Name: 준비 및 Nonhuman 영장류 조 혈 줄기와 조상 세포의 유전자 수정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: 학습하세요 비인간 영장류 골수에서 CD34+ 조혈 줄기세포를 분리하고 렌티바이러스 벡터로 유전자 수정하는 방법을. 이 프로토콜은 유전자 치료 연구에 활용할 수 있는 안전하고 효율적인 세포 제제를 준비합니다.

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저자는이 원고, 그래픽 디자인, 짐 Woolace 그리고 베로니카 넬슨과 Devikha Chandrasekaran 프로토콜의 개발에 참여를 준비 하기 위한 헬렌 크로포드를 감사 합니다. 이 프로토콜의 개발 알레르기의 NIH 국립 연구소와 전염병 (R01 AI135953와 H.P.K. AI138329) 국가 심 혼, 폐, 및 혈액 연구소 (R01 HL136135, HL116217, P01 HL122173, 및 U19에서 교부 금에 의해 지원 되었다 H.P.K. HL129902), NIH P51 OD010425 뿐만 아니라, 일부 NIH/NCI 암 센터, 지원 그랜트 P30 CA015704를 통해. H.P.K.는 마 키 분자 의학 탐정 세포 및 유전자 치료에 대 한 암 연구와 프레드 허 치 부여의 자에 대 한 지원의 호세 카레라스/E. Donnall 토마스 부여 자의 취임 받는 사람으로 받은.

