Name: 단백질 폴딩, 전송, 및 방사성 펄스 체이스 하 여 살아있는 세포의 저하의 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 배우세요 살아있는 세포에서 35S-메티오닌과 시스테인을 이용한 방사성 펄스 체이스 기법으로 단백질의 합성, 폴딩, 전송 및 분해 과정을 정량적으로 분석하는 방법을. 이 실험은 세포생물학 및 생화학 연구에 필수적인 도구입니다.

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저자 및 그들의 유익한 토론에 대 한 제시 고이 문서에서 제공 하는 방법 개발에 도움이 과거 Braakman 연구소의 모든 구성원을 감사 합니다. 이 프로젝트는 유럽 연합의 7 차 프레임 워크 프로그램 (FP7 2007-2013 년) N ° 235649 아래 유럽 연구 위원회와 네덜란드 조직의 과학적 연구 (NWO) 에코 프로그램 N ° 711.012.008 아래에서 자금을 받았다.

모든 방사성 시 약 및 절차는 로컬 위트레흐트 대학 방사선 규칙 및 규정에 따라 처리 합니다.
1. 펄스 체이스
<ol><li>
부착 세포에 대 한 펄스 체이스 참고: 여기에서 주어진 볼륨 기반으로 60 mm 셀 문화 요리 합니다. 35 m m 또는 100mm 요리, 곱합니다 볼륨 1/2 또는 2, 각각. 이 프로토콜은 0, 15, 30, 60, 120, 및 240 분의 10 분와 체이스의 펄스 시간을 사용합니다. 이러한 (아래 설명) 공부 되 고 특정 단백질에 따라 변화 될 수 있습니다.<ol>
<li>그렇게 그들은 있을 것입니다 부착 세포 (예를 들어, HEK 293, 헬러, 조) 6 60mm 셀 문화 요리에서 씨앗 펄스 체이스의 날 subconfluent (80%-90%). 시간 포인트 또는 조건 당 적어도 1 개의 접시를 사용 합니다.</li>
		<li>필요한 경우 transfect 셀 제조업체의 지침;에 따라 상용 transfection 시 약을 또는 virally transduce8 셀 1 일전 펄스-체이스 실험 식에 대 한 적절 한 구성.</li>
		<li>워시 버퍼 (행 크의 균형 소금 솔루션 [HBSS])의 2 개 mL와 설거지, 기아 매체 (일반 문화 매체 메티오닌과 시스테인 없이 최소 필수 매체 [가상 메모리] 같은 메티오닌과 시스테인 및 소 태아 혈 청 [FBS] 부족의 2 개 mL를 추가 하지만 10 mM HEPES, pH 7.4), 15 분 동안 5% CO2 와 37 ° C 습도 인큐베이터에서 요리를 놓습니다.</li>
		<li>그들은 물과 접촉 하지만 떠 있 하지 않습니다 prewarmed 37 ° C 물 욕조에 선반에 요리를 전송. 타이머를 시작 합니다.</li>
		<li>40에 s, 기아 중간 발음, 펄스 솔루션 (기아 미디어 + 55 µCi/35 m m 접시, 앞 단계 1.1.1 참고)의 600 µ L를 세우는 피 펫에 추가 부드럽게 접시의 중앙에 정확 하 게 1 분 반복에서이 단계 t에 대 일 분 간격 그 나머지 요리입니다. 실험 하는 동안 시간을 절약할 수 긴 체이스 샘플으로 시작 합니다. 참고: 방사성 물질을 처리 하는 경우 필수적입니다 적절 한 예방 조치 및 로컬 규칙 및 우발적인 노출 및 오염 방지를 규정에 따라.</li>
		<li>정확 하 게 11 분 및 0 분 체이스 샘플 제외한 모든 다음 요리 접시에 직접 체이스 중간의 2 개 mL를 추가 하 고, 발음 한 다시, 체이스 매체의 2 개 mL를 추가. 1 분 간격으로 나머지 요리에 대 한이 단계를 반복 합니다. 37 ° C 배양 기에 모든 요리를 전송.</li>
		<li>정확히 16 분 체이스 중간의 2 개 mL를 추가 (일반 배양 + 10 mM HEPES [pH 7.4] 5mm 시스테인 그리고 메티오닌 5mm) 라벨; 막으려고 펄스 매체 위에 0 분 샘플 접시에 직접 즉시 발음, 냉각된 알루미늄 접시에 접시를 전송 그리고 얼음 정지 버퍼 (HBSS + 20mm N-ethylmaleimide [NEM])의 2 개 mL를 추가 합니다. 참고: 이것은 0 분 체이스 샘플입니다. 이 샘플에 대 한 직접 1.1.9 단계를 진행 합니다.</li>
		<li>다시 물 목욕 2 분 전에 각 체이스 (예를 들어, 15 분 체이스 24 분) 각 체이스 접시를 전송, 정확한 체이스에 (예를 들어, 15 분 체이스 26 분), 체이스 미디어 발음 (또는 microcentrifuge 튜브에 전송 하는 경우 다음과 같은 홍보 otein 분 비)와 냉각된 알루미늄 접시에 접시를 전송. 얼음 처럼 차가운 중지 버퍼의 2 개 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>≥5 분;에 대 한 중지 버퍼에 얼음에 모든 요리를 품 어 그리고, 그만 솔루션 발음 얼음 정지 솔루션의 2 mL와 함께 그것을 씻어. 세척을 발음 하 고 요리 세포의 용 해 버퍼의 600 µ L lyse (인산 염 버퍼 염 [PBS] + nondenaturing 세제 [참조 테이블의 자료] protease 억제제 + 20mm NEM). 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 요리 양적 lysed 되도록.</li>
