Name: Immunohistochemistry 파라핀 임베디드 3D Glioma Neurosphere 문화에 의해 Glioma 바이오 마커의 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: 배우세요 파라핀 임베디드 면역조직화학법을 이용하여 3D 신경구체의 형태를 보존하면서 교모세포종 바이오마커를 평가하는 방법을. 이 기법은 종양 생물학 연구에 필수적인 도구입니다.

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이 작품은 국립 연구소의 건강/국립 연구소의 신경 장애 및 뇌졸중 (NIH/NINDS) 보조금 R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 M.G.C.;에 의해 지원 되었다 NIH/NINDS 부여 R01-NS076991, R01-NS082311, 및 R01-NS096756 P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; 1UO1CA224160; 신경외과 학과; 레 아의 행복 한 마음은 M.G.C. 및 P.R.L.; 그리고 RNA 의학 그랜트 F046166 M.G.C. F.M.M.에 의해 한 F31 NIH/NINDS-F31NS103500 지원 됩니다. Jp 모 간 풀브라이트 아르헨티나 스포츠 사역 및 교육 협력에 의해 지원 되었다.

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 미시간 대학에 의해 승인 되었습니다.
1. 뇌 종양 Neurospheres 마우스 모델에서 파생 된 세대
<ol><li>해 부 절차 전에 신경 줄기 세포 미디어 준비 (NSC 미디어: 1 x B27 보충, 1 x N2 보충, 1 x normocin, 및 1 x 항생제/antimycotic 인간 재조합 EGF와 20 ng/ml 각 농도에서 기본적인 FGF 보충 DMEM/F12). NSC 미디어의 300 µ L와 1.5 mL 튜브를 나중을 위해 예약.</li>
	<li>큰 종양으로 마우스를 선택 합니다. 참고: 종양의 크기 경우 플라스 미드 또는 바이러스 주입 인코딩합니다 소 생물 발광에 의해 모니터할 수 있습니다. 일반적으로, 큰 종양 > 106 /sr 광자/s/c m2의 생물 발광을 있다.</li>
	<li>Isoflurane의 과다와 함께 마우스를 안락사: isoflurane 티슈 페이퍼 고취와 자극을 방지 하기 위해 마우스와 직접 접촉을 피하고 euthanization 챔버에 조직 소개. 쥐 페달 반사 (일반적으로 5-10 분)을 표시 하지 않습니다 때까지 기다립니다. 목을 벨 마우스 및 Calinescu 외 에 설명 된 대로 뇌를 해 부 13.</li>
	<li>형광 성 종양 인 경우 형광 램프를 장착 해 현미경을 사용 하 여 뇌 내 종양 질량을 식별. 좋은 집게와 정상적인 뇌 조직에서 종양 (보통 5-7 m m 직경)를 해 부.</li>
	<li>NSC 미디어 (단계 1.1) 1.5 mL 튜브에 해 부 종양을 놓습니다. Microcentrifuge 튜브의 벽에 부드러운 압력을 적용 하 여 맞는 일회용 플라스틱 유 봉과 종양을 균질.</li>
	<li>해리 셀 덩어리, 분리 효소-무료 미디어의 1 mL을 추가 하 고 37 ° c.에 5 분 동안 품 어</li>
	<li>NSC 미디어의 20 mL와 여과기를 세척 및 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 세포 현 탁 액을 필터링 합니다.</li>
	<li>5 분 x 300g에 centrifuge, 상쾌한, 가만히 따르다 하 고 다시 6 mL 또는 펠 릿의 크기에 따라 NSC 미디어의 15 mL에 펠 릿을 일시 중단.</li>
	<li>종양 세포 현 탁 액 T-25 또는 T-75 문화 플라스 크 및 문화 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 95% 공기와 5% CO2의 분위기 접시.</li>
	<li>3 일 후, 건강 한 중단된 NS를 전송 하 고 다시 T-25 또는 T-75 조직 배양 플라스 크에 접시. 필요한 경우 문화에 더 많은 NSC 미디어를 추가 합니다. 참고: 일반적으로 세포의 혼합된 인구 있을 것입니다, 일부 죽은, 일부 준수 할 것입니다, 그리고 일부 매체에서 부동 것입니다 NS 형성 될 것 이다</li>
</ol>2. 유지 및 NS를 뿌리고
참고: 자라 난 방지 하 고 상대적으로 높은 밀도에서 세포를 유지 한다. 합류는 구체 크기 (큰 분야 의미 자라 난 검은 센터)에 의해 결정 됩니다. NS의 성장 율 oncogenes 종양 생성 하는 데 사용에 따라 달라 집니다.
