Name: 자동화된 미생물체 시스템을 사용하여 중국 햄스터 난소 세포의 단일 클론 항체의 정화 및 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: 배우세요 자동화된 미생물체 시스템을 사용하여 중국 햄스터 난소 세포에서 단일 클론 항체를 정화하고 N-글리칸 프로파일링 및 전하 변이체 분석을 수행하는 방법. 이 프로토콜은 제한된 샘플 볼륨에서 항체의 중요한 품질 속성을 효율적으로 분석하여 바이오프로세싱 연구에 활용합니다.

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저자는 그가 제공 한 분석 지원에 대한 스콧 루테에게 감사드립니다. 이 작업에 대한 부분적인 내부 자금 지원 및 지원은 CDER 중요 경로 프로그램(CA #1-13)에 의해 제공됩니다. 이 프로젝트는 오크 리지 과학 교육 연구소가 관리하는 미국 식품 의약국(FDA)의 생명 공학 제품 사무소에서 인턴십/연구 참여 프로그램을 통해 부분적으로 지원됩니다. 미국 에너지부와 FDA 간의 기관 간 계약을 체결할 수 있습니다.

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이 출판물은 저자의 견해를 반영하며 FDA의 견해 또는 정책을 나타내는 것으로 해석되어서는 안됩니다.

HCCF에는 비용이 많이 드는 계측을 막고 파괴할 수 있는 이물질과 큰 입자가 포함되어 있으므로 추가 다운스트림 처리 전에 배양 설명이 필요합니다. 원심분리는 일반적으로 여과 에 이어 단백질에서 세포 및 기타 불용성 입자를 분리하는 첫 번째 접근법입니다. 이러한 여과된 HCCF는 정제를 위해 빠른 단백질 액상 크로마토그래피(FPLC)를 실시합니다. 제품을 얻기 위해 자동화 된 미생물 반응기에서 HCCF의 정제는 다운 스트림 처리에 중요한 단계입니다. 여기서, 단백질 A 컬럼을 가진 벤치탑 FPLC 시스템은 HCCF로부터 단일클론 항체를 얻기 위해 사용된다. 업스트림 프로세스에 대한 분석은 세포 거동에 대한 유용한 통찰력을 제공하고 생물 공정 설계를 안내하여 일관되고 신뢰할 수 있는 품질의 제품을 얻을 수 있도록 도와줍니다. 또한 분석을 통해 중요한 품질 특성(CQA)을 업스트림 및 다운스트림 프로세스에 연결할 수 있습니다. 여기에서 제시된 단클론 항체의 특성화에서 일반적으로 이용되는 4개의 비약은. 이러한 기술은 부분적으로만 정제되고 DNA 및 HCP의 잔류 수준을 포함할 수 있는 다양한 업스트림 소스의 공정 및 제품 분석을 위해 강력하고 신뢰할 수 있으며 쉽게 배포할 수 있습니다.
분석을 위해 샘플을 청소할 때 는 생물 반응기의 가변성을 유지하면서 분석을 위해 충분히 깨끗한 샘플을 만드는 것 사이에 중요한 균형을 맞추어야 합니다. 제품에 영향을 미치는 두 가지 가장 일반적인 오염 물질은 DNA와 HCP이며, 260/280 nm에서 비흡도를 측정하고 SDS-PAGE 또는 μCE-SDS를 통해 확인할 수 있습니다. 여기에서 제시된 검사는 DNA 내용의 낮은 수준에 과민하지 않습니다. 제품의 순도는 μCE-SDS에 의해 결정된 바와 같이 >95% 순수합니다.
미세 모세관 전기 영동 시스템을 이용한 전하 변이체 분석은 상대적으로 구현하기 쉬운 칩과 시약으로 전하 변종을 식별하는 높은 처리량 방법을 제공합니다. 기술의 본질과 라벨시약의 화학은 부형제 및 기타 1차 아민에 민감하므로 대부분의 시료 매트릭스에 대해 탈염 단계가 필요합니다. 경험에서, DNA의 낮은 수준은 라벨 링 반응에서 자유 염료와 함께 마이그레이션하고 결과의 품질에 영향을 미치지 않습니다. 기본, 주 및 산성 피크 정량화의 가변성은 전형적으로 <1%, DNA 및 기타 오염 물질의 상부는 분석의 가변성을 증가시킬 수 있습니다. 단백질 라벨링과 일치하고 병에서 제거하고 염료와 혼합 한 후 DMF를 신속하게 사용하는 것이 매우 중요합니다. Lysine 및/또는 히스티딘 표준 라벨링 컨트롤로 권장 됩니다. 시간이 지남에 따라 샘플 품질에 따라 칩은 미세 유체 채널에서 코팅을 파울하거나 잃어 더 큰 소음, 고스트 피크의 존재 및 샘플 간 변형을 더 많이 발생시킬 수 있습니다. 이러한 발생을 식별하기 위해 블랭크 및 시스템 적합성 표준(즉, NISTmAb)을 정기적으로 샘플과 동시에 분석했습니다. 칩 문제가 발생하면 칩을 저장 솔루션으로 세척하거나 교체할 수 있습니다.
치료용 당단백질의 글리칸 분석에 사용되는 방법은 주로 액체 크로마토그래피(LC) 및/또는 질량 분석법(MS)을 포함하며, 렉틴마이크로어레이 분석은 제3의 옵션25로 인기를 얻고 있습니다. 이 문서에서 설명하는 방법은 장점과 단점이 있는 LC와 MS를 모두 사용합니다. 질량 분광 방법은 형광 검출 출력 또는 렉틴 마이크로어레이를 사용하는 LC 기반 방법으로는 불가능한 분석된 글리칸의 질량 검증의 장점이 있다. 이 방법은 LC 및 형광 검출을 사용하여 dextran 사다리 표준에 대한 보존 시간 비교를 사용하여 글리칸 ID를 할당합니다. 형광 모니터링은 MS만으로는 올리고당의 이온화 효율이 좋지 않아 낮은 풍부도종을 정량화하지 못할 수 있는 검출의 용이성으로 인해 감도 및 정량화를 증가시킴을 허용합니다. MS의 대량 정보는 글리칸 ID를 확인하는 데 사용되지만 처리 소프트웨어는 대용량 정보를 기본 할당 기준으로 사용하지 않습니다. 따라서 재현 가능한 크로마토그래피와 쉽게 해결할 수 있는 피크가 없으면 이 방법은 글리칸 할당과 관련하여 어려움을 겪을 수 있습니다. 다행히도 질량 정보는 크로마토그래피가 하위인 상황에서도 재현 가능한 글리칸 할당을 방해하는 보존 시간의 변화와 같은 상황에서도 글리칸 할당에 도움이 될 수 있습니다. 이 방법을 MS 없이 사용하는 경우, 질량 정보를 사용하여 체류 시간 드리프트를 수정할 수 없기 때문에 크로마토그래피는 가장 높은 수준에 있어야 합니다.
여기서 설명된 아미노산 분석 방법은 조세포 배양 배지에서 과소화된 아미노산의 신속한 정량화를 위해 LC-MS를 활용한다. 대체 아미노산 분석 방법은 UV 검출26을가능하게 하는 아미노산 유도제를 필요로 한다. LC-MS 방법은 LC-UV 방법에 비해 중요한 이점을 제공합니다: 질량 특성화의 부족에 의해 제한되는 LC-UV 방법과 는 반대로 체류 시간 및 이온 질량을 모두 기반으로 식별할 수 있습니다. 더욱이, LC-MS 방법은 시간 및 재현성 이점을 제공하며, LC-UV 방법은 시료 가변성(27)을 부여할 수 있는 시간 소모적 유도반응을 필요로 한다. 그러나, LC-MS 방법에서 조세포 배양 배지의 주입은 이온 스키머 파울링으로 인한 MS 신호에 해로운 영향을 미칠 수 있다. 교정 사다리는 시스템 적합성 검사로 자주 주입되며, 데이터의 편향을 방지하기 위해 샘플 순서가 무작위화됩니다.
미생물을 이용한 항체 생산을 위한 세포 배양공정은 앞서 9. 이 연구에서는 제한된 샘플 볼륨에서 수집된 데이터를 최대화하는 단일 클론 항체 특성 화 방법에 대한 상세한 프로토콜이 잘 정의되어 있습니다. 수확된 세포 배양 액의 양이 제한되어 때때로 획득된 제품 정보를 제한할 수 있으며 제품 품질 데이터를 얻기 위한 올바른 분석 절차의 선택이 필수적입니다. 분석은 업스트림 프로세스 매개변수를 제품 품질의 변화에 연결하는 데 중요합니다. 여기서, 사용자가 미생물 반응기로 작업 할 때 mAbs를 특성화할 수있는 지침이 제공됩니다.

