Name: 면역 형광 검사를 사용 하 여 마우스 뇌의 시 냅 스 단백질의 다른 유형의 분포를 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 배우세요 면역형광 및 공초점 현미경을 활용한 마우스 뇌 시냅스 단백질 분포 정량 분석법입니다. 이 기법은 형광 강도 비율을 사용하여 변이성을 최소화하고 다양한 뇌 영역에서 단백질 이질성을 평가할 수 있습니다.

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우리는 우수한 기술 지원 Irmgard와 이즈를 감사합니다. 저자는 헤르메스 Pofantis / Andoniya Petkova 지원을 인정합니다. 저자는 또한 유럽 신경 과학 연구소의 LSM800 및 기술 지원, 특히 박사 Nils Halbsgut에 의해 사용에 대 한 감사합니다. 이 작품은 대학 의료 센터 괴팅겐에 의해 투자 되었다. JSV 인정 나노 현미경과 분자 생리학의 두뇌 (CNMPB)를 위한 센터에 의해 지원 합니다.

이 프로토콜은 실험 동물에 포함 되지 않습니다. 뇌 샘플을 얻기 위해 동물의 euthanizing 관련 실험 승인 번호 T 10/30 (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin 괴팅겐) 현지 동물 보호 당국에 의해 승인 되었다.
참고:이 프로토콜에 대 한 3 성인 남성 C57BL/6 마우스 사용 되었다.
1. 샘플 준비
<ol><li>정착 액 및 0.1 M 인산 버퍼 (PB; 표 1참조)를 준비 합니다.</li>
	<li>게이지 외 에 설명 된 대로 transcardial 관류 하 여 동물을 해결 28. 먼저 0.9로 혈액을 씻어 %NaCl 해결책, 다음 4 %paraformaldehyde (PFA)의 30 mL와 함께 perfuse.</li>
	<li>가 위 두개골을 열고 뇌 조직 손상을 방지 하려면 무딘 가장자리와 숟가락을 사용 하 여 조심 스럽게 분리 합니다.</li>
	<li>정착 액 50 mL 반응 관 작성 및 4%에서 뇌를 후 위 PFA 하룻밤에 4 ° C에서.</li>
	<li>정착 액을 제거 하 고 30 분 통에 0.1 m M PB의 50 mL에 뇌 세척.</li>
	<li>세척, 후 48 h 또는 cryoprotection 4 ° C에서 튜브에 싱크까지 0.1 m M 샌드위치에 30% 자당에서 50 mL 반응 관에 뇌를 품 어.</li>
	<li>날카로운 블레이드와 cryoprotected 뇌를 손질 하 고는 cryomold에 최적의 절삭 온도 (10 월) 화합물 포함. 거품을 하지 마십시오. 두뇌를 동양 및 cryomold-80 ° C 냉장고에서 동결.</li>
	<li>단면에 대 한 냉동된 조직을 탑재 합니다. 구분 하기 전에 적어도 15 분 동안 cryomicrotome 온도 조직 equilibrate.</li>
	<li>25 µ m 두께 코로나 조각으로 두뇌를 섹션. 뇌 조직을 건드리지 않고 신중 하 게 유리 걸이로 10 월을 터치 합니다. 24 잘 접시에 잘 당 3 인접 한 조각을 수집 하 고 얼룩까지 4 ° C에서 0.1 M PB에 저장. 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기까지 2 주 동안. 긴 저장 시간 조직 품질을 방해 하 고 따라서 실험의 결과 영향을 미칠 수 있습니다.</li>
</ol>2입니다. 면역 형광 검사
<ol><li>블로킹 버퍼, 항 체 버퍼, 세척 버퍼 1, 및 세척 버퍼 2 ( 표 1참조)를 포함 한 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>초과 10 월을 제거 하는 PB와 한 번 분할 영역을 씻어.<ol>
<li>두뇌 조각에서 빠는 없이 플라스틱 피 펫과 솔루션을 제거 합니다. 1000 µ L 피 펫과 신선한 PB의 250 µ L를 추가 합니다. 주의: 분할 영역 해야 하지 밖으로 건조, 그래서 제거 하 고 체액 잘에 의해 잘 추가.</li>
	</ol>
</li>
	<li>플라스틱 피 펫으로 PB를 제거 하 고 250 µ L 당 1000 µ L 피 펫 잘 차단 버퍼의 추가. 셰이 커에 실 온 (RT)에서 3 h에 대 한 품 어.</li>
	<li>인큐베이션 기간 동안, 항 체 반응 튜브에 버퍼에서 기본 항 체 희석. 잘 당 250 µ L 항 체 버퍼를 사용 하 고 항 체의 적절 한 금액을 추가 ( 표 2참조) 2 µ L 피 펫을 사용 하 여 솔루션에 직접 pipetting으로. 부드럽게 몇 번 위아래로 pipetting으로 솔루션을 믹스. 소용돌이 후 적절 한 혼합 되도록 곧입니다. 참고: 배경 형광을 확인 하려면 stainings 또한 수행 되어야 한다 1 차 항 체를 추가 하지 않고. 그에 대 한 항 체는 프로토콜에 따라 기본 항 체 없이 솔루션에서 슬라이스를 품 어.</li>
	<li>외피 시간 후 플라스틱 피 펫과 블로킹 버퍼를 제거 하 고 잘 당 1 차 항 체를 포함 하는 항 체 솔루션의 250 µ L를 추가 합니다. 통에 4 ° C에서 하룻밤 1 차 항 체로 분할 영역을 품 어.</li>
	<li>다음 날, 세척 버퍼 1 3 조각 씻어 통에 RT에서 10 분에 대 한 x.<ol>
<li>플라스틱 피 펫과 매체를 제거 하 고 잘 당 버퍼 1 세척의 300 µ L를 추가 합니다. 10 분 반복 3 번 RT에서 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세척 단계 동안 반응 관에서 항 체 버퍼에 fluorophore 결합 보조 항 체 희석. 잘 당 250 µ L 항 체 버퍼를 사용 하 고 항 체의 적절 한 금액을 추가 ( 표 2참조) 2 µ L 피 펫을 사용 하 여 솔루션에 직접 pipetting으로. 부드럽게 몇 번 위아래로 pipetting으로 솔루션을 믹스. 소용돌이 후 적절 한 혼합 되도록 곧입니다. 주의: 항 체는 빛에 민감한, 때문에이 시점에서 모든 단계 어둠 속에서 수행 해야 합니다.</li>
