Name: Zebrafish 애벌레에 음식 감염에 대 한 차량으로 Protozoan Paramecium caudatum 를 사용 하 여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: 배우세요 Paramecium caudatum을 이용한 제브라피시 애벌레의 식품 매개 감염 방법을. 이 기술은 인간의 식품 매대 감염을 모델링하고 조직 손상을 최소화하며 장내 미생물 정착 동역학을 연구하는 데 활용됩니다.

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우리는 원고에 중요 한 읽기 및 의견에 대 한 Krachler 그룹의 구성원에 게 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 UT 시스템 스타 상, BBSRC, NIH (R01AI132354)에 의해 투자 되었다.

Zebrafish 관리, 번 식, 그리고 여기에 설명 된 실험 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드를 따라 하 고 텍사스 대학 보건 과학 센터, 프로토콜의 기관 동물 복지 위원회에 의해 승인 되었습니다. 숫자 AWC-16-0127입니다.
1. 성장 및 Paramecia 의 유지 보수
<ol><li>소스 Zebrafish 국제 리소스 센터 (ZIRC) 등에서 라이브 paramecia 문화를 가져옵니다.</li>
	<li>Paramecia 문화, 1에서 resuspended는 대장균 MG1655 문화 (광학 밀도 OD600 1.0-2.0)의 1 mL의 1 mL을 추가 라이브 성장 문화에서 x E3 (0.29 g/L NaCl, KCl, 13 mg/L 44 mg/L CaCl2, 81 mg/L MgSO4 0.48 g/L HEPES, pH 7.0, 살 균), 그리고 1의 8 mL 10ml 조직 배양 플라스 크로 x E3. 가볍게 소용돌이 22 ° c.에 저장</li>
	<li>문화를 유지 하려면 2 주마다 10를 포함 하는 신선한 1 x E3 매체의 9 mL와 10 mL 조직 배양 플라스 크에 paramecia 문화의 1 mL 통로8 CFU/mL 대장균 MG1655 1에 resuspended의 x E3.</li>
</ol>2. 세균성 복용량 Zebrafish에 관리의 결정
<ol><li>
Paramecium 내에서 세균 반감기를 결정 참고: 아래 설명 된 대로 paramecia 내의 박테리아의 반감기 도금 paramecium에서 복구 가능한 대장균 에 의해 결정 됩니다.<ol>
<li>박테리아 (OD600 1.0) 22 ° C에서 paramecia와의 2 h 인큐베이션, 다음 paramecia와 50 mL 원뿔 튜브로 세균성 공동 문화를 결합, E3, 그리고 수 x 1와 paramecia 세척 (아래 단계에서 설명 하는 대로 밀리 리터 당 paramecia의 수 3.2.7 고 3.2.8)입니다.</li>
		<li>Paramecia의 수를 세 후 paramecia 및 세균성 공동 문화 (6 h 사후 노출)에 대 한 매시간 50 µ L을 제거 하 고 신선한 1.5 mL 튜브에 각 샘플을 추가 합니다.</li>
		<li>1% 비 계면 활성 제의 장소 950 µ L ( 재료의 표참조) 인산 염에 버퍼링 (PBS) 염 1.5 mL 튜브와 1 분은 paramecia을 lyse 소용돌이의 각. 수행 하는 1시 10분 희석 액 (900 µ L 즉, 100 µ L)으로 살 균 PBS를 사용 하 여 각 샘플의 희석.</li>
		<li>선택적 접시에 각 희석의 100 µ L 플레이트 (파운드 tet 매체: 30 µ g/mL 항생물질, 1 g/L NaCl, 0.5 g/L 효 모 추출 물, 1 g/L tryptone)와 16 h 37 ° C에서 품 어. 다음 날, 계산 하 고 계산만 분리 되 고 명료한 개인적인 식민지에 의해 접시 (콜로 니 형성 단위, CFUs)에 세균성 식민지의 수를 기록 합니다. 30-300 CFU 주는 희석으로 접시를 식별 합니다.</li>
		<li>희석을 결정 요소 사용. 예를 들어 1 µ L 세균성 문화의 살 균 PBS의 99 mL와 혼합 하는 경우이 1: 100 (0.01) 희석입니다. 이 번호는 희석에서 CFU의 수 있을 것입니다. 원래 샘플의 CFU를 결정 하기 위해 모든 시간 지점에 대 한 아래, 계산을 수행: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq1.jpg" style="opacity: 0.9;">
</li>
		<li>계산 가능한 대장균수를 그래프/paramecium에 해당 하는 시간 노출 단계 3.3.1 계산 paramecia 농도 사용 하 여 게시 하 고 paramecia (그림 1) 내 반감기를 결정 합니다.</li>
		<li>CFU를 사용 하 여 계산 하 고 그래프의 paramecia 농도 단계 3.3.1에서에서 계산을 사용 하 여 x 축에 시간 게시물 보육 대 y paramecium 당 가능한 대장균 수 수 각 시간 지점에 대 한 계산. paramecia 내 반감기를 결정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
세균성 세균성 하프 라이프에서 투약 하 고 먹이 속도 결정 합니다. 참고: 세균성 복용량을 결정 하는 paramecia 안에 박테리아의 반감기와 paramecia에 zebrafish의 먹이 비율 고려 되어야 해야 (단계 3.4 참조).<ol>
<li>다음 수식을 사용 하 여 paramecia 내의 세균성 감퇴를 결정. (1)<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq2.jpg" style="opacity: 0.9;"> N0 paramecia 당 박테리아의 초기 수량 2 h 부 화 후가 Nt는 시간 t 후 나머지 수량, τ 후 실행 가능한 박테리아의 수는 절반으로, 시간 이며 k는 붕괴 상수.</li>
		<li>저하 실험에서 붕괴 상수 k 세균 하프 라이프를 사용 하 여 결정 (즉, 시간 후 실행 가능한 박테리아/paramecium의 금액은 절반 가까이 떨어졌다). (2)<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq3.jpg" style="opacity: 0.9;"> 하프 라이프의 결정에 대 한 용어 <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq4.jpg" style="opacity: 0.9;"> 및 (3) <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq5.jpg" style="opacity: 0.9;"> 또는 (4)<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq6.jpg" style="opacity: 0.9;"> 참고: 그림 1을 바탕으로, paramecia에 대장균 의 반감기는 약 2.3 h 이다. 따라서, 수식 (4), 감퇴 율, k를 사용 하 여, 대장균 은: (5)<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq7.jpg" style="opacity: 0.9;">
</li>
		<li>Zebrafish 애벌레에 의해 촬영 가능한 박테리아 (Nt)의 복용량을 찾을 반감기 실험에서 감퇴 율 (k)를 결정 후 먹이 시간 (t), (P)은 먹이 속도 또는 시간 당 한 물고기에 의해 먹 히는 paramecia의 수: (6) <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq8.jpg" style="opacity: 0.9;"> 또는 (7)<img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq9.jpg" style="opacity: 0.9;"> 참고: 그림 1, 2 h 인큐베이션 (t) 후 paramecia (N0) 당 박테리아의 초기 수량 790 CFU입니다. 영화 1 과 그림 2, 먹이 속도 (P) 1539입니다.</li>
		<li>이러한 값을 사용 하 여 방정식 (7)에, 다음으로 2 시간 보육 제 브라에서 세균성 복용량을 계산: (8)<img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq10.jpg" style="opacity: 0.9;">
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 음식을 통한 감염 Zebrafish의
<ol><li>Paramecia와 박테리아를 품 어.
	<ol>
<li>Paramecia 및 대장균 MG1655의 공동 문화 감염 전에 밤을 준비 합니다. E3 미디어의 8 mL, 지속적인 paramecia 문화의 1 mL 및 대장균 MG1655 문화의 1 mL (OD600 = 1.0) 1에서 resuspended T25 조직 배양 플라스 크에 x E3. 하룻밤 실 온 (RT)에서 플라스 크를 품 어. 각 치료 상태에 대 한 paramecia의 2 개의 플라스 크를 준비 합니다.</li>