<ol><li>NS 문화에는 confluency에 도달 했습니다, 일단 메 마른 분리기 관에 문화를 수집 하 고 5 분 동안 300 x g에서 NS를 작은.</li>
	<li>삭제는 상쾌한 세포 분리 솔루션의 1 mL을 추가 하 고 플라스틱 펠 릿을 다시 중단.</li>
	<li>튜브를 flicking 5 분 동안 37 ° C에서 셀 분리 수 있도록 매일 2 분을 품 어. 참고: NS confluency에 도달, 그들은 볼 수 있습니다 일반적으로 거시적으로 작은 백색 분야. 보장 하기 위해 세포 분리, 적어도 모든 보이는 NS 사라진 해야 합니다.</li>
	<li>HBSS 1의 5 mL을 추가 x 및 피 펫 여러 번. 5 분에 대 한 300 x g에서 펠 릿 세포는 상쾌한을 삭제합니다. 다시 재조합 EGF와 FGF 기본 보충 NSC 미디어의 5 ml에서는 펠 릿을 일시 중단 합니다.</li>
	<li>95% 공기와 5% CO2의 분위기와 NSC 미디어 문화와 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 T-75 플라스 크에서 15 mL를 셀의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>3 일 마다 성장 인자 (EGF와 기본적인 FGF)를 추가 합니다. 미디어 가벼운 경우 오렌지와 셀 아직 confluent, 미디어를 변경 합니다. 이렇게 하려면 4 분에 대 한 300 x g에서 NS 원심 그리고 성장 인자를 보충 하는 NSC 미디어에 다시 일시 중단. 참고: 형성 하는 펠 릿의 크기에 따라 셀 해야 더 플라스 크를 분할할 수 합니다.</li>
</ol>3. 장기 저장을 위한 NS 동결
<ol><li>NS 문화 confluent 때, 해리 셀 단계 2.1-2.4에에서 설명 된 대로. 일단 펠 릿 HBSS 다시 정지 하고있다, 한 약 수를 제거 하 고 셀을 계산.</li>
	<li>4 분에 대 한 300 x g에서 세포를 원심 고는 상쾌한의 가능한 한 많이 제거 합니다.</li>
	<li>다시 미디어 (열 비활성화 FBS, 10 %DMSO)에 펠 릿을 일시 중단 합니다. 1 x 106 mL 당 병 당 3 x 106 세포 사이 동결 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>얼음, 첫 번째 전송 하 여-20 ℃, 다음-80 ° C, 그리고 마지막으로 액체 질소 저장 컨테이너에 다음날 필요 하 고 천천히 튜브에 진정으로 많은 cryovials에 다시 정지 셀을 나눕니다.</li>
</ol>4입니다. 종양 NS의 고정
<ol><li>문화 종양 세포 confluent 때까지 2-3 일 동안 T-25 플라스 크에서 NS (~ 3 × 106 셀). 적어도 하나의 T-25 confluent 술병에서 종양 NS 15 mL 원뿔 튜브에서를 수집 합니다. 5 분 x 300g에 작은.</li>
	<li>다시 10% 포 르 말린의 1 mL에 펠 릿을 일시 중단 하 고 10 분 추가 5 ml 1 x HBSS의 실 온 (RT)에서 계속 작은 셀 3.2 단계에서 완료. 이 단계를 한 번 더 반복 합니다.</li>
	<li>얼음에 펠 릿을 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브를 놓습니다.</li>
</ol>5. 파라핀 종양 NS의 포함
<ol><li>다시 2% 따뜻한 액체 agarose의 500 µ L에 씻어 NS 펠 릿을 일시 중단 하 고 pipetting으로 부드럽게 혼합.</li>
	<li>즉시 얼음에 agarose 임베디드 NS를 두고는 agarose polymerizes 때까지. 은닉 NS agarose 조각을 제거 합니다. (그림 2)를 처리 하는 조직에 대 한 카세트에 NS와 생산 agarose 조각을 넣으십시오.</li>
	<li>조직 처리 (자동 파라핀 프로세서를 사용 하 여) 계속 하 고 파라핀 포함 (를 사용 하 여 포함 역).</li>
</ol>6. 파라핀 끼워 넣어진 NS의 단면
<ol><li>42 ° C에 물 목욕을 설정 하 고 신중 하 게 2 개의 페인트 브러쉬를 사용 하 여 파괴는 다는 것을 확인 하는 톰에 넣은 후. 이 블레이드를 사용 하 여 트리밍에 대해서만.</li>
	<li>톰에 파라핀 블록을 배치 합니다. 비 지배적인 손을 가진 각 섹션의 두께 제어 하는 왼쪽에 있는 레버를 아래로 누릅니다. 30 µ m 두께 나타내는 두 번째 중지를 누릅니다.</li>
	<li>블록을 트리밍 시작 (즉., 초과 파라핀 제거) 샘플의 표면에이 때까지 오른손으로 거친 손으로 바퀴를 선회 하 여. 이 시점에서, 레버는 트림 두께 10 μ m 또는 5 μ m를 제어 하십시오. 트리밍 샘플의 표면에 도달 하면 중지 합니다.</li>
