Name: 형광 성 펩 티 드 Zymography에 의해 프로 테아 제 활동의 탐지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: 배우세요 형광 펩타이드 자이모그래피를 이용한 프로테아제 활성 검출 방법입니다. 모듈형 설계로 특정 프로테아제를 표적으로 하는 펩타이드 서열을 쉽게 맞춤화할 수 있으며, 생체재료 분해 연구와 약물 전달 시스템 개발에 활용됩니다.

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자금에 오하이오 주립 대학 대학의 공학, 생명 공학 부, 그리고 종합 암 센터-아서 G. 제임스 암 병원과 리처드 J. Solove 연구소에 의해 제공.

1입니다. 해결 젤 층의 준비
<ol><li>10 %polyacrylamide 젤 솔루션 표 1에 의하여 해결을 준비 합니다. 즉시 그들의 추가 시작 중 합 반응으로 젤을 따르기 이전 Tetramethylethylenediamine (TEMED)와 암모늄 Persulfate (AP)를 추가 합니다.</li>
	<li>10% 해결 젤 솔루션 빈 1.5 m m 미니 젤 카세트 절반 방법 (5 mL)을 작성.</li>
	<li>레벨 젤 생산 및 거품 방지 polyacrylamide 젤의 맨 소 프로 파 놀 (~ 500 µ L)의 얇은 레이어를 추가 합니다. 남은 polyacrylamide 솔루션을 사용 하 여 중 합 반응의 진행 상황을 추적할. 때 튜브에 polyacrylamide가 완전히 경화, 반응은 완료 (40 분)입니다.</li>
</ol>2. Azido-PEG3-maleimide 링커 분자의 준비
<ol><li>첫 번째 해결 젤 레이어 polymerizing 동안-20 ° C 저장에서 azido-PEG3-maleimide 키트를 검색 하 고 실내 온도 도달 하는 구성 요소를 허용. 각 키트에는 두 개의 구성 요소가 있습니다. 유리병 1 maleimide-NHS 에스테 르를, 회색 단색 미색에 포함 되어 있습니다. 유리병 2 azido-PEG3-아민, 약간 노란색 오일에 포함 되어 있습니다. 참고: 저자 제안만 시간 (1-2 시간)의 짧은 기간 동안 저장할 수로 25 mg azido-PEG3-maleimide 키트를 사용 하 여-20 ° C에서 저하을 시작 하기 전에 준비 되 고 후. 25 밀리 그램 10 펩 티 드 젤을 생산 하기 위해 충분 하다. 준비의 3 주 안에 젤을 사용 합니다.</li>
	<li>제조업체에서 권장 하는 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 및 30에 대 한 소용돌이의 볼륨에서 유리병 2의 구성 요소를 분해 s 액체 되도록 잘 혼합 되어있다.</li>
	<li>파문 bar가 포함 된 깨끗 하 고 마른 100 mL 둥근 바닥 플라스 크에 유리병 1의 내용을 전송 합니다. 참고: 아세톤과 플라스 크를 헹 구 고 습기 반응에 방해가 되지 않도록 하려면 사용 하기 전에 완전히 건조.</li>
	<li>즉시 플라스 크의 입으로는 주사기 구멍 수는 막으로 고무 심장 마 개를 삽입 합니다. 플라스 크에 들어가기에서 습기를 방지 하기 위해 신속 하 게 작동 합니다.</li>
	<li>삽입 2 18 게이지 횡 경 막에 바늘 주사기 하 고 하나는 불활성 가스 탱크 (예: 아르곤 가스)를 연결 합니다. 3 분 믹스에 대 한 플라스 크를 채우기 위해 불활성 가스 튜브 1 2 불활성 가스에서 방지 하 고 바람직하지 않은 반응 제품의 구성 요소를 허용 합니다. 주의: 두 번째 주사기 바늘 불활성 가스로 채우고 플라스 크에서 흐름을 플라스 크에 포함 된 대기 공기 수 있도록 통풍구를 제공 하는. 환기 바늘을 포함 하는 것을 잊지 마세요!</li>
	<li>불활성 가스에서 종료 하 고 바늘에서 분리. 주사기를 사용 하 여 플라스 크에 유리병 2의 전체 내용을 삽입할.</li>
	<li>바늘과 주사기를 제거 하 고 교 반 하면서 실 온에서 30 분 동안 혼합 구성 요소를 허용 합니다.</li>
	<li>고무 심장 마 개를 제거 하 고 깨끗 한 5 mL 원심 분리기 튜브에 콘텐츠를 전송. Azido-PEG3-maleimide 솔루션은 실 온에서 1 시간 안에 사용 되어야 한다.</li>
</ol>3. 젤 레이어를 해결 하는 펩 티 드의 준비
