Name: 마이그레이션, 침공, 불멸 하 게 인간의 첫 번째 임신 Trophoblast 셀 라인의 확산을 평가를 생체 외 분석 실험에서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 배우세요 인간 초기 임신 트로포블라스트 세포의 이동, 침입, 증식을 평가하는 생체 외 분석법을 통해 산과학적 결과에 영향을 미치는 요인을 시각적·정량적으로 분석하는 방법을 익히세요.

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저자 박사 길 Mor Sw.71 세포를 제공 감사 합니다. 이 연구는 남서에 앨버트 McKern 학자 포상에 의해 지원 되었다

1. 세포 준비
<ol><li>37 ° C, 5% CO2, 그리고 95% 습도에서 표준 성장 미디어 T-75 플라스 크에 세포를 유지 합니다. 참고: 이 실험에 사용 된 세포는 불멸 하 게 했다 처음 임신 trophoblast 셀 라인 Swan.71 (Sw.71) 및 HTR-8/SVneo9,10. Sw.71 셀 DMEM/F-12와 10% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1.0 m m 나트륨 pyruvate, 10 mM HEPES, 0.10 m m MEM 비필수 아미노산, 100 단위/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스 보충에 유지 되었다. HTR-8/SVneo 셀 RPMI-1640 년 5%로 보충 유지 되었다 열 비활성화 FBS.</li>
	<li>90-100%의 합류를 도달할 때까지 복제를 셀 수 있습니다. 메 마른 조직 문화 흐름 후드를 사용 하 여 살 균 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x의 10 mL로 플라스 크 및 세척 세포에서 미디어 발음.</li>
	<li>PBS를 발음 하 고 1x (0.05%)의 5 mL을 추가 트립 신-EDTA 셀 트립 신에 의해 보호 됩니다 확인 하 고 플라스 크에. 모든 세포는 플라스 크 (약 5-10 분)의 하단에서 분리 될 때까지 37 ° C, 5% CO2, 그리고 95% 습도 유지 실험실 인큐베이터에 플라스 크를 배치 합니다.</li>
	<li>트립 신-EDTA를 비활성화 하려면 플라스 크를 미리 데워 진된 성장 매체의 10 mL를 추가 합니다.</li>
</ol>2. 스크래치 시험
<ol><li>다음 단계 1.4, 씨 48 h 합류 점 100%를 달성 하는 24-잘 접시로 셀의 적절 한 수 있습니다. 참고: 그것은 다양 한 다른 접시 레이아웃 스크래치 시험을 수행할 수입니다. 웰 스 상처 메이커 도구에 의해 허용의 최대 수는 96-잘 형식입니다.</li>
	<li>다음날 (전날 스크래치 분석 결과), 페 놀 레드 무료 미디어를 필요에 따라 보충 열 비활성화, 숯불 dextran 박탈 FBS를 포함 하 여 미디어를 변경 합니다. 참고: 다른 연구는 낮은 농도 FBS (예를 들어, 1%)와 미디어를 사용 하 여를 추천 했습니다. 하이 프로토콜11에 안으로 사용 될 수 있는 세포 증식을 최소화 합니다.</li>
	<li>스크래치 시험 당일 각 우물에서 미디어를 원하는 치료를 추가 하 여 30 분에 대 한 셀을 pretreat. 개요 실험 차량 (1 x PBS) 및 1 x PBS에 희석 100 nM dexamethasone 활용.</li>
	<li>
균일 한 상처를 만들 상처 메이커 도구의 핀에 살 균 10 µ L 피 펫 팁을 배치 합니다. 웰 스의 첫 번째 행에는 팁 낮은 고 피 펫 팁 우물의 반대편에 도달 될 때까지 상처 메이커의 트랙을 따라 격판덮개를 이동 합니다.
	<ol>
<li>우물의 직경에 걸쳐 상처 상수를 보장 하기 위해 접시의 바닥을 터치 지속적으로 피 펫 팁을 수 있도록 시작 위치로 다시 접시를 이동 합니다. 제거 및 살 균 10 µ L 피 펫 팁을 교체 하 고 우물의 다음 행에는 팁 낮은.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2.4 단계를 반복 하 여 모든 우물 긁힌. 참고: 상처 메이커 도구를 사용할 수 없는 경우 수동으로 10 µ L 피 펫 팁 우물의 센터를 된다고 하 여 상처를 만들 수 있습니다.</li>