		<li>세균성 성장 미디어 접종 (파운드: 1 g/L tryptone 0.5 g/L 효 모 추출 물, 1 g/L NaCl) 박테리아의 전염 성 긴장, 접시에서 개별 세균성 식민지를 선택 하 여 사용 하 여 살 균 접종 루프. 37 ° C에 액체 문화를 품 어 고 하룻밤 분 (rpm) 당 110 회전에서 흔들어 둡니다. 참고: 개인 보호 장비 (실험실 코트와 장갑)을 착용 해야 하 고 전염 성 요원을 처리할 때 사용 해야 하는 biosafety 수준 2 시설.</li>
		<li>다음 날, 하룻밤 문화의 OD600 을 측정 합니다. 문화 미디어의 11 ml에서 resuspended 때 1의 OD600 달성 하는 데 필요한 볼륨을 계산 합니다.</li>
		<li>Paramecia의 g 5 분, 각 플라스 크에 대 한 하나의 볼륨 x 6000에 원심 분리를 통해 단계 3.1.2에서에서 박테리아의 볼륨을 수확. 상쾌한 삭제 하 고 E3 미디어의 1 mL에서 세균 펠 릿 resuspend.</li>
		<li>필요에 따라 사전에 형광 염료와 박테리아 얼룩.<ol>
<li>FM 4 64FX 세균성 얼룩 (5 mg/mL 재고 솔루션)의 1 µ L를 추가 합니다. 커버 호 일 photobleaching에서 보호 하 고 회전 이상 끝 RT에서 15 분 동안 품 어 튜브.</li>
			<li>1 세척 하 여 과잉 염료를 제거 x E3: 작은 박테리아 원심 분리를 통해 6000 x g 1.5 분에서 다음 E3 미디어의 1 mL에 펠 릿을 resuspend. 두 번 세척 단계를 반복 합니다.</li>
			<li>수확 스테인드 박테리아 원심 분리를 통해 6000 x g 5 분 삭제에는 상쾌한 고 E3 미디어의 1 mL에서 세균 펠 릿 resuspend.</li>
		</ol>
</li>
		<li>신선한 paramecia의 두 개의 플라스 크의 각 세균 정지의 1 mL를 추가 합니다. 2 h RT에서 품 어. 참고: 얼룩진된 박테리아를 사용 하는 경우 2 시간에 대 한 실시간에 어둠 속에서 품 어.</li>
	</ol></li>
	<li>워시 박테리아/paramecia 공동 문화입니다.
	<ol>
<li>50 mL 원뿔 튜브에 paramecia/박테리아 공동 문화의 두 플라스 크의 내용을 결합 합니다. 10 분에 대 한 15 ° C에서 300 x g 에서 원심 분리기 샘플은 원심이이 단계 전에 미리 냉각 있는지 확인 합니다.</li>
		<li>E3 상쾌한 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여의 약 10 mL을 제거 하 고 신선한 1의 약 10 mL를 추가할 원뿔 튜브에 x E3. 참고: 모든 세척 단계 동안 되려고 매우 빠른 상쾌한, 제거는 paramecia 펠 릿에서 수영 하기 시작 것입니다 필수적입니다. 회전 하 고이 단계에서 충분 한 빠른 처리를 위해 한 번에 하나의 튜브에서 상쾌한 제거는 상쾌한에 paramecia의 손실을 방지.</li>
		<li>5 분 약 10 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 e 3 상쾌한의 제거에 대 한 샘플 원심 분리를 통해 15 ° C에서 300 x g에서 회전 하 고 신선한 1의 약 10 mL를 추가할 원뿔 튜브에 x E3. 이 단계를 두 번 반복 합니다.</li>
		<li>5 분에 대 한 15 ° C에서 300 x g 에서 원심 분리기 샘플 약 10 mL는 펠 렛을 방해 하지 않도록 주의 복용 E3 상쾌한의 제거.</li>
		<li>E3 미디어의 나머지 10 mL에 펠 릿을 resuspend 하 고 새로운 1.5 mL microcentrifuge 관으로 현 탁 액의 500 µ L를 전송. Paramecia의 수를 계산 하는 5 분에 대 한 300 x g 에서 centrifuging에 의해 paramecia의 500 µ L를 작은.</li>
		<li>500 µ L 샘플에서 표면에 뜨는 E3의 400 µ L을 제거 합니다. Paramecia의 나머지 100 µ L를 36.5% 포름알데히드 용액의 20 µ L을 추가 하 고 부드럽게 resuspend, 및 22 ° c.에 5 분 동안 품 어 참고: 이 단계는 세 수 있도록 paramecia를 죽인다.</li>
		<li>피 펫 및 레코드를 사용 하 여 실제 총 볼륨을 측정 합니다. Paramecia 서 스 펜 션 1:1 v/v 0.4 %trypan 블루 솔루션을 희석.</li>
		<li>사용 하 여 셀 또는 hemocytometer 죽은 paramecia/mL의 수를 계산 하. 참고: 사전 정착 단계 때문에 대부분 paramecia 죽은 시점에서, 하지만이 숫자는 라이브 paramecia 공동 배양 실험에 대 한 수를 반영. 저자가 여기 요인으로 무시 될 수 있다 그래서 세균성 공동 화, 때문에 중요 한 paramecia 죽음을 발견 하지 않았습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>공동 Paramecia 그리고 zebrafish 애벌레를 품 어.
	<ol>
<li>Paramecia의 농도 계산. <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq11.jpg" style="opacity: 0.9;"> <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq12.jpg"> 참고: 이 계산 단계의 3.2.5 50 mL 원뿔 튜브에 paramecia의 농도 제공합니다.</li>
		<li>E 3의 3 mL의 최종 볼륨에서 2 x 105 paramecia/mL의 농도에 필요한 세척된 paramecia의 볼륨을 계산 합니다. 참고: Paramecia의 농도 최적화는 원하는 세균성 복용량에 따라 조정할 수 있습니다.</li>
		<li>제 브라 paramecia (계산 단계에서의 적절 한 농도 포함 하는 신선한 E3의 3 mL의 총 볼륨으로 6 잘 플레이트의 각 음에 100 mg/l. 전송 10 zebrafish의 최종 농도를 100 mM Tris pH 8.0에서에서 tricaine를 추가 하 여 anesthetize 3.3.2). 그들은 받는 사람 잘 마 취에서 회복 되도록 액체의 최소한에 애벌레를 전송 확인.</li>
		<li>먹이 대 한 최적의 번개 조건 되도록 하루 빛 조건에서 일주 인큐베이터에 2 h 30 ° C에서 품 어.</li>
		<li>워시 zebrafish 전송 물고기는 새로운 잘 포함 3 mL 신선한 E3 때마다 100 mg/L tricaine를 포함 하 여 5 회 이상. 참고: 세척 단계는 tricaine를 생략 하지 마십시오. 마 취 없이 모바일 애벌레 전송 손상 동물 조 난의 위험이 증가 합니다.</li>
		<li>선택적으로, 준비 zebrafish 이미징 블랙 벽 6 잘 플레이트에서 1% 낮은 용융 agarose의 3 ml에서 zebrafish를 포함 하 여: 낮은 용융 agarose 1xE3에서 구성 하 고 전자 레인지에서가 열. 일단 녹은, 160 mg/mL의 최종 농도에 tricaine를 추가 합니다. 잘린된 젤 팁, 머리는 왼쪽 꼬리에가 로드를 사용 하는 stereomicroscope에서 위치 생선은 오른쪽 (그림 3). Agarose 설정 하려면 5 분 기다립니다 다음 이미징 1 x E3 포함 160 mg/mL tricaine와 함께 포함 된 물고기를 오버레이 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>먹이 속도 결정 합니다. 참고: 아니 별도 실험 먹이 속도 결정 하도록 설정 해야 합니다. 오히려,이 해질 수 있다 단계 3.3.4, 아래 설명 된 대로.<ol>
<li>3.3.4 단계 먹이 zebrafish 먹이 캡처의 stereomicroscope 및 캡처 영상 볼.</li>
		<li>점수는 영상. 먹이 캡처 먹이 향해 zebrafish의 눈에 띄는 특징 이다. 비록이 단지 근사 각 공격 한 먹이 캡처 이벤트로 계산 ( 내용참조).</li>
		<li>각각 다른 zebrafish 애벌레 (그림 2)을 나타내는 여러 개의 비디오 클립에서 시간 당 먹이 캡처 이벤트의 평균 개수를 계산 합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Westphal, R. E., O'Malley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+locomotor+maneuvers%2C+and+improving+sensory+capabilities%2C+give+rise+to+the+flexible+homing+strikes+of+juvenile+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Fusion of locomotor maneuvers, and improving sensory capabilities, give rise to the flexible homing strikes of juvenile zebrafish.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, 108(2013).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

