Name: 셀의 Cardiomyogenic 잠재력 향상을 동시 전기 및 기계적 자극 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: 배우세요 동시 전기 및 기계적 자극을 이용한 세포의 심근형성 잠재력 향상 방법을. 이 기술은 세포 치료 및 질병 모델링에 활용될 수 있습니다.

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저자는 ICREC 연구 프로그램 (IGTP, 바 달로 나)는 전자 및 생물 의학 계측 (오순절, 바르셀로나), 특히 교수 J. Rosell-페 러의 회원을 감사 드립니다. 또한, 저자 줄기 세포 변환 의학 저널 및 이전 게시 된 수치 (Llucià-Valldeperas, 그 외 여러분 의 적응을 허용 AlphaMed 프레스 인정 30).이 프로토 타입의 개발 및 프로토콜의 디자인 정부의 데 모두 y 많은 (SAF 2008-05144), 정부의 드 Economía y Competitividad (SAF 2014-59892), 유럽 위원회에 의해 지원 되었다 7 프레임 워크 프로그램 ( RECATABI, NMP3-SL-2009-229239) Fundació 라 Marató 드 TV3 (080330, 201516, 201502)와 Fundación 파라 라 Innovación y 라 Prospectiva en 건배 엉 에스파냐 (FIPSE; 06-00001396-15).