		<li>1.5 mL microcentrifuge 튜브 및 15000-20000 x g 에서 10 분 및 작은 핵을 4 ° C 원심 분리기는 lysate 전송.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
현 탁 액 셀에 대 한 펄스 체이스 참고: 효율적인 라벨 되도록 3 x 106 5 x 106 셀/mL의 농도에서 세포를 펄스와 체이스 볼륨 4 펄스 볼륨 배 이어야 한다. 다음 예제에서 우리는 5 x 106 셀 10 분 1 mL의 볼륨에 펄스, 항복에 5 시간 추적 (0, 15, 30, 60, 및 120 분)을 포함 하는 시간 포인트 당 1 x 106 셀 1 mL의 포인트. 모든 솔루션은 섹션 1.1에서와 같이.<ol>
<li>세포의 충분 한 수는 실험의 시간에 시간 당 적어도 1 x 106 셀 포인트 및 조건 (예를 들어, 3T3, Jurkat)9 이전 게시 된 프로토콜 따라 서 스 펜 션 셀 문화.</li>
		<li>필요한 경우 셀 제조업체의 지침에 따라 상용 transfection 시 약 transfect 또는 virally transduce8 셀 1 일전 펄스-체이스 실험 식에 대 한 적절 한 구성.</li>
		<li>250 x g 실 온에서 5 분 동안 50 mL 튜브에 조건 당 5 x 106 세포 pellet, 그들을 씻어 기아 미디어의 5 mL을 1 x 그들을 다시, 펠 렛 및 기아 미디어의 1 mL에 그들을 resuspend.</li>
		<li>37 ° C 물 목욕을 셀 전송 및 10-25 분 선동 튜브 하단에 정착에서 세포를 방지 하기 위해 모든 10-15 분에 대 한 그들을 품 어.</li>
		<li>타이머를 시작 합니다. 정확 하 게 1 분에 세포를 포함 하는 튜브에 직접 undiluted 라벨의 275 µCi (55 µCi/1 x 106 셀)을 추가 하 고 혼합 소용돌이. 참고: 방사성 물질을 처리 하는 경우 필수적입니다 적절 한 예방 조치 및 로컬 규칙 및 우발적인 노출 및 오염 방지를 규정에 따라.</li>
		<li>정확 하 게 11 분 체이스 미디어의 4 mL를 추가 하 여 레이블 중지 합니다. 샘플을 혼합 하 고 즉시 차가운 정지 솔루션의 9 mL를 포함 하는 얼음에 1 mL 15 mL 튜브에 전송. 참고: 이것은 0 분 체이스 샘플입니다.</li>
		<li>각 연속 시간 지점에 대해이 단계를 반복 합니다. 일단 모든 시간 포인트를 수집 작은 250 x g 4 ° c.에 5 분에 대 한 셀 발음 매체 (또는 단백질 분 비를 다음과 같은 경우 새로운 15 mL 튜브에 전송). 정지 솔루션의 5 mL로 세포 세척 하 고 250 x g 4 ° c.에 5 분에 대 한 셀을 펠 렛</li>
		<li>발음 그만 솔루션, 완전히 얼음 세포의 용 해 버퍼의 300 µ L로 세포를 lyse 하 고 완전 한 세포의 용 해 되도록 얼음에 20 분 동안 그들을 품 어. 1.5 mL microcentrifuge 튜브 및 작은 핵을 4 ° C에서 15000-20000 x g 에서 10 분 원심 분리기는 lysate 전송.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. Immunoprecipitation
<ol><li>항 체를 결합 (토론 참조) 및 immunoprecipitation 구슬 (예를 들어, 단백질 A-Sepharose)의 50 µ L (10% 중지 [v] 세포의 용 해 버퍼 + 0.25% 소 혈 청 알 부 민 [BSA])는 microcentrifuge에서 튜브 및 ~ 30 분 통에 4 ° C에서 그들을 품 어.</li>
	<li>실 온에서 12000 x g 에서 1 분 동안 구슬 펠 렛 하 고는 상쾌한 발음. 항 체-비드 혼합물에 lysate의 200 µ L을 추가 하 고는 immunoprecipitation 요구 하는 경우 1 시간 또는 머리 오버 헤드에 대 한 통에 4 ° C에서 품 어 > 1 h.</li>
	<li>실 온에서 12000 x g 에서 1 분 동안 구슬 작은 발음은 상쾌한 고 immunoprecipitation 워시 버퍼의 1 mL를 추가 합니다. 5 분 동안 실 온에서 통에 샘플을 놓습니다.</li>