여기에 설명 된 기본 프로토콜 병원 성 대장균, 최적화 하 고 성공적으로 살 모 넬 라 enterica 등 비 브리 오 cholerae다른 세균 종에 대 한 적응 되었습니다. 다음 목욕 침수, 일부 살 모 넬 라 enterica 긴장 등 일부 anaerobes zebrafish 창 자 식민지 하지 않는 일부 종족에 대 한 식품을 매개로 감염 여기에 설명 된 대로 사용할 수 있습니다 성공적으로 식민지를 설립. 애벌레의 창 자에 높은 세균성 짐이 설정도, microgavage에 비해 식품을 매개로 감염 기술적으로 덜 도전 이며 덜 전문된 장비가 필요 합니다. 그러나, 세균성 종 및 긴장 사용할 수에 대 한 중요 한 매개 변수를 최적화 합니다. 이러한 요소가 포함 박테리아 paramecium 공동 문화 단계에 대 한 박테리아와 paramecium 밀도: paramecia 내의 세균 숫자 낮은 경우에,이 공동 문화 단계에서 세균 밀도 증가 시켜 향상 될 수. 일부 세균성 종 paramecium 호스트 손상 될 수 있습니다 그리고이 현미경 검사 법에 의해 평가 되어야 합니다.
이 프로토콜에서 또 다른 중요 한 요인은 제 브라 먹이 캡처입니다. 먹이 속도 여기에 설명 된 대로 모든 먹이 캡처 한 paramecium의 섭취에 결과 공격 하는 가정에 근거한 다. 물고기 당 paramecia의 높은 밀도 높은 먹이 속도 보장 하는 프로토콜에 사용 됩니다. 그러나, 먹이 캡처 시스템에서 paramecia의 밀도에 따라 달라 집니다 그리고 매우 희석 paramecium 문화에서 먹이 요금 시간21,22당 13-15 paramecia로 낮은 수 있습니다. 한계는 먹이 캡처 속도 또한 조명 조건에 그리고 어둠 속에서 강하게 의존, 캡처 요금은 80% 낮은 조명 조건에서21 와이 해야 고려해 실험을 설정할 때 보다. 먹이에 노출 시간 최적화 식민 확장 될 경우, 고려 보조 노출 배설물을 통해 박테리아에 게 있다. -2 h 먹이 노출-위에서 설명한 조건 하에서이 노출 때문에 박테리아의 소화 관 통과 시간 1 시간 이상 차량에는 박테리아의 농도 배설물에 보다 훨씬 더, 이다. 그러나, 먹이 노출 시간이 크게 증가 하 고,이 중요 한 요소가 될 수 있습니다.
먹이 비 병원 성 대장균 을 포함 하는 paramecia와 다음 zebrafish의 식민지를 포함 하 여이 프로토콜에 적절 한 컨트롤을 포함 한다 MG1655. 여러 개의 세균성 긴장 zebrafish 호스트를 식민지로 그들의 능력에 대 한 비교 하는 경우 그것은 paramecia 내의 그들의 반감기는 여부를 테스트 하는 것이 중요. 세균성 돌연변이, 세포 벽 무결성 또는 산 감지, 타협 포함 paramecia 내의 세균 안정성 손상 시킬 수 있습니다. 이러한 경우, zebrafish 먹이 복용량에 차이 대 한 계정 조정 해야 합니다.
여기에 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 세균성 식민지와 조직 homogenate3, zebrafish 당 CFU 여 뿐만 아니라, 위에서 설명한 대로 zebrafish의 세균성 식민을 이미징 하 여를 포함 하 여 그 결과 조사 하 수 또는 감염 관련 질병 률 및 사망률을 조사. 이상적으로, 세균의 시각화를 위한 mCherry 등 형광 단백질 또는 빨간색 형광 성 단백질 (RFP)를 표현 하는 세균성 긴장 사용 되어야 한다. 이 세균성 인구 성장의 시각화 수 있게 됩니다. 만약 세균성 긴장은 유전자 세공 또는 형광 단백질 식의 사용은 다른 이유로 배제, 박테리아 수 있습니다 얼룩이 질 FM 4-64FX, 같은 형광 염료와 paramecia와 공동 문화 사전. 여기 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 때 paramecia와 공동 문화는 염료의 밝기를 감소 하지 않습니다 고 얼룩진된 박테리아 zebrafish 내장에서 명확 하 게 볼 수 있습니다. 그러나, 염료 zebrafish 호스트 내에서 발생 하는 중요 한 세균 확산 해야 시간이 지남에 희석 될 것입니다. 두 경우 모두, 레드-형광 박테리아는 녹색 형광 박테리아에 바람직 조직 autofluorescence 빨강 채널에 보다 녹색으로 높은 될 수 있기 때문.
이 프로토콜에 대 한 적용할 수 있습니다 발견 되었습니다 에어로빅 microaerophilic 세균성 종. 이 실험적으로 시험 될 남아 있지만 포자와 균 종, 먹이 대 한 적응 수 있습니다.