이 연구는 환자 샘플에서 인간의 심장 ATDPCs를 사용합니다. 지역 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다 그들의 사용 그리고 모든 환자 동의 했다. 연구 프로토콜 헬싱키의 선언에 명시 된 원칙을 준수 합니다.
1입니다. 준비
<ol><li>압력솥 2 핀셋, 전기 자극에 대 한 12 플래티넘 PTFE 전극 및 일부 종이 수건 20 분 동안 121 ° C에서.</li>
	<li>
소독 12 PDMS 주문 품 구조 (그림 1A).
	<ol>
<li>15 분 동안 실내 온도에 자석 동요와 살 균, 소 주 물 5 mL와 함께 각 구조를 씻어.</li>
		<li>마그네틱 동요와 70% 에탄올 5 mL 1 x 5 분 동안 실내 온도에 씻는 다.</li>
		<li>알코올 잔류물을 제거 하, 세척 당 10 분 동안 실내 온도에 자석 동요와 살 균, 소 주 물 5 mL와 5 배를 씻어.</li>
		<li>구문을 흐름 캐비닛 하룻밤 안에 메 마른 종이 수건에 건조.</li>
		<li>사용까지 살 균 50 mL 원심 분리기 튜브에 그들을 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 셀 시드 (주-1)
<ol><li>셀 시드, 전에 살 균 판 청소 PDMS 구조를 전송 하 고 완전 한 살 균을 위해 5 분 동안 자외선에 노출.</li>
	<li>35 mm 셀 문화 접시, 또는 즉시 셀 시드에 6 잘 플레이트 각 구조를 전송 합니다.</li>
	<li>
심장 ATDPCs의 confluent T75 플라스 크 trypsinize
	<ol>
<li>인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1의 5 mL와 T75 플라스 크를 씻으십시오.</li>
		<li>0.05% 트립 신-EDTA의 1 mL을 추가 하 고 셀을 분리 하려면 5 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>트립 신-EDTA 비활성화를 완전 한 매체의 5 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>수집 모든 15 mL 튜브 세척 플라스 크에 세포 나머지 셀을 수집 하는 PBS의 5 mL로 2 배.</li>
		<li>22 ° C에서 5 분 동안 230 x g 에서 centrifuge, 상쾌한, 제거 하 고 resuspend hemocytometer 상공 회의소와 함께 그들을 계산 하는 완전 한 매체의 2 mL에 셀.</li>
	</ol>
</li>
	<li>씨앗 심장 ATDPCs (2.5 x 105 셀/mL)의 200 µ L 12 PDMS 구조 (그림 1A, B)을가지고 시드 표면 보호의 ~ 80%의 셀 풀으로 세포에 의해, 다음날 고 37 ° C, 5% CO2에서 품 어. 참고: 2-4 h 후 셀을 연결 한다. 셀 inoculum 셀 크기와 성장 준비가 되어 있습니다. 작은 셀에 대 한 시드 밀도 증가 한다.</li>
	<li>부드럽게 접시 당 prewarmed 완전 한 매체 (α-MEM 10% 태아 둔감 한 혈 청, 1 %L-글루타민, 및 1% 페니실린-스 보충)의 2 개 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>밤새 문화 조건 (보통 37 ° C, 5% CO2)에서 구조를 품 어.</li>
</ol>3. 전기 기계 자극 설치 프로그램 (0 일)
<ol><li>절차를 시작 하기 전에 전기 자극에 대 한 6 개의 구조와 6 nonstimulated 컨트롤을 가져가 라. 자극 당 미만 6 접시, 적절 한 전기 분야 자극 되도록 같은 중간 볼륨으로 빈 구조를 사용 합니다.</li>
	<li>70% 에탄올과 자극 단위를 청소 하 고 장의 흐름에 배치.</li>
	<li>살 균 전극과 흐름 캐비닛 내부 핀셋가지고.</li>
	<li>쉽게 전극 구조를 조작 하는 문화 접시에서 미디어의 90%를 제거 합니다. 첫째, 고정 및 모바일 자석 사이의 자기 매력 (자석으로 문화 배지 내의 PDMS 변위)를 보장 하기 위해 올바른 위치에 PDMS 구조를 놓습니다. 다음, 전극 커넥터 및 PDMS 구문에서의 지정 된 공간에 PTFE 부분 백 금 철사를 연결 합니다.</li>
	<li>각 구문에 신선한 prewarmed 완전 한 매체의 2.5 mL를 추가 합니다. 참고: 절차를 통해 불 임을 유지 하 고 한 번에 하나의 구문에서 작동. 사용까지 37 ° C, 5% CO2 배양 기에서 구성의 나머지를 유지.</li>
	<li>일단 모든 PDMS 구조 배치 플랫폼에 전기적으로 연결, 37 ° C, 5% CO2배양 기에 플랫폼 다시 가져.</li>
	<li>전기 및 기계 소스를 연결 합니다.</li>
	<li>
자극 프로그램을 구성 합니다. 전기 및 기계적 자극 정권 전기 자극, 기계적 자극을 제어 하는 응용 프로그램의 사용자 인터페이스를 통해 지정 합니다. 오차를 다음과 같이 설정 합니다.
	<ol>
<li>전기 자극 기에 스위치. 디스플레이에 표시 주요 메뉴에 대 한 기다립니다.<ol>
<li>그런 다음 선택 옵션 2: 편집 시퀀스 + Enter.</li>
			<li>메뉴 순서를 다음과 같이 편집 합니다.<ol>
<li>모드 탭을 사용 하 여 전압 또는 전류를 선택 하. 현재 + 를 클릭 하 여 선택 하 고 Enter키를 누릅니다.</li>
				<li>진폭 탭에 대 한과 + 1 (mA)을 선택 하 고 Enter키를 누릅니다.</li>
				<li>기간 (T), 1000 (ms) + 를 선택 하 고 Enter키를 누릅니다.</li>
				<li>2 (ms) + 와 펄스 지속 시간 (Tw)를 설정 하 고 Enter키를 누릅니다.</li>
				<li>트리거 모드 탭에 대 한 외부 소프트웨어에 의해 선택 하 고 Enter키를 누릅니다.</li>
				<li>주 메뉴에서 다시 선택 옵션 4: 시퀀스를 생성 Enter키를 누릅니다. 참고: 직렬 포트를 통해 기계적 자극 응용 프로그램에서 트리거 명령의 받을 때까지 전기 자극 기는 대기에 달려있다.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>제어판 응용 프로그램 (그림 2C)의 기계적 자극 섹션에서 다음 단계를 수행 합니다.<ol>
<li>펄스 기간 텍스트 컨트롤에 1000 (ms)를 작성 합니다.</li>