	<li>2.3 단계에서 설명한 대로 구슬 작은 고 반복 세척 1 x. 그리고, 발음은 상쾌한 테 버퍼, pH 6.8 (10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA) 20 µ L에 구슬 resuspend. 소용돌이 샘플입니다.</li>
	<li>감소 시키는 대리인 없이 샘플 버퍼 x 2의 20 µ L 추가 소용돌이, 95 ° C, 그리고 소용돌이에 5 분 동안 그것을 다시 열. 참고: 경우에 감소 샘플 준비, 500mm DTT의 2 µ L 추가 되어야 합니다이 시점에서. 그런 다음, 2.7 단계로 진행 합니다.</li>
	<li>작은 구슬 2.3 단계에서 설명한 대로. 500 mM DTT의 1 µ L을 포함 하는 신선한 microcentrifuge 튜브에 nonreduced 상쾌한의 19 µ L를 전송, 샘플 및 소용돌이 원심 95 ° C에서 5 분 동안 그것을 다시 열 전에.</li>
	<li>12000 x g;에 1 분 샘플 다운 스핀 이것은 감소 된 샘플 이다. 실 온까지 냉각 하 고는 감소 및 nonreduced 샘플을 1 M NEM의 1.1 µ L를 추가 합니다. 소용돌이 스핀 다운 샘플.</li>
</ol>3입니다. SDS 페이지
<ol><li>첫째, 적절 한 SDS 페이지 해결 젤 비율 단백질에 대 한 관심의 결정 합니다. 예를 들어 에이즈-1 gp120, deglycosylated, ~ 60 kDa에 실행 하 고 7.5% 젤에서 분석 된다.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 TEMED 없이 해결 젤 혼합물 준비 (% 아크릴, 375 mM Tris HCl [pH 8.8,] 0.1 %SDS [w/v], x 그리고 0.05% 암모늄 persulfate [APS] [w/v]) 및 진공에 대 한 아래 드 > 15 분. 젤 혼합 기체 제거 동안 철저 하 게 70% 에탄올과 보풀 조직 젤 유리 접시를 청소 하 고 주조 장치에 그들을 배치.</li>
	<li>TEMED (0.005% [v]의 최종 농도)에서 해결 젤 혼합물에 추가 하 고 혼합 철저 하 게, 유리 접시, 겹쳐 쌓이는 젤에 대 한 ~1.5 cm 공간 사이 플라스틱. 신중 하 게 이온된 H2O 또는 소 프로 파 놀 젤 오버레이 그리고 유해를 두고.</li>
	<li>일단 해결 젤은 생산 준비 스태킹 젤 혼합물 (4% 아크릴, 125 mM Tris HCl [pH 6.8], 0.1 %SDS [w/v], 0.025 %APS [w/v]).</li>
	<li>이온 H2O 해결 젤의 상단을 플러시 하 고, 다음, 모든 물을 제거. 참고: 필터 종이 사용 하 여 마지막 방울을 제거.</li>
	<li>TEMED 스태킹 젤 혼합물 (0.005% [v])를 추가, 철저 하 게, 혼합 고 겹쳐 쌓이는 젤과 해결 젤 오버레이 15 잘 빗을 삽입. 겹쳐 쌓이는 젤 생산은 일단 실행 약 실에 그것을 전송 하 고 위와 더 낮은 약 실 버퍼를 실행 하는 것을 채워 (25mm Tris HCl, 글리신 192 m m [pH 8.3], 그리고 0.1 %SDS [w/v]).</li>
	<li>15-레인 minigel에서 차선 당 샘플의 10 µ L을 로드 합니다. 처음에 샘플 및 젤에 마지막 차선을 로드 하지 않도록 고 밴드의 미소를 방지 하기 위해 모든 빈 차선에서 nonreducing 샘플 버퍼를 로드 합니다. 젤에서 실행 상수 25 mA/젤 염료 전면 젤의 아래쪽에 때까지.</li>
	<li>유리 접시에서 제거 하는 젤, 단백질 얼룩 솔루션 젤 얼룩 (10% 초 산 및 H2O + 화려한 0.25%에서 30% 메탄올 블루 R250 [w/v]) 동요와 함께 5 분, 30 분에 대 한 솔루션 (얼룩을 destaining와 destain 그리고 화려한 블루 R250 없이 솔루션).</li>
	<li>정렬 젤 플라스틱에 얼굴 다운 포장 하 고, 다음, 0.4 m m 착 색 인쇄기 종이 그들의 위에 장소. 젤 샌드위치 크로마토그래피 종이 쪽 아래로 장소를 젤에 건조 합니다. 제조업체의 지침에 따라 건조 2 h 80 ° c.에 대 한 젤</li>
	<li>카세트에 말린된 젤 전송 및 autoradiography 영화 또는 인광 체 스크린 오버레이. Autoradiography 필름을 사용 하는 경우는 어두운 방에이 단계를 수행 해야 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-+and+Post-Translational+Protein+Folding+in+the+ER%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER.</a> Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