	<li>미디어를 신중 하 게 발음 하 고 부드럽게 씻어 1 x PBS로 두 번 셀. 최종 세척 후 보충된 페 놀 레드 무료, 박탈 또는 원하는 치료 또는 차량 (으로 단계 2.3에서에서 지시 되는) 낮은 FBS 미디어를 추가 합니다. 참고: HTR-8/SVneo 세포로 분리 하려면 셀 1 x PBS로 세척 하면 보충 페 놀 레드 미디어, 세척 되어야 한다.</li>
	<li>시간 경과 영상 ( 재료의 표참조) 37 ° C, 5% CO2, 그리고 95% 습도 유지 실험실 인큐베이터에 보관 되어, 포함 하는 자동화에 긁힌된 웰 스 24-잘 접시를 놓습니다. 상처 치유 (예를 들어, 모든 2 h 72 h에 대 한) 완료를 셀 수 있도록 필요에 따라 일정 한 간격의 이미지 우물</li>
	<li>자동, 시간 경과 영상와 관련 된 소프트웨어에 의해 상처 밀도 너비를 계산 ( 재료의 표참조). 시작 상처의 크기에 비해 상처 크기의 백분율 변화를 계산 하려면 설정 상처 폭 시간 0에서 100%. 시간 0에 상처 크기에 의해 각 후속 timepoint에 상처 크기를 분할 하 고 백분율 (그림 1)를 100을 곱하십시오.</li>
</ol>3. 침입 분석 결과
<ol><li>다음 단계 1.4, 시드 유지 셀 37 ° C, 5% CO2, 그리고 95% 습도 설정 실험실 인큐베이터에 48 h. 합류 점 90%에 도달 하는 셀 수 있도록 6 잘 플레이트에 셀의 적절 한 수.</li>
	<li>다음 날, 페 놀 레드 무료 미디어를 필요에 따라 보충 열 비활성화, 숯불 dextran 박탈 FBS를 포함 하 여 미디어를 변경 합니다. 참고: 세포 실험 설계에 따라이 이번에 pretreated 될 수 있습니다.</li>
	<li>이 시점에서 장소 10 mg/mL 세포 외 매트릭스의 유리병 ( 재료의 표참조)에 얼음 하 고 하룻밤 냉장고에서 해 동.</li>
	<li>다음 날, 24-잘 접시를 배치 하 여 미리 멋진 침공 분석 결과 제공, 세포 배양, microcentrifuge 튜브, 그리고 피 펫 팁에에서 삽입 세포 외 매트릭스를 사용 하기 전에 적어도 2 시간 동안 냉장고 (4 ° C).</li>
	<li>조직 문화 후드에 냉장된 장치를 사용 하 여, 10 mg/mL 기질 5 mg/mL의 최종 농도에 페 놀 레드 무료, 혈 청 무료 미디어와 1:1 희석. 참고: 항상 주식 및 얼음에 희석된 기질 유지. 미디어 세포 외 매트릭스의 비율 분석 결과에 사용 되는 셀 라인의 속성에 따라 조정할 수 있습니다.</li>
	<li>조직 문화 후드에 냉장된 장치를 사용 하 여, 24-잘 접시에 배치 된 삽입 ( 재료의 표참조)를 희석된 세포 외 매트릭스의 100 μ를 추가 합니다. 매트릭스는 어떤 거품 없이 다는 것을 확인 하십시오. 장소 매트릭스 코팅 24-잘 접시를 포함 하는 매트릭스를 확정할 수 있도록 37 ° c 배양 기에 삽입 합니다.</li>
	<li>침공 분석 결과 대 한 셀을 준비 하 1 x PBS의 1 mL로 세포 세척, PBS, 발음 하 고 추가 1 x 트립 신-EDTA의 500 µ L 각 잘. 모든 세포는 접시의 바닥에서 분리 될 때까지 37 ° C, 5% CO2, 그리고 95% 습도 유지 실험실 인큐베이터에 6-잘 접시를 놓습니다.</li>
	<li>셀을 분리 했으면 일단 trypsinized 셀의 각 음에 페 놀 레드 무료, 혈 청 무료 미디어의 500 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>Microcentrifuge 튜브 및 4 ° c.에 400 x g 에 5 분 동안 다운 스핀 분리 된 세포의 1000 µ L를 전송</li>
	<li>미디어를 발음 하 고 페 놀 레드 무료, 혈 청 무료 미디어에서 셀 resuspend (볼륨은 세포의 농도에 따라 달라 집니다). 자동화 된 셀을 사용 하 여 계산 셀 ( 재료의 표참조) 카운터 고 mL 당 5 x 105 셀의 최종 농도 대 한 셀 서 스 펜 션의 볼륨 조절. 참고: Hemocytometer 및 현미경 셀도 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>침공 분석 결과 대 한 사용 될 24-잘 접시의 우물에 완전 한 성장 매체의 600 μ를 추가 합니다. 참고: 추가 chemoattractants 또는 치료 잘 (더 낮은 약 실)에 완전 한 성장 매체에 추가할 수 있습니다. 개요 실험 차량 (1 x PBS) 또는 더 낮은 약 실에 1 x PBS에 희석 100 nM dexamethasone 추가.</li>