단백질 치료제는 조직 이식 합병증, 자가면역 질환 및 암 1을 포함하는증가하는 다양한 의료 조건을 치료하는 데 사용되고 있다. 2004년부터 미국 식품의약국(USFDA)은 약물 평가 및 연구 센터(CDER)가 규제하는 모든 승인의 생물학적 라이선스 신청(BLA)의 비율이 증가하고 있으며, BLA가 25% 이상을 차지하고 있습니다. 2014 년과 2015 년2.
이러한 시장 확대를 고려할 때, 바이오 제약 제조업체는 일관된 품질로 더 많은 제품을 신속하게 제공하는 데 어려움을 겪고 있습니다. 제품 수율을 높이기 위한 노력은 CHO 세포 공학 및 생산 라인 스크리닝에 초점을 맞추고 있지만, 가장 중요한 개선사항은 미디어/사료 전략 최적화 및 세포 배양 환경 제어의 발전에 기인합니다1. 3개 , 4개 , 5 제조 공정 중.
mAb는 생물학적 시스템에서 생산되기 때문에 고유의 단백질 가변성이 있을 수 있습니다. 항체 조성물은 글리코실화와 같은 번역 후 변경되거나 분해 또는 효소 반응에 의해 영향을 받을 수 있다. 이러한 구조적 변이는 위험한 면역 반응을 유발하거나 항체 결합을 변화시킬 수 있으며, 이는 차례로 의도된 치료 기능5를감소 또는 제거할 수 있다. 따라서, 단일 클론 항체의 중요한 품질 특성 (CQA) - N-글리칸 프로파일, 전하 변이체 분포 및 단일체 형태의 항체의 백분율 - 동안 품질 별 설계 (QbD) 접근법의 일부로 정기적으로 모니터링되고 제어됩니다. 제조공정 1,6. 규제 된 생산 환경에서 치료 단백질은 승인 된 상용 의약품7로허가되기 위해 수용 기준을 충족해야합니다. 본 명세서에 제시된 방법은 전형적으로 항체7,8에대한 품질 특성화 과정의 일부가 될 것이며, 임의의 단백질 과학자는 그들의 사용에 익숙할 것이다.
이전 작업9에서, 업스트림 바이오프로세싱에서 세포 배양 조건의 높은 처리량 스크리닝을 위한 미생물 반응기의 적용 및 작동이 설명되었다. 다양한 매체 조건에서 얻은 정제생성물은 LC-MS 를 이용한 N-글리칸 분석을 행하고 치료단백질의 글리코실화 패턴을 검출하고 LC-MS 기술10,11,및 다양한 글리칸 종의 존재는 사료 전략, pH 및 온도12와같은 생물 공정 매개 변수와 연결되었습니다. 결과 IgG의 백분율로 단조로운 형태로 표시된 제품 품질에 대한 다양한 미디어 조건의 영향은 또한 크기 배제 크로마토그래피- 다각형 광 산란(SEC-MALS)13,14로 평가됩니다. , 15. 충전 변형 프로파일은 제품의 기능에 영향을 줄 수있는 여러 가지 수정 사항16을 나타냅니다. 미세 모세관 영역 전기 영동 (mCZE)은 전하 변이체 분석 (17)에 사용되는 기존의 양이온 교환 (CEX) 크로마토그래피 및 모세관 등전 초점 (cIEF) 방법에 비해 상당히 빠른 분석 시간을 제공하는 기술입니다. ,18. 항체의 식별 속성19,20,21,22의 변화와 관련하여 단백질 생산 중 아미노산 소비를 추적하기 위해 생체 반응기 매체를 분석했습니다. , 23.
단백질 분석을 통해 공정 입력과 CQA의 변경 간의 관계를 기반으로 중요한 공정 파라미터(CCP)를 식별할 수 있습니다. 생물 공정 개발 중에 CPP를 식별하고 측정하는 것은 공정 제어를 근본적으로 입증하고 제품이 변경되지 않았는지 확인하며, 이는 규제가 엄격한 제조 환경에서 필수적입니다. 이 백서에서는 제품 CQA(N-글리칸 프로파일, 전하 변이체 및 크기 균질성)와 가장 관련이 있는 단백질의 생화학적 특성 중 일부를 측정하는 분석 기술이 제시된다.