<ol><li>첫 번째 해결 젤 레이어 생산은, 일단 소 프로 파 놀 레이어 붓는 다. 젤 상단 pipetting 1 mL 젤 상단에 있는 이온된 수로 린스 하 고 물을 붓는 다.</li>
	<li>-80 ° C 저장소에서 thiol 기능성된 형광 펩 티 드를 검색 하 고 실 온에서 해 동 있습니다. 참고: 앞에서 설명한11,12thiol 기능성된 펩 티 드를 준비 될 수 있다. 상업적으로 이용 가능한 펩 티 드 또한 사용 될 수 있습니다 하지만 maleimide thiol 있도록 터미널 시스테인 잔류물의 추가 클릭 반응 필요. 10 m m 재고 농도에 펩 티 드를 분해 하 고 반복된 freeze-thaw 주기를 제한 하는 작은 (30 uL) aliquots에서-80 ° C에서 그것을 저장.</li>
	<li>Azido-PEG3-maleimide 링커 분자 및 표 1에 의하여 형광 펩 티 드를 포함 하는 젤 솔루션 해결 10%를 준비 합니다. 즉시 그들의 추가 시작 중 합 반응으로 젤을 따르기 이전 APS와 TEMED를 추가 합니다.</li>
	<li>펩 티 드 젤 솔루션을 해결 절반 젤 카세트 (3 mL)의 나머지 부분을 채우십시오. 참고: 다중 층 해결 젤 접근 펩 티 드와 각 젤에 필요한 링커의 줄어듭니다. 펩 티 드 해결 젤 층의 크기는 필요에 따라 분자 무게의 더 큰 범위에 맞게 조정할 수 있습니다.</li>
	<li>레벨 젤 생산 및 거품 방지 polyacrylamide 젤의 맨 소 프로 파 놀 (~ 500 µ L)의 얇은 층을 플라스틱. 남은 polyacrylamide 솔루션을 사용 하 여 중 합 반응의 진행 상황을 추적할. 때 튜브에 polyacrylamide가 완전히 경화, 반응은 완료 (40 분)입니다. 참고: 형광 펩타이드는 빛에 민감한. 젤 젤 준비, 전기, 세탁 및 개발 하는 동안 photobleaching를 방지 하기 위해 알루미늄 호 일로 덮여 유지.</li>
	<li>소 프로 파 놀 레이어 부 어 해결 단계 3.1에서 이온된 수 젤 펩 티 드의 상단을 씻어.</li>
	<li>경우 4 단계로 진행 즉시는 젤을 사용 하 여, 그렇지 않으면, 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)는 젤 밖으로 건조 하지 않도록 플라스틱 상자에 4 ° C에서 x 1의 100 mL에 준비 된 젤을 담가. Photobleaching를 방지 하기 위해 알루미늄 호 일에 상자를 포장. 젤은 사용 전에 최대 3 주 동안 PBS에 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>4입니다. 겹쳐 쌓이는 젤의 준비
<ol><li>표 1당 5%의 스태킹 젤 솔루션을 준비 합니다. 즉시 그들의 추가 시작 중 합 반응으로 젤을 따르기 이전 APS와 TEMED를 추가 합니다.</li>
	<li>겹쳐 쌓이는 젤 솔루션 젤 카세트 (~ 2 mL)의 남은 빈 부분을 채우십시오.</li>
	<li>신속 하 게 1.5 m m 젤 빗 쌓기 젤 레이어 삽입, 확신 없는 거품 남아 있다 우물 아래 갇혀. 남은 polyacrylamide 솔루션을 사용 하 여 중 합 반응의 진행 상황을 추적할. 때 튜브에 polyacrylamide가 완전히 경화, 반응 완료 (~ 10 분)입니다.</li>
	<li>부드럽게 빗 및 테이프 젤 카세트의 뒷면에서 제거 합니다.</li>
</ol>5입니다. 전기 이동 법에 대 한 생물 학적 샘플의 준비
<ol><li>비 감소 조건2아래 설명 되어 있는 대로 조절된 세포, 세포 lysates, 조직 homogenates, 언론과 MMP 표준 준비. 샘플이 열 하지 마십시오.</li>
	<li>예를 들어 다음과 같이 조건된 셀 미디어를 준비 하십시오.<ol>
<li>10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 문화 미디어에 6 잘 플레이트에 플레이트 40, 000 셀/cm2 셀. 24 시간 동안 습도 챔버 (5% CO2 37 ° C에서)에 셀을 품 어 고 합류 70-80%에 도달 하도록 허용 합니다. 참고: 셀 24 시간 후 원하는 confluency를 도달 하지 않은 경우 추가 24 시간에 대 한 10 %FBS 문화 매체에서 성장 하도록 허용 합니다.</li>