	<li>장소 미리 코팅된 침공 분석 결과 대 한 사용 될 완전 한 성장 매체를 포함 하는 각 음에 삽입 합니다. 200 μ 1 x 105 셀의 총에 대 한 각 미리 코팅된 셀 삽입 (상단 챔버) 위에 셀을 추가 합니다. 참고: 이 분석 결과 대 한 부정적인 컨트롤로, 상부 챔버에 (셀) 없이 페 놀 레드 무료, 혈 청 무료 미디어의 동일한 볼륨을 추가할 수 있습니다.</li>
	<li>37 ° C, 5% CO2, 그리고 24 h에 대 한 95% 습도 유지 실험실 인큐베이터에서 24-잘 접시를 놓습니다. 참고: 24 시간 잠복기는 불멸 하 게 첫 임신 trophoblast 셀 최적화 되어 있으며 추가 테스트 해야 할 수 있습니다 다른 셀 라인에서 필요한 잠복기를 결정.</li>
	<li>야간 보육, 다음 세포 외 매트릭스를 방해 하지 않고 위와 더 낮은 약 실에서 나머지 미디어를 흡입. 다음, 조심 스럽게 제거 기질 및 비-침략 세포 기질을 제거 하는 데 필요한 횟수 만큼 보라고 면봉으로 삽입의 상단 부분에서.</li>
	<li>워시 각 3 x 1 x PBS, 우물의 위쪽과 아래쪽 챔버에 PBS를 추가 삽입. 각 세척 후 PBS를 발음.</li>
	<li>4 ° c.에 30 분 동안 100% 얼음 메탄올에 삽입을 배치 하 여 삽입에 연결 된 셀을 수정 최종 세척 후 세척 PBS와 제거 PBS x 1 3 x를 삽입 합니다. 20% 에탄올에 0.2% 크리스탈 바이올렛과 10 분 동안 삽입에 연결 된 셀을 얼룩.</li>
	<li>이온을 제거 된 물으로 배를 씻어 하 고 최종 세척 후 이온된 수를 발음.</li>
	<li>실 온에서 1 h 공기 건조를 삽입 합니다. 집게와 면도날 사용 하, 주의 깊게 잘라 삽입의 하단 막 하 고 하단 면이 유리 슬라이드에 탑재. 설치 미디어 실 온에서 건조를 허용 합니다.</li>
	<li>20 x 목표는 가벼운 현미경을 사용 하 여 샘플 당 침공된 셀의 적어도 4 독특한 이미지를 얻을. 각 이미지에는 셀의 총 수를 계산 하 고 샘플을 제어 하 고 데이터 (그림 2)는 셀의 수를 정상화.</li>
</ol>4. 확산 분석 결과
<ol><li>다음 단계 1.4, 자동된 셀 카운터를 사용 하 여 플라스 크에서 trypsinized 셀 및 씨앗으로 잘 표준 성장 매체에 당 2 × 105 셀의 밀도에서 6 잘 플레이트.</li>
	<li>37 ° C, 5% CO2및 4 h 또는 셀은 준수까지 95% 습도 유지 실험실 인큐베이터에 셀을 배치 합니다.</li>
	<li>페 놀 레드를 변경 미디어 무료 미디어 열 비활성화, 숯불 dextran 박탈 FBS를 포함 하 여 필요에 따라 보충 하 고 원하는 치료를 추가 합니다. 개요 실험 추가 차량 (1 x PBS) 또는 100 nM dexamethasone 1 x PBS에 희석. 37 ° C, 5% CO2, 그리고 95% 습도 유지 실험실 인큐베이터에 6-잘 접시를 놓습니다.</li>
	<li>미디어를 제거 하 고 새로운 미디어와 치료 모든 48 h을 바꿉니다.</li>
	<li>24, 48 또는 72 h 치료, 후 1 x PBS의 1 mL로 세포 세척 하 고 각 우물에 트립 신-EDTA의 500 µ L를 추가 합니다. 인큐베이터에 두고 6 잘 플레이트 세포 격판덮개에서 분리 했으면 때까지.</li>
	<li>세포는 접시에서 분리 된, 일단 trypsin 비활성화 보충된 페 놀 레드 무료 미디어의 500 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>별도 튜브에서 Trypan 파랑의 5 µ L을 trypsinized 셀의 5 µ L을 추가 하 고 pipetting으로 혼합.</li>
	<li>자동된 셀 카운터를 사용 하 여 중복에서 각 우물에서 셀을 계산 합니다.</li>
	<li>(그림 3) 시간의 기능으로 각 시간 포인트와 플롯에 잘 당 셀의 수를 평균.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