펄스 추적 방법 그대로 셀에 접히는 단백질의 과학자 들의 이해를 개발 하기 위한 필수 되었습니다. 우리가 가능한 일반적인 방법을 제공 하기 위해 시도 하 고,이 이렇게 공부 접는, 전송, 그리고 단백질의 인생 셀 내부를 하는 동안 발생 하는 다양 한 프로세스를 거의 무한 한 변이 위한 잠재력이 있다.
요리에 부착 세포를 사용 하 여 펄스 체이스를 수행할 때 각 접시 같은 별도 찬으로 가능한 만큼 각 시간 포인트 및 실험에서 조건에 대 한 사용은 치료를 필수적 이다. 특히 짧은 펄스와 체이스 시간에 대 한 (< 5 분), (디지털 타이머)와 펄스와 체이스 번 이상 꽉 컨트롤을 유지 하는 것이 필수적입니다. 현 탁 액 셀과 펄스 따라가는 모든 샘플은 단일 튜브에서 찍은이 다양성을 줄이기 위해 도울 수 있다. 일부 세포 유형 다른 사람 보다 문화 요리 덜 잘 준수로 셀 다양 한 중간 변경 시 멀리 세척 하지는 수 있도록 배려를가지고 한다. 이에이 셀을 사용 하거나 또는 준수 문화 요리...