<ol><li>Radtke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+hematopoietic+stem+cell+population+for+rapid+multilineage+engraftment+in+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">A distinct hematopoietic stem cell population for rapid multilineage engraftment in nonhuman primates.</a> Science Translational Medicine. 9 (414), eaan1145 (2017).</li>
<li>Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+hierarchy+of+multipotent+hematopoietic+progenitors+in+human+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood.</a> Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).</li>
<li>Notta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+single+human+hematopoietic+stem+cells+capable+of+long-term+multilineage+engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment.</a> Science. 333 (6039), 218-221 (2011).</li>
<li>Hoggatt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+mobilization+reveals+a+highly+engraftable+hematopoietic+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rapid mobilization reveals a highly engraftable hematopoietic stem cell.</a> Cell. 172 (1-2), 191-204 (2018).</li>
<li>Chandrasekaran, D., Nakamoto, B., Watts, K. L., Kiem, H. P., Papayannopoulou, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+promising+nonmyeloablative+conditioning+regimens+in+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Modeling promising nonmyeloablative conditioning regimens in nonhuman primates.</a> Human Gene Therapy. 25 (12), 1013-1022 (2014).</li>
<li>Humbert, O., Peterson, C. W., Norgaard, Z. K., Radtke, S., Kiem, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nonhuman+primate+transplantation+model+to+evaluate+hematopoietic+stem+cell+gene+editing+strategies+for+beta-hemoglobinopathies.+Molecular+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">A nonhuman primate transplantation model to evaluate hematopoietic stem cell gene editing strategies for beta-hemoglobinopathies. Molecular Therapy.</a> Methods & Clinical Development. 8, 75-86 (2018).</li>
<li>Peterson, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+impact+of+transplantation+on+peripheral+and+tissue-associated+viral+reservoirs%3A+Implications+for+HIV+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Differential impact of transplantation on peripheral and tissue-associated viral reservoirs: Implications for HIV gene therapy.</a> PLoS Pathogens. 14 (4), e1006956-e1006956 (2018).</li>
<li>Zhen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+persistence+and+function+of+hematopoietic+stem+cell-derived+chimeric+antigen+receptor+T+cells+in+a+nonhuman+primate+model+of+HIV%2FAIDS%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Long-term persistence and function of hematopoietic stem cell-derived chimeric antigen receptor T cells in a nonhuman primate model of HIV/AIDS.</a> PLoS Pathogens. 13 (12), e1006753(2017).</li>
<li>Moffett, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hit-and-run+programming+of+therapeutic+cytoreagents+using+mRNA+nanocarriers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Hit-and-run programming of therapeutic cytoreagents using mRNA nanocarriers.</a> Nature Communications. 8 (1), 389(2017).</li>
<li>Burtner, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+injection+of+a+foamy+virus+vector+to+correct+canine+SCID-X1%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Intravenous injection of a foamy virus vector to correct canine SCID-X1.</a> Blood. 123 (23), 3578-3584 (2014).</li>
<li>Evans, D. T., Silvestri, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonhuman+primate+models+in+AIDS+research%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+HIV+and+AIDS%22%5BJournal%5D)">Nonhuman primate models in AIDS research.</a> Current Opinion in HIV and AIDS. 8 (4), 255-261 (2013).</li>
<li>Taraseviciute, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cell-mediated+neurotoxicity+in+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cell-mediated neurotoxicity in nonhuman primates.</a> Cancer Discovery. 8 (6), 750-763 (2018).</li>
<li>McGary, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTLA-4%28%2B%29PD-1%28-%29+memory+CD4%28%2B%29+T+cells+critically+contribute+to+viral+persistence+in+antiretroviral+therapy-suppressed%2C+SIV-infected+rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CTLA-4(+)PD-1(-) memory CD4(+) T cells critically contribute to viral persistence in antiretroviral therapy-suppressed, SIV-infected rhesus macaques.</a> Immunity. 47 (4), 776-788 (2017).</li>
<li>Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+genomic+mapping+of+vector+integration+sites+in+gene+therapy+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies.</a> Methods in Molecular Biology. 1185, 321-344 (2014).</li>
<li>Zonari, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+ex+vivo+engineering+and+expansion+of+highly+purified+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cell+populations+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient ex vivo engineering and expansion of highly purified human hematopoietic stem and progenitor cell populations for gene therapy.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 977-990 (2017).</li>
<li>Doulatov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revised+map+of+the+human+progenitor+hierarchy+shows+the+origin+of+macrophages+and+dendritic+cells+in+early+lymphoid+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Revised map of the human progenitor hierarchy shows the origin of macrophages and dendritic cells in early lymphoid development.</a> Nature Immunology. 11 (7), 585-593 (2010).</li>
<li>Fares, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cord+blood+expansion.+Pyrimidoindole+derivatives+are+agonists+of+human+hematopoietic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal.</a> Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).</li>
<li>Gori, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+promote+expansion+of+long-term+engrafting+marrow+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+in+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells promote expansion of long-term engrafting marrow hematopoietic stem and progenitor cells in primates.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (3), 864-876 (2017).</li>
<li>Peterson, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+multilineage+engraftment+of+autologous+genome-edited+hematopoietic+stem+cells+in+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Long-term multilineage engraftment of autologous genome-edited hematopoietic stem cells in nonhuman primates.</a> Blood. 127 (20), 2416-2426 (2016).</li>
<li>Peterson, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+polyclonal+engraftment+of+Cal-1+gene-modified+cells+and+in+vivo+selection+after+SHIV+infection+in+a+nonhuman+primate+model+of+AIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS.</a> Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 3, 16007(2016).</li>
<li>Thompson, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+in+patients+with+transfusion-dependent+beta-thalassemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gene therapy in patients with transfusion-dependent beta-thalassemia.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (16), 1479-1493 (2018).</li>