		<li>PBS로 두 번 셀을 세척 하 고 혈 청 자유로운 문화 매체의 2 개 mL를 추가. 추가 24 시간 동안 습도 챔버 (5% CO2 37 ° C에서)에 셀을 품 어.</li>
		<li>혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 각 우물에서 바른된 미디어를 수집 합니다. 어떤 세포 파편을 제거 하려면 3 분 1200 rpm에서 미디어 원심 상쾌한 고 15 mL, 10 kDa 분자량 컷오프 원심 필터 단위를 사용 하 여 집중. X g 진동 물통 회전자에서 15 분 또는 고정된 각도 터에 15 분 동안 5000 x g 4000에서 필터 단위 원심 참고:이 단계는 선택 사항 하지만 펩 티 드 zymography 젤에서 분해 밴드의 강도 향상 시킬 수 있습니다.</li>
		<li>신선한 1.5 mL 원심 분리기 튜브에 집중 된 여과 액을 전송 합니다. 최대 3 개의 freeze-thaw 주기-80 ° C에서 약 수와 매장 샘플.</li>
	</ol>
</li>
	<li>계량 표준 단백질 정량화 분석 결과 사용 하 여 단백질 콘텐츠 (예: BCA, Bradford 분석 실험, 등).</li>
</ol>6. 펩 티 드 Zymography 젤에서 전기 이동 법 생물의 샘플
<ol><li>기존의 zymography 샘플 버퍼에서 샘플을 분해 (62.5 mM Tris HCl, pH 6.8, 25% 글리세롤, 4 %SDS, 0.01 %bromophenol 블루). 세포 및 조직 샘플 잘 당 총 단백질의 ~ 30 µ g을 사용 하는 것이 좋습니다, 그리고 MMP 표준 단백질의 50-100 ng.</li>
	<li>추가 1의 400 mL 젤 기구 하 트리 스-글리신 SDS 실행 버퍼 x. 잘 당 샘플의 최대 35 µ L을 로드 합니다. 1.5 시간 또는 분자량 표준 관심의 프로 테아 제 펩 티 드 (이 보이는 오렌지 색상) 젤 레이어를 해결 내는 나타냅니다 때까지 4 ° C에서 120 V에서 샘플을 실행 합니다. 참고: 대부분 MMPs와 그들의 이체 35-100 kDa의 범위 내에서을. 분자량 표준 나타냅니다 그 무게 젤 레이어를 해결 하는 펩 티 드 내, 전기 이동 법 중지 될 수 있습니다. 동일한 원리는 알려진된 분자 무게와 프로 테아의 다른 클래스에 적용할 수 있습니다. 분자 무게의 더 큰 범위에 걸쳐 여러 프로 테아 제를 감지 하는에 관심이 있다면, 해결 젤 계층의 크기를 줄일 하 고 펩 티 드 해결 젤 계층의 크기를 증가.</li>
	<li>전기 이동 법, 플라스틱 카세트에서는 젤을 제거 하 고 2.5% 트라이 톤 X-100, 1 µ M ZnCl2, 그리고 50 m m에서 5 mM CaCl2 renaturing 버퍼에 부드러운 동요에서 실내 온도에 3 시간 10 분 대 한 젤을 씻어 Tris HCl, pH 7.5</li>
	<li>전송 개발 버퍼 솔루션을 포함 하는 1% 트라이 톤 X-100, 1 µ M ZnCl2 젤 및 50 mM Tris HCl, 신선한 개발 15 분 바꾸기 위한 pH 7.5에에서 5mm CaCl2 솔루션을 버퍼링 하 고 24 시간 동안 부드러운 동요에서 37 ° C에서 젤을 품 어 는 젤 솔루션에서 submersed 완벽 하 게는 다는 것을 확인.</li>
</ol>7. 영상 펩 티 드 Zymography의 젤
<ol><li>24 시간 후에 형광을 사용 하 여 이미지 젤 젤 스캐너/영상 적절 한 여기 및 방출 필터를 사용 하 여. 예를 들어 대표적인 결과에 표시 된 펩 티 드 젤 Fluorescein로 활용 하 고 488의 여기 필터를 사용 하 여 몇 군데 있었다 nm와 521의 방출 필터 nm. 당신의 fluorophore에 대 한 적절 한 필터를 사용 하 여 분해 활동의 탐지를 극대화할 것입니다. 참고: 이미지 또한 ethidium 평범한 사람으로 물 DNA 젤의 이미지를 위해 자주 사용 하는 UV transilluminator을 갖춘 젤 영상을 함께 취할 수 있습니다. 젤 UV transilluminator를 사용 하 여 이미지 (365 nm) 설정 및 590의 방출 필터 nm.</li>
	<li>ImageJ13설명 되어 있는 대로 사용 하 여 밴드 농도의 densitometric 평가 실시 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