	<li>얼음 얼음 상자와 파라핀 블록 얼음에 놓으면 물 파라핀 블록, 직접 얼음을 만지기에서 보호 필름 역할도 충분 한 물을 추가. 파라핀 블록 20 분 동안 얼음에 품 어.</li>
	<li>오래 된 블레이드를 삭제 하 고 단면에 대 한 새로운 하나를 삽입 합니다. 건조 블록 다음에 톰에 배치, 거 즈를 사용 하 여.</li>
	<li>비 지배적인 손을 가진 파라핀 리본을 당겨 하는 데 사용 될 곡선된 집게의 쌍을 가져옵니다. 오른손 물 목욕을 파라핀 리본을 전송 하는 데 사용 됩니다 근처 젖은 페인트 브러쉬를 유지 합니다. 빠른 오른쪽 손으로 거친 손으로 바퀴를 선회 하 여 섹션을 시작 속도. 왼쪽 손에 집게를 사용 하 여 파라핀 리본을.</li>
	<li>젖은 페인트 브러시를 사용 하 여 파라핀 리본 물 목욕을 전송.</li>
	<li>분리는 섹션 피상적으로 두 개의 파라핀 섹션 사이 집게를 배치 후 부드럽게 떨어져 두 개의 섹션을 추진 하는 집게의 곡선을 사용 합니다. 참고:이 모션 파라핀 섹션의 표면에 완전히 해야 합니다. 누르지 마십시오 아래 섹션에.</li>
	<li>젖은 페인트 브러시를 사용 하 여 충전 된 접착 현미경 슬라이드에 분리 된 파라핀 섹션을 밀어.</li>
	<li>슬라이드 슬라이드 상자에 그들을 저장 하기 전에 화학 후드 안에 하룻밤 건조를 허용 합니다. 슬라이드 저장 수행 하는 얼룩의 종류에 따라 달라 집니다.</li>
</ol>7. 파라핀 끼워 넣어진 NS의 Immunohistochemistry (IHC)
<ol><li>금속 선반에 슬라이드를 배치 하 고 그들을 20 분 동안 60 ° C에서 배양 하 여 파라핀을 녹여.</li>
	<li>RT에 리하이드레이션 기차에 부 화 하 여 슬라이드를 deparaffinize: 크 실 렌 5 분, 2 분, 2 분, 2 분, 2 분, Hereon에 대 한 이온된 수 x 1에 대 한 70 %1 x 에탄올에 대 한 95 %2 x 에탄올에 대 한 100 %2 배 에탄올 x 3 유지 항 원 복구까지 수돗물에 슬라이드 밖으로 건조로 일반적인 항 체 바인딩을 발생할 것입니다.</li>
	<li>시트르산 buffer (10 m m 구 연산 산 성, 비 이온 세제 0.05%, pH 6) 30 125 ° C에서에서 슬라이드를 품 어 s 10에 대 한 90 ° C에서 s. 진정, 그들이 다음 5 번 증류수와 슬라이드를 씻어.</li>
	<li>30 분 동안 0.3% H2O2 에 RT에서 슬라이드를 품 어.</li>
	<li>워시 버퍼 (TBS에서 0.025% 세제) 부드러운 동요와 5 분 동안 세척에 3 번 슬라이드.</li>
	<li>30 분에 대 한 솔루션 (10% 말 혈 청, TBS에서 0.1 %BSA) 차단으로 RT에 슬라이드를 품 어.</li>
	<li>1 차적인 항 체 희석 솔루션 (TBS에서 0.1 %BSA) 준비와 습도 챔버에 4 ° C에서 하룻밤 슬라이드를 품 어. 3 번 부드러운 동요와 함께 5 분에 대 한 버퍼를 세척에 슬라이드를 씻어.</li>
	<li>Biotinylated 이차 항 체 희석 솔루션에서 준비와 1 시간에 대 한 실시간에 슬라이드를 품 어. 3 번 부드러운 동요와 함께 5 분에 대 한 버퍼를 세척에 슬라이드를 씻어.</li>
	<li>RT에서 슬라이드 avidin-biotinylated 양 고추냉이 과산화 효소 복잡 한와 함께 30 분 동안 어둠 속에 품 어. 3 번 부드러운 동요와 함께 5 분에 대 한 버퍼를 세척에 슬라이드를 씻어.</li>
	<li>DAB H2O2 기판 브랜드와 여기 실시간에 2-5 분에 대 한 슬라이드를 품 어</li>
	<li>수돗물으로 3 번을 씻어. (1-2 s) 되며 솔루션 counterstain, 슬라이드와 개간까지 수돗물에 그들을 철저 하 게 린스.</li>
	<li>다음과 같이 슬라이드를 탈수: 증류수 2 분 동안에 품 어, 80% 에탄올에 3 번을 찍어, 2 시간 2 분을 위한 95% 에탄올에서 품 어, 각, 2 분을 위한 2 시간 100% 에탄올에서 품 어 그리고 마지막으로 3 번 3 분에 크 실 렌에.</li>
	<li>Coverslip 자일 렌 기반 설치 매체와 슬라이드 이미징에 대 한 준비가 될 때까지 RT에서 평평한 표면에 말리 고.       참고: 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) 얼룩, 수행 하는 경우 슬라이드에 저장 될 수 실시간 그러나, 면역 형광 염색 법을 수행 하는 경우 사진 표백을 줄이기 위해-20 ° C에서 어둠에 슬라이드를 저장 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

