위해, 세포 선별기를 사용하여 10일째에 CD20-음성, CD38 양성, CD138 양성 조기 혈장 세포를 정화한다. 첫째, 배양 기질 세포는 배양 배지를 가진 5 일 동안.

0.2 마이크로리터 필터를 사용하여 기질 세포 배양 상수체를 필터링하여 기질 세포 조절 배지를 얻고 사용할 준비가 될 때까지 동결하십시오. 다음으로, 12웰 배양판에서 초기 혈장 세포를 배양하고, 인터류빈-6 및 4월의 세포 밀도에서 인터류빈-6 및 4월을 각각 양단에 세포 현탁액의 2밀리리터를 첨가함으로써 이전에 수득된 기질 세포 배지를 이용하여 배양한다. 섭씨 37도에서 배양하여 매주 기질 세포 조절 배지를 갱신합니다.

이어서, 혈류 세포 분석 선별 플라즈마 세포로부터 면역글로불린 분비를 측정한다. 24 시간 동안 밀리리터 당 백만 세포의 밀도로 플라즈마 세포를 배양하고 배양 상류체를 수확한다. ELISA 키트를 사용하여 면역글로불린 G 및 면역글로불린 A.First를 측정하여 유전체학 오픈 액세스 생물정보학 웹 도구를 시작합니다.

찾아보기 데이터 메뉴에서 인간 B 셀이라는 데이터 집합을 플라즈마 셀로 선택합니다. 독특한 유전자 또는 유전자 목록의 유전자 발현 프로파일의 시각화는 분석 도구에서 발현/공동발현 보고서 도구를 사용하여 사용할 수 있다. 다음으로 분석 도구 웹SAM을 선택하여 SAM 도구를 로드합니다.

인간 B 세포를 플라즈마 세포 데이터 집합에 선택하고 비교할 샘플 그룹을 선택합니다. 관심 있는 필터링 옵션을 적용하려면 사용 가능한 다양한 필터를 사용합니다. 유전자 발현 프로파일을 SAM 도구와 비교하려면 접이식 변화, 순열 수, 거짓 발견 률 및 비교 유형을 포함한 필터링 옵션을 수정합니다.

이 소프트웨어는 분석을 계산하고 선택한 그룹 간에 분화된 유전자를 제공합니다. 이 연구에서는 정상적인 혈장 세포 분화에서 후성 유전학 적 요인의 발현 변화가 조사됩니다. 다류 SAM 분석을 이용하여, 71개의 유전자는 메모리 B 세포, 전혈소, 플라즈마 폭발, 초기 혈장 세포 및 골수 혈장 세포 사이에 5%의 거짓 발견율을 가진 현저하게 분화되는 것으로 보이며, 메모리 B 세포 단계는 그의 39.13%를 포함한 23개의 후생유전학적 플레이어 유전자의 과발현을 특징으로 한다.33그의 세틸아테아제30%의 유전자를 포함한다. , 히스톤 데메틸라제 21.74%, 메틸 결합 단백질4.35%, 히스톤 디스티틸라스 4.35%.

14 후생유전학적 플레이어 유전자는 프리플라즈마블라스트 단계에서 크게 과발현되며, 여기에는 히스톤 메틸 트랜스퍼라아제의 50%, DNA 메틸 트랜스퍼라제의 14.28%, 히스톤 디아틸라스 21.43%, 그의 톤 데메틸라스 7.14%, 그의 세톤 아질 트랜스포메이아의 17.14%를 포함하였습니다. 이 절차에 따라, 이러한 B2 플라즈마 세포 분화 동안 크로마틴 구조 및 아키텍처의 수정을 식별하고 이해하기 위한 여러 분석이 수행될 수 있었다. 이 체외 분화 모델은 B2 플라즈마 세포 분화 중 이 전체 모델링과 다운스트림 전사 영향에 관련된 경로와 다운스트림 전사 적 영향을 모두 밝히기 위해 이 분자 분석을 완료하기에 충분한 세포를 생성할 수 있게 합니다.

이 연구에서 파생 된이 지식은 다발성 골수종의 경우와 같은 혈장 세포 질환에 대한 진단 및 치료 전략을 알리고 지시 할 수 있으며, 더 나은 예후와 개선 된 치료 전략이 비판적으로 필요한 확실한 치료법이없는 암. B2 플라즈마 세포 분화 시 크로마틴에 영향을 미치는 후성 유전학 리모델링 구조 및 건축 적 변화를 특성화하고 이해하는 것은 특히 흥미로할 것입니다. 이것은 유전자 염기서열 분석, ERRBS, ATAC 염기서열 분석, IC 및 RNA 순서를 사용하여 행해질 수 있었습니다.

적당한 이질성은 건강한 기증자의 혈액에 따라 활성화된 B 세포, 전혈전 폭발, 혈장 폭발 및 혈장 세포의 백분율에서 관찰될 수 있었습니다, 메모리 B 세포 정화를 위해 이용된.