Zebrafish 공유 형태학 상으로 그리고 기능적으로 granulocytic 계보 (예: 호 중구), monocyte/대 식 세포와 같은 세포, 수용 체 통행세 같이, 프로 염증 성 cytokines 그리고 항균 펩 티 드1 포함 한 포유류와 기능 보존 . Zebrafish에 장로 6 일 게시물 수정 (dpf)에 완벽 하 게 개발 되 고 형태학 및 기능 보존 장 상피 세포에 있는 보존된 transcriptional 규칙 등 포유류 위장와 함께 보여줍니다. 2. 이것은 제 브라 장내 미생물 식민과 병에 대 한 우수한 모델. 다양 한 장의 미생물 enterohemorrhagic3 대장균, 비 브리 오 cholerae4,5, 살 모 넬 라 enterica6, zebrafish 모델에서 공부는 zebrafish microbiota7,8, 그리고9장의 면역 probiotics의 역할. 뚜렷한 zebrafish 모델의 장점은 그것 혼합된 미생물 인구3, 의 맥락에서 미생물 행동의 조사를 수 있는 내 생 microbiota를 방해 하지 않고 많은 미생물에 의해 식민지는 6. 목욕 침수, zebrafish 세균성 정지 시간10의 특정 금액에 대 한 인 큐베이 팅에 의해 위장 식민과 질병의 대부분 zebrafish 모델 미생물의 관리에 의존 하는 현재. 그러나,이 어려운 관리, 박테리아의 정확한 복용량을 결정 하 고 특히 비 병원 성 박테리아와 일부 미생물과 제한 된 식민지에 이르게. 또한, 세균 현 탁 액은 구강11를 통해 물고기를 관리 하지만 이것이 기술적으로 도전적이 고 더 오래 된 애벌레 및 성인 물고기.
이 프로토콜 zebrafish 애벌레의 위장 요로에 미생물의 식품을 매개로 배달 차량으로 단 세포 protozoan Paramecium caudatum 의 사용을 설명합니다. Paramecia 간편 하 고 저렴 한 유지 하 고 미생물, 조류, 곰 팡이, 박테리아, 그들은 ciliated 구두 홈12,13,14을 통해 내 면화 등의 다양 한에 먹이의 할 수 있다. 일단 내 면, 박테리아는 그들에서 개최 되는 결국 시 어 지 다 하 고 목차 몇 시간15시간 프레임 저하는. 애벌레 zebrafish paramecia 자연 먹이로 빨리 후에 부 화, 약16, 온도 따라 3-4 dpf 캡처하고 높은 효율으로 그들을 차지 합니다. 먹이 붙 잡음의 과정 검색에서 평균 1.2 s에17, 잡으려고 하 고 캡처된 paramecia zebrafish foregut에 소화 신속 하 게 내 면된 가능한 박테리아는 창 자3에 출시 되는. 그 결과, paramecia zebrafish의 위장 요로에 박테리아의 높은 하 고 일관 된 복용량을 제공 하는 빠르고 쉬운 방법으로 사용할 수 있습니다. 배달 된 박테리아 중 mCherry 같은 형광 단백질을 표현 하는, 여기에 설명 된 대로 변형 될 수 있다 또는 그들은 유전으로 다루기 힘든 박테리아의 경우 미리 내에서 시각화 수 있도록 형광 염료와 스테인드 수는 위장 요 로입니다.
이 프로토콜에 설명 합니다 enteropathogenic 대장균 의 식품을 매개로 전달 (enterohemorrhagic E. 콜라 [EHEC] 및 부착 침략 대장균 [AIEC]), 그리고 ssp. 살 모 넬 라 enterica Typhimurium. 병원 성 대장균 과 S. typhimurium 전송 통해 분 변-구강 경로18,19, 그리고 획득 을 통해 오염 된 음식, 고기, 야채, 유제품 등을 수 있습니다. P. caudatum 를 사용 하 여 차량으로, 대장균 과 S. typhimurium 성공적으로 식민지 화 paramecium 차량 공동 보육의 30-60 분 이내 zebrafish 애벌레. 달성된 세균성 부담 충분히 강력한 시각화 식민 조직 homogenates를 도금 하 여 부담을 결정 하는.