현재 zymographic 기법으로 polyacrylamide 젤 베이스의 검출에 대 한 기본 기판의 설립에 의존합니다. 이러한 기술을 광범위 하 게 사용을 얻고 있다, 하는 동안 그들은 여전히 프로 테아 제 감지할 수의 숫자에 제한 됩니다. 여기, 프로토콜은 형광, 효소 분해 펩 티 드에 polyacrylamide 젤 해결에 통합 하는 설명 했다. 사용 하 여 연결 공유는 azido-PEG3-maleimide 링커 분자 수 있습니다 분리 및 다양 한 프로 테아의 검출 보다 현재 네이티브 기판으로 달성. 형광 펩 티 드의 높게 가변 자연 연구원 그들의 프로 테아 제 관심의 대상 기판 설계 하는 능력을 준다. 수많은 펩 티 드 기질 다양 한 프로 테아 제 펩 티 드 라이브러리를 사용 하 여에 대 한 확인 되었습니다 그리고 상용 소스 사용자 지정 펩 티 드 제조의 성장 수가 있다. 적절 한 형광 냉각 및 표준 버퍼에 용 해는 새로운 fluorogenic 펩 티 드를 개발 하는 것이 어려울 수 있습니다. 따라서 상업적으로에서 펩 티 ...

젤 zymography은 생물 학적 샘플, 체액 세포 배양1,2,3등 분해 활동을 측정 하는 생물학 기술입니다. 샘플 그들의 분자 무게 분해성 기판 임베디드 polyacrylamide 젤을 통해 전기 이동 법으로 구분 됩니다. 젤라틴, 카 세 인, 콜라겐과 엘라 스 틴, 매트릭스 metalloproteinases (MMPs)-1,-2,-3,-7,-8,-9, 및-11, cathepsins1,2 의 다양 한 뿐만 아니라의 활동을 측정 하기 위해 사용 된 일반적인 분해성 기판 포함 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8. 후 전기 이동 법, 효소 renatured와 젤 내 단백질을 저하 될 수. 전통적인 젤 zymography, 젤 Coomassie 파란 등 단백질 염료와 스테인드 하 고 효소 활동 즉, 흰색 밴드 (단백질의 저하)는 진한 파란색 배경에 신호의 손실으로 감지 합니다.
여기, 우리는 젤 zymography, 있는 분해성 기판은 짧은, fluorogenic 펩 티 드 covalently polyacrylamide 젤 (그림 1)에 통합 하는 대체 방법에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 분해성 기판으로 합성 펩 티 드의 대체 기본 단백질9전통적인 젤 zymography에 비해 프로 테아의 광범위의 검색 수 있습니다. Fluorogenic 펩 티 드의 공유 결합을 펩 티 드 보급 및 이전 방법9,10관찰 하는 젤 전기 이동 법 동안 마이그레이션 방지 합니다. 또한, fluorogenic 기판의 사용은 추가 얼룩-얼룩 단계 없이 프로 테아 제 활동의 직접 검출을 수 있습니다. 이 방법의 전반적인 목표는 zymogram 젤에서 fluorogenic 펩 티 드의 공유 결합을 통해 생물학 견본에서 효소 활동의 탐지.