	<li>세척 단계, 세척 플라스틱 피 펫을 버퍼링 하 고 잘 당 2 차 항 체를 포함 하는 항 체 솔루션의 250 µ L를 추가 제거 후. 어둠 속에서 RT에서 90 분에 대 한 2 차 항 체로 슬라이스를 품 어.</li>
	<li>버퍼 2 3의 세척 조각 씻어 실시간에서 10 분 x</li>
	<li>세척 단계 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 0.1 M 샌드위치 1: 2000의 농도에서 희석.</li>
	<li>플라스틱 피 펫으로 세척 버퍼 2를 제거 하 고 잘 당 DAPI 솔루션의 250 µ L을 추가. 셰이 커에 RT에 5 분 동안 품 어.</li>
	<li>플라스틱 피 펫 DAPI 솔루션을 제거 하 고 1000 µ L 피 펫 잘 당 0.1 M PB의 500 µ L을 추가.</li>
	<li>현미경 슬라이드에 분할 영역을 탑재 합니다.<ol>
<li>장소는 stereoscope 아래 현미경 슬라이드입니다. 정밀한 브러시와 함께 슬라이드에 0.1 m M PB의 세 가지 별도 방울을 추가 합니다. 현미경 슬라이드에 드롭 당 하나의 슬라이스를 놓습니다.</li>
		<li>좋은 브러시를 사용 하 여 평평 하 고 방향을 현미경 슬라이드에서 조각.</li>
		<li>모든 분할 영역을 올바르게 배치 하는 경우 초과 PB 화장지로 제거 하 고 신중 하 게 슬라이드를 건조. 주의: 두뇌 분할 영역을 완전히 건조 하지 마십시오.</li>
		<li>슬라이드에 매체를 포함 80 µ L를 추가 합니다. 신중 하 게 그로 인하여 뇌 조각 포함 슬라이드에 coverslip 낮은.</li>
		<li>1-2 h에 대 한 증기 두건에서 건조 슬라이드를 두고 (빛에 노출을 피하기 위해 그들을 커버) 4 ° c.에 현미경 슬라이드 상자에 보관 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3입니다. 영상
<ol><li>포함 매체 완전히 경화 된 후, confocal 현미경 현미경 슬라이드를 놓습니다. 참고: Epifluorescence 현미경 deconvolution 소프트웨어와 함께 비슷한 이미지 품질을 양보 한다.</li>
	<li>증가 또는 감소 하는 모든 채널에 대 한 레이저 강도 몇 픽셀 회색 값의 최대 배포 되도록 과도 노출 레이저 설정을 조정 합니다.</li>
	<li>다른 채널에 대 한 전체 뇌 조각의 가상 조직 취득.<ol>
<li>이미징 소프트웨어에서 ( 재료의 표참조), 타일 옵션을 선택 하 고 수동으로 타일 지역 설치뇌 조각 윤곽을 그리 다.</li>
		<li>지원 포인트 타일 지역에 걸쳐 배포 하 고 확인 타일 지역/위치... 를 눌러 다른 지원 포인트에 대 한 초점을 조정
</li>
		<li>결과 이미지의 원하는 해상도 파일 크기에 따라 획득 모드 에서 설정을 조정 하 고 스캔을 시작.</li>
	</ol>
</li>
	<li>검사가 완료 되 면 가상 조직 처리를 바느질 함수를 사용 합니다. .Tif 이미지 내보내기기능으로 파일을 내보냅니다.</li>
</ol>4. 컴퓨터 기반 분석
<ol><li>파일을 클릭 하 여 피지29 으로 하나의 이미지에 대 한 모든 단일 채널 로드 | 오픈.</li>
	<li>자유형 선택 도구와 함께 한 반구를 DAPI 채널에 나타냅니다. 편집을 클릭 하 여 선택의 마스크를 만들기 | 선택 | 마스크 레이어 만들기.</li>
	<li>분석을 클릭 하 여 단일 채널 (발동기 및 synaptophysin)에 대 한 평균 형광 강도 결정 | 측정. 참고: 각 채널에 대 한 평균 형광 강도 값을 결정 하는 다른 채널을 선택할 수 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>단일 채널에 대 한 평균 형광 강도 스프레드시트에 복사 합니다.</li>
	<li>또한 자유 선택 도구로 영역을 묘사 하 여 관심의 영역에서 단일 채널에 대 한 평균 형광 강도 결정 합니다. 마우스 뇌 아틀라스를 사용 하 여 참조로.</li>
	<li>모든 관심 분야에 대 한 모든 반구 4.1-4.5 단계를 반복 합니다. 참고: 별도로 나중에서 그 관심의 영역에 값을 비교 하기 위해 각 반구에 대 한 값을 결정 (단계 5.2 참조).</li>
</ol>5. 데이터 처리
<ol><li>배경 형광은 높은 경우 ( 내용참조), 배경 빼기 필요. 그에 대 한 참조 단백질에 대 한 1 차적인 항 체 없이 처리 하는 조각에 대 한 평균 형광 강도 결정 (여기: synaptophysin) 뇌 영역 및 반구에 대 한 가져온 모든 값에서 해당 값을 뺍니다.</li>
	<li>모든 반구와 관심의 모든 영역에 대 한 단일 채널에 대 한 평균 형광 강렬을 확인 한 때 ( 표 3참조), synaptophysin (에 대 한 값으로 발동기에 대 한 값을 분할 하 여 synaptophysin에 발동기의 비율을 계산 표 3에 노란색)입니다. 모든 반구와 관심의 모든 영역에 대 한이 작업을 별도로 수행할.</li>
	<li>북반구에 관심 분야의 비율을 확인 하려면 해당 반구 ( 표 3에 오렌지) 획득 비율에 의해 얻은 관심의 한 영역에 대 한 비율을 나눕니다.</li>
	<li>상대 발동기 풍부를 확인 하려면 1 ( 표 3에 빨간색)에서 편차를 확인 하 여 백분율에 5.2에서 얻은 비율을 번역 합니다. 1.25 비율 따라서 평균, 이상 25%의 상대 발동기 풍부 줄 고 0.75의 비율 평균 25%의 상대 발동기 풍부를 얻을 것 이다.</li>
</ol>