			<li>기계적인 펄스 기간을 설정 하려면 ON 시간 (Tw) 텍스트 컨트롤에 500 (ms)를 작성 합니다.</li>
			<li>쓰기 2000 (AU) 여행 텍스트 컨트롤에 10% 구조 신장 제공 하. 이 선형 제어 모터에는 단계 수입니다. 참고: 여기에 적용 하는 자극 프로토콜 1 Hz에서 7 일에 대 한 스트레칭 10 %50 mV/cm의 교류 2 ms monophasic 구형 파 펄스 이루어져 있다. 기계적인 펄스의 상승 및 하강 시간 대략 난로 압력 펄스의 모양을 모방 100 ms에서 설정 됩니다. 또한, 반복 모드 연속 을 설정 되 고 펄스의 수를 표시 하는 카운터입니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 주일 (월요일, 목요일 오후) x 2 미디어를 변경 합니다. 먼저, 제거 오래 된 미디어; 다음, 셀 풀에 절대 직접 PDMS 지원의 측면에서 따뜻한 미디어를 추가 합니다. 참고: 만약 셀 높은 성장률, 미디어 변경된 3 (예: 월요일, 수요일, 그리고 금요일) 주 배 이어야 한다. 그것은 분리 하 고 모든 케이블을 다시 연결 하는 데 필요한 이지만 그들의 장소에서 문화 접시와 전극을 제거할 필요가 없습니다.</li>
	<li>실험을 수행한 후 샘플을 수집 합니다.</li>
</ol>4. 샘플 컬렉션 실험 (7 일)의 끝에
<ol><li>
RNA 분석에 대 한
	<ol>
<li>구문이 세척 2 x 1 x PBS 실 온에서 5 분의 3 mL와 함께.</li>
		<li>(전체 구조를 커버 하기에 충분) 각 접시에 0.05% 트립 신-EDTA의 3 개 mL를 추가 37 ° c.에서 5 분을 기다립니다</li>
		<li>셀을 분리 하는 트립 신-EDTA 비활성화를 완전 한 중간의 2 개 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>수집 15 mL에 모든 셀 튜브와 구조를 씻어 3 mL의 나머지 셀을 수집 하는 PBS로 2 배.</li>
		<li>22 ° c.에 5 분 동안 230 x g 에서 원심 분리기</li>
		<li>제거는 상쾌한 고 1 mL의 PBS에 펠 릿을 resuspend.</li>
		<li>1.5 mL 튜브를 5 분 동안 230 x g 에서 원심 분리기 셀 솔루션을 전송 합니다.</li>
		<li>제거는 상쾌한 고 RNA 격리 추가 대 한 세포 시 약의 700 µ L에서-80 ° C에서 펠 릿을 저장 합니다.</li>
		<li>제조업체의 지침에 따라 상업 키트를 사용 하 여 RNA를 분리.</li>
		<li>리버스-키트 제조 업체의 프로토콜에 따라 무작위 hexamers를 사용 하 여 격리 된 RNA 녹음.</li>
		<li>작은 RNA 농도 대 한 preamplify 하 고 후속 실시간 반전 녹음 방송 연쇄 반응 (RT-PCR)를 수행 하기 전에 다음, RNase 무료 물과 1: 5을 희석. 실시간 RT-PCR를 위한 표준 프로토콜을 계속 하 고 주요 심장 마커 검사. 참고: 심장 녹음 방송 요인 등 다양 한 범주에서 초기 및 런타임에 마커를 구성 하는 전형적인 심장 마커 (myocyte 관련 증강 인자 2A [MEF2A], 가타-바인딩 단백질 4 [가타-4]) 및 구조 (심장 분 나 [cTnI], 심장 분 T [cTnT], α-actinin) 및 칼슘 규정 (Connexin43 [Cx43], sarco-/ 바인딩과 그물 Ca2 +-ATPase [SERCA2])30. 단백질 격리는 또한 필요한 경우에 수행할 수 있습니다. 동시 RNA 및 단백질 격리 같은 샘플, 샘플 수량이 적을 경우 상용 시 약 및 키트 (테이블의 재료)를 사용 하 여 수행할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunostainings에 대 한 참고: 이 PDMS 구조물의 셀 풀에 연결 된 셀에 직접 수행 됩니다. 따라서, 좋습니다, 배치 때마다, 1 cm x 1 cm 셀 풀 플레이트를 제외 하 고 위에 파라핀 영화의 뚜껑, 부 화 솔루션의 증발을 최소화 하기 위해.<ol>
<li>구조를 씻어 실 온에서 5 분에 대 한 PBS의 3 mL 2 x.</li>
		<li>실 온에서 15 분 동안 10% 포 르 말린의 2 mL와 함께 구조에 연결 된 셀을 수정 합니다.</li>
		<li>3 세포를 씻어 실 온에서 5 분에 대 한 PBS의 3 mL x. 장기 보관을 위해 두고 샘플 PBS에 4 ° c.에 0.1% 나트륨 아 지 드</li>
		<li>3 mL PBS + 0.5% 세제와 함께 세포를 permeabilize (3 배, 각 시간 실 온에서 5-10 분).</li>
		<li>특이 항 체 바인딩을 차단 PBS + 10% 말 혈 청 + 0.2% 세제 + 1% 소 혈 청 알 부 민 1 시간 실 온에서 100 µ L로 세포를 품 어.</li>
		<li>100 µ L의 PBS + 10% 말 혈 청 + 0.2% 세제 + 1% 소 혈 청 알 부 민, 1 시간에 대 한 실 온에서 1 차적인 항 체와 세포를 품 어. Cx43에 대 한 예를 들어 1 차 항 체 (1: 100), sarcomeric α-actinin (1: 100), 가타-4 (1:50), MEF2 (1:25), 그리고 SERCA2 (1:50).</li>
		<li>3 x 5 분 동안 실 온에서 PBS의 3 mL 씻으십시오.</li>
		<li>100 µ L의 PBS + 1 시간을 위해 어둠 속에서 실 온에서 이차 항 체와 세포를 품 어. 참고: 2 차 항 체와 다른 fluorophores 활용 그리고 counterstaining 에이전트 사용 되었다.</li>
		<li>그들을 씻어 5 분 동안 어둠 속에서 실 온에서 3 mL의 PBS로 3 배.</li>
		<li>15 분 동안 어둠 속에서 실 온에서 PBS에 핵 (0.1 µ g/mL) 얼룩의 100 µ L로 세포를 품 어.</li>
		<li>그들을 씻어 5 분 동안 어둠 속에서 실 온에서 3 mL의 PBS로 3 배.</li>
		<li>3 mL PBS의 4 ° C에서 0.1% 나트륨 아 지 드와 함께 인수까지 샘플을 저장 합니다. 참고: 현미경 인수 구문 두께 약 0.5 m m 때문에 거꾸로 형광 고 confocal 현미경 긴 작업 거리 목표에 가능 하다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