<table><tbody><tr><td>1.5mm 빈 젤 카세트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC2015</td><td></td></tr><tr><td>1.5mm, 10웰 빈 젤 카세트 빗</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC3510</td><td></td></tr><tr><td>1x 인산염 완충 식염수</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-010-049</td><td></td></tr><tr><td>20% SDS 솔루션</td><td>Ambion</td><td>AM9820</td><td></td></tr><tr><td>3x 자이모그래피 샘플 버퍼</td><td>Bio-Rad</td><td>1610764</td><td></td></tr><tr><td>40% (w/v) 아크릴아미드/비스 (19:1)</td><td>Ambion</td><td>AM9022</td><td></td></tr><tr><td>6웰 조직 배양 플레이트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>087721B</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-2 원심 필터 장치(10kDa MWCO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>UFC201024</td><td></td></tr><tr><td>과황산 암무늄</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Azido-PEG3-Maleimide Kit</td><td>Click Chemistry 도구</td><td>AZ107</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP510100</td><td></td></tr><tr><td>디메틸</td>설폭사이드 <td>Fisher Scientific</td><td>BP231</td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416P</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 BCA 단백질 분석 키트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>N N N' N'-테트라메틸에틸렌디아민(TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac 기본 전원 공급 장치</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus 단백질 이중 색상 표준</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide 피하 주사 바늘</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826</td><td></td></tr><tr><td>둥근 바닥 플라스크 (100 mL)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>50-873-144</td><td></td></tr><tr><td>격막 고무 마개</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-872-546</td><td></td></tr><tr><td>멸균 슬립 팁 주사기(1mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-434</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Trizma hydrochlroide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon 9410 Molecular Imager</td><td>GE Amersham</td><td>8149-30-9410</td><td></td></tr><tr><td>염화아연</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>208086</tr></tbody></table>

형광 성 펩 티 드 zymography에 의해 프로 테아 제 활동의 탐지

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

이 방법의 목적은 복잡 한 생물 학적 샘플의 분해 활동을 측정 하는 것입니다. 샘플 분자량 분해성 기판 임베디드 해결 젤 통해 전기 이동 법을 사용 하 여 구분 됩니다. 이 방법은 다릅니다 전통적인 젤 zymography에서 담금질된 fluorogenic 펩 티 드 covalently 전체 길이 단백질, 젤라틴 또는 카 세 인 등 대신 해결 젤에 통합 됩니다. Fluorogenic 펩 티 드의 사용에는 추가 착 단계 없이 분해 활동의 직접 감지 수 있습니다. 생물 학적 샘플 내에서 효소 쪼개 침묵과 fluorogenic 펩 티 드, 형광에 있는 증가 결과로. 젤에 형광 신호 다음 표준 형광 젤 스캐너로 몇 군데 이며 densitometry를 사용 하 여 계량 합니다. 분해성 기판으로 펩 티 드를 사용 하 여 크게 zymographic 기술로 감지 가능한 프로 테아 제를 확장합니다.

여기 설명 하는 방법을 사용 하 여, 두 개의 형광 효소 분해 펩 티 드 polyacrylamide 젤에 통합 했다: GGPQG↓IWGQK(PEG)2C (텍스트와 그림을 통해 QGIW로 약식)와 GPLA↓CpMeOBzlWARK(PEG)2 C (텍스트와 그림을 통해 LACW로 약식). ↓ 분열의 위치를 나타냅니다. QGIW는 콜라겐은-난 파생 시퀀스 세포 collagenases14을 탐지 하도록 설계 되었습니다. LACW는 MMP 14 MMP 1115의 검출에 대 한 최적화 된 시퀀스입니다. 펩 티 드 dabcyl (끄는) 및 fluorescein (fluorophore) N-hydroxysuccinimide (NHS)-에스테 르를 사용 하 여 표시 됩니다 아민 화학11<strong cl...

여기, 형광 펩 티 드 대신 네이티브 단백질 분해성 기판으로 사용 되는 수정 된 zymographic 기법에 대 한 자세한 프로토콜 선물이. 전기 이동 법 형광 펩 티 드 zymograms에 생물 학적 샘플의 이전 zymographic 기법 보다는 프로 테아의 광범위의 검색 수 있습니다.