<table><tbody><tr><td>Paramecium caudatum, 라이브</td><td>캐롤라</td>이나 <td>131554</td><td>실온 이하에서 재배 배양액을 보관하지 않음</td></tr><tr><td>0.4% Trypan Blue Solution&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T8154-20ML</td><td>액체, 멸균 여과, 세포 배양에 적합; 0.81% 염화나트륨 및 0.06% 인산칼륨, 이염기성</td></tr><tr><td>디메틸설폭사이드(DMSO)</td><td>Sigma</td><td>276855-100ML</td>로 제조 <td>용매 안전 캐비닛에 보관</td></tr><tr><td>대장균, MG1655</td><td>ATCC</td><td>ATCC 700926</td>는 <td>다른 비병원성 E. coli 균주로</td></tr> <tr><td>대체할 수 있습니다.FM 4-64FX 염색</td><td>Thermo Fisher</td><td>F34653</td><td>부분 표본 및 냉동</td></tr><tr><td>포름알데히드</td><td>보관 Sigma</td><td>F8775-4X25ML</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>Sigma</td><td>L3397-1KG</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 정제</td><td>Thermo Fisher</td><td>18912014</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Sigma</td><td>87128-25G</td><td>독성, 자극성</td></tr><tr><td>트리카인(에틸 3-아미노벤조에이트 메탄 설포 네이트)</td> <td>시그마</td><td>E10521-10G</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>트리판 블루 솔루션, 0.4 %</td> <td>시그마</td><td>93595-50ML</td><td></td></tr><tr><td>울트라 퓨어 저 융점 아가로 오스</td><td>써모 피셔</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>혈구 계 또는 세포 계수기</td><td>실</td><td></td><td></td></tr><tr><td>체 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>탁상용 원심 분리기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로파</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>회전 바퀴</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>가열 된 흔들림 인큐베이터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>수생 시설</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>사육 탱크</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zebrafish 애벌레에 음식 감염에 대 한 차량으로 protozoan paramecium caudatum 를 사용 하 여

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

그들의 투명성, 유전 추적성 및 유지 보수의 용이성, zebrafish (Danio rerio) 전염병은 널리 사용 되는 척추 모델 되고있다. 애벌레 zebrafish 자연스럽 게 단 세포 protozoan Paramecium caudatum에 먹이. 이 프로토콜 애벌레 zebrafish의 식품을 매개로 감염을 위한 차량으로 P. caudatum 의 사용을 설명합니다. P. caudatum internalize 다양 한 박테리아와 세균성 세포는 몇 시간 동안 실행 가능한 유지. Zebrafish P. caudatum에 다음 먹이, 세균성 부하 foregut paramecium 차량 소화 시에 출시 하 고 박테리아는 창 자를 식민지. 프로토콜은 paramecia와 먹이로 paramecia 유지 보수, 박테리아, 로드 세균성 저하 및 복용량, 물론 zebrafish의 감염에 대 한 자세한 설명이 포함 되어 있습니다. 음식을 매개로 감염의이 방법 사용의 장점은 밀접 하 게 인간의 질병에서 감염의 모드를 모방, 침수 프로토콜에 비해 보다 강력한 식민지로 연결을 다양 한 병원 균의 연구를 수 있습니다. Zebrafish 모델에서 식품을 매개로 감염 호스트, 호스트 병원 체 상호 작용, 및 pathogenicity 세균 부담, 지역화, 배포 및 사망률 등의 세균성 유전자 발현을 조사 하기 위해 사용할 수 있습니다.