심지어 상대적으로 간단한 단백질의 폴딩 포함 많은 다른 접는 효소, 분자 보호자, 화학식 수정1. 이러한 프로세스에서 생체 외에서 의 완전 한 재구성 실질적으로 불가능 하다, 관련 된 다른 구성 요소의 광대 한 번호. 그것은 매우 바람직한, 그러므로, 라이브 셀에서 vivo에서, 접히는 단백질을 공부 하입니다. 방사성 펄스-체이스 기술을 증명 합성, 접는, 전송, 그리고 그들의 자연적인 환경에 있는 단백질의 공부를 위한 강력한 도구.
대사 35S 표시 된 메티오닌 시스테인과 짧은 펄스 동안 단백질의 라벨, 방사성 라벨의 부재에 체이스 뒤, 넓은 셀룰러 환경에서 새로 합성된 단백질의 인구의 특정 추적을 수 있습니다. 그리고 대상 단백질 격리 를 통해 immunoprecipitation 수 분석을 통해 SDS 페이지 또는 다른 기술. 많은 단백질에 대 한 셀을 통해 그들의 여행은 SDS 페이지 젤에 표시 되는 수정에 의해 표시 됩니다. 예를 들어 골 복잡 한 당화 단백질 바인딩과 그물 (응급실)에서 교통은 종종 함께 N 연결 된 glycans의 수정 또는 O 연결 glycans2,3의 추가 합니다. 이러한 수정 이동성 변화 SDS 페이지에 의해 볼 수 있는 명백한 분자 질량에 있는 큰 증가 일으킬. 성숙 신호 펩 티 드 분열 등 프로-펩 티 드, SDS 페이지 젤4에 쉽게 따라 할 수 있는 명백한 분자 질량에 있는 변화 결과로 제거 분해 분열에 의해 표시할 수 있습니다. 방사능 어디 소설 단백질 합성 방지, 긴 치료 세포에 독성 그리고 더 오래 된, 안정 상태에서 단백질의 대부분을 제외 하지 마십시오 cycloheximide 추격전 같은 유사한 기술에 비해 상당한 장점을 있는 분석, 일부 단백질 일의 반감기를가지고. 모두 nonreducing에서 단백질의 비교 조건 감소 고 이황화 결합 형성, 많은 분 비 단백질4,,56, 의 폴딩에 중요 한 단계 분석 7.
여기 우리가 방사성 펄스-체이스 방식을 사용 하 여 단백질 폴딩과 그대로 셀에 수송의 분석에 대 한 일반적인 방법을 설명 합니다. 우리로 방법을 제공 하는 목적으로 하는 동안, 가능한 상세한 프로토콜 적응성에 대 한 거의 무한 한 잠재력이 고 각 독자의 특정 단백질 공부를 최적화 하면.
두 개의 다른 펄스-체이스 프로토콜, 부착 셀 (여기에 제시 된 프로토콜의 단계 1.1)와 현 탁 액 셀 (여기에 제시 된 프로토콜의 단계 1.2) 제공 됩니다. 조건을 제공 여기 중간-높은 식 수준으로 표현 되는 단백질을 시각화 하기에 충분. 독자가 제대로 표현한 단백질 또는 여러 immunoprecipitations 등의 다양 한 posttreatment 조건으로 작동 하는 경우 그것이 접시 크기를 늘리거나 셀 번호를 적절 하 게 필요 합니다.
서 스 펜 션 펄스 체이스, 체이스 샘플 각 시간 지점에서 찍은 모두에서 가져옵니다 셀의 단일 튜브. 세척 단계 후 펄스는 생략; 대신, 추가 35S의 레이블이 메티오닌과 시스테인의 높은 과잉을 가진 희석에 의해 방지 된다.
제시 프로토콜 세포질 단백질 접히는 과정에 따라 방사성 35S 표시 된 시스테인 그리고 메티오닌을 사용 합니다. 연산자와 환경 방사능 방사선에의 한 노출을 최소화 하 여 지정 된 실험실에서 수행 될 적절 한 보호 조치를 사용 하 여 방사성 시 약으로 모든 작업을 수행 되어야 합니다. 펄스-체이스로 기술 라벨은 상대적으로 효율적인 짧은 펄스 시간에 (< 15 분), 방사능의 시작 금액의 1%는 새로 합성된 단백질에 포함 하는 보다는 더 적은. Immunoprecipitation 통해 대상 단백질의 농축 후 방사능의 시작 금액의 0.05% 미만 SDS 페이지에 대 한 샘플에 포함 되어 있습니다.
35S 메티오닌과 시스테인 믹스 라벨 안정화는, 비록 일부 분해, 휘발성 방사성 화합물, 저조한 발생 합니다. 연구원 및 기구를 보호 하기 위해 몇 가지 예방 조치는 취해야 한다. 연구원 항상 로컬 방사선 안전 규칙을 순종 해야 하 고 숯 마스크 실험실 외 투와 (더블) 장갑 외에 간호를 입을 수 있습니다. 증기 두건에서 또는 로컬 포부 지점에서 35S 메티오닌과 시스테인 재고 튜브 항상 열 수 있습니다. 알려진된 실험실 오염 명소 원심 분리기, 펫, 물 욕, 인큐베이터 및 동영상 있습니다. 차콜 필터, 긍정적인 물개 microcentrifuge 튜브 ( 재료의 표참조), 펄스-체이스 요리에 붙어 물 목욕, 숯 필터 종이에 목탄 수족관 스폰지 피 펫 팁을 사용 하 여이 분야의 오염 감소 목탄 가드 포부 시스템 및 요리 incubators 및 스토리지 컨테이너에 숯 곡물의 배치.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL safeseal 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>72.706.400</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>Sigma</td><td>A6283</td><td>빙초산</td></tr><tr><td>BAS 저장 형광체 스크린 20x25 cm</td><td>GE Life Sciences</td><td>28956475</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Sigma</td><td>B8026</td><td>분자생물학 등급</td></tr><tr><td>Carestream Biomax MR 필름</td><td>Kodak</td><td>Z350370-50EA</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 배지</td><td>다양한</td><td>N/A</td><td>특정 세포주에 대한 일반 세포 배양 배지 사용</td></tr><tr><td>세포 배양 배지, 메티오닌/시스테인 없음</td><td>다양한</td><td>N/A</td><td>일반 배양 배지와 동일한 배지 제형(예: DMEM/MEM/RPMI, 메티오닌 및 시스테인 결</td></tr><tr><td>핍) 숯 여과지</td><td>Whatman</td><td>1872047</td><td></td></tr><tr><td>숯 여과 피펫 팁</td><td>분자 bioproducts</td><td>5069B</td><td></td></tr><tr><td>숯 진공 가드</td><td>Whatman</td><td>67221001</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R250</td><td>Sigma</td><td>112,553</td><td>전기영동용</td></tr><tr><td>Cysteine</td><td>Sigma</td><td>C7352</td><td>분자 생물학 등급, 500 mM 재고 만들기, -20&nbsp에서 보관;</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td> <td>Sigma</td><td>10197777001</td><td>분자 생물학 학년</td></tr><tr><td>EasyTag Express35S 단백질 라벨링 믹스</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG772014MC</td><td>용도에 따라 라벨의 다른 크기 배치를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E1644</td><td>분자 생물학 학년</td></tr><tr><td>젤 건조 장비</td><td>다양한</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마</td><td>G5516</td><td>분자생물학 등급</td></tr><tr><td>3등급 크로마토그래피 종이</td><td>GE Life Sciences</td><td>3003-917</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>24020117</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes 섬세한 작업 와이프</td><td>VWR</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>M3671</td><td>분자생물학 등급</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>시그마</td><td>MX0490&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>메티오닌</td><td>시그마</td><td>M5308</td><td>분자 생물학 등급, 250 mM 재고 확인, -20</td></tr><tr><td>Minigel 주조 / 실행 장비</td><td>다양한</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>분자 생물학 등급</td></tr><tr><td>N-에틸말레이미드</td><td>시그마</td><td>E3876</td><td>분자 생물학 등급, 100% 에탄올로 1M 재고 제작, -20</td></tr><tr><td>PBS</td><td>시그마</td>에 보관<td>P5368</td><td>분자 생물학 등급</td></tr><tr><td>단백질 -A 세파 로스 패스트 플로우 비드</td><td>GE 건강 관리</td><td>17-5280-04</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)</td> <td>시그마</td><td>L3771</td><td>분자 생물학 등급</td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마</td><td>T8787</td><td>분자 생물학 등급</td></tr><tr><td>트리즈마 염기 (트리스)</td> <td>시그마</td><td>T6066</td><td>분자 생물학 등급</td></tr><tr><td>태풍 IP 생체 분자 이미저</td><td>Amersham</td><td>29187194</td><td></td></tr><tr><td>Unwire 시험관 랙 20mm 수조용</td><td>Nalgene</td><td>5970-0320PK</td><td></td></tr></tbody></table>