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<li>Paul, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+enrichment+of+gene-modified+primary+T+cells+via+CCR5-targeted+integration+of+mutant+dihydrofolate+reductase%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Efficient enrichment of gene-modified primary T cells via CCR5-targeted integration of mutant dihydrofolate reductase.</a> Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 5 (9), 347-357 (2018).</li>
<li>Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+manufacturing+of+CAR+T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Global manufacturing of CAR T cell therapy.</a> Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).</li>
<li>Masiuk, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+gene+therapy+efficiency+through+the+enrichment+of+human+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Improving gene therapy efficiency through the enrichment of human hematopoietic stem cells.</a> Molecular Therapy. 25 (9), 2163-2175 (2017).</li>
<li>Trobridge, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transduction+of+pigtailed+macaque+hematopoietic+repopulating+cells+with+HIV-based+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient transduction of pigtailed macaque hematopoietic repopulating cells with HIV-based lentiviral vectors.</a> Blood. 111 (12), 5537-5543 (2008).</li>
<li>Beard, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+stable+MGMT-mediated+selection+of+long-term+repopulating+stem+cells+in+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354 (2010).</li>
<li>Horn, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+lentiviral+gene+transfer+to+canine+repopulating+cells+using+an+overnight+transduction+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient lentiviral gene transfer to canine repopulating cells using an overnight transduction protocol.</a> Blood. 103 (10), 3710-3716 (2004).</li>
<li>Adair, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-automated+closed+system+manufacturing+of+lentivirus+gene-modified+haematopoietic+stem+cells+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Semi-automated closed system manufacturing of lentivirus gene-modified haematopoietic stem cells for gene therapy.</a> Nature Communications. 7, 13173(2016).</li>
<li>Kutner, R. H., Zhang, X. Y., Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+concentration+and+titration+of+pseudotyped+HIV-1-based+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors.</a> Nature Protocols. 4 (4), 495-505 (2009).</li>
<li>Salmon, P., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+titration+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Production and titration of lentiviral vectors.</a> Current Protocols in Human Genetics. 54 (1), (2007).</li>
<li>Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+lentiviral+vector+titration+methods%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Comparison of lentiviral vector titration methods.</a> BMC Biotechnology. 6, 34(2006).</li>
<li>Kiem, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+gene+transfer+into+baboon+marrow+repopulating+cells+using+recombinant+human+fibronectin+fragment+CH-296+in+combination+with+interleukin-6%2C+stem+cell+factor%2C+FLT-3+ligand%2C+and+megakaryocyte+growth+and+development+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Improved gene transfer into baboon marrow repopulating cells using recombinant human fibronectin fragment CH-296 in combination with interleukin-6, stem cell factor, FLT-3 ligand, and megakaryocyte growth and development factor.</a> Blood. 92 (6), 1878-1886 (1998).</li>
<li>Morton, W. R., Knitter, G. H., Smith, P. M., Susor, T. G., Schmitt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternatives+to+chronic+restraint+of+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Veterinary+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Alternatives to chronic restraint of nonhuman primates.</a> Journal of the American Veterinary Medical Association. 191 (10), 1282-1286 (1987).</li>
<li>Noser, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclosporine+increases+human+immunodeficiency+virus+type+1+vector+transduction+of+primary+mouse+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Cyclosporine increases human immunodeficiency virus type 1 vector transduction of primary mouse cells.</a> Journal of Virology. 80 (15), 7769-7774 (2006).</li>
<li>Uchida, N., Hsieh, M. M., Washington, K. N., Tisdale, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transduction+of+human+hematopoietic+repopulating+cells+with+a+chimeric+HIV1-based+vector+including+SIV+capsid%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Efficient transduction of human hematopoietic repopulating cells with a chimeric HIV1-based vector including SIV capsid.</a> Experimental Hematology. 41 (9), 779-788 (2013).</li>
<li>Cornetta, K., Anderson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protamine+sulfate+as+an+effective+alternative+to+polybrene+in+retroviral-mediated+gene-transfer%3A+implications+for+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Protamine sulfate as an effective alternative to polybrene in retroviral-mediated gene-transfer: implications for human gene therapy.</a> Journal of Virological Methods. 23 (2), 187-194 (1989).</li>
<li>Goerner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+granulocyte+colony-stimulating+factor+during+retroviral+transduction+on+fibronectin+fragment+CH-296+enhances+gene+transfer+into+hematopoietic+repopulating+cells+in+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The use of granulocyte colony-stimulating factor during retroviral transduction on fibronectin fragment CH-296 enhances gene transfer into hematopoietic repopulating cells in dogs.</a> Blood. 94 (7), 2287-2292 (1999).</li>
<li>Dao, M. A., Hashino, K., Kato, I., Nolta, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+to+fibronectin+maintains+regenerative+capacity+during+ex+vivo+culture+and+transduction+of+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Adhesion to fibronectin maintains regenerative capacity during ex vivo culture and transduction of human hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Blood. 92 (12), 4612-4621 (1998).</li>
<li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E2+regulates+vertebrate+haematopoietic+stem+cell+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis.</a> Nature. 447 (7147), 1007-1011 (2007).</li>
<li>Goessling, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E2+enhances+human+cord+blood+stem+cell+xenotransplants+and+shows+long-term+safety+in+preclinical+nonhuman+primate+transplant+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E2 enhances human cord blood stem cell xenotransplants and shows long-term safety in preclinical nonhuman primate transplant models.</a> Cell Stem Cell. 8 (4), 445-458 (2011).</li>
<li>Booth, C., Gaspar, H. B., Thrasher, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treating+immunodeficiency+through+HSC+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Treating immunodeficiency through HSC gene therapy.</a> Trends in Molecular Medicine. 22 (4), 317-327 (2016).</li>
<li>Humbert, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+immune+reconstitution+of+SCID-X1+canines+after+G-CSF%2FAMD3100+mobilization+and+in+vivo+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Advances%22%5BJournal%5D)">Rapid immune reconstitution of SCID-X1 canines after G-CSF/AMD3100 mobilization and in vivo gene therapy.</a> Blood Advances. 2 (9), 987-999 (2018).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