Paramecium caudatum 는 쉽게 저장 그들에 박테리아의 넓은 범위를 유입. 세포내 세균 밀도 박테리아 및 공동 문화, 사용 하는 세균 종에 있는 paramecia의 밀도에 따라 달라 집니다. 시간이 지나면서, 그들은 시 어 지 다 및 세균성 저하 ensues. 속도 저하의 사용 하는 모든 종자에 대 한 개별적으로 확인할 수 있다. 병원 성 대장균, 초기 세균 밀도 790 박테리아 /paramecium및 박테리아는 약 2.3 h (그림 1)의 반감기를 가진 타락 한.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58949/58949fig1.jpg"> 그림 1: paramecia에 세균성 하프 라이프의 결정. (A) 다음 2 h 공동 보육의 전염 성 대장균, P. caudatum 와 세척 되었고 박테리아 없이 매체에 전송. 숫자 표시 시간 지점에서 가능한 대장균 의 세포 선택적 agar에 희석 도금에 의해 결정 되었다. 결과 의미의 평균 ± 표준 오차 (SEM, n = 3). Paramecium의 (B) 일반적인 이미지 내 면 밝은 필드 (Bi), 형광 박테리아 (Bii), 박테리아 및 채널 (Biii)를 병합. 눈금 막대 20 μ m =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58949/58949fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
또한, zebrafish 먹이 속도, 즉, 어떤 zebrafish에 속도 internalize 공동 보육에 박테리아 로드 paramecia, 공부 했다. 비록 그것은 발견 했다, 애벌레의 개발 가속 30 ° C에서 발생 하 고 동물 먹이 행동 4 dpf에서 표시 애벌레 zebrafish 사냥 하 고 먹이 5 dpf20에서 캡처 시작 합니다. 먹이 행동20 (그림 2A), 눈에 띄는 특성과 먹이 비율의 결정은 가정을 기반으로 각 파업 한 paramecium의 국제화에 이르게이 간주만 수는 근사 ( 내용참조). Zebrafish 애벌레 먹이의 여기 설명 된 관측에 기초를 두어, paramecia 통풍 관 비율은 h (그림 2B) 당 약 1,539 이다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58949/58949fig2.jpg"> 그림 2: 제 브라 먹이 비율의 결정. (A) 표시는 제 브라 paramecia 형광 박테리아를 들고에 먹이 하는 유 충 (5 dpf) 먹이 비디오에서 스틸 이미지. [초] 시간입니다. 화살표는 눈에 띄는 하는 동안 운동의 주요 축을 나타냅니다. 먹이 속도 (시속 paramecia 섭취), 부 량 (B) n에 따라 = 10 동영상 전체 2 시간 노출 시간 점령. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58949/58949fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
Paramecia의 국제화, 다음에서 zebrafish 효율적으로 소화 시스템에 전염 성 박테리아를 방출 foregut에 먹이 저하 됩니다. 여기에 설명 된 대로 paramecia 저하 진행 신속 하 게, 그리고 무료 박테리아 먹이의 30 분 이내 창 자에서 검출 될 수 있다. 박테리아 무료 다음 이동은 foregut에서 중반-후부 및 내장 탐지는 먹이 (그림 3)의 시작 후 약 1-2 h. 소장에서 세균 지 종 및 복용량 범위에 따라 여러에서 E. coli 와 S. enterica몇 일. S. enterica localizes 일부 상피 침공 (그림 3D)과 장 거칠어에 주로 상피 (그림 3C)에 호 중구의 침투에 지도.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58949/58949fig3.jpg"> 그림 3: 박테리아와 제 브라의 식민. Zebrafish 5 dpf에 감염 되지 않은 (A) 왼쪽 또는 mCherry (B) 대장균 또는 (C) S. enterica표현으로 식민지. 감염 실험 야생 타입 (A 와 B) 생선이 나 유전자 변형 라인에서 수행할 수 있습니다 (예를 들어, 라인 안내 (MPO::EGFP) 나114 (C)에 표시 된 녹색 형광 neutrophils 표현. 직장 여는 화살표가 표시 됩니다. 전체-마운트 포함된 애벌레 감염 된 살 모 넬 라 enterica 감염에서에서 장 섹션의 (D) 높은 확대. (디) 블루 Hoechst 핵, (Dii) 보라색 표시 = phalloidin (Diii) 레드 F 걸 표시 = = 살 모 넬 라, (Div) 병합. 눈금 막대 5 μ m를 =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58949/58949fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/58949/58949mov1.jpg"> 영화 1: 먹이 캡처 비디오 푸티지. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58949/PreyCapture.mp4" target="_blank">이 비디오를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

Zebrafish (Danio rerio) 널리 사용 된 척추 동물 모델 미생물 식민과 병에 대 한 되 고 있다. 이 프로토콜 zebrafish 애벌레에 식품을 매개로 감염에 대 한 차량으로 Paramecium caudatum protozoan의 사용을 설명합니다. P. caudatum 쉽게 박테리아를 유입 하 고 애벌레 zebrafish 자연 먹이 행동에 의해 촬영 얻을.

Zebrafish 애벌레에 음식 감염에 대 한 차량으로 Protozoan Paramecium caudatum 를 사용 하 여

Due to their transparency, genetic tractability, and ease of maintenance, zebrafish (Danio rerio) have become a widely-used vertebrate model for ...