이 절차는 마이그레이션 및 침략의 사용 trophoblast 셀 운동 측정된 차이에 잠재적인 참가자로 셀 확산의 속도 포함 분석 실험 바탕. 함께 사용이 생체 외 분석 실험은 trophoblast 마이그레이션 조절 세포 경로 식별 하기 위해 사용할 수 있는 간단 하 고 효과적인 방법입니다. 위에서 설명한 대로 호르몬, cytokines, 성장 인자, 또는 다른 분자 trophoblast 운동에 미치는 영향을 확인 하려면 trophoblast 세포를 치료할 수 있습니다. 또는 대상 단백질 trophoblast 운동에 그들의 기능적인 역할을 명료 하 게 하는 세포에서 고갈 될 수 있습니다. Trophoblast 마이그레이션 키 변조기를 식별 하는 것은 임신의 기본 합병증 placental 결함, 자간 전 증, 조산, 자궁내 성장 금지 등와 관련 된 기본 메커니즘의 더 나은 이해를 제공할 수 있습니다.
정확한 결과 얻을 하는 데 필요한이 프로토콜에 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. ...

Placental 발달은 임신, 산 모와 태아 모두 건강에 영향을 미치는의 설립에 중요 한 단계 이다. 그러나, 기계적으로이 프로세스는 발생 합니다 완전히 이해 하지는. 셀 마이그레이션 임신 중의 태 반 기능과 설립에 기여 하는 중요 한 생물 학적 과정 이다. Blastocyst 주입, 다음은 trophectoderm villous trophoblasts 융 villi의 표면을 커버 하 고 가스 및 영양소 교환에 관련 된, 그리고는 villi에서 마이그레이션할 extravillous trophoblasts (EVTs)으로 차별화 그리고 침략 모성 decidua 및 맥 관 구조1. EVTs의 마이그레이션 모성 나선형 동맥을 개장 하 고 태아 성장2를 지 원하는 uteroplacental 순환 설정에 대 한 필수적입니다. 임신 중 부족 trophoblast 침공 비정상적인 태 반 개발 결과 자간 전 증, 임 신성 고혈압, 자 궁 내 성장 제한, 조산3, 등 임신 합병증에 기여할 수 있습니다. 4. 따라서, trophoblast 운동에 영향을 주는 요소를 이해 정상적인 placentation에 필요한 경로 결정 하는 것이 필수적입니다.
Trophoblast 마이그레이션 신호 분자, 성장 인자, cytokines, 호르몬, 신생 요인5등의 복잡 한 네트워크에 의해 제어 됩니다. Vivo에서 태 반 연구의 제한으로 인해 활용 생체 외 분석 실험 불후 인간의 trophoblast 셀 라인 trophoblast 운동에 기여 하는 요소를 식별 하는 중요 한 되었습니다. 스크래치 및 침입 분석 양적 trophoblast 셀 마이그레이션6,,78에 개별 분자의 역할을 평가 하기 위해 광범위 하 게 사용 되었습니다. 그러나, 어떻게 변화 마이그레이션에 의해 발생할 수 있습니다 변경 셀 침입에 조사에 유용한,이 두 개의 분석 셀 마이그레이션 변경 된 요금에 기여할 수 있는 추가적인 메커니즘에 대 한 계정을 하지 않습니다. 예를 들어 마이그레이션할 수 적은 세포 세포 확산의 속도를 감소 발생할 수 있습니다.
여기, trophoblast 마이그레이션 스크래치, 세포 증식, 세포 침입 분석 실험을 사용 하 여 평가 하기 위한 정량 생체 외에서 방법을 설명 합니다. 스크래치 분석 결과에서 균일 한 상처 셀 단층에서 만들어지고 격차를 채우기 위해 셀의 마이그레이션 자동화, 시간 경과 상처 크기의 영상과 상처 내의 세포의 조밀도 의해 측정 된다. 셀 확산 분석 결과 셀의 알려진된 시작 수량에 비해 각 시간 지점에서 세포의 비율을 계산 기준으로 합니다. 셀 침공 분석 결과, 세포는 세포 외 매트릭스 코팅 셀 문화 삽입 챔버 (예: Transwell), 위에 시드 그리고 항 암 치료-유인에 기질을 통해 침입 하는 셀의 수 계산 됩니다.
스크래치 분석 결과 어떻게 다른 환경 조건을 결정 하는 데 사용할 수 있는 간단 하 고 효과적인 도구 셀 마이그레이션에 영향을 미칠 것 이다. 침공과 확산 분석 실험 이후에 세포 확산과 침입 셀 마이그레이션에 전반적인 변화에의 기여를 확인 하려면 사용할 수 있습니다. 샨 다, 이러한 분석 셀 운동에 기여할 수 있는 생물 학적 프로세스의 강력한 측정을 제공 합니다. 2 개의 불멸 하 게 첫 임신 trophoblast 셀 라인 HTR-8/SVneo9,10, Swan.71 (Sw.71) 기술된 분석에서 사용 되었다. 그러나, 이러한 분석 셀 이동과 침략의 주요 변조기를 식별 하기 위해 다른 셀 형식에 사용 하기 위해 최적화 또한 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>0.4% 트리판 블루 염색</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>0.5% 트립신-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>1.0 M HEPES</td><td>AmericanBio</td><td>AB06021-00100</td><td></td></tr><tr><td>10 mM MEM 비필수 아미노산</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>100 mM 피루브산 나트륨</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>24웰 플레이트 트랜스웰 인서트</td><td>Corning</td><td>3422</td>에는 <td>8 &mu의 폴리카보네이트 필터가 포함되어 있습니다. m 기공 크기</td></tr><tr><td>숯 덱스트란 박리 FBS</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-119</td><td></td></tr><tr><td>Countess II 자동 세포 계수기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>크리스탈 바이올렛</td><td>시그마 Aldrich</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>8310-4</td><td></td></tr><tr><td>덱사메타손(Dex; 1, 4-pregnadien-9&alpha;-fluoro-16&alpha;-methyl-11&beta;, 17, 21-triol-3, 20-dione; &ge; 98% TLC)</td><td>스테랄로이드</td><td>P0500-000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/햄' s F12</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>시그마 Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte 24웰 ImageLock 플레이트</td><td>Essen BioScience</td><td>4365</td><td>IncuCyte Zoom 이미징 시스템을 사용하는 경우 세포를 IncuCyte ImageLock 플레이트에 시드합니다. 이 플레이트는 플레이트 바닥에 표준 마커가 있어 일정한 시야에서 반복 이미징을 위한 참조로 사용됩니다.</td></tr><tr><td>IncuCyte 소프트웨어</td>, <td>Essen BioScience</td><td>2010A Rev2</td><td></td></tr>, <tr><td>IncuCyte ZOOM 시스템</td><td>, Essen BioScience</td><td>N/A</td><td>스크래치 분석 이미지는 사전 설정 "를 사용하여 캡처 및 분석되었습니다. 긁힌 상처" IncuCyte ZOOM 시스템의 매개변수. 다른 타임 랩스 현미경도 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Matrigel Membrane Matrix</td><td>Becton Dickinson</td><td>356231</td><td>성장 인자 감소, 페놀-레드 프리</td></tr><tr><td>Micro Slides</td><td>VWR International, LLC</td><td>48311-7003</td><td></td></tr><tr><td>현미경 커버 유리</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-E</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX71 도립 현미경</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>페니실린(10,000 units/mL)/스트렙토마이신(10,000 &마이크로; g/mL)</td><td>Life Technologies</td><td>151-40-122</td><td></td></tr><tr><td>페놀-레드 프리 DMEM/Ham's F12</td><td>Life Technologies</td><td>11039-021</td><td></td></tr><tr><td>반자동 상처 메이커 도구</td><td>Essen BioScience</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