<table><tbody><tr><td>CHO DG44 세포주</td><td>Invitrogen</td><td>A1100001</td><td></td></tr><tr><td>Akta Avant 25</td><td>General Electric Life Sciences</td><td>28930842</td><td></td></tr><tr><td>Pro Sep vA 울트라 크로마토그래피 수지</td><td>Millipore Sigma</td><td>115115830</td><td>정화 고정상</td></tr><tr><td>Omnifit 10cm 컬럼</td><td>Diba Fluid Intelligence</td><td>006EZ-06-10-AA</td><td>하우징 고정상</td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP154-1</td><td></td></tr><tr><td>Superloop 10 mL</td><td>GE 헬스케어</td><td>18-1113-81</td><td></td></tr><tr><td>&micro; Dawn 다중 각도 광 산란 검출기</td><td>Wyatt</td><td>WUDAWN-01</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro; m Millex GV 필터 유닛 PVDF 막</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGV033RB</td><td></td></tr><tr><td>10X 인산염 완충 식염수</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>12 mL 주사기</td><td>Covidien</td><td>8881512878</td><td></td></tr><tr><td>1290 Infinity Binary Pump</td><td>Agilent Technologies</td><td>G4220A</td><td></td></tr><tr><td>1290 Infinity DAD&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>G4212A</td><td></td></tr><tr><td>1290 Infinity Sampler</td><td>Agilent Technologies</td><td>G4226A</td><td></td></tr><tr><td>1290 Infinity Thermostat</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1330B</td><td></td></tr><tr><td>1290 Infinity Thermostatted Column Compartment</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1316C</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon tube</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>352097 150 uL 유리 인서트와 폴리머 피트&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>5183-2088</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 팔콘 튜브</td><td>Corning Inc.</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트</td><td>Bio-Rad</td><td>127737</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695072</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fisher Chemical</td><td>BPA996-4</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY I-Class UPLC BSM</td><td>Waters Corporation</td><td>18601504612</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY I-Class UPLC Sample Manager</td><td>Waters Corporation</td><td>186015000</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC FLR 검출기</td><td>Waters Corporation</td><td>176015029</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 100kDa 원심 필터</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC810096</td><td></td></tr><tr><td>아미노산 표준물질, 1 nmol/&micro; 엘&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>5061-3330</td><td></td></tr><tr><td>아미노산 보충제</td><td>Agilent Technologies</td><td>5062-2478</td><td></td></tr><tr><td>포름산 암모늄 용액 - Glycan Analysis</td><td>Waters Corporation</td><td>186007081</td> Septa Agilent Technologies 5182-0717 CD OptiCHO AGT 매체 Thermo Fisher Scientific A1122205 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> 이 <tr><td>있는 파란색 나사 캡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 튜브</td>, <td>Eppendorf</td><td>22363352</td><td></td></tr><tr><td>Charge Variant Chip,</td><td>Perkin Elmer</td><td>760435</td><td></td></tr><tr><td>Charge Variant Reagent Kit</td><td>, Perkin Elmer</td><td>CLS760670</td><td></td></tr><tr><td>크로마토그래피, 물(MS 등급)</td><td>Fisher Chemical</td><td>W6-4</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylformamide</td><td>Thermo Scientific</td><td>20673</td><td></td></tr><tr><td>추출 플레이트 매니폴드 Oasis 96웰 플레이트용</td><td>Waters Corporation</td><td>186001831</td><td></td></tr><tr><td>포름산</td><td>Fisher Chemical</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>GlycoWorks RapiFlour-MS N-글라이칸 스타터 키트 - 24 Sample</td><td>Waters Corporation</td><td>176003712</td><td></td></tr><tr><td>GXII 버퍼 튜브</td><td>E& K Scientific</td><td>697075- NC</td><td></td></tr><tr><td>GXII 감지 창 청소용 천</td><td>VWR</td><td>21912-046</td><td></td></tr><tr><td>GXII HT 터치</td><td>Perkin Elmer</td><td>CLS138160</td><td></td></tr><tr><td>GXII 사다리 튜브</td><td>Genemate</td><td>C-3258-1</td><td></td></tr><tr><td>GXII 보푸라기 무료 면봉</td><td>ITW Texwipe</td><td>TX758B</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>Intact mAb Mass Check Standard</td><td>Waters Corporation</td><td>186006552</td><td></td></tr><tr><td>Intrada 아미노산 컬럼 150 x 2mm</td><td>Imtakt</td><td>WAA25</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis 분광 광도계</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>840274100</td><td></td></tr><tr><td>Optilab UT-rEX 시차 굴절률 검출기</td><td>Wyatt</td><td>WTREX-11</td><td></td></tr><tr><td>과염소산</td><td>Aldrich Chemistry</td><td>311421</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Tips with Microcapillary for Loading Gels</td><td>Labcon</td><td>1034-960-008</td><td></td></tr><tr><td>폴리프로필렌 96-웰 마이크로플레이트, F-바닥, 굴뚝 스타일, 블랙</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655209</td><td></td></tr><tr><td>RapiFlour-MS Dextran 교정 사다리</td><td>Waters Corporation</td><td>186007982</td><td></td></tr><tr><td>스크류 탑 투명 바이알 2mL</td><td>Agilent Technologies</td><td>5182-0715</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>요오드화나트륨</td><td>시그마 알드리치</td><td>383112</td><td></td></tr><tr><td>TSKgel UP-SW3000 4.6mm ID x 30cm L</td><td>Tosoh Biosciences</td><td>003449</td><td></td></tr><tr><td>UNIFI Scientific Information System</td><td>Waters Corporation</td><td>667005138</td><td></td></tr><tr><td>진공 매니폴드 Shims</td><td>Waters Corporation</td><td></td><td></td>186007986</tr><tr><td>진공 펌프</td><td>Waters Corporation</td><td>725000604</td><td></td></tr><tr><td>Xevo G2 Q-ToF</td><td>Waters Corporation</td><td>186005597</td><td></td></tr><tr><td>Zeba 스핀 탈염 컬럼, 0.5mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>89883</td><td></td></tr></tbody></table>