LV 벡터 엔지니어링은 유전자 수정 CD34 셀 유형 베스트 특징이 방법+ HSPCs, 이후 이식 vivo에서. 여기에 설명 된 프로토콜은 유전자 수정 HSPCs, vivo에서 장기 유지의 수를 극대화 하 고 다양 한 악성, 감염 및 유전 질환을 가진 환자에 게 임상 혜택을 제공 설계 되었습니다. 유전자 편집 전략 지난 10 년간 등장, LV 수정 세포는 최고의 생체 외에서, 동물 모델, 그리고 환자1,8,20,,2122공부.
우리의 광범위 한 경험과 순수 CD34의 농축이이 프로토콜에 따라+ HSPCs (즉, >는 CD34의 80%+</sup...

줄기 세포 유전자 치료 인간 병 리의 넓은 범위를 해결 하는 강력한 수단 이다. HSPC 유전자 치료는 특히 매력적인 접근 이다, i) 상대적으로 완화의 환자에서 이러한 셀을 수집 ii) 사용할 수 셀 표면 고기 및 ex vivo 문화 매개 변수 이며, 필드와 확장, 지식 재산 때문 때문에 iii) 과학자 들은 유전자 수정 전략 관심의 다양 한 질병에 맞게 늘어나는 도구 상자와 함께 제공. 우리는 적극적으로 HSPC 생물학, 유전자 수정 HSPCs 전 임상 생체 조건 모델에서의 engraftment 및 관련 환자 인구를 응용 프로그램의 기초 과학을 포함 하 여 여러 각도에서 HSPC 유전자 치료 접근을 조사 하고있다. 우리와 다른 기능적으로 뚜렷한 HSPC 하위 집합1,2,3, 동원 및 컨디셔닝 regimens HSPC 수율 및 최소화 하면서 engraftment를 극대화 하는 세포 표면 표현 형 특징 있다 독성4,5, 그리고 유전자 수정 및 다양 한 악성, 유전, 그리고 전염병6,7,8,를 맞게 되었습니다 유전자 편집 전략 9,10. 쥐, 개, NHPs를 포함 한 작은 큰-동물 모델의 여러에서 기능과 유전자 수정 HSPCs의 engraftment를 평가할 수 있습니다. 특히, NHP 모델은 많은 시 약, 예를 들어 CD34 CD90, 같은 HSPC 세포 표면 단백질을 위한 특정 항 체를 번갈아 인간과 NHP 셀에 사용할 수 있기 때문에 유리. 또한, 마우스, 달리 NHPs 같은 큰 동물 허용 가까이 근사 유전자 수정의 규모의 임상 효능에 필요한. 마지막으로, NHPs 에이즈-1 감염11 같은 인간의 병 리 모델링에 대 한 황금 표준 고 후보 항 암 및 항 HIV immunotherapies12,13신흥 모델 시스템입니다.
이 프로토콜의 목적은 NHP HSPC 주입 제품 준비 및 정화, 유전자 수정 방법 개요입니다. 이 프로토콜의 범위 밖에 서 우리는 이전에 표시 있지만 이러한 제품 헌 NHP 호스트에서 engraft 모든 조 혈 계보, 하 고 질병 모델1의 광범위 한 범위에서 치료 효능을 제공 합니다. 우리 또한 engrafting HSPCs의 clonality를 특징 하 고 속도 론, 매매, 및 개별 HSPCs 및 그들의 자손, 다음 헌 이식1,14형 추적 플랫폼을 구축. 여기에 제시 된 방법은 다음과 같은 목표와 함께 개발 되었습니다: i)를 매우 순수한 HSPCs 장기 engrafting HSC 하위 집합, ii) 게 유지와 ex vivo 문화, 동안 원시 HSCs iii)를 효율적으로 유전자-수정 중 대량 HSPCs 격리 또는 장기 HSC 하위 집합 engrafting 형광 활성화 된 세포 (FACS), 격리 phenotypically/기능적으로 뚜렷한 HSPC 인구, 많은 그룹2,15의 방법으로 일관 된 정렬 뿐만 아니라 자기 기반 셀 정렬 (맥)을 고용 16. 문화에 기본 HSCs의 유지 보수 (즉, 림프 및 골수성 하위 집합을 분화 완전 하 일으키 다하고 창시자로이 세포의 분화를 최소화) 여기에 설명 된 프로토콜의 필수적인 일 면 이다. 비록 우리는 원시적인 형17,18, 여기, 유지 하면서 HSPCs를 확장 하는 접근을 특징 이전는 최소한의 (48 h) 통해 HSCs를 유지에 초점을 맞추고와 ex vivo 문화 정의 하는 프로토콜을 설명 합니다.
HSPCs 및 HSC의 효율적인 수정 하위 집합이이 프로토콜의 중앙 목표 이다. 몇 가지 방법을 우리는 보고, 중 2 개는 지금까지 가장 조사에서 임상 시험: LV 중재 유전자 수정 및 편집1,,619nuclease 중재 하는 유전자. 유전자 편집 전략 특히 관심의 대상된 유전자 수정 nuclease 플랫폼의 수 중 하나를 사용, 예를 들어 C C chemokine 수용 체 타입-5 (CCR5) 치료에 대 한 HIV 감염7,19 또는 Bcl11A의 치료에 대 한 hemoglobinopathies6의. 여기, 우리는 유전자 변형 화물 통합 semirandomly 게놈1,,820LV 중재 유전자 수정에 집중 한다. LV 방식의 주요 장점은 (최대 8 또는 9 kilobases) 유전 물질의 대용량을 제공 하는 능력입니다. 유전자 편집 전략 transgene 지정 된 장소에만 통합 하는 관심의 대상으로 동종 기증자 재결합 (HDR)에 의해 개발 되고있다, 하지만 이러한 방법을 더 생체 외에서 그리고 작은 동물 모델 개발이 필요 합니다. 대조적으로, LV 벡터 사용 되었습니다 광범위 하 게 NHPs와 환자21,22. 중요 한 것은, 사용 하는 시작 HSPC 소스로 BM 액, 여기에 설명 된 프로토콜 적응 수 있다 수 쉽고 광범위 하 게, 예를 들어 PBSCs을. 위에서 설명한 대로 우리 두 종에 적용 되는 시 약을 사용 하 여 NHPs와 인간 사이의 유전적 유사성의 높은 학위의 활용. 마지막으로,이 이렇게 맞게 조정 되었습니다 다른 조 혈 하위 집합, 즉 T 세포12,,2324; 수정 하 효과 T 세포 immunotherapy 접근의 출현이이 프로토콜에서 동일한 LV 플랫폼 무 겁 게 의존 하고있다. 이러한 메서드는 모든 연구원 HSPC 생물학 또는 LV 중재 유전자 수정에 적합 합니다. 여기에 제시 된 HSPC 정화 프로토콜 소설 HSC 농축 하위 집합의 특성을 사용 하는 수 예를 들어 앞에서 설명한1,,1525. 마찬가지로, 여기에 제시 하는 방법 수 마찬가지로 LV 변환 적용 되며 다른 수많은 세포 유형 및 실험적인 질문, 둘 다 생체 외에서 그리고 vivo에서 모델에 대 한 개발.
요약 하자면, 우리는 분리 및 유전자 NHP HSPCs를 수정 하는 방법을 제시. 이러한 메서드는 다른 종 및 HSPCs의 다른 소스에 쉽게 적용할 수 있습니다. 이 철저 하 게 검증 된 프로토콜 수많은 인간의 질병에 대 한 효과가 치료의 모델링에 큰 약속을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>스템스팸 SFEM II("HSPC") 미디어</td><td>StemCell</td><td>09655</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered</td><td>Saline Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-100</td><td></td></tr><tr><td>100% 에탄올</td><td>Decon labs</td><td>M18027161M</td><td></td></tr><tr><td>Cyclosporine</td><td>Sigma</td><td>30024-25MG</td><td></td></tr><tr><td>500 mM EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>열 비활성화 소 태아 혈청</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PS-0500-A</td><td></td></tr><tr><td>CH-296/ RetroNectin (2.5 mL, 1 &micro; g/&마이크로; L)</td><td>TaKaRA</td><td>T100B</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마</td><td>A7906-100g</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마</td><td>H9897</td><td></td></tr><tr><td>쥐 안티 마우스 IgM 마그네틱 비드</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-047-301</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 줄기 세포 인자 (SCF)</td><td>Peprotech</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 트롬보 포이에틴 (TPO)</td><td>Peprotech</td><td>300-18</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 FMS 유사 티로신 키나아제 3 (FLT-3)</td><td>Peprotech</td><td>300-19</td><td></td></tr><tr><td>프로타민 설페이트</td><td>시그마</td><td>P-4505</td><td></td></tr><tr><td>14 mL 폴리프로필렌 둥근 바닥 튜브</td><td>코닝</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>콜로니 젤 1402</td><td>ReachBio</td><td>1402</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS 분리기</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>MACS L25 컬럼</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>10 mM PGE2</td><td>케이맨 화학</td><td>14753-5mg</td><td></td></tr><tr><td>TC 처리 T-75 플라스크</td><td>Bioexpress</td><td>T-3001-2</td><td></td></tr><tr><td>비 TC 처리 T-75 플라스크</td><td>Thermo-Fisher</td><td>13680-57</td><td></td></tr><tr><td>20 mL 주사기</td><td>BD Biosciences</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>16.5 G 바늘</td><td>BD 정밀</td><td>305198</td><td></td></tr><tr><td>주사기 팁 캡</td><td>BD Biosciences</td><td>305819</td><td></td></tr><tr><td>QuickExtract DNA 솔루션</td><td>진원지</td><td>QE09050</td><td></td></tr><tr><td>8-튜브 스트립 캡 PCR 튜브</td><td>미국 과학</td><td>1402-2708</td><td></td></tr><tr><td>96-well Thermocycler</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4375786</td><td></td></tr><tr><td>사전 분리 필터</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>스트레이너, 셀; BD 팔콘; 메 마른; 나일론 메쉬; 매쉬의 크기: 70um; 색깔: 백색; 50/CS</td><td>fisher scientific</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Ultracomp ebeads</td><td>eBioscience</td><td>01-2222-42</td><td></td></tr><tr><td>MACSmix Tube Rotator</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>3 mL Luer-Lock 주사기</td><td>Thermo-Fisher</td><td>14823435</td><td></td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm 세포 배양 접시</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm 세포 배양 접시</td><td>Corning</td><td></td><td></td>430196</tr><tr><td>150 mm x 25 mm 세포 배양 접시</td><td>Corning</td><td>430599</td><td></td></tr><tr><td>Non TC 처리 플라스크</td><td>Falcon</td><td>353133</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen DNA 추출</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td></td></tr><tr><td>PE Anti-Human CD90 (Thy1) 클론 : 5E10</td><td>Biolegend</td><td>328110</td><td></td></tr><tr><td>PE-CF594 마우스 Anti-Human CD34 클론 : 563</td><td>BD 수평선</td><td>562449</td><td></td></tr><tr><td>APC-H7 마우스 Anti-Human CD45RA 클론 : 5H9</td><td>BD Pharmingen</td><td>561212</td><td></td></tr><tr><td>V450 마우스 Anti-NHP CD45 클론 : d058-1283</td><td>BD Biosciences</td><td>561291</td><td></td></tr><tr><td>자가 혈청</td><td>CD34 + HSPC의 동원 및 수집 전에 동결 보존</td><td>됨 N / A</td><td>수염, BC 외. 비인간 영장류에서 장기 보충 줄기 세포의 효율적이고 안정적인 MGMT 매개 선택. 임상 조사 저널. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td></tr><tr><td>Virus-Conditioned Media (VCM)</td><td>Kiem Lab, FHCRC Co-operative Center for Excellence in Hematology (CCEH)</td><td>N/A</td><td>Beard, B. C. et al. 비인간 영장류에서 장기 보충 줄기 세포의 효율적이고 안정적인 MGMT 매개 선택. 임상 조사 저널. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td></tr><tr><td>항-CD34 항체, Clone 12.8</td><td>Kiem Lab</td><td>N/A</td><td>Beard, B. C. et al. 비인간 영장류에서 장기 보충 줄기세포의 효율적이고 안정적인 MGMT 매개 선택. 임상 조사 저널. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td></tr><tr><td>Lenti F 프라이머: AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCA</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Peterson, C. W. et al. AIDS의 비인간 영장류 모델에서 SHIV 감염 후 Cal-1 유전자 변형 세포의 다중 계통 다클론 생착 및 생체 내 선택. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td></tr><tr><td>Lenti R 프라이머: TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAA</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Peterson, C. W. et al. AIDS의 비인간 영장류 모델에서 SHIV 감염 후 Cal-1 유전자 변형 세포의 다중 계통 다클론 생착 및 생체 내 선택. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td></tr><tr><td>Actin F 프라이머: TCCTGTGGCACTCACGAAACT</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Peterson, C. W. et al. AIDS의 비인간 영장류 모델에서 SHIV 감염 후 Cal-1 유전자 변형 세포의 다중 계통 다클론 생착 및 생체 내 선택. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td></tr><tr><td>Actin R 프라이머: GAAGCATTTGCGGTGGACGAT</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Peterson, C. W. et al. AIDS의 비인간 영장류 모델에서 SHIV 감염 후 Cal-1 유전자 변형 세포의 다중 계통 다클론 생착 및 생체 내 선택. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td></tr></tbody></table>

