면역 형광 검사를 사용 하 여 마우스 뇌의 시 냅 스 단백질의 다른 유형의 분포를 측정
January 29th, 2019
여기, 우리 면역 형광 염색 법을 사용 하 여 마커 단백질, confocal 현미경 검사 법 및 컴퓨터 기반 분석 시 냅 스 단백질의 분포를 결정 하는 양적 접근 방식을 설명 합니다.
여기서 우리는 참조 단백질에 비해 시냅스 단백질의 분포를 결정하기 위해 면역 형광, 공초점 현미경 및 컴퓨터 기반 분석을 사용하는 프로토콜을 설명합니다. 우리의 방법은 절대 형광 수준이 아닌 비율을 사용하여 면역 형광 얼룩의 내재된 가변성을 우회합니다. 이 방법을 사용하면 다른 수준에서 단백질 분포의 이질성을 분석할 수 있습니다.
전체 뇌 슬라이스에서 뇌 영역, 해마의 다른 층과 같은 하위 영역에 이르기까지. 이 기술은 마우스 이외의 뇌 및 모델 시스템 이외의 다른 조직에서 단백질 분포를 결정하기 위해 적응될 수 있다. 원고에 설명된 대로 이전에 격리되고 고정된 마우스 뇌를 세척하여 시작합니다.
그런 다음 뇌를 15 밀리리터 반응 튜브로 옮기고 30%의 자당 0.1 어금니 PB를 전달한다. 저온을 보호하려면 뇌가 섭씨 48도 또는 가라앉을 때까지 배양합니다. 그 후 날카로운 블레이드를 사용하여 관심 영역에 따라 극저온 보호 뇌를 다듬습니다. 그런 다음 뇌를 냉동고 금형에 넣고 최적의 절삭 온도 화합물을 추가하여 거품을 피하고 뇌를 제대로 방향을 조정하여 절단의 관상 동맥 평면을 갖도록 합니다.
냉동 고체가 동결 될 때까지 영하 80도 냉동고에 냉동 냉동고에 냉동 금형을 배치합니다. 냉동 된 조직을 냉동 마이크로 톤에 장착하고 미세 토메 온도에 평형섹션 전에 적어도 15 분 동안 기다립니다. 25 마이크로 미터 두께의 관상 슬라이스로 뇌를 자르기 시작합니다.
뇌 조직을 건드리지 않고 첫 번째 슬라이스의 10 월에 유리 후크를 신중하게 사용하십시오. OCT는 유리 후크에 충실합니다. 유리 후크를 사용하여 뇌 슬라이스를 첫 번째 우물로 옮기.
0.1 어금니 PB로 채워진 24 개의 웰 플레이트에서 잘 당 3 개의 인접 조각을 수집합니다. 슬라이스를 섭씨 4도에 보관하여 최대 2주 동안 염색할 때까지 보관합니다. 면역 염색을 위한 슬라이스를 준비하려면 플라스틱 파이프를 사용하여 뇌 슬라이스에 그려지지 않고 PB 용액을 잘 제거합니다. 그런 다음 1000 마이크로 리터 파이프를 사용하여 250 마이크로 리터의 신선한 PB를 추가하여 10 월 초과를 씻어 냅니다.
슬라이스를 건조하지 않도록 시간에 각 우물에 대해이 세탁을 반복합니다. 그런 다음 플라스틱 파이프를 사용하여 첫 번째 우물에서 PB 용액을 제거합니다. 1000 마이크로리터 파이펫을 사용하여 잘 작동하면 잘 작동할 때 250 마이크로리터의 블로킹 버퍼를 추가합니다.
셰이커의 실온에서 플레이트를 3시간 동안 배양합니다. 인큐베이션 동안 반응 튜브에 잘 당 항체 완충제의 250 마이크로리터를 첨가한다. 그런 다음 2 마이크로리터 파이펫을 사용하여 적절한 양의 항체 파이펫을 용액에 직접 넣고 여러 번 부드럽게 파이프를 섞습니다.
그런 다음 이 희석된 항체를 소용돌이로 사용하여 적절한 혼합을 보장하지 않습니다. 잘 작동 플라스틱 파이프차단 버퍼를 제거하고 잘 당 1 차 항체 용액의 250 마이크로 리터를 추가합니다. 하룻밤 사이에 셰이커에 접시를 배양합니다.
다음 날 플라스틱 파이펫으로 항체 용액을 제거합니다. 300 마이크로리터의 세탁 버퍼 1개씩 1회 3분 당 실온에서 셰이커로 세척합니다. 세탁 하는 동안, 어둠 속에서 작업, 이전에 1 차 적인 항체와 함께 수행 하는 것과 같은 방식으로 반응 튜브에 몇 두 번째 항체에 대 한 불소를 희석.