형광 성 펩 티 드 Zymography에 의해 프로 테아 제 활동의 탐지

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

현재 자모그래피 기술은 제한된 수의 프로테아제수를 감지합니다. 형광 펩티드 zymography는 형광 펩티드를 분해 가능한 기판으로 사용하여 더 넓은 범위의 프로테아제의 측정을 가능하게 합니다. 이 방법의 주요 장점은 모듈식 디자인입니다.형광 펩티드의 서열은 어떤 프로테아제검출을 결정하고 형광 펩타이드는 다른 서열의 펩티드로 쉽게 교환될 수 있으며, 다른 프로테아제검출 능력을 가진다. 이 기술은 약물 전달 또는 조직 공학 응용 분야에 사용되는 것과 같은 엔지니어링 된 생체 재료에서 분해 가능한 크로스 링커로 펩티드의 사용을 알리는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술에 이 펩티드를 통합하면 생체 물질 분해를 담당하는 분비된 프로테아제 조직을 식별할 수 있습니다.이 기술의 데모는 다른 zymography 기술에 비해 고유 한 다층 접근 방식을 시각화하는 데 중요합니다. 이 기술을 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원생인 아메야 데슈무크(Ameya Deshmukh)가 될 것입니다. 먼저 텍스트 프로토콜 중 하나에 설명된 대로 10% 폴리아크릴아미드 해결 젤 솔루션을 준비합니다.젤을 붓기 직전에 TEMED 및 APS를 추가합니다. 이어서, 1.5밀리미터 미니 젤 카세트를 해결하는 젤 용액으로 반쯤 채우고 비우게 한다. 폴리아크릴아미드 젤 의 상단에 이소프로파놀의 얇은 층을 추가하여 레벨 젤을 생성하고 거품을 방지합니다.남은 폴리아크릴아미드 용액을 사용하여 중합 반응의 진행 상황을 추적한다. 튜브의 폴리아크릴아미드가 완전히 응고되면 반응이 완료됩니다. 첫 번째 해결 젤 층은 중합체이지만, 섭씨 20도에서 저장에서 아지도-PEG3-Maleimide 키트를 검색하고 구성 요소가 실온에 도달 할 수 있습니다.그런 다음, 제조 업체 권장 볼륨DMSO의 제조 업체 권장 볼륨에 유리병 2의 구성 요소를 용해. 그리고 액체가 잘 혼합되어 있는지 확인하기 위해 30 초 동안 소용돌이. 유리병의 내용물들을 교반 바가 들어 있는 깨끗하고 건조한 100밀리터 라운드 하단 플라스크로 옮기습니다.즉시 플라스크의 입에 주사기로 구멍을 뚫을 수있는 다이어프램고무 중격 스토퍼를 삽입합니다. 다음으로, 다이어프램에 두 개의 18 게이지 주사기 바늘을 삽입합니다. 주사기 바늘 중 하나를 불활성 가스 탱크에 연결하고 가스가 3 분 동안 둥근 바닥 플라스크를 채울 수 있도록합니다.그런 다음 불활성 가스를 차단하고 바늘에서 분리하십시오. 주사기를 사용하여 유리병 2의 전체 내용을 플라스크에 주입하십시오. 바늘과 주사기를 모두 제거합니다.부품을 실온에서 30분 동안 혼합할 수 있도록 하면서 저어줍니다. 이 후 고무 중격 스토퍼를 제거하고 깨끗한 5 밀리리터 원심 분리 튜브로 내용을 전송합니다. 일단 첫 번째 해결 젤 층이 중합화되면 이소프로판올 층을 부어.젤 위에 이온화 된 물 1 밀리리터를 파이프한 다음 물을 부어 젤을 헹구습니다. 80°C에서 저장에서 티올 기능성 형광 펩티드를 검색합니다. 실온에서 해동하도록 허용하십시오.표에 설명된 대로 Azido-PEG3-Maleimide 링커 분자 및 형광 펩티드를 포함하는 10%의 해결 젤 용액을 준비한다. 젤을 붓기 직전에 TMED와 APS를 추가합니다. 다음으로, 젤 카세트의 나머지 부분의 절반을 펩타이드 해결 젤 용액으로 채우는 다.