단백질 폴딩, 전송, 및 방사성 펄스 체이스 하 여 살아있는 세포의 저하의 분석

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

방사성 펄스-체이스 라벨 구조적 성숙, 그들의 기능 세포 위치와 라이브 셀에 대상 단백질의 저하를 전송 위한 강력한 도구입니다. 짧은 (펄스) radiolabeling 시간을 사용 하 여 (< 30 분) 체이스 시간을 엄격 하 게 제어 하 고 총 단백질 풀의 극히 일부에 고의 접는 따라 수. Nonreducing/감소 SDS polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지) 및 immunoprecipitation (나 란 특정) 항 체와 결합 될 때 프로세스를 접는 훌륭한 세부 사항에서 시험 될 수 있다. 이 시스템 단백질 용 해 단백질, 단일 및 멀티 패스 막 횡단 단백질, 무 겁 게 N 및 O 당화 단백질, 속성에 거 대 한 변화 및 광범위 한 이황화 없이 단백질의 폴딩 분석 하는 데 사용 되었습니다. 결합. 펄스 추적 방법 등 공동 및 posttranslational 수정, oligomerization, 중 합, 근본적으로 죽음에 출생에서 단백질의 분석을 수 있도록 추가 기능의 범위에 활동적인 연구의 기초입니다. 단백질 폴딩에 펄스 체이스 학문은 증가 시간적 해상도 생리 적인 정보를 제공 하 여 단백질에서 생체 외에서 공부에 대 한 생화학 및 생물 다른 방법으로 보완. 이 문서에서 설명 된 대로 메서드는 포유류 나 곤충 세포 시스템에서 표현할 수 있는 거의 모든 단백질 폴딩 공부를 쉽게 적응 됩니다.

접는 에이즈-1 gp120 부착 펄스 체이스에서의 분 비는 그림 2에 표시 됩니다. (그림에서 셀 NR) nonreducing 젤 gp120의 산화 접는 보여줍니다. 체이스 진행 되는 동안, 밴드 마이그레이션합니다 통해 젤 다운 더욱 확산 꽉 밴드 (NT)에 축적 될 때까지 (그것) 중간체를 접는 펄스 직후 확산 밴드, 젤 높은 나타납니다 5 분 (0 분 체이스) gp120의 라벨 기본적으로 접힌된 gp120을 나타내는입니다. 이 이황화 결합의 형성 증가 완전히 감소 단백질 보다 더 빨리 이동 하는 단백질의 압축 발생 합니다. 줄이는 젤 (그림에서 셀 R)에 모든 형태에 이황화 결합 되도록, 체이스 항상, 그들은 영향을 주지 않습니다 이동성 감소 되었습니다. 다른 수정 분석 수 있습니다. Ru에서 Rc 시간 동안 근무 나타냅니다의 gp120 posttranslational 신호 펩 티 드 분열: 신호 펩 티 드, 더 ...

여기는 접는, 전송 및 라이브 셀에 따라 단백질의 저하의 운동 분석을 허용 하는 일반적인 펄스-체이스 메서드에 대 한 프로토콜에 설명 합니다.