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<li>Poole, A. R., Dingle, J. T., Mallia, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+localization+of+retinol-binding+protein+in+rat+liver+by+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The localization of retinol-binding protein in rat liver by immunofluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Science. 394, 379-394 (1975).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

메서드는 알려진된 분포와 마커 단백질의 풍부에 상대적인 관심사의 단백질의 분포를 측정 하는 겨냥 여기 제시. 면역 형광 염색 얼룩 다른 조각 사이 농도의 높은 다양성을 표시할 수 있습니다. 정량화 방법은 여기에 설명 된 북반구 전체 평균에 관심사의 단백질의 비율을 결정 하 여이 문제를 circumvents. 따라서, 분할 영역에 걸쳐 서로 다른 착 색 농도가 밖으로 취소 하 고 정량에 대 한 허용.
모든 면역 형광 검사 프로토콜에서와 마찬가지로 질적 또는 양적, 여러 가지 요인 성공에 영향를 분석 함으로써 혼동 됩니다. 따라서, 프로토콜의 중요 한 단계에 특별 한 주의 지불 합니다. 첫째, 조직의 적절 한 고정이 필요 합니다. 이 고정 일반적으로 성공적인 transcardial 관류에 의해 얻을 수 있습니다. 관류의 품질은 혈액에 밖으로 세척 후 간을 확인 하 여 확인할 수 있습니다. 성공적인 관류에 대 한 첫 번째 지표는28간 및 사지...