이 방법은 위장관에 있는 미생물에 의하여 식민지 와 감염의 역학에 관하여 미생물학 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 인간에서 음식 매개 감염을 더 대표하고 구강 개간에 비해 물고기의 잠재적 인 조직 손상을 감소시킨다는 것입니다. 이 방법의 시각적 데모는 파라메시아의 매우 운동성 특성 때문에 세척 단계가 수행하기 어려울 수 있기 때문에 중요합니다.살아있는 성장 문화에서, 파라메슘 배양1 밀리리터와 e-coli MG1655 배양의 1 밀리리터를 E3 배지의 8밀리리터를 포함하는 10 밀리리터 조직 배양 플라스크에 추가하십시오. 2주마다 1밀리리터의 새로운 10밀리리터를 함유한 새로운 10밀리리터 조직 배양 플라스크에 22도의 플라스크를 가볍게 소용돌이치게 한다. 파라메뮴 내의 세균 반감기수를 결정하기 위해 600개의 파라메시아 박테리아 공동 배양의 광학 밀도에서 파라메시아의 수를 계산하고 6시간 동안 매시간 새로운 1.5 밀리리터 미세센심분리기 튜브에 50 마이크로리터 알리쿼트를 추가한다.PBS에 1% 비이온 계면활성제의 950마이크로리터를 튜브에 추가합니다. 그리고 1분 동안 의 소용돌이로 각 시료에 파라메시아를 lyse한 다음 멸균 PBS에서 각 시료의 10개의 희석제 중 하나를 만듭니다. 그리고 각 희석제의 100 마이크로리터를 섭씨 37도에서 16시간 배양에 선택용 플레이트에 접시에 놓습니다.다음 날, 플레이트에 세균 성 식민지의 수를 결정하기 위해 고립되고 뚜렷한 개별 식민지만 계산합니다. 그리고 30-300 식민지 형성 단위를 산출 희석플레이트를 식별합니다. 감염 전날, 원심분리에 의한 치료당 600배양문화의 광학밀도로부터 1부의 박테리아를 수집한다.그리고 튜브 당 E3 배지의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 다음으로, 각 세균 현탁액에 적절한 세균 얼룩의 마이크로 리터 1 개를 추가합니다. 그리고 호일로 표백 튜브 사진을 보호합니다.박테리아 샘플을 실내 온도에서 15분 동안 엔드 오버 엔드 회전으로 배양하기 전에. 인큐베이션의 끝에서, 과도한 염료를 제거하기 위해 E3 배지의 큰 부피에서 박테리아를 두 번 세척한다. 그리고 튜브 당 신선한 E3 매체의 1 밀리리터에 펠릿을 다시 중단.그런 다음 실온에서 2 시간 동안 조건당 신선한 파라메시아 의 두 플라스크각각에 세균 현탁액 1 밀리리터를 추가하십시오. 조건당 두 플라스크의 내용을 개별 50 밀리리터 원추형 튜브로 가져옵니다. 그리고 원심분리에 의해 샘플을 펠렛.sterilogical 파이펫을 사용하여 각 튜브의 E3 상체의 약 10 밀리리터를 신선한 E3 배지 10 밀리리터로 교체하여 3개의 세심분리에 의해 세정합니다. 마지막 세척 후, E3 슈퍼나티의 약 10 밀리리터를 제거하고 펠릿을 방해하지 않도록 주의하고, E3 배지의 나머지 10 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단한다. 각 현탁액의 500마이크로리터를 개별 1.5 밀리리터 마이크로센리분리기 튜브로 옮기고 원심분리로 파라메시아를 펠릿으로 전달한다.슈퍼나티의 400 마이크로리터를 폐기하고, 36.5%의 포름알데히드 용액 20개에 파라메시아의 나머지 100마이크로리터에 부드러운 파이펫팅을 추가한다. 실온에서 5분 후, 밀리리터당 죽은 파라메시아 수를 계산하기 전에 파이펫으로 각 튜브의 실제 총 부피를 측정합니다. 제브라피시의 식품 매개 감염의 경우, 파라메시아 샘플을 E3 중간 농도의 밀리리터 당 5개 파라메시아로 2배 10배까지 희석시.그리고 각 파라메시아 배양의 밀리리터 3밀리리터를 조건당 6개의 웰 플레이트의 1웰에 추가합니다. 다음으로, 최소한의 액체부피에 10개의 마취된 제브라피쉬를 각 우물로 옮기. 그리고 일광 조건에서 일주 인큐베이터에서 섭씨 30도에서 2 시간 동안 공동 문화를 배양하십시오.먹이 속도를 확인하려면 먹이 캡처의 비디오 영상을 획득하면서 스테레오 현미경으로 먹이 제브라피시를 볼 수 있습니다. 먹이 포획은 먹이를 향해 제브라피쉬의 눈에 띄는 특징이다. 각 스트라이크는 하나의 먹이 캡처 이벤트로 추정된다.인큐베이션이 끝나면 제브라피쉬를 5개의 다른 우물에서 씻어 내고 3밀리리터의 신선한 E3 배지를 함유하고 있으며, 트리카인 리터당 100밀리그램을 잘 보충합니다. 그리고 검은 웰 6 웰 플레이트에 1 % 저용 아가로즈의 3 밀리리터에 각 제브라피쉬를 포함. 모든 물고기가 내장된 경우, 스테레오 현미경 아래에 접시를 놓고 잘린 젤 로딩 팁을 사용하여 머리가 왼쪽에 있고 꼬리가 각 시야에서 오른쪽에 있는지 확인합니다.아가로즈가 설정될 때까지 5분 간 기다린 다음, 임베디드 된 생선을 트리카인으로 보충한 신선한 E3 배지로 오버레이하고 형광 현미경으로 제브라피시를 이미지하여 세균 감염의 진행 상황을 평가합니다. 병원성 대장균의 경우, 초기 세균 밀도는 파라메슘 당 790개의 박테리아이며, 박테리아는 반감기약 2.3시간으로 각 파라메슘 절단 원자의 바쿠올레스 내에서 저하된다. 먹이는 특징적인 타격 동작을 수반하며, 먹이 속도의 결정은 각 파업이 1 파라메슘의 내정화로 이어진다는 가정에 근거한다.소화 후, 무료 박테리아는 포주에서 중간 및 후방 장으로 이동하며, 먹이가 시작된 후 약 1~2시간 후에 검출됩니다. S-enterica, 예를 들어, 상피로 호중구의 침투로 이어지는 일부 상피 침공과 함께 주로 장 점막에서 국소화. 특정 유형의 박테리아와 함께 일하는 것은 매우 위험할 수 있으며 적절한 개인 보호 장비를 착용하는 것과 같은 예방 조치는 항상이 절차를 수행하는 동안 취해야한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