폴리아크릴아미드 젤 의 상단에 이소프로파놀의 얇은 층을 추가하여 레벨 젤을 생성하고 거품을 방지합니다. 남은 폴리아크릴아미드 용액을 사용하여 중합 반응의 진행 상황을 추적한다. 반응이 완료되면 이소프로판올 층을 부어 넣습니다.젤 위에 이온화 된 물 1 밀리리터를 파이프한 다음 물을 부어 젤을 헹구습니다. 즉시 젤을 사용하지 않을 경우 섭씨 4도에서 1x PBS10밀리리터로 채워진 플라스틱 상자에 담그고 보관하십시오. 알루미늄 호일로 상자를 감싸서 광표백을 방지합니다.먼저 텍스트 프로토콜 중 하나에 설명된 대로 5%의 스태킹 젤 솔루션을 준비합니다. 젤을 붓기 직전에 TMED와 APS를 추가합니다. 스태킹 젤 용액으로 젤 카세트의 나머지 빈 부분을 채웁니다.1.5 밀리미터 젤 빗을 스태킹 젤 레이어에 빠르게 삽입하여 우물 아래에 거품이 갇혀 있지 않도록 합니다. 남은 폴리아크릴아미드 용액을 사용하여 중합 반응의 진행 상황을 추적한다. 반응이 완료되면 젤 카세트 뒷면에서 빗과 테이프를 부드럽게 제거합니다.먼저, 기존의 zymography 샘플 버퍼에서 샘플을 용해하십시오. 젤 장치에 400 밀리리터 OS 1X 트리스 글리센 SDS 실행 버퍼를 추가합니다. 우물당 최대 35마이크로리터의 시료를 적재합니다.1시간 반 동안 섭씨 4도에서 120볼트로 샘플을 실행하거나 분자량 기준이 펩티드 해결 젤 층 내에 있는 것으로 나타났습니다. 이 후, 플라스틱 카세트에서 젤을 제거합니다. 부드러운 동요 하에서 실온에서 재침 버퍼에 젤을 세 번 씻으라.각 세척으로 10 분 동안 지속됩니다. 젤을 개발 버퍼 솔루션으로 15분 간 전송합니다. 그런 다음 솔루션을 신선한 개발 버퍼로 교체하고 24 시간 동안 부드러운 동요에서 섭씨 37도에서 배양하십시오.그 후 적절한 여기저기 및 방출 필터가 있는 형광 젤 스캐너 이미저를 사용하여 젤을 이미지화합니다. 형광 프로테아제 분해 펩티드에 대한 이 연구에서는 폴리아크릴아미드 젤에 통합된다. QGIW는 세포 콜라발생을 검출하도록 설계된 콜라겐 1유래 서열이며, LACW는 MMP-14 및 MMP-11의 검출에 최적화된 서열이다.형광 화상 진찰은 LACW 펩티드 젤 내의 수많은 밴드를 드러내지만 QGIW 젤에서 단 하나의 밴드만 볼 수 있습니다. 젤라틴 zymography에 비해, LACW 젤은 더 많은 프로테오리틱 밴드를 검출할 수 있으며, 이는 펩타이드 zymography가 네이티브 기판을 사용하는 전통적인 방법보다 생물학적 샘플 내에 존재하는 프로테아제의 넓은 범위를 검출하는 능력을 보여줍니다. 펩타이드 자모그래피 세포는 GM6001, 광범위한 스펙트럼 MMP 억제제 또는 일반 카테프신 억제제인 E64를 포함하는 개발 버퍼에서 배양된다.GM6001을 함유한 LACW 펩티드 젤의 치료는 밴드의 강도를 감소시다. E64로 치료하는 동안 눈에 띄는 효과가 없습니다. GM6001을 가진 QGIQ 펩티드 젤의 처리는 이전에 본 밴드의 완전한 절제결과.E64는 효과가 없습니다. 젤라틴 zymography는 현재 금 본위제와 펩타이드 자모그래피의 감도를 비교하기 위해 정제된 활성 MMP-9를 사용하여 수행됩니다. LACW 젤은 MMP-9의 가장 작은 농도를 검출할 수 있다.프로테아제는 재성격과 활성화되기 위해 특정 조건이 필요합니다. 버퍼 솔루션을 신중하게 준비하여 컴포지션과 PH가 올바른지 확인합니다. 이 방법은 기존 기술로 보완되어 ID를 확인하고 측정된 프로테아제의 추가 분석을 수행할 수 있습니다.여기에는 서부 블로팅, 실시간 PCR 및 질량 분석법이 포함됩니다. 폴리 아크릴아미드를 취급할 때는 주의하십시오. 비중합용액은 강력한 신경독소로 간주되며 취급 시 적절한 개인 보호 장비는 항상 착용해야 합니다.

