셀의 Cardiomyogenic 잠재력 향상을 동시 전기 및 기계적 자극

이것은 세포에 전기 기계적 자극을 적용하는 방법입니다. 그것은 세포 인구에 미치는 영향을 연구 하는 여러 응용 프로그램, 생체 내 전달에 대 한 사전 훈련, 그리고 세포 성숙. 장점은 전기 및 기계적 자극이 멸균 바이러스를 그대로 유지하면서 동일한 장치로 개별적으로 또는 동시에 적용 될 수 있다는 것입니다.

이 기술은 우리의 치료에 간접적인 접근입니다. 세포 치료는 전기 기계적 자극 세포로 간주되는 것은 내성 심근을 치료하는 흥미로운 세포 집단일 수 있다. 이 방법은 일반적으로 심장 혈관 필드에 속하지만 신경계에도 적용 될 수 있습니다.

이것은 인내심을 필요로하는 쉬운 기술입니다. 가장 어려운 부분은 작은 조각으로 작업하고, 전체 멸균을 유지하는 것입니다. 설명하기 어려운 조작에 대한 세부 사항은 거의 없으므로 시각적 데모가 정말 유용합니다.

먼저 12개의 청소된 PDMS 구조를 10센티미터 플레이트멸균으로 옮기는 것으로 시작합니다. 완전한 멸균을 보장하기 위해 플레이트를 UV 광에 5분 동안 노출하십시오. 그런 다음 각 구조를 별도의 35mm 세포 배양 판또는 즉각적인 세포 파종용 6웰 플레이트로 이송한다.

세포 파종을 시작하려면 먼저 1x PBS의 5 밀리리터로 심장 ATDPC의 컨물수 T75 플라스크를 세척하십시오. 세포를 분리하려면 0.05%의 트립신-EDTA의 1밀리리터를 추가합니다. 그리고 5 분 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오.

그런 다음 트립신-EDTA를 비활성화하려면 5밀리리터의 완전한 매체를 추가합니다. 15 밀리리터 튜브에서 모든 분리 된 세포를 수집합니다. 나머지 세포를 수집하기 위해 PBS의 5 밀리리터로 셀 유리를 두 번 세척하고 15 밀리리터 튜브에 추가하십시오.

섭씨 22도에서 5분간 230g의 원심분리기. 상체를 제거하고 완전한 배지의 두 밀리리터에서 세포를 다시 중단하고 혈종계로 계산합니다. 시드 200 마이크로리터의 심장 ATDPC는 PDMS를 사용하여 각 플레이트에 삽입하여 다음 날 세포에 의해 덮인 파종 표면의 약 80%를 얻습니다.

섭씨 37도, CO2 5%에서 배양합니다. 플레이트당 미리 데워진 완전 중간 크기의 밀리리터 2밀리리터를 부드럽게 넣습니다. 세포를 섭씨 37도, 하룻밤 동안 5%의 CO2로 배양합니다.

이 절차를 시작하기 전에 전기 기계적 자극을 위해 12개의 구문 중 6개구를 할당하고 자극되지 않는 컨트롤에 6개구를 보관합니다. 70%에탄올을 사용하여 자극 장치를 청소하십시오. 자극 장치, 멸균 전극 및 핀셋을 유동 캐비닛 내부에 배치합니다.

전극과 구문구를 쉽게 조작하기 위해 각 세포 배양판에서 배지의 90%를 제거합니다. 고정 자석과 이동 자석 사이의 자기 매력을 보장하기 위해 PDMS 구조를 자석쪽으로 올바른 위치에 배치합니다. 프로세스 전반에 걸쳐 멸균을 유지하면서 셀의 시드 PDMS 구조와 전극을 조작하는 이 두 가지 이전 단계가 가장 중요합니다.

그런 다음 백금 와이어를 전극 커넥터에 연결합니다. PDMS 구문에서 지정된 공간에서 전극의 PTFE 부분을 방향을 지정합니다. 각 구문에 2.5 밀리리터의 신선하고 미리 따뜻해지는 완전 매체를 추가합니다.

모든 PDMS 구문이 배치되고 플랫폼에 전기적으로 연결되면 플랫폼을 섭씨 37도, CO2 인큐베이터 5%로 다시 배치합니다. 그런 다음 전기 및 기계 소스를 연결합니다. 자극 프로그램을 구성하려면 기계적 자극기및 기계적 자극을 제어하는 응용 프로그램의 사용자 인터페이스를 통해 전기 및 기계적 자극 체제를 지정합니다.

동기화를 설정하려면 전기 자극기를 켜고 메인 메뉴가 디스플레이에 나타날 때까지 기다립니다. 그런 다음 옵션 2를 선택하고 시퀀스를 편집하고 Enter를 선택합니다. 시퀀스 메뉴를 편집하려면 모드 탭을 사용하여 "플러스"를 클릭하고 Enter"를 눌러 현재를 선택합니다. 1000"플러스 / 마이너스 및 누기 입력"그리고 트리거 모드 탭의 경우, 소프트웨어로 외부를 선택하고 Enter"진폭 탭의 경우, 플러스 / 마이너스 및 enter"를 선택하고 Enter"다음, 메인 메뉴에서 다시 선택 옵션 4, 다음 시퀀스를 생성하고 Enter"제어 응용 프로그램 패널의 기계적 자극 섹션에서, 먼저 1000"을 작성합니다.

그런 다음 ON 시간 텍스트 컨트롤에 500"을 작성하여 기계적 펄스 지속 시간을 설정합니다. 마지막으로, 10%의 구조 신장을 제공하기 위해 소풍 텍스트 컨트롤에 2000"을 작성합니다. 먼저 오래된 미디어를 제거한 다음 PDMS 지원 측면에 따뜻하고 신선한 미디어를 추가하여 일주일에 두 번 셀 미디어를 변경합니다.

7일째, 실험이 끝나면 원고에 설명된 바와 같이 샘플을 수집한다. 전기 기계적으로 자극된 심장 ATDPC는 심근 성 잠재력을 향상시켰습니다. 이는 심장 전사 인자 GATA-4, 구조적 마커 베타-묘신 중형 체인, 칼슘 관련 유전자 Connexin43의 발현이 증가된 것을 보여주는 실시간 PCR에 의해 표시되었다.

판로이드는 액틴 섬유에 대한 염색은 대부분의 세포가 수직 패턴에 따라 정렬된 것으로 나타났다. Connexin43 분포는 주로 세포질및 혈장 막에서 갭 접합을 통한 세포내 통신에 기여했다. MEF2 및 GATA-4 전사 인자는 심장 ATDPC의 핵에 위치했다.

그러나 GATA-4는 피하 ATDPC에서 검출되지 않았다. 세포질 마커 SERCA2 및 육종 알파-액틴은 심근 세포에 전형적인 성숙한 sarcomere 조직을 보여주지 않았습니다. 그리고 구타는 통제에서 관찰되지 않았고 세포 집단을 자극했다.

이 프로토콜의 시작 부분에 건강한 세포 단층과 절차 전반에 걸쳐 멸균을 유지하는 것이 중요합니다. 샘플 수집 후, 표준 게놈 단백질 발현 기술을 수행할 수 있다. 이 기술은 세포 전기 및/또는 기계적 자극의 효과를 더 잘 이해하는 데 도움이 됩니다.

최근까지 두 자극에 동일한 장치를 사용하는 것이 불가능했기 때문에 결과를 비교하기가 더 어려워졌습니다.