저자 없다 공개, 제외 하 고는 자극 장치 및 프로토콜 (WO 2013185818 a 1, WO 2017125159 a 1) 특허 이전 했다.

전기 자극 적대적인 심장 환경에 대 한 셀을 준비 하 고 그들의 심장 헌신을 강화에 대 한 안전한 대안을 것 같다. 여기, 심장 조상 세포 주 심장 감 적의 식을 증가 하 고 되었다 설명 프로토콜 infarcted murine 심근30에 그들의 다음 주입에 도움이 될 보고. 일반적으로, electromechanically 자극된 심장 ATDPCs 유전자와 관련 된 초기, 구조, 및 결코 달성 된 이전 전기 또는 기계적 stimulations와 개별적으로 칼슘 규정의 표현을 증가. 사실, electromechanically 자극된 심장 ATDPCs 더 완전 한 단면도 표시 하 고 이전 보고 보다 더 심장 계보를 위해 최선을 다하고 있을 것 같았다.
심장 유전자 발현은 특히 피하 ATDPCs에 비해 심장 ATDPCs의 주목할 만한 확대 후 전기 자극 후 두 셀 형식에 변조 했다. 이 결과 세포 격리, 즉, epicardial 또는 피하 지방...

심장 기능 전기 자극 및 기계적 수축의 결합을 기반으로 합니다. 간단히, cardiomyocyte 세포 접합 및 폐 시스템을 통해 체계적으로 거의 동기 수축이 심장의 펌프 혈액 생산 전기 신호 전파를 허용 합니다. 심장 세포, 따라서, 유전자 표현과 휴대 기능을 조절 하는 전기 및 기계적 힘을 받 다. 따라서, 많은 그룹 심장 개발, 기능, 및 성숙에 기계적, 전기적 자극의 역할을 이해 하는 심장 생리 적 환경을 모방 문화 플랫폼을 개발 하려고 했습니다. 생체 외에서 전기 및 기계적 stimulations 개별적으로 적용 된 광범위 하 게 심장 조직 공학 기능 속성 강화, 세포 성숙, 증가 또는 셀 커플링 및 칼슘1 처리 개선 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. 자극 및 프로토콜을 개발 하는 도전 및 필수 최적화22때문에 그럼에도 불구 하 고, 동기 전자 컨디셔닝 unexploited 남아.
예비 작업 해결 전기 자극 및 미디어 관류;의 조합으로 전기 자극 그러나, 흐름 심 실 충전 물23,,2425의 전형적인 스트레인 기반 변형을 포함 되지 않습니다. 나중에, 더 많은 생리 적 접근와 함께 전기 자극 물리적 변형 또는 isovolumetric 수축26,,2728,29,30 모방 하는 스트레칭 ,31. Feng 외. 2005, cardiomyocyte 크기와 수축 속성26향상 된 보고에 전기 자극의 첫 번째 데모 설명. 왕 외. 청소용 5-azacytidine와 중간 엽 줄기 세포와 동시 전기 및 기계적 컨디셔닝, recellularization, 세포 생존 능력, 심장 차별화 및 조직27개장 개선 적용. 그의 간행물부터 더 많은 그룹 셀 monolayers의 전기 자극에 보고 또는 조직 (예를 들어, 검은28, Vunjak Novakovic29,31, 그리고 우리의 그룹30)와 설계는 첫 번째 조건된 셀 테스트 vivo에서30. 간단히, 모건 테스트 전기 및 기계적 자극의 몇 가지 조합을 블랙 보고 stimulations 사이 타이밍 지연된 결합 된 전기 자극 나왔고 좋은 결과28때문에 결정적 이었다. 다음, Godier Furnémont 및 공동 작업자 신생아 쥐 심장 세포에서 설계 된 심장 근육 구조에 대 한 전기 자극 프로토콜을 최적화 하 고 달성, 처음으로, 긍정적인 힘-주파수 관계29. 그 후, 우리의 그룹 보고 electromechanically preconditioned 세포 증가 주요 심장 마커에 생체 외에서 의 표현 및 광범위 한 도움이 효과 vivo에서와 같은 심장 기능을 향상 또는 경색에 배 밀도 증가 국경 지역30. 가장 최근 게시 심장 조직에서 줄기 세포 유래 cardiomyocytes는 성숙 수준 가까이 인간의 성인 심장 구조와 기능31를 도달 하는 전기 기계 컨디셔닝 대상이 시연 했다. 또한, 다른 3 차원 자극 플랫폼 electroactive 건설 기계 전기, 기계, 제공 하는 구성 및 지형 신호에 있는 셀에 연결 된32. 또한, 기계적 변형 (셀 단층 스트레칭 및 압축) 정상적인 생리 적인 조건 뿐만 아니라 극한 상황33를 흉내 낸 stretchable 전극으로 유도 또한 수 있다.
따라서, 근거는 생체 외에서 전기 자극 생리 적 조건에 따라 셀의 cardiomyogenic 잠재력을 향상 시킬 수 있는. 실제로,이 자극 더 임상 시나리오에서 심근으로 세포 치료의 통합 혜택 하거나 마약 검사 응용 프로그램에 대 한 조직 성숙 증가 수 있습니다.
또한, 우리는 고립 되 고 심장의 인간 지방 조직 유래 조상 세포의 인구 특징 원점 (심장 ATDPCs)34. 이 세포는 epicardial 지방에 위치 해 있습니다. 이러한 세포 심근 경색의 치료에 histopathological 및 기능적 효능을 표시 하 고 또한 심장 및 내 피 분화 가능성 유지. 30 , 35. 우리는 이러한 혜택은 생물 자극 후 증가 시킬 것입니다 가설.
따라서, 우리는 장치 및 관심의 세포 인구에 대 한 자극 정권 개발 하 고 효과 조사. 이 전기 프로토콜 살 균 방식으로 스트레칭 현재 셀을 유도 하는 새로운 전략 이며 noninvasively 이전 간행물36, 함께 전기 분야 자극에 비해. 여기 보고 기술 장치 및 셀의 전기, 기계, 및 전기 자극을 위해 사용 되는 방법을 자세히 설명 합니다.
이 장치는 독립적으로 또는 동시에 전기 및 기계적 자극을 제공할 수 있습니다. 자극은 presterilized 셀 지원, 전극 표준 문화 플레이트, 그리고 기계 및 전기 힘 (그림 1)을 유도 하는 플랫폼 안에 포함 된 비 침범 성 및 무 균 소설 방식으로 수행 됩니다.
6 문화 플레이트와 레이저-컷 poly(methyl methacrylate) 및 인쇄 회로 기판의 샌드위치 구조 이루어져 플랫폼까지 저장할 수 있습니다. monophasic 프로그래밍 가능 컴퓨터 제어 전기 자극 기, 전극, 및 6 10 m m x 10 m m x 5 m m 니켈 도금된 네오디뮴 고정 자석 배치의 강력한 연결에 대 한 인쇄 회로 기판의 조합에 의존 하는 플랫폼 프로토타입 근처 문화 접시의 한쪽. 6 운전 자석 (같은 모델) 문화 판의 다른 쪽 앞 및 선형 전동기와 이동 알루미늄 바가 있다. 모터는 모터 컨트롤러, RS-232 포트를 통해 운영 하는 상용 소프트웨어에 의해 구동 됩니다 ( 테이블의 자료를 참조). 사용자 인터페이스 및 프로그래밍 가능한 자극을 통해 그것은 전기 강도, 펄스 지속 시간 및 주파수, 기계적 자극, 듀티 사이클, 펄스, 펄스 진폭 (자석 여행), 수의 주파수를 프로그래밍할 수 그리고 사면입니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58934/58934fig1.jpg"> 그림 1 : 전기 자극. (A) PDMS 구성 세포 조절에 사용 합니다. (B) 전극 등 자석 PDMS 구조물의 도면. 전기 난방을 수행 하는 데 사용 하는 인쇄 회로 기판 (플랫폼)의 (C) 세부 사항. 이 패널은 Llucià-Valldeperas에서 수정 된 외30. 전기 자극 플랫폼 및 사용자 인터페이스 (컴퓨터)의 (D) 그림. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58934/58934fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
자극 및 전기 기계 컨디셔닝 위한 방법 두 국제 특허 WO 2013185818 a 137 , WO 2017125159 a 138완벽 하 게 설명 합니다.
구문에 셀, 전극, 및 자석 구조 지원을 제공 하도록 설계 되었습니다 생체 실리콘 기술 이전10,21. 간단히, 그들은입니다 (PDMS), 성형 하 고 실내 온도에, 생리 적 수준 1.3 MPa의 영의 계수와 함께 치료의 구성 됩니다. 구문이 포함 셀 문화 풀 유연한 영역 (10 x 10 m m x 2 m m)에, 전극, 잡아 두 내부 가로 슬롯 및 2 포함 6 m m x 2 m m x 4 m m 니켈 도금된 네오디뮴 자석. 전극은 0.2는 2 m m x 3 m m x 12 m m 소계 (PTFE)를 엉키지 플래티넘 m m 와이어 전극, 약 23 회전 (21 cm) 바 코어와 유도 위한 전기 분야 생성 유연한 영역의 반대편에 내장 전기 자극입니다. 기계 기지개는 지원에 포함 된 자석 및 문화 접시 옆과 이동 알루미늄 팔에 외부 자석 사이의 자기 매력을 통해 이루어집니다. 이 방법에서는, 셀 지원 살 균 방 벽을 위반 하지 않고도 확장할 수 있다. 이 이렇게 셀 단층에 적합 하지만 3 차원 구조에 맞게 수 있습니다.