뉴런 간의 통신 시 냅 스 라는 전문된 연락처 사이트에서 발생 합니다. 시 냅 스 통합 하는 시 냅 스 전송 하는 다른 단백질의 무수를 포함 합니다. 그 단백질의 일부는 신경 시스템을 통해 다른 유형의 분포를 표시 하 고 모든 시 냅 스1에 존재 하지 않습니다. 이러한 단백질에 대 한 한 예로 시 냅 스 소포 프라이 밍 과정에 포함 되는 Munc13 이다. heterogeneously 뇌2전체 분포, Munc13의 다른 isoforms 그리고 존재 또는 부재 특정 isoforms의 영향을 미칠 수 단기 시 냅 스가 소성 및 시 냅 스 소포 역학3, 4 , 5. 따라서 뇌 분야에 걸쳐 다른 시 냅 스 단백질의 존재를 식별할 수에 중요 한 중요성의 이다.
-지금까지-시 냅 스 단백질의 정량화에 대 한 선택의 메서드는 질량 분석 및 서 부 럽, 보다는 오히려 immunohistochemistry6,7,,89. 경우에 따라 여러 가지 방법은 모두 수량과 특정 단백질 (즉, 빌헬름 외 의 지역화를 평가 하기 위해 서로 보완 하 되 10). 여기 설명 하는 방법 지역화 하 고 정량화 없이 단순히 채용 immunofluorescent stainings 어떤 생 화 확 적인 방법을 사용 하 여 관심사의 단백질의 수 있습니다. 또 다른 장점은 여기은 훨씬 작은 지역에는 정량화를 할 수 있습니다, 따라서, 그 보다 더 구체적인 다른 방법으로 달성. 그러나, 하나의 신뢰할 수 있는 레퍼런스 단백질 관심사의 단백질의 분포를 평가 하는 데 필요한은 고려 하고있다.
Immunohistochemistry 여 형광 얼룩 다른 신경 구획 내에서 뿐만 아니라 뇌 영역에 걸쳐 정기적으로 단백질의 지역화를 식별할 수 있습니다. 다른 구획을 식별 하기 위해 특정 마커 사용 됩니다. 일반적으로, synapsin 및 synaptophysin11 에 대하여 항 체 바 순에 대 한 항 체는 연 접 터미널12의 활성 영역 레이블을 동안 시 냅 스 소포 라벨을 사용할 수 있습니다. 기공을 전송기, 기공을 조미료 전송기 (vGluT) 또는 기공을 GABA 운송업 자 (vGAT), 같은 라벨을 흥분 성의13 및 금지14 연 접 맨끝 각각 사용 됩니다. Postsynaptic 측면에서 호머 단백질에 대 한 항 체 postsynaptic 터미널과 postsynaptic 밀도 단백질 95 (PSD95)15,,1617 또는 gephyrin18 에 대 한 항 체를 채택 될 수 있다 , 19 , 20 흥분 성의 또는 금지 postsynaptic 단말기를 각각 레이블을 수 있습니다. 관심 및 위에서 설명한 것과 같은 표시자의 단백질에 대하여 항 체를 사용 하 여 하나 이러한 단백질의 지 방화를 결정할 수 있습니다. 날짜에 많은 연구 질적 방법21에이 일을. 그러나, 특정 시 냅 스 단백질의 차등 분배를 안정적으로 결정 하려면 하나 결정 해야 합니다 하지만 그것의 존재 또는 부재 뿐만 아니라 그것의 상대 농도. 시 냅 스의 밀도 크기의이 시 냅 스 마커 및 관심사의 단백질 간의 비율을 설정 하는 것이 중요 합니다. 그렇지 않으면, 해 마의 비 피라미드 층 및 소 뇌의 분자 층 등 냅 풍부한 지역 시 냅 스 단백질, 시 냅 스의 높은 밀도 인해만 하지만 그 단백질의 강한 존재 때문에의 높은 밀도 표시 됩니다. (예를 들어, Wallrafen 및 Dresbach1) 각 시 냅 스. 신경 소마 (예를 들어, TGN3822)에 단백질이 hippocampal 피라미드 셀 레이어 또는 hippocampal 또는 소 뇌과 립 세포 층 신경 셀 시체의 높은 농도 때문에 강한 존재를 보여줄 것 이다 일반적으로 다른 한편으로, 에 그 지역. 따라서,이 비 균질 유통 구조,이 경우 synapses, 자체는 관심사의 단백질의 분포의 잘못 된 추정으로 이어질 수 있습니다. 또한, 샘플 immunohistochemical stainings에 걸쳐 휘도 얼룩에 본질적인 변화가입니다. 여기에 설명 된 프로토콜 고려이 고 immunohistochemical 방법에서 발생 하는 다른 주의 사항으로 그런 편견을 피 한다.
우리 16 서로 다른 뇌 영역1에 걸쳐 발동기 (TPRGL23 또는 SVAP3024라고도 함)의 차동 식을 설명 하기 위해이 메서드를 사용 해야, 우리의 최근 연구. 움직이는 척추 관련 시 냅 스 단백질 시 냅 스 소포에 협회에서 찾을 수 있습니다 및 영향 신경 전달 물질 방출25,,2627이다. 우리 시 냅 스 소포 참조 표식으로 synaptophysin에 대 한 얼룩에 의해 시 냅 스 소포의 풍요에 발동기 식을 관련 있다. 우리는 특히 septal 핵, 복 부 마와 편도 체에 발동기의 높은 수준을 발견. 해 마, 내 우리 레이어 내부 hippocampal 계산와 입력 및 출력 계층의 낮은 수준에서에서 높은 수준으로 발동기의 다른 유형의 분포를 발견.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 반응 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>30120094</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 반응 튜브</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>멀티웰 24 웰</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 087721H</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 피펫 (일회용)</td><td>Sarstedt</td><td>861,176</td><td></td></tr><tr><td>1000 mL 피펫</td><td>Rainin</td><td>&nbsp; </td><td></td>17014382</tr><tr><td>2 ml 피펫</td><td>Eppendorf</td><td>3123000012</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genius 3&nbsp;</td><td>IKA</td><td>3340001</td><td></td></tr><tr><td>Menzel 현미경 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 10144633CF</td><td></td></tr><tr><td>스테레오스코프</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM800</td><td>Zeiss</td><td></td><td>컨포칼 현미경</td></tr><tr><td>동결 마이크로톰</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X)</td><td>Roche</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td></td>11666789001</tr><tr><td>PFA</td><td>시그마</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; P6148-1kg</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BioFroxx</td><td>1394KG001</td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td>neoFroxx</td><td>1104KG001</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Tek</td><td>Sakura&nbsp;</td><td>4583</td><td>OCT</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>BioFroxx</td><td>5155KG001</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Merck</td><td>1,063,460,500</td><td></td></tr><tr><td>일반 염소 혈청</td><td>Merck Millipore</td><td>S26-100ML</td><td></td></tr><tr><td>일반 당나귀 혈청</td><td>Merck</td><td>S30-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck</td><td>1,086,031,000</td><td></td></tr><tr><td>토끼 안티 무버</td><td>시냅스 시스템</td><td>RRID: AB_10804285</td><td></td></tr><tr><td>기니피그 항 시냅토피</td>신 <td>시냅스 시스템</td><td>RRID: AB_1210382</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 항 토끼 AF647</td><td>잭슨 면역연구</td><td>RRID: AB_2492288</td><td></td></tr><tr><td>염소 항 마우스 AF488</td><td>잭슨 면역연구</td><td>RRID: AB_2337438</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol4-88</td><td>Calbiochem</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td></td>475904</tr><tr><td>ZEN2 블루 소프트웨어</td><td>, Zeiss</td><td>현미경 소프트웨어</td>, <td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>ImageJ</td><td></td><td>분석 소프트웨어</td></tr>, <tr><td>Microsoft Excel</td>, <td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