마이그레이션, 침공, 불멸 하 게 인간의 첫 번째 임신 trophoblast 셀 라인의 확산을 평가를 생체 외 분석 실험에서

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

셀 운동은 placental 개발 및 임신 초기 동안 trophoblasts의 중요 한 속성 이다. 적절 한 trophoblast 마이그레이션 및 침략의 중요성 모성 맥 관 구조의 부적당 한 trophoblast 침공과 관련 된 사전 eclampsia 및 자궁내 성장 제한 같은 임신 장애에 의해 증명 됩니다. 불행히도, 메커니즘의 우리의 이해는 태에서 마이그레이션 개발 trophoblasts 제한 됩니다. 스크래치 분석 결과 통해 셀 이동의 생체 외 분석 trophoblast 철새 용량을 조절 하는 요소 식별에 유용한 도구입니다. 그러나, 혼자이 분석 결과 변경 된 셀 이동에서 발생할 수 있는 세포 변화를 정의 하지 않습니다. 이 프로토콜 설명 trophoblast 셀 운동 평가를 공동으로 사용 되는 세 가지 다른 생체 외 분석 실험: 스크래치 분석 결과, 침공 분석 결과 및 확산 분석 결과. 여기에 설명 된 프로토콜 계량 셀 운동 자극에 대 한 응답에서을 다른 셀 라인에 사용 하기 위해 수정할 수 있습니다. 이 메서드는 셀 운동에 기여 하 고 기본 셀 마이그레이션에 명백한 변경 잠재적인 메커니즘의 철저 한 검사를 제공 하는 개별 요소 식별에 조사 수 있습니다.

불멸 하 게 인간의 첫 번째 임신 trophoblast 셀 라인 Sw.71 및 HTR-8/SVneo trophoblast 셀 마이그레이션12스테로이드 제제의 역할을 결정 하기 위해이 실험에 사용 되었다. 그들은 최근에 보였다 trophoblast 기능 변경 대체 치료 사용된12수 있지만 스테로이드 제제가이 실험에 사용 했다. 두 셀 라인 차량 (1 x PBS) 또는 100로 치료 했다 모든 실험에 대 한 합성 glucocorticoid dexamethasone (덱 스)의 nM. 상처 밀도 크기는 자동화 된, 시간 경과 이미징 시스템을 사용 하 여 72 h에 대 한 모든 2 h를 측정 했다. 그림 1 에 이미지와 다른 timepoints에서 스크래치 분석 결과에서 얻은 결과의 예가 나와 있습니다. 두 치료에 대 한 0, 8, 및 18...

여기, 우리는 3 개의 생체 외 분석 실험을 사용 하 여 인간의 trophoblast 셀에 셀 운동 평가 위한 매우 액세스할 수 있는 프로토콜 제시: 스크래치 분석 결과, transwell 침략 분석 결과 및 세포 확산 분석 실험.