또한, 일반 패턴 수 있는 세포는 시드, 인쇄 통치 회절 격자 (1250 홈/mm)를 사용 하 여 있습니다. 명시 및 형광 현미경에서 PDMS 구조물에 배양 세포의 직접적인 시각화의 투명성과 0.5 m m 두께 때문에 가능 하다. 현재 경우 PDMS 문화 수영장에 수직 표면 패턴, 정렬 셀에서 전기 분야 기온 변화도 최소화 하는 전기 분야에 수직 셀 기지개 힘에 수직 합니다.
그림 1 구성 및 자극에 대 한 사용 되는 장치에 대 한 자세한 설명이 나와 있습니다. PDMS 구성 하 고 특성 (그림 1A, B)를 기지개 하는 셀에 대 한 최적화. 자극 기 개발 이며 PDMS 구조물에 연결 된 셀에 원하는 전기 및 기계적 자극의 효과적인 응용 프로그램에 대 한 검증. 이 프로세스는 소프트웨어 인터페이스 (그림 1 c, D)를 통해 좋은 연결 및 사용자 운용성 보장을 포함 됩니다.
이 주문 품 장치를 사용 하 여 세포 자극에 대 한 절차는 프로토콜 섹션에 설명 되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Stimulator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>nickel 도금 네오디뮴 자석</td><td>Supermagnete</td><td>Q-10-10-05-N</td><td></td></tr><tr><td>니켈 도금 네오디뮴 자석</td><td>Supermagnete</td><td>Q-06-04-02-HN</td><td></td></tr><tr><td>폴리디메틸실록산(PDMS) SYLGAR 184 실리콘 엘라스토머 키트</td><td>Dow Corning</td><td>Corp 184</td><td></td></tr><tr><td>ruled diffraction grating(1250 grooves/mm)</td><td>Newport</td><td>05RG150-1250-2</td><td></td></tr><tr><td>모터 컨트롤러</td><td>Faulhaber</td><td>MCLM-3006-S</td><td></td></tr><tr><td>Labview</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td>70013-065</td><td></td></tr><tr><td>0.05% trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-120</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 세포 배양 접시</td><td>BD Falcon</td><td>45353001</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민 200 mM, 100x</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Streptomicine, 10.000 U/mL</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>최소 필수 매체 독수리(alfa-MEM)</td><td>Sigma</td><td>M4526-24x500ML</td><td></td></tr><tr><td><스트롱>단백질 & RNA 분석</강력></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>QIAzol 용해 시약</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td></td></tr><tr><td>AllPrep RNA/단백질 키트</td><td>Qiagen</td><td>50980404</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy 미니 키트</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>iTaq 범용 프로브 원스텝 키트</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>172-5140</td><td></td></tr><tr><td>랜덤 헥사머</td><td>Qiagen</td><td>79236</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan PreAmp MasterMix 2x</td><td>Applied Biosystems</td><td>4391128</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR MasterMix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4324018</td><td></td></tr><tr><td>Immunostaining</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% 포르말린</td><td>Sigma</td><td>HT-501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>호스 세럼</td><td>시그마</td><td>H1138</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>소 세럼 알부미나 (BSA)</td><td>시그마</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>파라필름</td><td>시그마</td><td>P6543</td><td></td></tr><tr><td>4',6-디아미디노-2-페닐린돌 (DAPI)</td><td>시그마</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>팔로이딘 알렉사 568</td><td>인비트로젠</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>아지드화나트륨</td><td>Sigma</td><td>S8032-100g</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma</td><td>14533</td><td></td></tr><tr><td>Connexin-43 토끼 1차 항체</td><td>Sigma</td><td>C6219 lot#061M4823</td><td></td></tr><tr><td>sarcomeric &alpha;-actinin 마우스 1차 항체</td><td>Sigma</td><td>A7811 lot#080M4864</td><td></td></tr><tr><td>GATA-4 염소 1차 항체</td><td>R& D</td><td>AF2606 VAZ0515101</td><td></td></tr><tr><td>MEF2 토끼 1차 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-313 lot#E0611</td><td></td></tr><tr><td>SERCA2 염소 1차 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8095 lot#D2709</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 2차 항체</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 2차 항체</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-165-151</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 2차 항체 항체</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-165-150</td><td></td></tr><tr><td>Cy2 2차 항체</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-225-150</td><td></td></tr><tr><td>Cy2 2차 항체</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-225-152</td><td></td></tr><tr><td>Cy2 2차 항체</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-225-147</td><td></td></tr></tbody></table>