준비 및 nonhuman 영장류 조 혈 줄기와 조상 세포의 유전자 수정

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

조 혈 줄기와 조상 세포 (HSPC) 이식 백혈병에 대 한 초석 치료와 거의 반세기 동안 다른 암, 인간 면역 결핍 바이러스 (hiv-1) 감염의 유일한 알려진된 치료의 기초가 되었으며에 엄청난 약속을 보여줍니다. 베타 thalassemia 같은 유전 질환의 치료. 우리의 그룹 많은 같은 시 약 및 병원에 적용 되는 기술을 최적화 하는 과학자를 허용 nonhuman 영장류 (NHPs)에 모델 HSPC 유전자 치료 프로토콜을 개발 했습니다. 여기, 우리는 CD34 정화 방법 설명+ HSPCs 및 장기적인 유지 액된 골 (BM)에서 조 혈 줄기 세포 (HSC) 하위 집합. 다른 HSPC 소스 (예: 동원된 주변 혈액 줄기 세포 [PBSCs])의 정화에 대 한 동일한 기법을 사용할 수 있습니다. 설명 하는 것은 2 일 프로토콜 있는 셀은 정화, 교양, lentivirus (LV), 수정 및 헌 호스트에 다시 주입에 대 한 준비. 성공의 주요 정보는 CD34의 순도 포함+ HSPC 인구, 반 고체 미디어, 그리고 가장 중요 한 것은, 진 수정 효율에 형태학 상으로 다른 식민지를 형성 하는 순화 된 HSPCs의 기능. HSPC 유전자 치료의 주요 장점은 모든 조 혈 세포 종류를 수명이 긴 세포의 소스를 제공 하는 기능입니다. 따라서, 이러한 방법은 암, 유전 질환 및 전염 성 질환에 대 한 모델 치료에 사용 되었습니다. 각각의 경우에서 치료 효능 붉은 혈액 세포, T 세포, B 세포, 및 골수성 하위 집합을 포함 하 여 고유 HSPC 자손의 기능을 강화 하 여 설정 됩니다. 를 분리 하는 방법을 수정 하 고 준비 HSPC 제품은 직접 적용 및 번역 인간 환자에서 여러 질병에.

위에서 설명한 프로토콜은 격리 하 고 유전자 수정 NHP CD34 설계 되었습니다+ HSPCs, 이후 헌 호스트 (그림 1 및 그림 2)에 다시 들어갈 수 있습니다. 이 프로토콜에 따라 때 우리가 일반적으로 피그 원숭이에서 끝났다 BM에서 8 x 10까지9 총 Wbc 얻을 그리고, 때때로, 붉은 털 원숭이에서 그 금액을 두 번. 두 종, CD34의 수+ 우리가 풍요롭게 HSPCs 총 WBC count (그림 3)의 입력에 비례 이다. 이전 연구 결과 보여 총 CD34+ HSPC 사실, 장기 engrafting HSCs. 따라서 있지 않은 셀을 포함 하는 제품, 우리 흐름 cytometry-기반 기술 (<strong class="xfig...

이 프로토콜의 목표 nonhuman 영장류 CD34 분리 하는+ 세포 액된 골, 유전자-수정 lentiviral 벡터와이 셀 하 고 주입 헌 호스트에 대 한 제품을 준비에서. 총 프로토콜 길이 약 48 h입니다.

준비 및 Nonhuman 영장류 조 혈 줄기와 조상 세포의 유전자 수정

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...