마이그레이션, 침공, 불멸 하 게 인간의 첫 번째 임신 Trophoblast 셀 라인의 확산을 평가를 생체 외 분석 실험에서

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

이러한 방법은 주요 불리 한 산부인과 결과에 대 한 통찰력을 제공할 수 있는 trophoblast 침략에 영향을 미치는 요인을 결정 하기 위해 활용 될 수 있습니다. 이 기술의 장점은 증식 및 마이그레이션을 포함한 트로포블라스트 침공에 영향을 미칠 수 있는 여러 요인에 대한 시각적 및 정량적 분석을 제공한다는 것입니다. 스크래치 분석서를 시작하려면 적절한 수의 세포를 24웰 플레이트로 시드하여 48시간 만에 100%의 인플루엔기를 달성합니다.다음 날, 열을 비활성화 탄 dextran 박탈 FBS로 보충 페놀 레드 무료 미디어로 미디어를 변경합니다. 스크래치 당일, 각 우물의 미디어에 원하는 치료를 추가하여 30 분 동안 세포를 퇴각시하십시오. 균일한 상처를 만들려면 멸균 10 마이크로리터 파이펫 팁을 상처 제조자 도구의 핀에 놓습니다.팁을 우물의 첫 번째 행으로 낮추고 파이펫 팁이 우물의 반대편에 도달 할 때까지 상처 메이커의 트랙을 따라 접시를 이동합니다. 그런 다음 플레이트를 다시 시작 위치로 이동하여 우물의 직경에 걸쳐 일정한 상처를 보장합니다. 팁을 다음 우물행으로 낮추고 모든 우물이 긁히때까지 반복합니다.스크래치가 현미경으로 플레이트를 관찰하여 우물의 폭을 커버하는지 확인합니다. 다음으로, 조심스럽게 미디어를 흡인하고 부드럽게 두 번 1x PBS로 세포를 씻어. 마지막 세척 후, 원하는 치료와 보충 페놀 레드 프리 스트립 또는 낮은 FBS 미디어를 추가합니다.다음으로, 긁힌 우물이 있는 접시를 섭씨 37도, 습도 가 95%의 습도 대기시 이산화탄소 5%가 들어 있는 인큐베이터에 보관된 자동 타임랩스 이미저에 놓습니다. 세포가 상처 치유를 완료할 수 있도록 필요에 따라 정기적으로 세포를 이미지합니다. 침략 분석서를 시작하려면 적절한 수의 세포를 섭씨 37도, 습도 가95%의 습도 대기에서 5%의 이산화탄소를 유지하는 인큐베이터에서 적절한 수의 세포를 6웰 플레이트로 시드합니다.세포가 48시간 안에 90%의 합류에 도달할 수 있도록 합니다. 다음 날, 열을 비활성화 탄 dextran 박탈 FBS로 보충 페놀 레드 무료 미디어로 미디어를 변경합니다. 얼음에 냉장고에 밀리리터 세포 외 매트릭스 당 10 밀리그램의 유리병을 배치하고 하룻밤 해동하자.다음 날, 차가운 파이펫 팁을 사용하여 페놀 레드 프리 세럼 프리 미디어와 세포외 매트릭스의 밀리리터 당 10 밀리그램을 희석하여 밀리리터당 5밀리그램의 최종 농도로 희석합니다. 그런 다음 희석된 세포외 매트릭스의 100 밀리리터를 차가운 24웰 플레이트에 넣은 차가운 인서츠에 추가합니다. 매트릭스가 경화 할 수 있도록 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다.침략 분석에 대한 세포를 준비하려면 1 x PBS의 1 밀리리터로 세포를 씻으하십시오. 그런 다음 PBS를 흡인하고 각 우물에 1x 트립신 EDTA의 500 마이크로 리터를 추가합니다. 모든 세포가 플레이트 바닥에서 분리 될 때까지 섭씨 37도 의 온도와 5 %의 습도 대기를 유지하는 인큐베이터에 6 웰 플레이트를 놓습니다.세포가 분리되면, 트립시네이드 셀의 각 웰에 페놀 레드 프리 세럼 무료 매체의 500 마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 분리 된 세포의 1, 000 마이크로 리터를 미세 원심 분리기 튜브로 옮기고 섭씨 400 회에서 5 분 동안 회전합니다. 다음으로, 미디어를 흡인하고 페놀 레드 프리 세럼 프리 미디어에서 세포를 재분리한다.자동 세포 카운터를 사용하여 세포를 계산하고 밀리리터 당 0.5 백만 세포의 최종 농도에 대한 세포 현탁액의 볼륨을 조정합니다. 전체 성장 매체의 600 마이크로리터를 24웰 플레이트의 각 웰에 추가하고 미리 코팅된 인서트를 넣습니다. 그런 다음 총 010만 개의 세포에 대해 미리 코팅된 각 세포 인서치 위에 200마이크로리터의 셀을 추가합니다.