투명 zebrafish의 배아는 다음과 같은 시각화하는 유용한 모델 호스트와 타고난 면역 세포와 세포 세균성 병원체 간의 기능상 학습 상호 작용을...

세포내 세균성 병원균과 Zebrafish 태아의 감염

zebrafish의 급속한 발전, 소형 크기 및 투명성은 감염의 타고난 면역 제어 연구를위한 엄청난...

Zebrafish 애벌레의 분해해 칸디다 증의 비침습 이미징

출처: Flores, E. 외 제브라피시 유충의 식중성 감염 매개체로 원생동물 파라메시움 카우다툼을 이용하기. J. Vis. 경험 (2019년).이 영상은 형광성 대장균에 감염된 파라미시아를 먹여 제브라피시 유충에서 식중성 박테리아 장 감염 모델을 구축하는 방법을 시연합니다.

식중성 박테리아를 이용한 제브라피시 유충의 장 감염 모델링

출처: Li, J. 외.  클로스트리디오이데스 디피실에 대한 유충 얼룩말고기 감염 모델 개발. J. Vis. Exp. (2020).이 영상은 마취된 제브라피시 유충을 아가로스에 고정시키고 추적자 유도 바늘을 이용해 병원성 박테리아를 경구 주입하는 마이크로가비지 시술을 시연합니다. 비침습적 전달은 자연 감염을 모방하여 박테리아 복제, 독소 방출, 장 상피 손상 분석을 가능하게 합니다.

마이크로가비지를 이용한 제브라피시 유충 감염 모델 개발

이 비디오는 제브라피시 유충의 곰팡이 감염을 정량화하는 방법을 보여줍니다. 곰팡이 포자는 유충 후뇌실에 미세 주입되고 유충은 감염이 발생할 수 있도록 배양됩니다. 감염된 유충은 정의된 간격으로 수확되며, 군집 형성 단위를 열거하여 감염 진행 상황을 평가합니다.

제브라피시 유충의 곰팡이 감염을 정량화하는 기술

점막 수준에서의 병원체와 면역 방어의 생체 내 시공간 상호 작용은 기존 척추동물 숙주에서 쉽게 이미지화되지 않습니다. 여기에 제시된 방법은 어린 제브라피쉬의 부레를 감염 부위로 사용하여 살아있는 척추동물의 점막 칸디다증을 연구할 수 있는 다목적 플랫폼을 설명합니다.

Swimbladder 주입에 의해 애벌레 Zebrafish의 점막 칸디다증 모델링

제브라피쉬는 식이 지질 처리 및 대사 질환의 중요한 모델로 부상하고 있습니다. 지질이 풍부한 유충 사료의 프로토콜, 식이 형광 지질 유사체의 실시간 이미징 및 음식 섭취의 정량화가 설명되어 있습니다. 이러한 기술은 다양한 스크리닝, 이미징 및 가설 기반 조사 기술에 적용할 수 있습니다.

애벌레 Zebrafish의에 대한 패러다임을 먹이 고 지방 : 수유, 라이브 영상, 식품 섭취의 정량화

이 프로토콜에 붙일 레이블된 T. cruzi 투명 zebrafish 애벌레로 주입 했다 그리고 기생충 운동 성에서 관찰 되었다 vivo에서 빛 시트 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여.

조사 Trypanosoma cruzi 운동 비보 를 동물 모델로 서 애벌레 Zebrafish의 설립

이 프로토콜의 목표 높은 처리량 패션에 애벌레 zebrafish의 용기를 통해 붙일 레이블 음식의 통과 시간을 측정 하는 것입니다.

애벌레 Zebrafish를 사용 하 여 창 자 환승 시간의 높은 처리량 측정

여기에 제시된 것은 미세 주입 및 비침습적 미세가브지에 의한 형광성 표지 혐기성 C. difficile로 얼룩말 유충을 감염하는 안전하고 효과적인 방법입니다.

클로스트리디오이드 디피실을 위한 애벌레 제브라피쉬 감염 모델 개발

이 프로토콜은 무균(GF) 어류 배아를 얻고 유충에서 유년기까지 유지하기 위한 주요 단계를 간략하게 설명하며, 여기에는 불임 상태 샘플링 및 감지가 포함됩니다. 감염과 함께 GF 모델을 사용하는 것은 숙주 건강에서 미생물의 역할을 이해하는 데 중요합니다.

유충에서 유년기까지 무균 제브라피시 모델의 생성, 유지 관리 및 식별

배우세요 Paramecium caudatum을 이용한 제브라피시 애벌레의 식품 매개 감염 방법을. 이 기술은 인간의 식품 매대 감염을 모델링하고 조직 손상을 최소화하며 장내 미생물 정착 동역학을 연구하는 데 활용됩니다.

Zebrafish 애벌레에 음식 감염에 대 한 차량으로 Protozoan Paramecium caudatum 를 사용 하 여

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