세척을 완료한 후 플라스틱 파이펫으로 세척 버퍼를 제거하고 250 마이크로리터의 이차 항체 용액을 잘 첨가합니다. 실온에서 90분 동안 어둠 속에서 배양하세요. 인큐베이션을 완료한 후 플라스틱 파이프로 항체 용액을 제거합니다.
세탁 버퍼 1개와 동일한 방법으로 2개의 세척 버퍼로 섹션을 세 번 씻습니다. 이 세척 중 DAPI 얼룩을 0.1 어금니 PB로 희석하여 1-2000 농도를 달성한다. 플레이트에서 세척 버퍼를 제거한 후 DAPI 용액 250마이크로리터를 추가하고 셰이커의 실온에서 5분 동안 배양합니다.
플라스틱 파이펫으로 DAPI 용액을 제거한 후 1000 마이크로리터 파이펫을 사용하여 웰당 0.1 마이크로리터 PB 500마이크로리터를 추가합니다. 현미경 슬라이드를 스테레오스코프 아래에 놓습니다. 미세 브러시를 사용하여 슬라이드에 0.1 어어 PB 3 방울을 추가합니다.
브러시를 사용하여 슬라이드에 한 방울당 한 조각을 놓고 슬라이스를 평평하게 하고 방향을 지정합니다. 모든 슬라이스가 올바르게 배치 된 후 제대로 종이 조직을 사용하여 여분의 PB를 제거하고 조각을 완전히 건조하지 않고 조심스럽게 건조하십시오. 그런 다음 슬라이드에 중간을 포함시키는 80 마이크로 리터를 추가하고 조심스럽게 커버 슬립으로 커버하여 뇌 슬라이스를 포함시게 됩니다.
슬라이드를 덮어 가벼운 노출을 피하고 연기 후드에서 1~2시간 동안 건조한 다음 공초점 현미경 검사법에 대비할 때까지 섭씨 4도의 현미경 슬라이드 상자에 보관하십시오. 원고에 설명된 대로 다른 채널에 대한 전체 뇌 슬라이스의 가상 조직을 획득 한 후 파일을 클릭하여 모든 단일 채널 또는 하나의 이미지를 FIJI로 로드한 다음 엽니다. 그런 다음 무료 손 선택 도구를 사용하여 DAPI 채널에서 한 반구를 묘사합니다.
편집을 클릭한 다음 선택한 영역의 마스크를 만들기 위해 마스크를 만듭니다. 그런 다음 분석을 클릭한 다음 입자를 측정하여 단일 채널의 평균 형광 강도를 결정합니다. 단일 채널을 선택하여 각 채널의 평균 형광 강도 값을 결정해야 합니다.
그런 다음 단일 채널의 평균 형광 강도를 스프레드시트에 복사합니다. 관심 영역에서 단일 채널에 대한 평균 형광 강도를 결정하기 위해 자유 손 선택 도구로 영역을 설명합니다. 핵을 얼룩지게 하는 DAPI를 염색한 후 핵은 천자 패턴을 가지며 세포 밀도가 높은 영역은 세포 밀도가 낮은 영역보다 밝습니다.
무버 항체로 염색하는 것은 시냅토피신이 더 균일한 분포를 드러낸 두뇌를 통해 밝은 핫스팟 지역 및 조광기 지역을 가진 이질적인 분포를 밝혔습니다. 이미지의 오버레이는 무버 단백질이 시냅토피신을 나타내는 녹색 형광을 비교했음을 나타내는 적색 형광의 차동 분포를 보여 주었다. 정량화 분석 후 반구와 관심 영역 전반에 걸쳐 다른 채널에 대한 형광 강도 값이 무버와 시냅토피신 모두에 대해 결정되었다.
시냅토피신 형광값에 대한 무버 형광값의 비율은 시냅스 소포에 비해 무버의 이질분포를 나타내고 있다. 상대 무버는 반구에 걸쳐 에 비해 관심의 한 영역에서 비율을 풍부하고 백분율로 변환 평균에 비해 관심의 한 영역에 얼마나 많은 무버가 존재하는지 보여 주었다. 상대무버 풍부는 해마의 하위 필드에 있는 다른 층을 위해 결정되었습니다.
관심의 세 영역은 해당 반구의 비율에 각각의 층의 비율을 비교하여 정량화된다. 이 절차는 관심있는 단백질의 세포 분포를 추가로 결정하기 위하여 초분해능 현미경 검사법과 같은 다른 화상 진찰 기술과 쉽게 적응하고 결합될 수 있습니다. 이 기술은 또한 유전자 변형 또는 약물 처리 동물과 같은 다른 모형 시스템에 적용될 수 있습니다.