섭씨 37도, 이산화탄소 5%를 24시간 동안 95% 습도 대기에 보관하는 인큐베이터에 24웰 플레이트를 배치합니다. 하룻밤 잠복 에 이어, 세포 외 매트릭스를 방해하지 않고 상부 및 하부 챔버에서 나머지 미디어를 흡입. 그런 다음 면봉을 가진 인서트 의 상부에서 세포외 매트릭스및 비침범된 세포를 조심스럽게 제거합니다.웰의 상부 및 하부 챔버에 1x PBS를 추가하여 각 삽입을 세 번 세척합니다. 세척 할 때마다 PBS를 흡인하십시오. 인서트에 부착된 세포를 고정하려면 인서트를 섭씨 4도에서 100%의 얼음 차가운 메탄올에 넣고 30분간 놓습니다.1x PBS로 세 번 인서트를 세척하고 최종 세척 후 PBS를 제거합니다. 10 분 동안 20 %의 에탄올에 0.2 %의 크리스탈 바이올렛으로 삽입에 부착 된 세포를 얼룩. 탈이온된 물로 세 번 헹구고 최종 세척 후 탈화물 이온수를 흡수합니다.실온에서 1시간 동안 공기 건조 인서트. 마지막으로 집게와 면도날을 사용하여 인서트의 하단 멤브레인을 조심스럽게 잘라 하단면이 위로 향하는 유리 슬라이드에 장착하십시오. 20X 목표를 가진 광 현미경을 사용하여, 샘플 당 침략 된 세포의 적어도 네 개의 고유 한 이미지를 얻을.증식 분석서를 시작하려면 자동화된 셀 카운터를 사용하여 플라스크에서 트립시화된 셀을 계산합니다. 종자 세포는 표준 성장 매체에서 우물 당 0.2 백만 세포의 밀도로 6 웰 플레이트로 종자 세포. 그런 다음 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%를 4시간 동안 또는 세포가 부착할 때까지 95%의 습도 대기에 보관합니다.다음으로, 열을 비활성화 한 숯 dextran 박탈 FBS와 원하는 치료로 보충 페놀 레드 프리 미디어로 미디어를 변경합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%를 유지하며 습도가 95%에 달하는 인큐베이터에 6웰 플레이트를 배치합니다. 그런 다음 미디어를 48시간마다 원하는 치료로 보충한 신선한 매체로 대체합니다.24, 48, 또는 72 시간 치료 후, 1 x PBS의 1 밀리리터로 세포를 세척하고 각 우물에 트립신 EDTA의 500 마이크로 리터를 추가합니다. 세포가 플레이트에서 분리 될 때까지 인큐베이터에 6 웰 플레이트를 놓습니다. 세포가 접시에서 분리되면 트립신을 비활성화하기 위해 보충 페놀 레드 프리 미디어의 500 마이크로 리터를 추가합니다.마지막으로 트립시닉 된 세포의 5 마이크로 리터를 별도의 튜브에 Trypan Blue의 5 마이크로 리터에 추가하고 파이펫팅으로 혼합하십시오. 자동화된 셀 카운터를 사용하여 각 웰의 셀을 복제하여 계산합니다. 불멸의 인간 최초의 삼보격 트로포블라스트 백조.71세포는 스크래치 분석에서 합성 글루코코르티코이드 덱사메타손의 차량 1x PBS 또는 100 마이크로몰로 0, 8, 18시간 동안 처리되었다. 백조의 상처 크기와 상처 밀도의 측정. 71 및 HTR-8/SVneo 세포는 차량 또는 100 나노몰러 덱스로 치료되어 덱스 처리가 글루코코르티코이드가 세포 이동을 저해할 수 있음을 나타내는 상처 폐쇄 속도를 감소시키는 것으로 나타났다.침략 분석 에 이어, 글루코코르티코이드 치료는 침략된 백조의 수에 있는 15% 감소에 의해 도시된 바와 같이 세포 침략을 감소시다. 71 및 HTR-8/SVneo 세포는 차량으로 처리된 세포에 비해 24시간 동안 100 나노몰러 덱스로 처리하였다. 세포 증식 분석에 따라, 글루코코르티코이드 치료는 적은 백조에 의해 표시된 대로 세포 증식을 감소시켰다.71 및 HTR-8/SVneo 세포는 차량으로 처리된 세포에 비해 100 나노몰러 덱스로 처리하였다. 세포 사멸을 평가하는 방법은 세포 사멸 또는 괴사 변경 된 trophoblast 기능에 기여 여부를 결정하기 위해이 절차와 함께 사용할 수 있습니다. 우리는 트로프토블라스트 기능 연구를 위해 암 생물학에서 일상적으로 사용되는 표준 기술의 사용을 독특하게 채택했습니다.이러한 방법과 관련된 위험은 없습니다. 시청자가 취해야 할 유일한 예방 조치는 조직 배양을 위해 멸균 기술을 사용하는 것입니다.