자동화된 미생물체 시스템을 사용하여 중국 햄스터 난소 세포의 단일 클론 항체의 정화 및 분석

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

단일 클론 항체 (mAbs)는 오늘날 제조 된 가장 인기 있고 잘 특성이있는 생물학적 제품 중 하나입니다. 가장 일반적으로 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포를 사용하여 생산, 배양 및 공정 조건은 항체 적기를 최대화하고 목표 품질 프로파일을 달성하기 위해 최적화되어야한다. 일반적으로 이러한 최적화는 자동화된 마이크로스케일 바이오리액터(15mL)를 사용하여 여러 공정 조건을 병렬로 스크리핑합니다. 최적화 기준에는 배양 성능과 단일클론 항체(mAb) 제품의 중요한 품질 특성(CQA)이 포함되며, 이는 그 효능 및 안전성과 에 영향을 미칠 수 있습니다. 배양 성능 메트릭은 세포 성장 및 영양소 소비를 포함하며, CQA에는 mAb의 N-글리코실화 및 응집 프로파일, 전하 변이체 및 분자량이 포함됩니다. 이 상세한 프로토콜은 자동화된 미생물 기체 시스템에서 생성된 HCCF 샘플을 정화하고 분석하여 귀중한 성능 메트릭 및 출력을 얻는 방법을 설명합니다. 첫째, 자동화된 단백질 A 고속 단백질 액상 크로마토그래피(FPLC) 방법은 수확된 세포 배양 샘플로부터 mAb를 정화하는 데 사용된다. 일단 집중되면, 글리칸 프로파일은 특정 플랫폼을 사용하여 질량 분석법에 의해 분석됩니다 (재료 표참조). 항체 분자량 및 응집 프로파일은 크기 배제 크로마토그래피-다중 각도 광 산란(SEC-MALS)을 사용하여 결정되며, 전하 변이체는 마이크로칩 모세관 영역 전기 영동(mCZE)을 사용하여 분석됩니다. 생물반응기 과정 동안 포착된 배양 성능 메트릭(즉, 배양 생존가능성, 세포 수 및 글루타민, 포도당, 락테이트 및 암모니아를 포함한 일반적인 대사산물) 이외에, 소비된 배지는 제한적인 영양소를 식별하기 위해 분석된다. 공급 전략 및 전반적인 공정 설계를 개선할 수 있습니다. 따라서, 소비된 매체의 액체 크로마토그래피 질량 분광법(LC-MS)에 의한 아미노산의 절대 정량화를 위한 상세한 프로토콜도 설명된다. 이 프로토콜에 사용되는 방법은 많은 수의 소량 샘플에 호환되는 높은 처리량 플랫폼을 활용합니다.