이것은 다른 실험 조건 또는 종에 걸쳐 비교 접근을 허용할 수 있습니다.
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개요
본 연구는 면역형광 및 공초점 현미경을 사용하여 시냅스 단백질의 분포를 분석하는 정량적 방법을 제시합니다. 이 방법은 절대 형광 수준 대신 단백질 분포 비율을 평가할 수 있게 하여 뇌를 넘어 다양한 생물학적 조직에 적용할 수 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 세포 생물학
- 면역형광 기술
배경
- 시냅스 단백질의 검출은 뉴런 기능을 이해하는 데 중요합니다.
- 면역형광 염색은 변동성이 발생하기 쉽지만, 이 방법은 이러한 변동성을 완화합니다.
- 이 기술은 다른 조직과 모델 유기체에 걸쳐 사용될 수 있습니다.
연구 목적
- 시냅스 단백질 분포를 정량화하기 위한 정확한 접근법을 개발합니다.
- 다양한 뇌 수준에서 단백질 분포의 이질성을 평가합니다.
- 여러 생물학적 맥락에 적합한 단백질 분석 기술을 개선합니다.
사용된 방법
- 뇌 슬라이스에 면역형광 및 공초점 현미경을 결합합니다.
- 이전에 분리된 마우스 뇌 조직을 생물학적 모델로 사용합니다.
- 두께 25 마이크로미터의 뇌 조직을 냉동 보존하고 단면화합니다.
- 항체 적용 및 염색을 위한 단계별 세척 및 배양 절차입니다.
- 형광 강도를 정량화하기 위해 FIJI 소프트웨어를 사용한 이미지 분석입니다.
주요 결과
- 이 방법은 뇌 영역 전반에 걸쳐 단백질 분포의 명확한 묘사를 제공합니다.
- 다른 시냅스 단백질은 분포에서 이질적이고 균질적인 패턴을 표시합니다.
- 높은 세포 밀도 영역은 DAPI 염색의 효과성을 나타내는 더 밝은 신호를 보여줍니다.
결론
- 본 연구는 시냅스 단백질 분포를 정량적으로 평가하는 능력을 향상시킵니다.
- 이 방법은 다양한 조직 및 모델 시스템 간의 분석을 가능하게 하여 다용도입니다.
- 이러한 분포 패턴을 이해하면 뉴런 메커니즘 및 잠재적인 질병 모델에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Quantitative mapping of synaptic protein distribution using immunofluorescence and confocal microscopy addresses a critical need for reproducible, comparative protein localization in neurobiology and CNS drug discovery. By leveraging ratio-based fluorescence analysis, this method enhances predictive confidence in target validation and supports translational continuity across preclinical models. The approach enables robust cross-study and cross-platform comparisons, directly impacting early discovery and mechanistic de-risking in biopharma pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of synaptic protein localization relative to reference markers.
- Supports functional target validation by revealing heterogeneous protein distribution across brain regions and subregions.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing region-specific protein abundance patterns.
- Improves predictive confidence for target engagement and pathway mapping.
Screening & Assay Development
- Prepares validated brain tissue systems for downstream quantitative imaging workflows.
- Standardizes immunofluorescence outputs by using ratio metrics, reducing inter-experiment variability.
- Enables reproducible, scalable quantification of protein distribution for assay development.
- Supports reliable evaluation of compound effects on synaptic protein localization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns protein distribution data with disease-relevant brain regions and subfields.
- Enables comparative studies across genetically modified or drug-treated animal models.
- Supports translational biomarker identification by quantifying protein heterogeneity at multiple anatomical levels.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions based on quantitative spatial protein data.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early discovery through preclinical research, supporting hypothesis testing, target validation, and translational biomarker alignment in CNS-focused R&D.
- Discovery Biology: Provides quantitative, region-specific protein distribution data for hypothesis-driven target validation.
- Screening: Delivers standardized, reproducible imaging outputs suitable for assay development and compound screening.
- Analytics: Generates ratio-based fluorescence measurements for robust statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Enables continuity from discovery to preclinical validation by supporting cross-model and cross-condition analyses.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, adaptable workflow for diverse tissues, antibodies, and imaging platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of protein localization studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by providing robust quantitative data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of CNS targets and biomarkers.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence, confocal microscopy, and quantitative image analysis.
- Depends on access to high-quality antibodies and advanced imaging instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of staining, imaging, and analysis protocols.
- Adaptable to various tissues, model systems, and imaging platforms with protocol optimization.
- Potential limitations include antibody specificity and photobleaching during imaging.