이 문서에서는, 우리 선발 immunohistochemistry 파라핀 끼워 넣어진 glioma NS에 수행 하기 위해 다양 하 고 재현할 수 방법 두뇌 제자리에서 성장 하는 종양 세포의 특성 3 차원 구조를 유지 하는. 이 기술은 유리 또는 플라스틱 표면에 도금 하는 셀을 사용 하 여 다음과 같은 이점을: 난) NS;의 3D 구조의 보존 ii) 단백질 표정;의 분석 하기 전에 셀 분리의 스트레스의 방지 3) 유전자 조작된 종양 NS, 사용; 형광 스펙트럼에 걸쳐 얼룩에서 내 생 fluorophore 식의 냉각 그리고 iv) 장기 저장.
셀 잘 되도록 그들은 homogenously 배포 하지 함께 clumped agarose에서에서 다시 일시 중단 되도록이 기술의 중요 한 단계가입니다. 이 기술의 한 가지 제한 관련 세포 배양 및 NS IHC 절차를 착 색 하기 전에 처리 시간이 걸리는 단계입니다. 두 번째 제한 셀이이 방법을 실행 하는 데 필요한 높은 수입니다....

Gliomas 중추1세계 보건 기구 따르면 그들의 phenotypic genotypic 특성에 의해 분류의 기본 고체 종양입니다. 이 분류는 생체2의 매력적인 소스를 나타내는 드라이버 돌연변이의 유무를 통합 합니다. 생체 측정 하 고 치료 적 개입3약리 응답 뿐 아니라 정상 및 병 적인 프로세스를 나타내기 위해 평가 될 수 있는 생물 학적 특징입니다. 바이오 마커의 검출 될 수 있다 종양 조직에 셀 glioma에서 파생 된 다양 한 측면에서의 생물 학적 특성 사용. Glioma biomarkers의 몇 가지 예로 돌연변이 isocitrate 효소 1 (IDH1), 돌연변이 효소 더 나은 예 지4와 관련 된 낮은-학년 gliomas의 있습니다. IDH1 돌연변이 TP53 알파 thalassemia/정신 박약 증후군 X 연결 (ATRX)와 함께에서 자주 표현 된다-돌연변이 비활성화 특정 glioma 정의 하위4,5. ATRX 비활성화 돌연변이 또한 소아 고급 gliomas2,6 의 44%에서 발생 하 고 공격적인 종양 및 게놈 불안정성6,7관련 된 되었습니다. 또한, 소아 확산 본질적인 pontine gliomas (DIPG)는 히스톤 H3 유전자 H3F3A, 또는 HIST1H3B/C 유전자1,6K27M 돌연변이의 유무에 따라 하위 그룹에서 분화 된다. 따라서, 분자 특성의 소개 허용 세분, 연구, 그리고 더 더 개발 하면 별도 엔터티로 gliomas의 치료 대상으로 각 하위 형식에 대 한 치료. 또한, biomarkers의 분석 apoptosis8, autophagy9, 세포 주기 진행10, 셀 확산11, 세포 분화12 등 다른 생물 학적 과정을 평가에 사용할 수 있습니다. .
유전자 조작된 동물 모델 인간의 암 발생에 유전적 병 변의 항구는 질병의 진행을 중재 하는 통로 신호 하는 연구를 위한 중요 합니다. 우리의 실험실 glioma 은닉 인간의 glioma 하위13,14정리 특정 돌연변이의 유전자 조작된 마우스 모델 개발에 잠자는 아름다움 (SB) transposase 시스템의 사용을 구현 했습니다. 이러한 유전자 조작된 마우스 모델 3D 시스템에서 생체 외에서 연구는 종양에서 파생 된 NS를 생성 하는 데 사용 됩니다, 그리고 미러링 현저한 특징 종양에 원래의15에 제시. 또한, 쥐로 NS orthotopical 이식 1 차 종양의 기능을 유지 하 고 해당 기본 종양15의 histopathological, 게놈, 및 phenotypic 특성을 모방 하는 이차 종양을 생성할 수 있습니다.
혈 청 무료 문화에서 뇌 종양 세포 줄기 세포 특성을 가진 농축 될 수 있다, 그리고 표 피 성장 인자 (EGF)과 섬유 아 세포 성장 인자 (FGF), 존재 그들은 NS 문화 등 단일 세포 유래 식민지로 성장 될 수 있다. 이 선택적 문화 시스템에 대부분 차별화 또는 차별화 된 세포 급속 하 게 죽어, 반면 줄기 세포 분열과 세포 클러스터 형성. NS 문화 glioma 종양 기능16,,1718유지를 생성 수 있습니다. Glioma NS 종양 생물학, 생체 진단, 예 후, 분류, 종양 진행의 상태 및 세포 분화 상태에서 응용 프로그램의 분석을 포함 한 여러 가지 측면을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 여기, 우리가 glioma NS를 생성 하 고 사용 되는 파라핀에 3D 문화를 포함 하는 프로토콜 세부 IHC 얼룩에 대 한. 담합 및 glioma NS 포함의 장점 중 하나는 NS의 형태는 유지 더 나은 기존의 cytospin 방법19, 어떤 glioma에서 NS 셀 분리에 대 한 스트레스가 조작에 복종 하 고 평평 하 게 될에 비해입니다. 또한, 유전자 조작된 종양 NS, 형광 스펙트럼에 걸쳐 얼룩 사용에서 생 fluorophore 식 냉각 포함. 이 방법의 전반적인 목표는 과정을 포함 한 파라핀 glioma 셀의 3 차원 구조를 유지 하 고 glioma neurospheres immunohistochemistry를 사용 하 여 특성을 사용 하입니다.