유망한 유전자 치료 접근법의 효율성과 안전성을 평가하기 위해 생체 내 모델에서 검증된 전임상에서 유전자 변형 세포의 포괄적인 테스트가 중요합니다. 관련 세포 표면 마커의 보존 시약의 교차 반응성, 그리고 임상 매개 변수를 밀접하게 모방하는 비 인간 영장류 모델을 따라 환자에게 투여 된 동일한 지원 치료를 적용하는 능력. 나와 함께 절차를 시연하는 것은 아나이 페레즈, 박사 한스 - 피터 키엠의 실험실에서 연구 기술자가 될 것입니다.건강한 비인간 영장류 기증자로부터 분리된 골수의 10-12 밀리리터 알리쿼트를 50 밀리리터 원추형 튜브에 첨가하여 시작합니다. 용혈 완충액으로 튜브의 부피를 최대 50 밀리리터까지 가져와 실온에서 최대 7 분 동안 세포를 배양하십시오. 세포 파편을 원심분리하여 제거하고, 상류체의 마지막 2~5밀리리터를 제외한 모든 것을 흡인시합니다.튜브를 가볍게 하여 잔류 체상체 부피의 펠릿을 다시 중단하고, 골수 현탁액을 70 마이크로미터 모공 세포 여과기를 사용하여 새로운 50 밀리리터 튜브로 이송하여 혈전을 제거합니다. 신선한 용혈 버퍼를 추가하여 최대 50 밀리리터의 부피를 가져오고 원심 분리로 수집하기 전에 실온에서 5 분 동안 세포를 배양합니다. 모든 슈퍼나티를 흡인시키고 최대 버퍼의 10 밀리리터에서 셀을 재일시 중단합니다.또 다른 70 마이크로 미터 공공 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 필터링하기 전에, 신선한 버퍼의 40 밀리리터로 튜브를 헹구고, 셀 서스펜션으로 세척을 풀. 표준 자기 보조 세포 선별 프로토콜에 따라 CD34 양수 세포를 농축한 후, 비드 분리 된 세포를 최대 50 밀리리터의 신선한 최대 버퍼로 세척하고 HSPC 배지에서 펠릿을 다시 중단하십시오. 그런 다음 세포의 10~20밀리리터를 환기 조직 배양된 T75 플라스크로 플레이트하여 섭씨 37도및 이산화탄소 인큐베이터5%에서 야간 배양을 치료하였다.골수의 세포 샘플의 사전 및 후 농축 순도를 평가하기 위해 모든 이벤트가 흩어져 있는 CD34 양성, 조혈 줄기 세포, 다능성 안에리스로 골로이드 전구체 및 림프골성 선조선자를 보여주는 적절한 플롯 및 인구 계층 구조로 유동 세포 측정 프로토콜을 생성합니다. 다음으로, 스테인드, 사전 농축, 백혈구 샘플을 실행하여 전방 및 측면 산란 파라미터의 전압을 조정하고, 모든 형광 채널다음에 는 단일 스테인드 보정 비즈를 사용하여 인접한 채널 간의 보상을 조정한다. 그런 다음 CD34 농축 효율을 문서화하기 위해 조정 및 보상 프로토콜로 나머지 얼룩이 없는 얼룩진 모든 샘플을 모두 실행합니다.모든 보상이 설정된 경우 CD34 서브세트의 정렬 정제를 위한 셀 선별기를 콜로니 형성 세포 소약으로 구성하고, 스테인드 CD34 농축 시료 튜브를 사이토미터에 적재한다. 그런 다음 2000에서 3000 개의 이벤트를 기록하고 신호 강도및 대상 인구에 맞게 정렬 게이트를 미세 조정합니다. 설정이 완료되면 분란, CD34 양성, 조혈 줄기 세포, 다중 효능 안성 안에리스로 골로이드 전구 및 림프골골선질 3.6 밀리리터를 포함하는 분리된 튜브로 800~1200개의 세포를 분류하는 세포를 초당 500~1000세포로 조정하는 세포를 획득한다.종류의 끝에 수집 튜브, 3 멸균 3.5 센티미터에 세포 현탁액의 1 밀리리터를 추가, 비 조직 배양 처리 페트리 접시 는 37 섭씨에서 자신의 10-14 일 인큐베이션에 대한 세포 인구 당 개별 15 센티미터 페트리 접시 내에서 설정. 다음 날 아침 10 밀리리터 파이펫을 사용하여 각 플라스크 바닥에서 멸균 HBSS로 부착 된 세포를 부드럽게 헹구고 원심 분리에 의해 수확 된 세포를 수집합니다. 밀리리터 농도당 6세포에 1 x 10에서 트랜스듀션 배지에서 세포를 재연한다.그리고 세포 배양 인큐베이터에서 하룻밤 배양을 위해 12웰 플레이트를 코팅한 재조합 섬유네틴 단편의 한 웰에 모의 제어를 위한 세포의 1밀리리터를 첨가한다. 그런 다음 남은 세포의 10 밀리리터 알리쿼트를 재조합 섬유네틴 단편 코팅 T75 플라스크에 넣고 캡이 배출된 세포 배양 인큐베이터에서 30분 동안 배양합니다. 잠복식 동안 바이러스가 조건부 된 중간 표본을 조절하고 글리리터 당 전염되는 세포의 티터 및 감염 단위의 수에 기초하여 첨가될 바이러스의 양을 계산한다.인큐베이터에서 플라스크를 꺼내 각 플라스크에 적절한 양의 바이러스 조절 배지를 추가하여 세포를 섭씨 37도 및 이산화탄소 5%로 되돌려 보세요. 다음날 아침 플라스크에서 개별 50 밀리리터 원추형 튜브로 세포를 전달합니다. 세척당 최대 50밀리리터의 HBSS로 셀을 세척하고 잔류 바이러스를 제거하기 위해 최대 3배까지 이 단계를 반복합니다.프로스타글란딘 E2로 보충된 HSPC 미디어에서 2시간 동안 세포를 배양한다. 그런 다음 세포를 세척하고 튜브 당 2 %의 자가 혈청으로 보충 된 HBSS의 10 밀리리터에서 세포를 다시 일시 중단합니다. 그런 다음 16.5 게이지 바늘을 장착 한 20 밀리리터 주사기를 사용하여 셀 서스펜션을 흡인시합니다. 신선한 HBSS플러스 2%의 자동 혈청으로 튜브 내부를 세척하고 주사기에 흡인합니다.주사기를 바늘 캡으로 조심스럽게 캡을 넣은 후 세포 용액을 얼음위에 올려놓고 자가 호스트로 주입될 때까지 조심스럽게 캡을 씌울 수 있습니다. 변환된 세포의 유전자 변형 효율을 결정하기 위해, 플레이트 1 x 10 에서 6번째 예약된 모의 또는 변형된 세포당 HSPC 배지의 밀리리터당 비조직 배양 처리 플레이트에. 둘째 날, 5일, 12일 후에 세포를 수확하고 계산합니다.2일과 5일에는 신선한 HSPC 배지에서 세포의 33%를 밀리리터 농도당 1 x 10에서 6번째로 재플레이트합니다. 2일, 5일 및 12일에는 정량적 실시간 PCR을 위한 DNA 추출 완충제에서 세포의 33%를 동결하고, 표준 프로토콜에 따라 세포의 최종 33%를 유동 세포측정에 의해 분석하여 조혈자 자손의 피형 조성물을 평가한다. 유동 세포측정에 의한 트랜스진 발현을 정량화하려면, 3개의 추가 측면 산란 대 추가한다.트랜스진 플롯;및 조혈 줄기 세포에 대한 첫 번째 플롯, 다능성 안-에리스로 골수성 전조자에 대한 두 번째 플롯, 림프골골성 전구의 세 번째 플롯, 모두 대 트랜스진. 그런 다음 2000에서 3000 개의 이벤트를 기록하고 신호 강도및 대상 인구에 맞게 정렬 게이트를 미세 조정합니다.이 프로토콜을 사용하여 농축되는 비인간 영장류 CD34 양성 HSPC의 수는 전형적으로 입력 총 백혈구 수에 비례한다. 이전 연구 결과는 총 CD34 양성 HSPC 생성물이 실제장기 및 접목 조혈 줄기 세포를 포함하는 것을 입증했기 때문에, 이러한 유동 세포측정 기반 및 식민지 형성 세포 기술은 헌신적인 선조로부터 장기간 조혈 줄기 세포를 위해 농축된 하위 세트를 안정적으로 식별하고 분화하는 데 사용될 수 있다. CD34 양성 인간 줄기 세포 농축 세포는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 효율적으로 유전자 변형될 수 있다.벡터의 비통합 된 사본을 운반하는 세포는 12 일 액체 배양 분석 기간 동안 희석되는 반면, 게놈내의 안정적으로 통합 된 벡터는 모든 자손에게 전달됩니다. 콜로니 형성 세포 에서 벡터의 발현에 의해 확인된 바와 같이. 이 전임상 방법은 유전자 치료를 위한 고품질 통제된 비인간 영장류 조혈 줄기 및 선조 세포에서 유전자 변형을 격리하는 데 사용될 수 있다.이 방법은 다른 종, 조혈 줄기 및 전구 세포, 유전자 치료 도구 및 질병에 쉽게 적응할 수 있습니다. 이 철저하게 심사 된 프로토콜은 수많은 인간 질병에 대한 효과적인 치료법을 모델링하는 것에 대한 큰 약속을 보여줍니다. 비인간 영장류 조직과 협력하려면 개인 보호 장비를 포함한 향상된 보안 조치가 필요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