면역 형광 검사를 사용 하 여 마우스 뇌의 시 냅 스 단백질의 다른 유형의 분포를 측정

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

존재, 결핍, 또는 특정 시 냅 스 단백질의 수준을 심각 하 게 시 냅 스 전송을 좌우할 수 있다. Elucidating 단백질의 기능, 뿐만 아니라 또한 그것의 배급을 결정에 필수적입니다. 여기, 우리는 면역 형광 검사, confocal 현미경 검사 법, 및 시 냅 스 단백질 발동기 (TPRGL 또는 SVAP30 라고도 함)의 분포를 확인 하기 위해 컴퓨터 기반 분석 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 따라서 발동기의 분포 synaptic vesicles의 풍부에 상대적인 양적 방식 결정 시 냅 스 소포 단백질 synaptophysin의 발동기의 분포를 비교 합니다. 특히,이 방법은 잠재적으로 다른 연구를 통해 또는 다른 항 체 또는 현미경을 사용 하 여 단백질의 분포의 비교 있도록 구현 수 있습니다. 우리의 방법은 절대 형광 수준 보다는 오히려 비율을 양보 하 여 immunofluorescent stainings의 고유의 가변성 circumvents. 또한, 우리가 설명 하는 방법 다른 수준에 단백질의 분포를 분석 하는 연구원을 가능: 전체 뇌 조각 한 두뇌 지역, 다른 레이어는 해 마의 또는 감각에서 오는 다른 아구에 뇌 영역에서 외피가입니다. 움직이는 시 냅 스 소포와 연결 되는 척추 관련 단백질 이다. 이 방법으로 우리는 발동기입니다 heterogeneously 뇌 영역, 상부 복 부 마, septal 핵에는 편도 해 마의 다른 레이어 같은 단일 뇌 영역 내에서 분산을 보여줍니다.

대표 다른 마커 패턴을 얼룩이 지는 그림 1에서 볼 수 있습니다. 패턴은 단백질의 분포에 따라 달라 집니다. 5 rostro 꼬리 수준의 예 열 (A)에 표시 됩니다-(E). 첫 번째 행에 표시 되는 대표적인 DAPI 얼룩: DAPI는 세포의 DNA를 준수 하 고 따라서 핵은 스테인드. 이 결과 punctate 패턴. 높은 세포 밀도 낮은 세포 밀도와 지역 보다 밝은. Heterogeneously 분산된 단백질에 대 한 예는 두 번째 행에서 볼 수 있습니다. 얼룩이 발동기 밝은 핫스팟 지역 및 주차 지역 두뇌에 걸쳐 차등 분배를 보여준다. 세 번째 행에서 더 균질 분산된 참조 마커 synaptophysin에 대 한 예가 표시 됩니다. 두 단백질의 오버레이 (4 행) 차동의 분포를 보여줍니다 발동기 (빨간색) 마커 단백질 synaptophysin (녹색)에 비...

여기, 우리 면역 형광 염색 법을 사용 하 여 마커 단백질, confocal 현미경 검사 법 및 컴퓨터 기반 분석 시 냅 스 단백질의 분포를 결정 하는 양적 접근 방식을 설명 합니다.