<table><tbody><tr><td>코팅된 마이크로톰 블레이드 HP35</td><td>Thermo Scientific</td><td>3150734</td><td></td></tr><tr><td>Microtome RM 2135</td><td>Leica</td><td>MR2135</td><td></td></tr><tr><td>포르말린 용액, 중성 완충, 10%</td><td>Sigma-aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit polyclonal anti-ATRX,Santa</td> <td>Cruz Biotechnology</td><td>sc-15408</td><td>IHC, 1:250 희석</td></tr><tr><td>Rabbit polyclonal anti-Ki-67</td><td>Abcam</td><td>Ab15580</td><td>IHC, 1:1000 희석</td></tr><tr><td>토끼 다클론 항 OLIG2</td><td>Millipore</td><td>AB9610</td><td>IHC, 1:500 희석</td></tr><tr><td>염소 다클론 항 토끼 비오틴 접합</td><td>Dako</td><td>E0432</td><td>IHC, 1:1000 희석</td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC HRP 키트</td><td>Vector Laboratories Inc</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT</td><td>Biocare 의료</td><td>BDB2004 L/가격 12/18</td><td></td></tr><tr><td>N-2 보충제</td><td>ThermoFisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-27 보충제</td><td>ThermoFisher</td><td>A3582801</td><td></td></tr><tr><td>Accutase&reg; 세포 박리 솔루션</td><td>Biolegend</td><td>423201</td><td></td></tr><tr><td>AGAROSE LE</td><td>GoldBio</td><td>A-201-1000</td><td></td></tr><tr><td>Genesee Sc. Corporation</td><td>Olympus 15 ml</td><td>21-103</td><td></td></tr><tr><td>Genesee Sc. Corporation</td><td>TC-75 처리 플라스크</td><td>25-209</td><td></td></tr><tr><td>Genesee Sc. Corporation</td><td>TC-25 처리 플라스크</td><td>25-207</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11330-057</td><td>NS 매체</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>GibcoTM</td><td>14175-103</td><td>평형 염 용액</td></tr><tr><td>C57BL/6</td><td>Taconic</td><td>B6-f</td><td>C57BL/6 마우스</td></tr></tbody></table>