셀의 cardiomyogenic 잠재력 향상을 동시 전기 및 기계적 자극

Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential

심혈 관 질환 선진국에서 죽음의 주요 원인입니다. 따라서, 효과적인 심장 세포 치료에 대 한 수요는 체 외에서 높은-충실도 인간의 심근 기초 연구 및 임상 응용 프로그램을 개발 하는 줄기 세포와 생명 공학 분야에서 연구 동기는. 그러나, 심장 세포의 미 숙 형 기능 모방 기계 및 전기 신호에 의해 주로 특징은 성인 심근 조직에 제한 사항입니다. 따라서,이 프로토콜의 목적은 준비 하 고 대상 셀 인구 전기 자극을 통해 생리 적 매개 변수 업과 성숙입니다. 심장 조직 공학 더 많은 생물 학적 접근, 방향으로 진화 하 고 전략 기반 생물 자극, 따라서, 기세를 얻고 있다. 이 목적을 위해 개발 된 장치 고유 이며 개별 또는 동시 전기 및 기계적 자극, 신중 하 게 특징 및 확인을 수 있습니다. 또한, 비록 방법론은이 자극 및 특정 세포 인구에 대 한 최적화 되었습니다, 그것은 쉽게 적용할 수 있습니다 다른 장치 및 셀 라인에. 여기 결과 전기 자극 후 셀 인구의 증가 심장 헌신의 증거를 제공합니다. Electromechanically 자극된을 세포 증가 표현의 초기, 구조, 및 칼슘 조절 유전자를 포함 하 여 주요 심장 마커를 표시 합니다. 이 셀 컨디셔닝 추가 재생 세포 치료, 질병 모델링 및 높은 처리량 마약 검사에 대 한 유용할 수 있었다.

그림 2 는 세포 자극에 대 한 다음 일반적인 스키마를 나타냅니다. 간단히, 세포는 PDMS 구조물에 시드 했다 일주일에 두 번 수행 하는 미디어 변경 전기 자극에 복종 하 고. Nonstimulated 세포는 전기 시설에 대 한 제어로 사용 되었다. 또한, 우리는 실험을 추가 컨트롤을 추가 및 피하 ATDPCs 심장 ATDPCs에 대 한 제어로 사용 되었다. 피하 ATDPCs 심장 ATDPCs33에 관해서는 동일한 격리와 문화 절차에 따라 피하 지방 조직에서 가져옵니다. PDMS 구조물에 연결 된 셀 전과 자극 후 일반적인 방 추상 표현 형을 입증. 또한, 셀이 경우 수직 패턴에 따라 패턴화 된 표면에 따라 정렬.
전기 및 기계 stimulations 먼저 개별적으로...

여기 선물이 심장 생리학을 모방 하는 전기 및 기계적 자극을 사용 하 여 셀 인구를 교육 하기 위한 프로토콜. 이 전기 자극 치료 세포의 cardiomyogenic 잠재력을 강화 하 고 더 세포 치료, 질병 모델링 및 의약품 심사를 위한 유망한 전략 이다.

셀의 Cardiomyogenic 잠재력 향상을 동시 전기 및 기계적 자극

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated ...