자동화된 마이크로스케일 바이오리액터로부터 수확된 세포 배양액은 도 1과 같이 빠른 단백질 액상 크로마그래피(FPLC)를 사용하여 정제되고, 정제된 단백질의 중요한 품질 특성(CQA)은 다양한 특징을 특징으로 하였다. 다운스트림 분석 방법. 이것은 자동화 된 미생물 시스템의 주요 이점입니다. 다양한 조건에서 빠르게 평가할 수 있습니다. 질량 분석법에 의해 처리되는 CHO 생산 mAbs의 N-글리칸 데이터는 도2에 나타난 크로마토그램과 같아야 한다. 이 그림은 한 샘플에서 만노스 5 피크(M5)가 상당히 낮다는 것을 보여주는 두 크로마토그램 간의 비교를 나타낸다. 피크 대신 시끄러운 기준선만 관찰되는 경우 크로마토그래피 설정에 결함이 있거나 프로시저가 성공하지 못한다는 의미일 수 있습니다. 컨트롤을 사용하면 문제 해결을 간소화할 수 있습니다. 첫째, 덱스렌 사다리에서 FLR 피크를 평가; 이러한 피크는 크로마토그래피 시스템이 올바르게 작동하고 있음을 나타냅니다. 다음으로, 실험적으로 수득된 피크를 처리된 그대로 mAb 표준으로부터 얻은 피크와 비교한다. 표준의 피크가 표시되지만 샘플 피크가 식별되지 않으면 mAb 샘플이 올바르게 처리되지 않았습니다. 이는 N-글리칸 라벨링 및 정제를 방해하는 완충제 내의 SDS 또는 뉴클레오필 존재 때문일 수 있다.
SEC-MALS는 항체의 응집 프로파일 및 분자량이라는 두 가지 더 많은 CQA를 평가하는 데 사용될 수 있다. 대표적인 SEC-MALS 크로마토그램은 그림3에 나타낸 것과 비슷합니다. 분자 질량 분포 및 절대 분자량은 소멸 계수가 1.37 mL*(mg*cm)-1및 dn/dc0.185 mL/g의 필요한 소프트웨어를 사용하여 결정하였다. 소프트웨어의 최고 통화 및 기준 설정이 수동으로 수행되므로 결과는 사용자마다 약간 다를 수 있습니다. 도 3에서 단모성 IgG1의 절대 분자량은 1.504 x 105 Da±0.38%(청색)이고 고차 복합체는 7.799 x 105 Da±3.0%(적색)이다. 응집체의 다분산은 피크 1의 적색 어금니 질량 분포에 의해 지시된 바와 같이단량체의 다분산도보다 훨씬 크다(그림 3). 소량의 시료와 CQA로서의 응집의 중요성은 이 기술을 자동화된 미생물 반응기 시스템에 매우 가치 있는 보완 분석 도구로 만듭니다.
mCZE의 결과는 단일 클론 항체에 대한 전하 변이체 프로파일을 보여주는 도4와 같은 전기 전형체입니다. 프로파일은 조사중인 단백질에 대한 독특한 서명이며 작동 pH에 매우 민감합니다. 또한 전하 변형 프로파일의 왼쪽에 있는 자유 염료 피크가 보입니다. 작동 pH를 설정할 때 작업자가 해상도와 신호의 균형을 맞추기 위해 재량에 따라 조정됩니다. 또한, 작업자는 ~30s에서 이동하는 자유 염료 피크에서 좋은 분리를 보장해야합니다. 이 피크를 제거하기 위해 라벨링 후 샘플을 탈염시킬 수 있지만 신호가 현저하게 손실됩니다. 작동 pH가 설정되면 샘플 프로파일을 비교할 수 있습니다. 일반적으로 일관된 반면, 라벨링 효율의 변화 또는 부형제의 차이는 샘플 의 이동과 전하 변형 프로파일의 변화에 약간의 차이가 발생할 수 있으므로 전기 전형은 직접 비교하기 가 어렵습니다. 대신, 비교 방법은 일반적으로 기본, 주요 및 산성 종의 백분율을 기반으로합니다. 이 경우 mCZE를 사용하여 1-2%만큼 작은 상대적 차이를 식별할 수 있습니다.
아미노산 소비고갈고갈이 CQA의 변화를 일으키는지 여부를 확인하기 위해 모니터링할 수 있습니다. 질량 분석기의 크로마토그램 판독값은 조생물 반응기 미디어 샘플에서 아미노산의 절대 정량화를 위한 교정 곡선의 성공적인 생성을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 도 5는 이 과정에서 2개의 총 이온 크로마토그램(TIC)과 추출된 이온 크로마토그램(XIC)을 대표적인 결과로 나타낸다. 도 5A에서, 도시된 TIC는 물 블랭크만 주입된 바와 같이 버퍼 시스템의 배경 신호를 도시한다. 그림 5 B는 아미노산 표준의 대표적인 TIC를 나타내며, 물 빈 것과 비교했을 때, 개별 아미노산 종에 대응하는 작은 피크가 관찰될 수 있다(예: 7.96분의 리신). 피크를 통합하고 피크 영역(및 따라서 농도)의 정량화를 용이하게 하기 위해 XIC는 정의된 "크로마토그램 질량 창"의 신호만 표시되는 곳에서 사용됩니다. 계측기의 감도와 크로마토그래피 분리의 품질에 따라 최적의 질량 창은 사용자가 결정해야 합니다. 이 예에서(도5C) 10 ppm의 질량 윈도우를 가진 리신의 XIC(m/z=147.1144)는 아미노산 표준에서 리신이 8.03분에서 컬럼떨어져 용해되는 곳을 도시한다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig1.jpg"> 그림 1 . 빠른 단백질 액상 크로마토그래피(FPLC) 기술을 이용한 정제 방식의 대표적인 크로마토그램. 체적(mL)에 해당하는 정제 방법 상은 x축을 따라 표지된다. 280 nm (mAU y 축, 실선)에서의 UV 흡광도는 정제 주기 전반에 걸쳐 모니터링됩니다. 비특이적 결합 불순물은 높은 염분 세척 동안 전도도(mS/cm y축, 파선)를 증가시킴으로써 변위됩니다. 를 표시합니다). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig2.jpg"> 그림 2. 질량 이 확인된 태그글리칸으로부터 얻은 대표적인 형광 크로마토그램. x축은 유지 시간(분)이며 y축은 신호 강도입니다. 14.94분의 피크는 만노스 5(M5) 글리칸을 나타내며, 여기서 M5 신호 강도 사이의 큰 차이는 중첩된 두 샘플 간에 관찰될 수 있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig3.jpg"> 그림 3. IgG1 단일 클론 항체의 분자량 분포. 1x PBS(pH7.4)에서 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분리된 손상되지 않은 IgG1 단일클론 항체의 크로마토그램. 흡광도는 280 nm(검정; 좌측 축)에서 모니터링되고 광 산란 및 굴절률 검출기는 각 피크(적색 및 청색; 오른쪽 축)의 절대 분자량을 계산하는 데 사용되었다. 높은 분자량 종은 "HMW"라고 표시된 피크로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig4.jpg"> 그림 4 . IgG1 단일클론 항체의 전하 변이체 프로파일. 이 전기 전형체는 mCZE 플랫폼에서 생성됩니다. 자유 염료 피크는 ~ 30s에서 마이그레이션되며 IgG1과 잘 분리됩니다. 정량화를 위해 피크는 계측기 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 기본, 주 및 산성 종으로 분할되었습니다. 빨간색 선은 통합된 피크 영역을 간략하게 설명합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig5.jpg"> 그림 5. 조생물반응기 매체의 질량 분광계 계 아미노산 분석을 위한 이온 크로마토그램의 대표적인 결과. x축은 시간(분)이 면서 y축은 신호강도(A) 물 블랭크가 음의 제어 역할을 하며 액체 크로마토그래피 그라데이션(B) 225 pmol/μL 아미노산의 과정에서 관찰된 배경 신호를 나타낸다. 표준은 이 총 이온 크로마토그램에서 관찰된 개별 피크가 크로마토그래피로 해결되는 표준 혼합물의 상이한아미노산을 나타내기 때문에 양성 대조군으로 여기에서 사용된다 (C) m에 대한 대표적인 추출된 이온 크로마토그램 /z 147.1144, 이는 리신이다. B의 7.96 분 피크는 리신의 C에서 8.03 피크에 해당합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