immunohistochemistry 파라핀 임베디드 3d glioma neurosphere 문화에 의해 glioma 바이오 마커의 평가

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Glioma에 단백질 발현의 분석은 여러 가지 측면의 병 리의 연구에 관련이 있습니다. 수많은 단백질 생체 진단, 예 후, 분류, 종양 진행의 상태 및 세포 분화 상태에서 응용 프로그램으로 설명 했습니다. 생체의 이러한 분석은 또한 종양 neurospheres (NS) glioma 환자 및 glioma 모델에서 생성 된 특성을 유용 합니다. 종양 NS 모델을 귀중 한 생체 외에서 평가는 그들이 파생 되 고 미러 glioma 생물학을 더 정확 하 게 수 있습니다 종양의 다른 기능을 제공 합니다. 종양 NS 바이오 마커 분석 하는 자세한 방법을 설명 여기에 파라핀 포함 종양 NS immunohistochemistry (IHC)를 사용 하 여.

종양 개발 모니터링 및 평가 종양 NS를 생성 하는 데 필요한 크기에 도달 하면, 우리는 생물 발광을 사용 하 여 종양에 의해 방출 하는 발광 분석. (그림 1A , 1B) luciferase의 발광 신호에 의해 새끼 및 종양 진행에 변환 효율의 연구 수 있습니다. 종양 크기는 1 x 107 광자/s/cm2/sr (그림 1B)의 신호에 도달 하면, NS 세대에 대 한 뇌를 처리할 수 있습니다. 이 시스템의 또 다른 장점은 다른 형광 단백질의 코딩 순서 유전자 전달 및 종양 생성에 사용 되는 플라스 미드에 추가할 수 있습니다. 우리 다음 형광 램프 (그림 1C)를 장착 해 현...

Neurospheres 3D 문화로 성장 glioma 생물학을 공부 하는 강력한 도구를 구성 합니다. 여기 선물이 immunohistochemistry 파라핀 포함 통해 glioma neurospheres의 3 차원 구조를 유지 하면서 수행 하는 프로토콜. 이 메서드는 stemness 등 신경 분화 glioma neurosphere 속성의 특성을 수 있습니다.