이것은 세포에 전기 기계적 자극을 적용하는 방법입니다. 그것은 세포 인구에 미치는 영향을 연구 하는 여러 응용 프로그램, 생체 내 전달에 대 한 사전 훈련, 그리고 세포 성숙. 장점은 전기 및 기계적 자극이 멸균 바이러스를 그대로 유지하면서 동일한 장치로 개별적으로 또는 동시에 적용 될 수 있다는 것입니다.이 기술은 우리의 치료에 간접적인 접근입니다. 세포 치료는 전기 기계적 자극 세포로 간주되는 것은 내성 심근을 치료하는 흥미로운 세포 집단일 수 있다. 이 방법은 일반적으로 심장 혈관 필드에 속하지만 신경계에도 적용 될 수 있습니다.이것은 인내심을 필요로하는 쉬운 기술입니다. 가장 어려운 부분은 작은 조각으로 작업하고, 전체 멸균을 유지하는 것입니다. 설명하기 어려운 조작에 대한 세부 사항은 거의 없으므로 시각적 데모가 정말 유용합니다.먼저 12개의 청소된 PDMS 구조를 10센티미터 플레이트멸균으로 옮기는 것으로 시작합니다. 완전한 멸균을 보장하기 위해 플레이트를 UV 광에 5분 동안 노출하십시오. 그런 다음 각 구조를 별도의 35mm 세포 배양 판또는 즉각적인 세포 파종용 6웰 플레이트로 이송한다.세포 파종을 시작하려면 먼저 1x PBS의 5 밀리리터로 심장 ATDPC의 컨물수 T75 플라스크를 세척하십시오. 세포를 분리하려면 0.05%의 트립신-EDTA의 1밀리리터를 추가합니다. 그리고 5 분 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오.그런 다음 트립신-EDTA를 비활성화하려면 5밀리리터의 완전한 매체를 추가합니다. 15 밀리리터 튜브에서 모든 분리 된 세포를 수집합니다. 나머지 세포를 수집하기 위해 PBS의 5 밀리리터로 셀 유리를 두 번 세척하고 15 밀리리터 튜브에 추가하십시오.섭씨 22도에서 5분간 230g의 원심분리기. 상체를 제거하고 완전한 배지의 두 밀리리터에서 세포를 다시 중단하고 혈종계로 계산합니다. 시드 200 마이크로리터의 심장 ATDPC는 PDMS를 사용하여 각 플레이트에 삽입하여 다음 날 세포에 의해 덮인 파종 표면의 약 80%를 얻습니다.섭씨 37도, CO2 5%에서 배양합니다. 플레이트당 미리 데워진 완전 중간 크기의 밀리리터 2밀리리터를 부드럽게 넣습니다. 세포를 섭씨 37도, 하룻밤 동안 5%의 CO2로 배양합니다.이 절차를 시작하기 전에 전기 기계적 자극을 위해 12개의 구문 중 6개구를 할당하고 자극되지 않는 컨트롤에 6개구를 보관합니다. 70%에탄올을 사용하여 자극 장치를 청소하십시오. 자극 장치, 멸균 전극 및 핀셋을 유동 캐비닛 내부에 배치합니다.전극과 구문구를 쉽게 조작하기 위해 각 세포 배양판에서 배지의 90%를 제거합니다. 고정 자석과 이동 자석 사이의 자기 매력을 보장하기 위해 PDMS 구조를 자석쪽으로 올바른 위치에 배치합니다. 프로세스 전반에 걸쳐 멸균을 유지하면서 셀의 시드 PDMS 구조와 전극을 조작하는 이 두 가지 이전 단계가 가장 중요합니다.그런 다음 백금 와이어를 전극 커넥터에 연결합니다. PDMS 구문에서 지정된 공간에서 전극의 PTFE 부분을 방향을 지정합니다. 각 구문에 2.5 밀리리터의 신선하고 미리 따뜻해지는 완전 매체를 추가합니다.모든 PDMS 구문이 배치되고 플랫폼에 전기적으로 연결되면 플랫폼을 섭씨 37도, CO2 인큐베이터 5%로 다시 배치합니다. 그런 다음 전기 및 기계 소스를 연결합니다. 자극 프로그램을 구성하려면 기계적 자극기및 기계적 자극을 제어하는 응용 프로그램의 사용자 인터페이스를 통해 전기 및 기계적 자극 체제를 지정합니다.동기화를 설정하려면 전기 자극기를 켜고 메인 메뉴가 디스플레이에 나타날 때까지 기다립니다. 그런 다음 옵션 2를 선택하고 시퀀스를 편집하고 Enter를 선택합니다. 시퀀스 메뉴를 편집하려면 모드 탭을 사용하여 "플러스"를 클릭하고 Enter"를 눌러 현재를 선택합니다. 1000"플러스 / 마이너스 및 누기 입력"그리고 트리거 모드 탭의 경우, 소프트웨어로 외부를 선택하고 Enter"진폭 탭의 경우, 플러스 / 마이너스 및 enter"를 선택하고 Enter"다음, 메인 메뉴에서 다시 선택 옵션 4, 다음 시퀀스를 생성하고 Enter"제어 응용 프로그램 패널의 기계적 자극 섹션에서, 먼저 1000"을 작성합니다.그런 다음 ON 시간 텍스트 컨트롤에 500"을 작성하여 기계적 펄스 지속 시간을 설정합니다. 마지막으로, 10%의 구조 신장을 제공하기 위해 소풍 텍스트 컨트롤에 2000"을 작성합니다. 먼저 오래된 미디어를 제거한 다음 PDMS 지원 측면에 따뜻하고 신선한 미디어를 추가하여 일주일에 두 번 셀 미디어를 변경합니다.7일째, 실험이 끝나면 원고에 설명된 바와 같이 샘플을 수집한다. 전기 기계적으로 자극된 심장 ATDPC는 심근 성 잠재력을 향상시켰습니다. 이는 심장 전사 인자 GATA-4, 구조적 마커 베타-묘신 중형 체인, 칼슘 관련 유전자 Connexin43의 발현이 증가된 것을 보여주는 실시간 PCR에 의해 표시되었다.판로이드는 액틴 섬유에 대한 염색은 대부분의 세포가 수직 패턴에 따라 정렬된 것으로 나타났다. Connexin43 분포는 주로 세포질및 혈장 막에서 갭 접합을 통한 세포내 통신에 기여했다. MEF2 및 GATA-4 전사 인자는 심장 ATDPC의 핵에 위치했다.그러나 GATA-4는 피하 ATDPC에서 검출되지 않았다. 세포질 마커 SERCA2 및 육종 알파-액틴은 심근 세포에 전형적인 성숙한 sarcomere 조직을 보여주지 않았습니다. 그리고 구타는 통제에서 관찰되지 않았고 세포 집단을 자극했다.이 프로토콜의 시작 부분에 건강한 세포 단층과 절차 전반에 걸쳐 멸균을 유지하는 것이 중요합니다. 샘플 수집 후, 표준 게놈 단백질 발현 기술을 수행할 수 있다. 이 기술은 세포 전기 및/또는 기계적 자극의 효과를 더 잘 이해하는 데 도움이 됩니다.최근까지 두 자극에 동일한 장치를 사용하는 것이 불가능했기 때문에 결과를 비교하기가 더 어려워졌습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