자동화된 미생물반응기의 수확된 세포 배양 유체(HCCF)로부터의 단일클론 항체의 정제 및 후속 분석을 위한 상세한 프로토콜이 기술되었다. 분석을 사용하여 중요한 품질 특성(CQA)을 결정하고 제한된 샘플 볼륨을 최대화하여 중요한 정보를 추출하는 것도 제공됩니다.

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

이 프로토콜은 제품의 중요한 품질 특성에 대한 중요한 정보를 추출하기 위해 미생물 반응기에서 얻은 제한된 샘플의 분석을 다룹니다. 이러한 기술의 또 다른 장점은 최소한의 분석 시간을 사용하여 제조 된 제품의 품질 매개 변수를 지시하는 주요 특성을 결정한다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 데이비드 파워스, 탈리아 페이슨, 필립 앙가르트, 내 실험실에서 연구 펠로우가 될 것입니다.정제 시스템에 부착된 소프트웨어를 열고 정제된 항체 용염 및 50 밀리리터 원추형 튜브를 수집하여 분수 수집기로 높은 염분 세척 시 흐름을 수집하는 것으로 시작한다. 다음으로, 0.22 마이크로미터 모공 여과된 수확된 세포 배양액을 덮인 노즐이 있는 빈 12밀리리터 주사기에 추가합니다. 캡을 제거한 후, 정화 시스템의 수동 사출 포트에 주사기 노즐을 삽입한다.주사기를 비틀어 시료의 전체 부피가 주입되고 부착된 10 밀리리터 대용량 샘플 루프에서 볼 수 있습니다. 저장된 메서드를 선택하고 계측기 소프트웨어의 메시지가 표시되면 실행을 클릭합니다. 모든 항체가 배제되면, 정제된 단백질을 1개의 어금니 트리베이스로 즉시 약 5.5의 pH로 중화한다.정제된 항체를 원심분리에 농축하려면 100킬로달톤 필터를 여과 수집 튜브에 넣습니다. 필터를 이중 증류수 500마이크로리터로 세척한 다음 원심분리기를 세척합니다. 필터 세척을 두 번 반복합니다.두 번째 세척 후, 여과를 버리고 헹구는 필터를 새로운 원심분리기 튜브로 옮겨냅니다. 다음으로 원심분리를 위해 각 필터에 500마이크로리터의 샘플을 추가합니다. 스핀의 끝에서, 최종 원심 분리와 농축 된 샘플을 얻기 위해 새로운 수집 튜브로 필터를 반전.N-글리칸 라벨링 및 절연을 위해 각 농축 항체 샘플의 7.5 마이크로리터를 희석시하십시오. 키트에서 1밀리리터 튜브에 15.3 마이크로리터의 액체 크로마토그래피 질량 분광법 또는 LCMS 급 수분으로, 3분 동안 90°C에서 효소 친화적이고 질량 분광에 친화적인 계면활성제의 5%의 마이크로리터 6개를 사용하여 항체를 분해합니다. 데마처링이 끝나면 시료가 3분 동안 실온으로 냉각된 후 펩타이드 N-글리코시다아제 F의 마이크로리터를 섭씨 50도에서 5분간 배양할 수 있습니다.시료를 실온까지 3분 동안 냉각한 후 실온에서 5분 동안 무수성 디메틸포르마미드에 용해된 12개의 형광 태깅 시약으로 샘플을 라벨로 지정합니다. 인큐베이션의 끝에서, 아세토닐트리의 358 마이크로리터로 표시된 N-글리칸 혼합물을 희석하고 심과 폐기물 쟁반이 있는 진공 매니폴드에 수성 성소 작용 크로마토그래피 플레이트를 놓습니다. 200 마이크로리터의 물을 진공으로 10~15킬로파스칼로 조절하여 액체가 15~30초 정도 걸리도록 하여 수성 성소 성소 염색체 수지를 통과합니다.각 음질에 각 표지된 글리칸 혼합물의 400 마이크로리터를 적재하기 전에 15~30초 동안 85%의 아세토닐릴200 마이크로리터로 우물을 상화하여 각 새 액체를 첨가한 후 진공을 가집니다. 모든 시료를 첨가하면 수지600 마이크로리터1%의 마이크로리터와 세척당 90%의 아세토닐트리어로 두 번 세척하고 폐기물 트레이를 600마이크로리터 수집 튜브로 교체합니다. 그런 다음 30 마이크로리터 용량의 분광력 용출 버퍼로 표지된 N-글리칸을 회피하고 아세토닐틸리알 샘플링 용출제에서 310마이크로리터의 디메틸포르마미드로 풀 희석제를 희석시합니다.형광 검출기및 비행 질량 분광계의 4중 시간에 결합된 초고성능 액체 크롬토그래피 시스템에서 표지된 N-글리칸 용출 샘플을 분석하려면 이동 단계에 대해 50 밀리머암모늄 용암모늄 과 100% LCMS 등급 아세토나이트를 사용하십시오. 