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

여기서 우리는 참조 단백질에 비해 시냅스 단백질의 분포를 결정하기 위해 면역 형광, 공초점 현미경 및 컴퓨터 기반 분석을 사용하는 프로토콜을 설명합니다. 우리의 방법은 절대 형광 수준이 아닌 비율을 사용하여 면역 형광 얼룩의 내재된 가변성을 우회합니다. 이 방법을 사용하면 다른 수준에서 단백질 분포의 이질성을 분석할 수 있습니다.전체 뇌 슬라이스에서 뇌 영역, 해마의 다른 층과 같은 하위 영역에 이르기까지. 이 기술은 마우스 이외의 뇌 및 모델 시스템 이외의 다른 조직에서 단백질 분포를 결정하기 위해 적응될 수 있다. 원고에 설명된 대로 이전에 격리되고 고정된 마우스 뇌를 세척하여 시작합니다.그런 다음 뇌를 15 밀리리터 반응 튜브로 옮기고 30%의 자당 0.1 어금니 PB를 전달한다. 저온을 보호하려면 뇌가 섭씨 48도 또는 가라앉을 때까지 배양합니다. 그 후 날카로운 블레이드를 사용하여 관심 영역에 따라 극저온 보호 뇌를 다듬습니다. 그런 다음 뇌를 냉동고 금형에 넣고 최적의 절삭 온도 화합물을 추가하여 거품을 피하고 뇌를 제대로 방향을 조정하여 절단의 관상 동맥 평면을 갖도록 합니다.냉동 고체가 동결 될 때까지 영하 80도 냉동고에 냉동 냉동고에 냉동 금형을 배치합니다. 냉동 된 조직을 냉동 마이크로 톤에 장착하고 미세 토메 온도에 평형섹션 전에 적어도 15 분 동안 기다립니다. 25 마이크로 미터 두께의 관상 슬라이스로 뇌를 자르기 시작합니다.뇌 조직을 건드리지 않고 첫 번째 슬라이스의 10 월에 유리 후크를 신중하게 사용하십시오. OCT는 유리 후크에 충실합니다. 유리 후크를 사용하여 뇌 슬라이스를 첫 번째 우물로 옮기.0.1 어금니 PB로 채워진 24 개의 웰 플레이트에서 잘 당 3 개의 인접 조각을 수집합니다. 슬라이스를 섭씨 4도에 보관하여 최대 2주 동안 염색할 때까지 보관합니다. 면역 염색을 위한 슬라이스를 준비하려면 플라스틱 파이프를 사용하여 뇌 슬라이스에 그려지지 않고 PB 용액을 잘 제거합니다. 그런 다음 1000 마이크로 리터 파이프를 사용하여 250 마이크로 리터의 신선한 PB를 추가하여 10 월 초과를 씻어 냅니다.슬라이스를 건조하지 않도록 시간에 각 우물에 대해이 세탁을 반복합니다. 그런 다음 플라스틱 파이프를 사용하여 첫 번째 우물에서 PB 용액을 제거합니다. 1000 마이크로리터 파이펫을 사용하여 잘 작동하면 잘 작동할 때 250 마이크로리터의 블로킹 버퍼를 추가합니다.셰이커의 실온에서 플레이트를 3시간 동안 배양합니다. 인큐베이션 동안 반응 튜브에 잘 당 항체 완충제의 250 마이크로리터를 첨가한다. 그런 다음 2 마이크로리터 파이펫을 사용하여 적절한 양의 항체 파이펫을 용액에 직접 넣고 여러 번 부드럽게 파이프를 섞습니다.그런 다음 이 희석된 항체를 소용돌이로 사용하여 적절한 혼합을 보장하지 않습니다. 잘 작동 플라스틱 파이프차단 버퍼를 제거하고 잘 당 1 차 항체 용액의 250 마이크로 리터를 추가합니다. 하룻밤 사이에 셰이커에 접시를 배양합니다.다음 날 플라스틱 파이펫으로 항체 용액을 제거합니다. 300 마이크로리터의 세탁 버퍼 1개씩 1회 3분 당 실온에서 셰이커로 세척합니다. 세탁 하는 동안, 어둠 속에서 작업, 이전에 1 차 적인 항체와 함께 수행 하는 것과 같은 방식으로 반응 튜브에 몇 두 번째 항체에 대 한 불소를 희석.세척을 완료한 후 플라스틱 파이펫으로 세척 버퍼를 제거하고 250 마이크로리터의 이차 항체 용액을 잘 첨가합니다. 