detection-of-protease-activity-by-fluorescent-peptide-zymography

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

단백 분해 효소 형광 탐지 키트는 fluorometry를 사용하는 프로 테아제 활동의 측정을 위해 설계되었습니다. 그것은 또한 프로 테아제 오염 성분의 검출에 적합합니다. 방법은 FITC - 카제인 표시 기판의 독자적인 배합의 proteolytic hydroysis을 기반으로합니다.

단백 분해 효소의 활동을 확인하는 프로 테아제 형광 검출 키트의 사용

이 프로토콜은 문화 supernatants이나 체액의 매트릭스 metalloproteinases 검출을위한 활동 기반의 분석을 설명합니다.

Zymography의 기능 매트릭스 Metalloproteinases의 감지

이 비디오에서는 생물학적 샘플 내의 단백질 분해 활성을 분석하기 위해 전기영동 기술인 자이모그래피를 수행합니다.

형광 펩타이드 자이모그래피: 자이모그램 겔에서 형광 기질을 사용하여 프로테아제 활성을 검출하는 수정된 기술

이 동영상은 세포 배양 상등액에 존재하는 기질 금속단백분해효소(MMP)의 활성을 평가하기 위한 자이모그래피 겔 전기영동 기술을 보여줍니다. 활성 MMP는 폴리아크릴아미드 겔에 내장된 MMP 특이적 기질을 분해하며, 이는 염색 후 어두운 염색된 배경에 대해 투명한 띠로 나타납니다.

Zymography Gel Electrophoresis: 효소 활성을 평가하여 기질 금속단백분해효소를 검출하는 전기영동 기법

이 비디오는 형광 펩타이드를 사용하여 프로테아제의 단백질 분해 활성을 스크리닝하는 분석을 보여줍니다. 프로테아제는 펩타이드의 절단 부위를 인식하여 절단하고 형광단에서 소광체를 분리하여 형광 방출을 가능하게 합니다. 형광 신호를 검출하고 분석하여 다양한 펩타이드 변이체의 분할 효율을 확인합니다.

프로테아제의 단백질 분해 활성을 스크리닝하기 위한 형광 펩타이드 절단 분석

우리는 인간, 마우스 또는 쥐 Granzyme B (GzmB)의 단백질 분해 활성을 구체적으로 측정하는 간단하고 정량적인 비색 분석을 설명합니다. 이 프로토콜은 적절한 인식 서열을 가진 다른 합성 펩타이드 기질의 가수분해에 의해 다른 과립 세린 프로테아제의 프로테아제 활성을 측정하기 위해 쉽게 조정할 수 있습니다.

BOC-알라 - 알라 -의 ASP-S-BZL의 가수 분해 : 색채 특히 그랜 자임 B 단백질 분해 활동를 측정 분석

여기에서는 살아있는 세포에서 일체형 막 단백질의 방향과 토폴로지를 결정하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 간단한 프로토콜은 관심 단백질과 GFP 사이의 키메라의 선택적 단백질 분해 효소 민감도에 의존합니다.

형광 단백질 분해 효소 보호를 사용하여 막 단백질 토폴로지를 결정 (FP​​P)

여기, 선물이 원유 마우스 조직에서 효소 특이성을 결정 하는 프로토콜 MALDI TOF 분석을 사용 하 여 추출.

마우스 조직에서 효소 특이성 결정 TOF MALDI 질량 분석에 의해 추출: PH 특이성 변경를 조작

여기, 우리 N 터미널 hexahistidine/맥 아당 의무적인 단백질 및 형광 단백질 융합 재조합 기판 니켈 nitrilotriacetic의 표면에 부착 된 최근에 개발한 효소 분석 플랫폼의 상세한 절차를 제시 산 자기 agarose 구슬입니다. 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 이동 법으로 분리 분석 결과 샘플의 후속에 젤 분석 또한 제공 됩니다.

형광 효소 분석 결과 플랫폼에 그들의에서 젤 Renaturation 재조합 융합 단백질의 사용

우리는 바이러스 성 퓨전 펩 티 드의 분열 사이트를 대표 하는 펩 티 드에 프로 테아의 분해 활동의 신속한 심사를 허용 하는 fluorogenic 펩 티 드 분열 분석 결과 제시. 이 방법은 효소 활동에 대 한 테스트 하려면 단백질 시퀀스 내에서 다른 아미노산 주제에 사용할 수 있습니다.

분해 활동에 대 한 화면에 Fluorogenic 펩 티 드 분열 분석 결과: 코로나 바이러스에 대 한 응용 프로그램 스파이크 단백질 활성화

단백분해효소는 박테리아 병인에 필수적이며 침입과 면역 회피를 가능하게 합니다. 활성 형태의 박테리아의 세포질 및 막 단백질을 단일 단계 추출하는 것은 끔찍한 일입니다. 이 비디오 기사는 젤라티나제를 검출하고 특성화하기 위한 자이모그래피 분석을 위해 렙토스피라의 전체 세포 단백질을 추출하는 방법을 보여줍니다.

박테리아 젤라티나제의 원스텝 추출 및 자이모그래피 분석

배우세요 형광 펩타이드 자이모그래피를 이용한 프로테아제 활성 검출 방법입니다. 모듈형 설계로 특정 프로테아제를 표적으로 하는 펩타이드 서열을 쉽게 맞춤화할 수 있으며, 생체재료 분해 연구와 약물 전달 시스템 개발에 활용됩니다.

형광 성 펩 티 드 Zymography에 의해 프로 테아 제 활동의 탐지

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