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

35S 라벨메티오닌과 시스테인을 이용한 방사성 펄스 추격은 여전히 살아있는 세포에서 시간이 지남에 따라 단백질 생합성을 조사하는 유일한 생화학적 방법입니다. 단백질 생합성은 번역, 접이식 및 조립, 인신매매 및 분해를 모두 다룹니다. 방사성 펄스 추격전과 이황화 결합 형성 및 아세틸화와 같은 공동 및 번역 후 단백질 수정의 분석을 결합하면 단백질의 믿음을 시간이 지남에 따라 조사하기 위한 민감하고 정량적인 분석을 제공합니다.이 절차에는 좋은 초점과 실험 처리가 필요합니다. 버퍼, 방사성 작업 공간 및 명확한 일정과 같은 좋은 준비는 중요합니다. 이 비디오는 방사성 펄스 추적 프로토콜의 어깨 보기를 통해 명확합니다.절차를 시연하는 것은 우리 실험실에서 pHd 후보인 후이잉 여(Hui Ying Yeoh)가 될 것입니다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 종자 transfect 및 배양 셀을 시드합니다. 펄스 추적 하기 전에 현미경을 통해 세포를 검사 합니다.다음으로, 세척 버퍼의 두 밀리리터로 설거기를 씻는다. 그리고 세포에 기아 배지의 2 밀리리터와 15 분 동안 5 %의 이산화탄소와 섭씨 37도에서 가습 된 인큐베이터에 접시를 배치합니다. 펄스 추적 설정이 순서대로 되어 있는지 확인합니다.미리 따뜻하게 섭씨 37도까지 미리 데운 수조의 랙으로 요리를 옮기. 요리가 물과 접촉하고 있는지 확인하지만, 떠있지 않습니다. 그런 다음 타이머를 시작합니다.40초에서 기아 매체를 흡인합니다. 마이크로 파이프를 사용하여 600 마이크로리터의 펄스 용액을 그립니다. 정확히 1분 만에 펄스 용액을 접시 중앙에 부드럽게 추가합니다.기아 매체를 제거하고 나머지 요리에 대한 펄스 용액을 1분 간격으로 추가하는 과정을 반복합니다. 정확히 11 분에서 펄스 추적 계획에 따라, 0 분 추적 샘플을 제외하고, 모든 다음 요리에 대한, 접시에 직접 추적 매체의 두 밀리리터를 추가합니다. 추적 매체를 흡인하고 신선한 추적 매체의 두 밀리리터로 대체합니다.남은 모든 요리에 대해 1분 간격으로 이 과정을 반복합니다. 타이머가 정확히 16분을 읽을 때, 펄스 매체 위에 0 분 추적 접시에 직접 체이스 매체의 두 군대를 추가하여 라벨을 중지합니다. 즉시 매체를 흡인합니다.접시를 냉각 된 알루미늄 접시에 옮기고 얼음 냉간 정지 버퍼 두 마리를 추가합니다. 다른 모든 요리를 섭씨 37도에서 인큐베이터로 옮기. 각 추적 접시를 인큐베이터에서 각 추격 시간이 끝나기 2분 전에 수조로 옮기다.각 접시에 대한 정확한 추적 시간에, 추적 매체를 흡인하고 냉각 알루미늄 접시에 접시를 전송합니다. 얼음 콜드 스톱 버퍼 2밀리리터를 추가합니다. 모든 접시를 얼음 위에 두고 세포를 lyse 할 시간이 있을 때까지 버퍼를 중지하십시오.그런 다음 정지 용액을 흡착하고 모든 접시를 씻으십시오. 얼음 냉간 정지 용액 2 밀리리터와 동시에 3. 정지 용액을 완전히 흡인하고 한 번에 600 마이크로 리터의 용해 버퍼를 두 접시에 추가합니다.셀 스크레이퍼를 사용하여 접시 표면을 철저히 긁어 내지만 부드럽게 섞어 줍니다. 각 접시에서 신선한 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 lysate를 옮김합니다. 15, 000 ~ 20, 000 G의 원심분리기는 핵을 펠릿하는 데 10분 동안 섭씨 4도에서 000 G.서스펜션 세포에 대한 펄스 추격을 위해 1개의 50 밀리리터 튜브에서 시간당 5백만 개의 세포를 수집한다. 텍스트에 설명된 대로 기아 절차를 수행합니다. 수조에서 15 분 동안 기아 시술 후 타이머를 시작합니다.정확히 1 분, 세포를 포함하는 튜브에 직접 희석되지 않은 라벨의 275 마이크로 큐피를 추가하고 혼합 소용돌이. 정확히 11분 만에 4밀리리터의 체이스 미디어를 추가하여 라벨링을 중단합니다. 그리고 즉시 라벨링을 중지하는 얼음 차가운 정지 솔루션9 밀리리터를 포함하는 얼음에 15 밀리리터 튜브에 밀리리터를 전송합니다.