초기 유량은 분당 0.4 밀리리터로 설정하고 LC 그라데이션은 용출 단계에서 암모늄 용산염을 증가시도록 합니다. 265 나노미터의 발산과 2 헤르츠의 샘플링 속도로 425 나노미터의 방출을 측정하기 위해 형광 검출기를 설정합니다.100~2, 000 달톤의 질량 범위, 0.25초의 스캔 시간 및 연속체 데이터 수집으로 MS1 양성 이온 감도 모드로 비행하는 네 배의 시간을 설정합니다. 그런 다음 샘플을 자동 샘플러에 10°C로 로드하고 로드된 메서드를 실행합니다. 충전 변형 분석을 준비하기 위해 샘플을 탈염하려면 0.5 밀리리터 탈염 컬럼의 바닥 스토퍼를 스냅하고 상단 스토퍼를 풀고 탈염 컬럼을 1.7 밀리리터 원심분리기 튜브에 놓습니다.새로운 컬럼을 새로운 마이크로센심심분리기 튜브로 옮기고 밀리리터 항체 용액당 3.5밀리그램의 80마이크로리터를 컬럼 상단에 추가합니다. 열을 원래 방향에 정렬하고 열을 원심분리합니다. 그런 다음 탈염 컬럼을 버리고 농축 된 샘플을 철저히 혼합합니다.96웰 플레이트의 단일 웰에 25 마이크로리터의 초순수 수분에서 밀리리터 농도당 2밀리그램으로 샘플을 희석하고 라벨링 버퍼 5개소와 라벨링 시약 5마이크로리터를 첨가합니다. 빛으로부터 보호되는 실온에서 10분 간 배양한 후 시약 등급의 물 60마이크로리터를 샘플과 혼합하고 원심 분리를 위한 플레이트 씰로 플레이트를 덮습니다. 전하 변형 칩을 준비하려면 저장 용액을 제거하고 우물 1, 3, 4, 7, 8 및 10을 물로 세척하십시오.물을 pH 7.2 실행 버퍼로 교체하고 버퍼 튜브에 750 마이크로리터의 실행 버퍼를 추가합니다. 계측기 사용자 인터페이스에서 언로드 플레이트를 누르고 96웰 플레이트에서 씰을 제거합니다. 플레이트와 버퍼 튜브를 GX2 샘플 트레이의 표시된 지점에 삽입하고 로드 플레이트를 누릅니다.칩 챔버에 칩을 놓고 뚜껑을 칩 챔버에 닫고 메시지가 표시될 때 HT 단백질 충전 변형 분석기를 선택하고 실행을 클릭합니다. 빠른 단백질 액체 크로마토그래피에 의해 자동화된 마이크로스케일 생물반응기로부터 수확된 세포 배양 시료의 정제를 통해 다양한 하류 분석 방법에 의한 정제된 단백질의 중요한 품질 특성의 특성을 입증할 수 있다. 질량 분석법에 의해 처리된 중국 햄스터 난소에서 생성된 단클론 항체의 N-글리칸 데이터는 이러한 대표적인 크로마토그램과 유사하게 나타나야 한다.크기 배제 크로마토그래피 다중 각도 광 산란은 항체의 응집 프로파일 및 분자량을 평가하는 데 사용될 수 있다. 소량의 시료와 집계의 중요성은 이 기술을 자동화된 미생물 반응기 시스템에 매우 귀중한 보완 분석 도구로 만들기 위한 중요한 품질 특성입니다. 마이크로 모세관 영역 전기포광의 결과는 전기페로그램이며 단클론 항체에 대한 전하 변이체 프로파일을 표시하는 데 사용될 수 있으며, 이는 작동 pH에 매우 민감한 단백질에 대한 독특한 시그니처이다.아미노산 소비는 또한 고갈이 항체의 중요한 품질 속성에 변경을 일으키는지 결정하기 위하여 감시될 수 있습니다. 분석 단계는 제대로 정제 된 단백질로만 수행 할 수 있기 때문에 제조 된 제품의 적절하고 효율적인 정제를 보장하는 것이 중요합니다. 이 제품은 펩티드 매핑 및 안정성 테스트를 실시할 수도 있습니다.그러나 단백질이 하나의 특성화 방법에 사용되면 전형적으로 다른 특성화 방법을 사용할 수 없습니다. 이러한 기술은 소량의 높은 처리량 바이오 프로세싱 스크리닝 플랫폼에서 생산된 제품을 분석하여 바이오 프로세싱 파라미터가 제품 품질에 미치는 영향을 이해할 수 있게 합니다. 이러한 기술 중 일부는 농축 된 과염소산, 포름산, N-디메틸포르마미드를 사용하며, 모두 위험하며 적절한 보호 장비를 착용하는 동안 신중하게 처리해야합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

단백질 치료제 생산을위한 생산 세포주 개발의 높은 처리량, 자동화된 플랫폼은 설명합니다. BD FACS 아리아 세포 분류기의 구현, CloneSelect 영상기 및 TECAN 자유 에보 (Evo) 액체 처리 시스템이 향상 세포주의 품질과 높은 재현성과 세포주 개발에 크게 증가 처리 능력을 보여주었다.