세포의 심근성 잠재력을 향상시키기 위한 동시 전기 및 기계적 자극

우리는 심혈관 수리를 위해 인간의 심장 progenitors 및 기능 cardiomyocytes의 큰 공급 파생을 가능하게 작은 분자와 함께 정의된 조건 하에서 유지 pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 직접 cardioblasts의 유도를위한 프로토콜을 설립했습니다.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포로부터 인간 심장 엽 성의 전구 물질과 Cardiomyocytes의 효율 유도

고혈압이나 심근 경색 등의 심혈관 질환의 생쥐 모델에서 심근 내 세포 전달은 널리 재생 연구에서 서로 다른 종류의 세포 치료 가능성을 테스트하는 데 사용됩니다. 그러므로, 상세한 설명이 수술의 명확한 시각화가 작은 설치류의 혈관 세포 치료 분석의 한계와 이점을 정의하는 것을 도울 것이다.

심근 내 휴대 납품 : 쥐과 마음의 관찰

이 원고는 표면 마커 발현과 세포 분류를 사용하여 정의된 공학적 심장 조직의 생성을 설명합니다. 그런 다음 정의된 조직을 다중 조직 생물반응기에서 사용하여 심장 세포 치료의 메커니즘을 조사하여 기능적이면서도 제어된 인간 심장 모델 시스템을 제공할 수 있습니다.

정의 인간 공학 심장 조직의 건설 심장 세포 치료의 메커니즘을 연구하는

우리는 심근 세포, 내피 세포, 평활근 세포 및 패치 - 매개 사이토 카인 배달 세포 주입을 조합함으로써 이식 된 세포의 생착을 향상 배송 방법으로 인간 유도 만능 줄기 세포를 구별하기위한 세 가지 신규하고보다 효율적인 프로토콜을 제안한다.

다 능성 줄기 세포는 심근 수리를위한 심장 세포를 유도

심장 biowire 플랫폼은 전기 자극 3 차원 세포 배양을 조합하여 인간 배아 및 유도 된 다 능성 줄기 세포 유래 심근 (hPSC-CM)를 숙성에 사용되는 시험 관내 방법. 이 원고는 심장 biowire 플랫폼의 자세한 설정을 제공합니다.

전기 자극을 사용하여 Biowires 인간 줄기 세포 유래 심근 세포의 성숙

여기, 우리는 생쥐에서 생존 가능한 심실 슬라이스의 준비와 날카로운 전극 활동 전위 녹음에 대한 그들의 사용을 설명합니다. 이러한 다세포 제제는 생체 내 에서 생리 학적 및 약리학 적 연구 에 유용한 모델이되는 조직 구조와 같은 생체 내 보존성을 제공합니다.

전기 생리학 연구를위한 마우스 짧은 축 심실 조각

여기 선물이 overexpression Mef2c, GATA4, Hand2, Tbx5, 미르-1, 그리고 미르-133 (GHMT2m) TGF-β 신호 전달의 억제와 함께 통해 기능 cardiomyocytes에 기본 미 발달 섬유 아 세포를 재 설 정할 하는 강력한 방법. 우리의 프로토콜 생성 박동 cardiomyocytes 일찍 최대 60 %7 일 후 변환 효율.

프로 거리 신호 억제 유도 Cardiomyocytes에 마우스 미 발달 섬유 아 세포의 프로그래밍 요소 중재 Potentiates

이 프로토콜에서, 우리는 심근 세포 분화 및 정제를 위해 인간 유도 만능 줄기 세포를 사용하는 방법에 대해 설명하고 정교하게, 그리고 더 나아가, Rho 관련 단백질 키나아제 억제제와 함께 이식 효율을 개선하는 방법에 대해 마우스 심근 경색 모델에서 전처리.

로 키나아제 활성의 일시적인 억제를 통해 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포의 생착을 강화

생쥐의 심근 경색 부위 주변의 초음파 유도 세포 전달은 안전하고 효과적이며 편리한 세포 이식 방법입니다.

심근 경색 마우스에서 초음파 유도 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 이식

여기에서는 비디오 기반 현미경과 결합된 유연한 기판에 도금된 2D 인간 유도만능 줄기 세포 유래 심근세포(hiPSC-CM) 단층을 사용하여 비침습적 심장 의료 기기 수축성 평가 방법을 시연합니다. 이 도구는 심장 전기 생리학 장치의 수축 특성에 대한 시험관 내 평가에 유용합니다.

2D 인간 줄기 세포 유래 심근 세포에서 심장 수축성 조절 요법의 평가

빛을 사용하여 심장 세포와 조직을 제어하면 비접촉 자극이 가능하여 세포의 자연 상태와 기능을 보존할 수 있으므로 기본 연구와 치료 응용 분야 모두에 유용한 접근 방식이 됩니다.

비유전적 광학 자극을 통한 Ca2+ 전파를 연구하기 위한 심장 미세생리학적 시스템

배우세요 동시 전기 및 기계적 자극을 이용한 세포의 심근형성 잠재력 향상 방법을. 이 기술은 세포 치료 및 질병 모델링에 활용될 수 있습니다.

셀의 Cardiomyogenic 잠재력 향상을 동시 전기 및 기계적 자극

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