각 연속 추격 시간 지점에 대한 정지 솔루션의 아홉 밀리리터를 포함하는 얼음에 튜브에 추격의 1 밀리리터를 전송하는이 과정을 반복합니다. 면역 침전 후, 마지막 세척을 완전히 흡인. TE 버퍼 및 소용돌이의 20 마이크로 리터에서 구슬을 다시 중단합니다.감소 제고없이 두 개의 X 샘플 버퍼20 마이크로 리터를 추가합니다. 샘플을 소용돌이로 간 후 섭씨 95도에서 5분간 가열합니다. 샘플을 다시 소용돌이시다.원심분리기는 실온에서 12, 000배 G로 1분 동안. 500 밀리머 DDT의 마이크로리터 1개를 포함하는 신선한 미세 원심 분리기 튜브로 감소되지 않은 체퍼나탈19마이크로리터를 전달합니다. 필요한 경우 모든 액체가 바닥에 있도록 샘플을 신속하게 원심 분리합니다.그리고 5 분 동안 섭씨 95도에서 가열합니다. 감소된 샘플을 식힌 다음 소용돌이를 식힙니다. 원심분리기는 1분 동안 실온에서 12배, 000배 G의 감소 및 비감소 시료를 모두 한 다음 모든 샘플에 1개의 어금니 NEM의 1.1 마이크로리터를 추가합니다.이 연구에서는 방사성 펄스 추적 접근법이 단백질 접기 및 운반을 손상시키지 않는 세포에서 분석하는 데 사용됩니다. HIV1 GP120의 접이식 및 분비은 부착된 펄스 추격전에서 여기에 표시됩니다. 비감소 젤은 GP120의 산화 접기를 나타낸다.펄스 라벨링 직후, 젤에서 더 높은 확산 밴드로 나타납니다. 추격이 진행됨에 따라, 밴드는 GP120에서 기본적으로 접힌 것을 나타내는 타이트 한 밴드에 축적 될 때까지 더 확산 접이식 중간체를 통해 젤 아래로 이동합니다. 이것은 이황화물 결합의 형성이 단백질의 압축성을 증가시켜 완전히 감소된 단백질보다 빠르게 이동하게 함에 따라 발생합니다.감소 젤에, 이황화물 결합 및 모든 분자 감소 하 고 mobiilty에 영향을 주지 않습니다. 따라서 이동성의 차이는 분자 질량의 변화의 결과일 뿐입니다. 감소된 신호 펩타이드 아클라베드 형태에서 감소된 신호 펩타이드 절단 형태로의 시간이 지남에 따라 GP120의 번역 후 신호 펩티드 골짜기를 나타낸다.더 많은 단백질이 네이티브 접을 달성하고 그들의 신호 펩티드를 분실하기 때문에 추격 도중 증가하는 신호 펩티드의 손실 때문에 이동성이 증가합니다. 비 감소 및 감소 젤 모두에서, 신호는 GP120의 분비로 인해 약 1 시간 에서 감소하기 시작합니다. 미디어를 분석하여 모니터링할 수 있습니다.이 방법은 오가노이드 세포 모델을 포함한 모든 세포주에도 적용됩니다. 그러나 성공은 크게 관심의 단백질의 발현 수준에 따라 달라집니다. 이 절차를 시작하기 전에, 당신의 요리를 표시하고 실험 을 통해이 순서를 유지합니다.기아 매체를 추가하기 전에 모든 것이 준비되었는지 확인하십시오. 이것은 실험의 시작입니다. 그리고 당신의 실험실 시간은 당신의 친구이지만, 당신이 준비되지 않은 경우 가장 큰 적이 될 수 있습니다.빌의 추적은 시간이 지남에 단백질의 전체 재산을 조사하기 위해 제한된 proteolysis와 결합 될 수있다. 또한 다른 선출 된 냉동고 방법은 헹구거나 엄격하거나 충전 차이의 분석을 허용합니다. 연구자와 장치를 보호하기 위해 모든 지역 방사선 안전 규칙을 준수해야 합니다.그리고 보호 조치는 프로토콜에 따라 취해야한다. STH 페이지에 사용되는 아크릴아미드는 신경 독성이 있습니다.

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연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

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형광 단백질에서 프롤린 유사체에 의한 프롤린의 잔기 특이적 교환 : 백본의 "분자 수술"이 폴딩 및 안정성에 미치는 영향

배우세요 살아있는 세포에서 35S-메티오닌과 시스테인을 이용한 방사성 펄스 체이스 기법으로 단백질의 합성, 폴딩, 전송 및 분해 과정을 정량적으로 분석하는 방법을. 이 실험은 세포생물학 및 생화학 연구에 필수적인 도구입니다.

단백질 폴딩, 전송, 및 방사성 펄스 체이스 하 여 살아있는 세포의 저하의 분석

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