Immunohistochemistry 파라핀 임베디드 3D Glioma Neurosphere 문화에 의해 Glioma 바이오 마커의 평가

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

이 프로토콜은 종양 신경구의 3D 구조를 보존하는 방법에 의해 신경교종 바이오마커의 존재를 연구하는 데 사용될 수 있기 때문에 중요하다. 이 프로토콜의 주요 장점은 세포가 스트레스 조작을 실시하고 평평해지는 사이토스핀 방법에 비해 신경권의 형태가 유지된다는 것입니다. 이 방법은 세포가 3D로 배양되고 구조의 유지보수가 중요한 다른 조직 배양 시스템에 적용될 수 있다.시작하려면, 세포가 수렴 될 때까지 T-25 플라스크에서 배양 종양 신경구 또는 NS. 15 밀리리터 원내 관에서 종양 NS를 선출한다. NS를 300 Gs에서 5분간 임펠트하십시오.그 후, 펠릿을 10%의 포르말린 1밀리리터로 다시 중단하고 실온에서 10분 동안 튜브를 배양합니다. 다시 중단된 NS에 HBSS 5밀리리터를 추가합니다. 이전에 설명한 바와 같이 세포를 임펠트합니다. 펠릿이 들어 있는 튜브를 얼음 위에 놓습니다.2% 따뜻한 액체 아가로즈의 500 마이크로 리터에 세척 된 NS 펠릿을 다시 중단합니다. 그리고 부드러운 파이펫팅이나 교반으로 섞는다. 아가로즈가 중합될 때까지 아가로즈가 내장된 NS를 얼음 위에 놓습니다.그런 다음 NS를 잡고 아가로즈 조각을 제거합니다. 아가로즈 조각을 조직 처리를 위해 카세트에 넣습니다. 수조를 섭씨 42도까지 설정합니다. 그리고 조심스럽게 마이크로 톤에 블레이드를 삽입합니다.그런 다음 파라핀 블록을 마이크로토메에 넣습니다. 한 손으로 는 기계의 왼쪽에 있는 각 섹션의 두께를 제어하는 레버를 누릅니다. 레버를 두 번째 정지로 눌러 마이크로토메를 30 마이크로미터 두께로 설정합니다.거친 손 바퀴를 돌려 블록 트리밍을 시작합니다. 시료의 표면이 거의 노출되면 두께를 5 또는 10 마이크로미터로 제어하는 레버를 설정합니다. 샘플 표면에 도달하면 트리밍을 중지합니다.얼음 상자와 파라핀 블록이 얼음에 직접 닿지 않도록 충분한 물로 채웁니다. 오래된 마이크로톤 블레이드를 버리고 단면에 새 칼을 삽입합니다. 파라핀 블록을 거즈로 말리고 마이크로톤에 놓습니다.거친 손 바퀴를 돌려 파라핀을 단면화하기 시작합니다. 그런 다음 젖은 페인트 브러시를 사용하여 파라핀 리본을 섭씨 42도의 수조로 옮겨냅니다. 집게의 곡선을 사용하여 두 파라핀 섹션 사이에 집게를 배치하고 섹션을 부드럽게 밀어 넣습니다.젖은 페인트 브러시를 사용하여 분리된 부분을 양전하 접착 현미경 슬라이드로 밀어 넣습니다. 먼저, 20분 동안 60°C의 금속 랙에

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 비디오 프로토콜은 neurosphere 분석 문화 방법을 사용하여 수술 resected 인간 glioblastoma의 mutliforme (GBM) 종양 조직에서 세포처럼 고립과 줄기의 확장을 보여줍니다.

분리 및 Neurosphere 분석을 사용하여 인간 Glioblastoma의 Multiforme 종양 세포의 확장

출처: Núñez, F. J., et al. 파라핀 함유 3D 신경교종 신경구 배양에 대한 면역조직화학에 의한 신경교종의 바이오마커 평가. J. Vis. 특급. (2019).이 비디오는 파라핀이 포함된 뇌종양 신경구에서 종양 바이오마커를 라벨링하기 위한 면역조직화학 기술을 보여줍니다. 신경구 절편은 파라핀 제거 및 재수화 과정을 거친 후 바이오마커 부위를 노출시키는 치료를 받습니다. 그런 다음 1차 및 2차 항체를 적용하여 이러한 바이오마커를 라벨링합니다. 2차 항체는 아비딘 접합 과산화효소(avidin-conjugated peroxidase enzyme)에 결합되어 있으며, 이 효소는 발색 기질을 산화시켜 바이오마커 위치를 나타냅니다. 마지막으로, 현미경 분석을 위해 핵 counterstaining 및 slide preparation이 완료됩니다.