실온에서 90분 동안 어둠 속에서 배양하세요. 인큐베이션을 완료한 후 플라스틱 파이프로 항체 용액을 제거합니다.세탁 버퍼 1개와 동일한 방법으로 2개의 세척 버퍼로 섹션을 세 번 씻습니다. 이 세척 중 DAPI 얼룩을 0.1 어금니 PB로 희석하여 1-2000 농도를 달성한다. 플레이트에서 세척 버퍼를 제거한 후 DAPI 용액 250마이크로리터를 추가하고 셰이커의 실온에서 5분 동안 배양합니다.플라스틱 파이펫으로 DAPI 용액을 제거한 후 1000 마이크로리터 파이펫을 사용하여 웰당 0.1 마이크로리터 PB 500마이크로리터를 추가합니다. 현미경 슬라이드를 스테레오스코프 아래에 놓습니다. 미세 브러시를 사용하여 슬라이드에 0.1 어어 PB 3 방울을 추가합니다.브러시를 사용하여 슬라이드에 한 방울당 한 조각을 놓고 슬라이스를 평평하게 하고 방향을 지정합니다. 모든 슬라이스가 올바르게 배치 된 후 제대로 종이 조직을 사용하여 여분의 PB를 제거하고 조각을 완전히 건조하지 않고 조심스럽게 건조하십시오. 그런 다음 슬라이드에 중간을 포함시키는 80 마이크로 리터를 추가하고 조심스럽게 커버 슬립으로 커버하여 뇌 슬라이스를 포함시게 됩니다.슬라이드를 덮어 가벼운 노출을 피하고 연기 후드에서 1~2시간 동안 건조한 다음 공초점 현미경 검사법에 대비할 때까지 섭씨 4도의 현미경 슬라이드 상자에 보관하십시오. 원고에 설명된 대로 다른 채널에 대한 전체 뇌 슬라이스의 가상 조직을 획득 한 후 파일을 클릭하여 모든 단일 채널 또는 하나의 이미지를 FIJI로 로드한 다음 엽니다. 그런 다음 무료 손 선택 도구를 사용하여 DAPI 채널에서 한 반구를 묘사합니다.편집을 클릭한 다음 선택한 영역의 마스크를 만들기 위해 마스크를 만듭니다. 그런 다음 분석을 클릭한 다음 입자를 측정하여 단일 채널의 평균 형광 강도를 결정합니다. 단일 채널을 선택하여 각 채널의 평균 형광 강도 값을 결정해야 합니다.그런 다음 단일 채널의 평균 형광 강도를 스프레드시트에 복사합니다. 관심 영역에서 단일 채널에 대한 평균 형광 강도를 결정하기 위해 자유 손 선택 도구로 영역을 설명합니다. 핵을 얼룩지게 하는 DAPI를 염색한 후 핵은 천자 패턴을 가지며 세포 밀도가 높은 영역은 세포 밀도가 낮은 영역보다 밝습니다.무버 항체로 염색하는 것은 시냅토피신이 더 균일한 분포를 드러낸 두뇌를 통해 밝은 핫스팟 지역 및 조광기 지역을 가진 이질적인 분포를 밝혔습니다. 이미지의 오버레이는 무버 단백질이 시냅토피신을 나타내는 녹색 형광을 비교했음을 나타내는 적색 형광의 차동 분포를 보여 주었다. 정량화 분석 후 반구와 관심 영역 전반에 걸쳐 다른 채널에 대한 형광 강도 값이 무버와 시냅토피신 모두에 대해 결정되었다.시냅토피신 형광값에 대한 무버 형광값의 비율은 시냅스 소포에 비해 무버의 이질분포를 나타내고 있다. 상대 무버는 반구에 걸쳐 에 비해 관심의 한 영역에서 비율을 풍부하고 백분율로 변환 평균에 비해 관심의 한 영역에 얼마나 많은 무버가 존재하는지 보여 주었다. 상대무버 풍부는 해마의 하위 필드에 있는 다른 층을 위해 결정되었습니다.관심의 세 영역은 해당 반구의 비율에 각각의 층의 비율을 비교하여 정량화된다. 이 절차는 관심있는 단백질의 세포 분포를 추가로 결정하기 위하여 초분해능 현미경 검사법과 같은 다른 화상 진찰 기술과 쉽게 적응하고 결합될 수 있습니다. 이 기술은 또한 유전자 변형 또는 약물 처리 동물과 같은 다른 모형 시스템에 적용될 수 있습니다.이것은 다른 실험 조건 또는 종에 걸쳐 비교 접근을 허용할 수 있습니다.