이 절차는 murine 골수에서 조혈 세포 기본 문화를 확립하고 진 Pulser MXCell의 electroporation 시스템을 사용 transfection하여 다음 방법을 설명합니다.

Electroporation에 대한 Murine 골수에서 조혈 세포 차 문화의 준비

여기, 우리는 인간의 만능 줄기 세포 (hPSC) 문화 프로토콜, hPSCs CD34로 차별화 하는 데 사용 현재+ 조 혈 창시자. 이 방법은 단계 특정 조작 정식 WNT 신호 독점적으로 프로그램 중 하나는 확실 한 또는 원시 조 혈 세포를 지정 하려면 사용 합니다.

기본 및 확실 한 조 혈 창시자 인간 만능 줄기 세포에서의 감독

이 프로토콜에서는 안전 하 고 효율적인 절차 CD133 수정+ 조 혈 줄기 세포. 제시 비 바이러스 성, 자기 polyplex 기반 접근 자기 공명 화상 진 찰을 통해 관리 셀 제품 모니터링에 관해서는 뿐만 아니라 치료 줄기 세포 효과의 최적화를 위한 기반을 제공할 수 있습니다.

성인 골 수 유래 조 혈 줄기 세포로 세포 공학 자기 대상으로 함께 있도록 예측에 관한 전송을 위한 프로토콜

여기, 우리는 전 설명 CD34에서 조 혈 줄기 세포의 생체 내 확장+ 세포 탯 줄 혈액에서 파생 된 칵테일 cytokine VPA의 조합으로 치료. 이 메서드 중 하나에 대 한 기본 HSCs의 비보 확장 전의 상당한 정도로 리드 임상 또는 실험실 응용 프로그램.

인간 탯 줄 혈액 파생 CD34에서 조 혈 줄기 세포의 생체 내 확장 전+ 세포 Valproic 산 사용 하 여

설명된 것은 CRISPR/Cas9 시스템에 의한 뮤린 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)의 고효율 게놈 편집을 위한 프로토콜로 조혈 시스템 별 유전자 수정을 통해 마우스 모델 시스템을 신속하게 개발합니다.

질병 모델에서 조혈 세포의 연구를 위한 렌티바이러스 CRISPR/Cas9 매개 게놈 편집

본 프로토콜은 생체 내에서 유전자 편집 세포의 강력한 생착을 위한 최적화된 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC) 배양 절차를 설명합니다.

유전자 치료 애플리케이션을 위한 조혈 줄기 및 전구 세포의 CRISPR/Cas9 유전자 편집

조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)의 체세포 돌연변이를 충실하게 모델링하는 새로운 전략은 조혈 줄기 세포 생물학 및 혈액 악성 종양을 더 잘 연구하는 데 필요합니다. 여기에서는 CRISPR/Cas9의 사용과 이중 rAAV 공여체 형질도입을 결합하여 HSPC에서 이형접합체 기능 획득 돌연변이를 모델링하는 프로토콜이 설명됩니다.

인간 조혈 줄기 및 전구 세포에서 발암성 이형접합체 기능 획득 돌연변이 공학

B세포 치료제 연구를 위해 CRISPR/Cas9 및 재조합 아데노 관련 바이러스 혈청형 6을 이용하여 일차 붉은털원숭이 B세포를 배양하고 유전자를 편집하는 방법을 제시합니다.

일차 붉은털 원숭이 B 세포의 유전자 편집

본 프로토콜은 인간 및 비인간 영장류 소변 유래 세포를 유도 만능 줄기 세포(iPSC)로 분리, 확장 및 재프로그래밍하는 방법과 새로 생성된 iPSC의 피더 없는 유지 관리에 대한 지침을 설명합니다.

소변에서 유래한 영장류 유도 만능줄기세포의 생성 및 유지

영장류 대뇌 오가노이드의 전기천공법은 영장류(병리)생리학적 신피질 발달에 가까운 모델 시스템에서 다양한 전구체 유형과 뉴런에 일시적인 유전자 변형을 도입하는 정확하고 효율적인 접근 방식을 제공합니다. 이를 통해 신경 발달 및 진화 과정을 연구 할 수 있으며 질병 모델링에도 적용 할 수 있습니다.

유전자 변형을 위한 영장류 대뇌 오가노이드의 표적 미세주입 및 전기천공

학습하세요 비인간 영장류 골수에서 CD34+ 조혈 줄기세포를 분리하고 렌티바이러스 벡터로 유전자 수정하는 방법을. 이 프로토콜은 유전자 치료 연구에 활용할 수 있는 안전하고 효율적인 세포 제제를 준비합니다.

준비 및 Nonhuman 영장류 조 혈 줄기와 조상 세포의 유전자 수정

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