단백질 치료제 제조 셀 라인의 개발을위한 높은 처리량 자동 플랫폼

이 비디오는 마우스 종양 이종 이식 모델에서 종양 특이적 항체의 생체 내 국소화를 연구하는 기술을 보여줍니다. 종양 형성을 위해 암세포를 마우스에 피하 주입하면 종양 특이적 수용체에 결합하는 형광 표지된 항체를 주입하여 이미징을 통해 항체 국소화를 생체 내에서 평가할 수 있습니다.

종양 특이적 항체의 In vivo 국소화를 평가하는 기법

이 비디오는 유전자 발현에서 분비에 이르기까지 포유류 숙주 세포에서 항체를 생산하는 과정을 설명합니다. 여기에는 전사, 번역, 신호 인식, 올바른 접힘, 그리고 궁극적으로 분비 소포를 통해 세포 외 매체로 방출되는 것이 포함됩니다.

포유류 세포에서 재조합 항체의 생산 및 정제

이 비디오는 중국 햄스터 난소 세포에서 수확한 세포 배양액에서 단클론 항체를 정제하는 분석을 보여줍니다. 이 제품은 고정화된 단백질 A가 있는 다공성 유리 수지를 사용하며, 이 수지는 샘플에 있는 항체의 Fc 영역에 결합하여 오염 물질로부터 효과적으로 분리합니다. 낮은 pH의 용출 완충액을 사용하면 상호 작용이 약화되어 정제된 항체의 회수가 용이해집니다.

중국 햄스터 난소 세포에서 생산된 단일클론 항체를 정제하는 기술

이 비디오는 항체 생산 세포 배양에서 얻은 배양 상등액에서 단클론 항체를 정제하는 기술을 보여줍니다. 이 공정에는 접합된 단백질 A와 교차된 아가로스 비드의 매트릭스를 사용하는 것이 포함되며, 이는 비드의 상등액에 있는 항체를 고정시켜 오염 물질로부터 효과적으로 분리할 수 있습니다. pH가 낮은 용출 완충액을 적용하면 단백질 A-항체 상호 작용이 느슨해져 항체 함유 분획의 수집이 용이해집니다.

단클론 항체 정제를 위한 친화성 크로마토그래피 기법

하이브리도마 기술을 기반으로 한 단클론 항체 생성을 위해 최적화된 프로토콜이 제시됩니다. 마우스는 면역접합체로 면역되었습니다. 비장 세포는 PEG와 전기 충격에 의해 불멸의 골수종 세포와 융합되었습니다. 항체 생산 하이브리도마 세포는 HAT 및 항원 특이적 ELISA 스크리닝에 의해 선택되었습니다.

하이 브리 도마 기술에 의해 쥐 단일 클론 항체의 생성

Microbioreactor 시스템에 다양 한 조건에서 48 병렬 세포 배양의 동시 작업에 대 한 자세한 프로토콜 제공 됩니다. 셀 문화 과정, 수확 및 후속 항 체 titer 분석을 설명 합니다.

높은 처리량의 사용 모델 IgG1 조 세포에서의 생산을 위한 Microbioreactor 시스템 자동화

여기에서, 우리는 단백질 A 열을 사용하여 세포 수확 및 단백질 정량화에 선행된 자동화된 마이크로 bioreactor에 있는 실험의 디자인을 실행하는 상세한 절차를 제시합니다.

중국 햄스터 난소 세포 재배에서 고처리량 자동화 마이크로 바이오리액터를 사용한 공정 최적화

항체의 글리코실화 패턴은 그의 임상 성능을 결정하고, 따라서 글리코실화를 조절하기 위한 산업적 및 학문적 노력이 지속된다. 전형적인 글리코엔지니어링 캠페인은 시간과 노동 집약적이기 때문에, 일시적 침묵을 사용하여 글리코실화 유전자의 영향을 특성화하는 신속한 프로토콜의 생성은 유용할 것이다.

중국 햄스터 난소 세포의 신속한 항체 당공학

이 프로토콜은 MISS 세포(Single-cell Microliter-droplet Culture Omics System)를 사용하여 미생물 단클론 분리, 배양 및 피킹을 수행하는 방법을 설명합니다. MISS cell은 액적 미세유체 기술을 기반으로 하는 통합 워크플로우를 달성하며, 이는 우수한 액적 단분산성, 높은 병렬 배양 및 고처리량 바이오매스 검출을 제공합니다.

Single-cell Microliter-droplet Culture Omics System을 사용한 자동화된 High-throughput Microbial Monoclonal Cultivation and Picking

배우세요 자동화된 미생물체 시스템을 사용하여 중국 햄스터 난소 세포에서 단일 클론 항체를 정화하고 N-글리칸 프로파일링 및 전하 변이체 분석을 수행하는 방법. 이 프로토콜은 제한된 샘플 볼륨에서 항체의 중요한 품질 속성을 효율적으로 분석하여 바이오프로세싱 연구에 활용합니다.

자동화된 미생물체 시스템을 사용하여 중국 햄스터 난소 세포의 단일 클론 항체의 정화 및 분석

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