뇌종양 신경구 절편에서 바이오마커의 면역조직화학적 염색

혈청이 없는 신경권 배지에서 해리된 고급 신경종 수술 용 시편을 전파하여 암 줄기 세포 표현형을 가진 세포를 선택한다. 신경구로 성장하지 못하는 표본의 경우 대체 프로토콜이 제안됩니다. 면역 세포화학을 위한 3D 신경구 아키텍처를 유지하기 위한 파라핀 임베딩 기술이 설명된다.

임상적으로 관련동물 모델 및 3D 면역화학에 사용하기 위한 외과 표본에서 고학년 신경교종 세포 배양의 최적화

이 프로토콜은 chromogenic immunohistochemistry 및 ImageJ를 사용하여 glioblastoma 환자 절제술에서 종양 microenvironment 구성 요소를 정량적으로 식별하기 위해 개발되었습니다.

환자 Glioblastoma 절제술에서 세포 미세 환경의 정량적 면역 조직 화학

여기서 우리는 인간 신경교종 세포(hGC) 이동을 실시간으로 연구하기 위한 전 생체내 혼합 단층 배양 시스템을 제시한다. 이 모형은 구획화된 약실 내의 hGCs와 myelinated 및 비 myelinated 축색둘다 사이 상호 작용을 관찰하는 기능을 제공합니다.

등쪽 뿌리 신경절 축삭-올리고젠드로시트 공동 배양에 대한 인간 신경교종 세포 이동의 실시간 모니터링

레이저 미세 해부 (LMD)는 신경교종 이질성과 침략을 중재하는 통로를 밝히기 위하여 이용될 수 있는 민감하고 높게 재현가능한 기술입니다. 여기에서, 우리는 전사성 분석에 선행된 레이저 LMD를 사용하여 신경교종 조직에서 이산 지역을 격리하기 위하여 최적화된 프로토콜을 기술합니다.

종양 내 이질성, 온코스트림 및 침략의 공간 및 분자 특성화를 위한 신경교종 소구역의 레이저 캡처 미세 분해

여기에서는 교모세포종에 대한 사용하기 쉬운 침략 분석방법을 설명합니다. 이 분석은 교모세포종 줄기 와 같은 세포에 적합합니다. 침략, 마이그레이션 및 확산의 쉬운 정량화를 위한 피지 매크로도 설명되어 있습니다.

교모세포종을 위한 3D 스페로이드 모형

여기에서 우리는 세포외 플럭스 분석을 통해 3차원(3D) 신경아교종 스페로이드와 이미징 기반 정규화를 통합하는 대사 프로파일링 플랫폼을 구축합니다. 이 접근법을 통해 약물 치료에 대한 종양 대사 반응을 보다 정확하게 평가할 수 있으며 잠재적인 내성 메커니즘에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

약물 스크리닝을 위한 3차원 뇌종양 스페로이드의 대사 프로파일링의 발전

우리는 새로 진단되고 재발한 종양에서 생성된 환자 유도 자기 교모세포를 이용한 3D 교모세포종 이동 모델을 제시합니다. 이 플랫폼은 환자별 이동 역학을 시각화하고 치료 효과 평가를 가능하게 합니다. 이 분석법은 이동 후 다중화되어 단백질 위치와 발현 패턴을 평가할 수 있습니다.

저산소 조건에서 자기 나노입자를 이용한 구형 위치 측정을 이용한 재현 가능한 3D 교모세포종 이동 검사

이 프로토콜은 환자 유래의 세포 배양 모델 또는 종양 미세 환경과 세포의 직접적인 특성화 확립 사후 확산 극한 뇌교 교종 샘플들의 빠른 처리를위한 방법을 설명한다.

확산 내장 뇌교 신경 교종의 신속한 사후 세포 배양을위한 프로토콜 (DIPG)

배우세요 파라핀 임베디드 면역조직화학법을 이용하여 3D 신경구체의 형태를 보존하면서 교모세포종 바이오마커를 평가하는 방법을. 이 기법은 종양 생물학 연구에 필수적인 도구입니다.

Immunohistochemistry 파라핀 임베디드 3D Glioma Neurosphere 문화에 의해 Glioma 바이오 마커의 평가

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