in-vitro-assays-to-evaluate-migration-invasion-proliferation

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 프로토콜에서는, 우리는 Percoll 기울기를 사용하여 trophoblast 세포의 분리에 이어 임신 d10.5에 마우스에서 placentae의 절개를 설명합니다. 우리는 matrigel의 침공 분석에서 분리 된 세포의 사용을 보여줍니다.

기본 마우스 Trophoblast 셀 및 Trophoblast의 침략 분석의 절연

전통적인 2 차원 세포 배양 기술은 종종 차별화 마커, 크린 시토킨 및 성장 요인과 관련하여 변경된 특성의 결과. extravillous trophoblast 세포 라인과 함께 그림과 같이 회전 세포 배양 시스템의 세 가지 차원 세포 배양 (RCCS)는 이러한 요소 중 많은 표현 reestablishes.

인간 세포 배양을위한 회전 세포 배양 시스템 : 모델로 인간 Trophoblast 셀

일반적으로 사용되는 체외에서 세포의 이동 및 침윤을 조사하기위한 고도의 접근 방법이 설명되어 있습니다. 첫 번째 방법은 세포 운동성을 측정하는 세포 상처 폐쇄 분석이다. 두 번째 방법은 화성과 세포의 침략적인 능력을 평가하는 트랜스 웰 마이그레이션 및 침입 분석이다.

체외 세포 이동 및 내습 분석 실험에서

이 프로토콜은 효과적으로 격리 갓 인간 융모 cytotrophoblasts에 siRNA를 형질 감염 microporation을 사용하여 이들 세포의 DNA 단백질 복합체를 식별하는 방법을 설명한다. 형질 감염된 세포는 웨스턴 블롯에 의해 모니터링 될 수 있고, EMSA는 4 일간의 배양 기간 동안 분석한다.

갓 고립 된 인간의 산모 Cytotrophoblasts에 siRNA를 형질 및 EMSA 분석

이 원고는 저산소증/재산소화 하에서 배양된 면역정제된 인간 융모 세포영양아세포 세포의 독특한 체외 모델을 제시합니다. 이 모델은 멜라토닌과 같은 유망한 치료법이 산화 스트레스 증가 및 태반 기능 변화와 관련된 임신 합병증에 대한 보호 효과를 연구하는 데 적합합니다.

인간의 기본 영양막 세포 멜라토닌에 대해 저산소증의 보호 효과를 연구하기 위해 세포 배양 모델 / 재산 소화에 의한 혼란

여기에서는 Tfap2c, Gata3, Eomes 및 Ets2의 10일 과발현을 통해 쥐 배아 섬유아세포를 완전한 기능을 갖춘 안정적인 영양막아세포 줄기세포로 직접 전환하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

영양막 줄기 세포로 쥐 배아 섬유 아세포의 직접적인 변환을위한 프로토콜

여기에서는 뼈 형태 생성 단백질 4 및 Activin/Nodal 경로의 억제제를 사용하여 인간 만능 줄기 세포에서 인간 융막 세포를 효율적으로 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 인간 만능 줄기 세포의 효율적인 분화에 적합하며 유전자 조작을 위해 많은 양의 세포를 생성할 수 있습니다.

인간 다 능성의 체외 분화에서 융모 세포로 줄기 세포

여기에 제시 된 인간 placental villous 조직의 기본 세포 배양에 대 한 cytotrophoblasts의 격리 다음 샘플링에 대 한 프로토콜이입니다. TNFα와 trophoblasts의 치료 비만 자궁내 환경에 염증이 분자 대상 산 모 비만과 염증 반응과에 의해 규제의 발견을 촉진 한다.

태에서 Autophagy의 규제에 모성 비만과 관련 된 염증의 효과 연구 하는 기본 인간 Trophoblast 모델

여기에서, 우리는 시험관내 이식 기간을 통해 그(것)들을 배양하고, 단 하나 세포로 소화하고 추가 조사를 위한 초기 trophoblast 세포를 수집하는 유리한 인간 blastocysts를 온난화하는 방법을 기술합니다.

페리 이식 단계 인간 배아에서 트로포 블라스트 세포의 단일 세포 수집

현재 프로토콜은 영양막 세포와 같은 세포가 세포외 기저막 매트릭스 층에 걸쳐 모세관 같은 구조로 조직되는 고전적인 체외 혈관 형성 분석에서 형성된 튜브와 같은 구조를 복구할 수 있도록 합니다. 회수된 구조는 다양한 생화학 분석을 위한 RNA 및 단백질 분리에 사용됩니다.

분화 마커 발현 분석을 위한 Angiogenesis-Tube Formation Assay에서 영양막 세포 회수

이 프로토콜은 인간 기저 배반의 소추모 및 융모막에서 1차 HLA-G+ 외 영양층(EVT)의 정제, 특성 분석 및 배양을 가능하게 합니다. 1차 EVT 배양은 96시간 동안 생존 가능성을 유지하여, 샘플이 일치한 모체 면역세포와의 공동 배양과 이들의 상호작용에 대한 유동 세포 및 분자 분석을 가능하게 합니다.

표현형 및 기능 분석을 위한 HLA-G+ 외 영양층 정제 인간 임기 태반 조직에서

배우세요 인간 초기 임신 트로포블라스트 세포의 이동, 침입, 증식을 평가하는 생체 외 분석법을 통해 산과학적 결과에 영향을 미치는 요인을 시각적·정량적으로 분석하는 방법을 익히세요.

마이그레이션, 침공, 불멸 하 게 인간의 첫 번째 임신 Trophoblast 셀 라인의 확산을 평가를 생체 외 분석 실험에서

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