quantifying-heterogeneous-distribution-synaptic-protein-mouse-brain

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 프로토콜은 dissociated의 연결을 문화와 immunocytochemistry를 사용하여 뇌 부분에서 모두 버렸네 번호를 계량하는 방법 세부 사항. 구획 특정 항체를 사용하여, 우리는 presynaptic 터미널뿐만 아니라 postsynaptic 전문 사이트를 라벨. 우리는이 표시에 의해 생성되는 신호 사이에 colocalization 지점으로 시냅스를 정의합니다.

Quantifying 시냅스 : 시냅스 번호를 수치 Immunocytochemistry 기반 어세이

시냅스에서 신경 전달 물질 수용체 클러스터의 풍부한 강력히 시냅스 강도에 영향을 미칩니다. 이 방법에서는 단일 시냅스 해상도로 가로, 세로, 높이로 fluorescently-라벨이 신경 전달 물질 수용체를...

에서 시냅틱 형광의 자동 부량<em&gt; C. elegans</em

이 비디오는 특정 시냅스전 단백질의 분포를 정량화하기 위해 마우스 뇌 절편의 면역형광 염색을 보여줍니다. 이 프로세스에는 비특이적 부위를 차단하고, 표적 단백질에 대한 1차 항체와 참조 마커를 적용한 다음, 2차 항체 라벨링 및 핵 counterstaining이 포함됩니다. 참조 마커는 일관된 기준선을 제공하여 정확한 정량화를 보장하며, 공초점 현미경을 사용하여 뇌 영역 전반에 걸쳐 시냅스전 단백질의 분포를 분석합니다.

면역형광을 이용한 쥐 뇌의 시냅스전 단백질 분포 정량화(Quantifying the Distribution of a Presynaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence)

출처: Schönherr, S., et. al. 마우스 편도체에서 글루타메이트 수용체의 입력 특이적 배열을 조사하기 위해 광유전학 및 동결 파괴 복제 면역 라벨링을 결합했습니다. J. Vis. 특급. (2016)이 비디오는 전자 현미경을 위한 마우스 뇌 조직의 동결 파괴 복제본의 면역 라벨링을 보여줍니다. 파쇄되고 코팅된 복제품은 수용체를 노출시키기 위해 소화됩니다. 1차 및 골드 태그가 지정된 2차 항체를 추가하여 특정 신경세포막 수용체를 표지합니다. 복제본은 그리드에 장착되고 전자 현미경으로 시각화됩니다.

Immunolabeling of Neuronal Membrane Proteins in a Freeze-fractured Specimen of Mouse Brain Tissue

출처: McLeod, F., et al. 해마 설치류 뇌 절편의 시냅스 밀도 평가. J. Vis. 특급 (2017). 이 비디오는 컨포칼 면역형광 분석을 사용하여 해마 뇌 절편에서 시냅스 마커를 시각화하는 방법을 보여줍니다. 슬라이스는 시냅스전 및 시냅스후 마커를 표적으로 하는 1차 항체로 면역 염색된 후 형광단 접합 2차 항체로 면역 염색됩니다. 그런 다음 표지된 마커는 공초점 현미경을 사용하여 시각화하여 공동 국소화를 통해 시냅스 구조를 평가합니다.

면역형광을 이용한 마우스 해마 절편의 시냅스 현미경 분석

이 논문은 신경전달물질 수용체의 발현을 정량화하는 방법과 광유전학 도구의 바이러스 전달과 동결-파괴 복제 면역 표지 기술의 조합을 사용하여 식별된 시냅스 전후 요소로 시냅스에서 분석된 패턴을 설명합니다.

Optogenetic 및 동결 골절 복제 Immunolabeling는 마우스 편도체에서 글루타메이트 수용체의 입력 특정 배열을 검사하기 위해 결합

정확 하 게 파악 하 고 분석 hippocampal 조각 면역 형광을 사용 하 여 시 냅 스에 대 한 프로토콜은이 문서에 설명 되어.

시 냅 스 밀도 Hippocampal 설치류 두뇌 분할 영역에서의 평가

우리는 교양된 뉴런에 재활용 시 냅 스 소포 (SV)에 대 한 광학 분석 결과 설명 합니다. 더블 transfection는 연 접 마커 관심사의 단백질을 표현 하는이 프로토콜을 결합 연 접 사이트를 그들의 시 냅 스 소포 용량, 재활용 찾아서 관심사의 단백질의 역할을 결정할 수 있습니다.

시 냅 스 소포 교양된 신경 연 접 단백질 Overexpressing에 있는 재활용에 대 한 광학 분석 결과

여기서, 우리는 뇌 영역에서 단백질을 분석 하기 위해 면역 조직 화학 및 고해상도 스캔과 함께 근 적외선 염료를 사용 하는 프로토콜을 제시 합니다.

근 적외선 형광 및 고 분해능 주사를 사용 하 여 설치류 뇌의 단백질 발현 측정

이 프로토콜은 다중 표지 FISH 및 형광 IHC 신호를 달성하는 것을 목표로 신선 냉동 및 고정 마우스 뇌 절편 모두에서 형광 in situ hybridization(FISH)과 형광 면역조직화학(IHC)을 결합하는 방법을 설명합니다. IHC는 세포질 및 막 부착 단백질을 표적으로 삼았습니다.

Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Section(신선 냉동 또는 고정 마우스 뇌 절편에서 Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization과 형광 면역조직화학의 결합)

이 프로토콜은 마우스 뇌에서 고순도 시냅토솜, 시냅스 소포 및 기타 시냅스 분획을 얻는 강력하고 상세한 방법을 제시합니다. 이 방법은 단백질 국소화의 생화학적 분석을 포함한 시냅스 과정의 평가 및 구획 분해능을 통한 기능을 가능하게 합니다.

쥐의 뇌로부터 시냅스 성분의 분리를 위한 세포하 분획

배우세요 면역형광 및 공초점 현미경을 활용한 마우스 뇌 시냅스 단백질 분포 정량 분석법입니다. 이 기법은 형광 강도 비율을 사용하여 변이성을 최소화하고 다양한 뇌 영역에서 단백질 이질성을 평가할 수 있습니다.

면역 형광 검사를 사용 하 여 마우스 뇌의 시 냅 스 단백질의 다른 유형의 분포를 측정

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