Name: 전체 게놈 DNA 분석을 위한 매우 긴 읽기 시퀀싱 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: 학습하세요 초장기 DNA 서열 분석 방법으로 나노포어 시퀀싱을 활용하여 인간 세포에서 고분자량 DNA를 추출하고 라이브러리를 준비하는 전체 과정을 익히세요. 이 기술은 게놈 복잡성 연구와 정밀 의학에 활용됩니다.

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저자는 원고에 대 한 그녀의 의견에 대 한 당 주를 감사합니다. 이 간행물에 보고 된 연구 보너스 번호 P30CA034196에서 국립 보건원의 국립 암 연구소에 의해 부분적으로 지원 되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다.

<ol><li>Mardis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing platforms.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 6, 287-303 (2013).</li>
<li>Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coming+of+age%3A+ten+years+of+next-generation+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (6), 333-351 (2016).</li>
<li>Shendure, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+at+40%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing at 40: past, present and future.</a> Nature. 550 (7676), 345-353 (2017).</li>
<li>Alkan, C., Coe, B. P., Eichler, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+structural+variation+discovery+and+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome structural variation discovery and genotyping.</a> Nature Reviews Genetics. 12 (5), 363-376 (2011).</li>
<li>Weischenfeldt, J., Symmons, O., Spitz, F., Korbel, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+impact+of+genomic+structural+variation%3A+insights+from+and+for+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Phenotypic impact of genomic structural variation: insights from and for human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 14 (2), 125-138 (2013).</li>
<li>Pollard, M. O., Gurdasani, D., Mentzer, A. J., Porter, T., Sandhu, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+reads%3A+their+purpose+and+place%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Long reads: their purpose and place.</a> Human Molecular Genetics. 27 (R2), R234-R241 (2018).</li>
<li>Cretu Stancu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+phasing+of+structural+variation+in+patient+genomes+using+nanopore+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mapping and phasing of structural variation in patient genomes using nanopore sequencing.</a> Nature Communications. 8 (1), 1326(2017).</li>
<li>Gong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picky+comprehensively+detects+high-resolution+structural+variants+in+nanopore+long+reads%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Picky comprehensively detects high-resolution structural variants in nanopore long reads.</a> Nature Methods. 15 (6), 455-460 (2018).</li>
<li>Sedlazeck, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+detection+of+complex+structural+variations+using+single-molecule+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Accurate detection of complex structural variations using single-molecule sequencing.</a> Nature Methods. 15 (6), 461-468 (2018).</li>
<li>Jain, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopore+sequencing+and+assembly+of+a+human+genome+with+ultra-long+reads%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanopore sequencing and assembly of a human genome with ultra-long reads.</a> Nature Biotechnology. 36 (4), 338-345 (2018).</li>
<li>Jain, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+data+analysis+for+the+MinION+nanopore+sequencer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved data analysis for the MinION nanopore sequencer.</a> Nature Methods. 12 (4), 351-356 (2015).</li>
<li>Deamer, D., Akeson, M., Branton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+decades+of+nanopore+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Three decades of nanopore sequencing.</a> Nature Biotechnology. 34 (5), 518-524 (2016).</li>
<li>Jain, M., Olsen, H. E., Paten, B., Akeson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Oxford+Nanopore+MinION%3A+delivery+of+nanopore+sequencing+to+the+genomics+community%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">The Oxford Nanopore MinION: delivery of nanopore sequencing to the genomics community.</a> Genome Biology. 17 (1), 239(2016).</li>
<li>Editorial, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long+view+on+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The long view on sequencing.</a> Nature Biotechnology. 36 (4), 287(2018).</li>
<li>Jain, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+assembly+of+a+human+centromere+on+the+Y+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Linear assembly of a human centromere on the Y chromosome.</a> Nature Biotechnology. 36 (4), 321-323 (2018).</li>
<li>Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimap2%3A+pairwise+alignment+for+nucleotide+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Minimap2: pairwise alignment for nucleotide sequences.</a> Bioinformatics. 34, 3094-3100 (2018).</li>
<li>De Coster, W., D'Hert, S., Schultz, D. T., Cruts, M., Van Broeckhoven, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoPack%3A+visualizing+and+processing+long-read+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">NanoPack: visualizing and processing long-read sequencing data.</a> Bioinformatics. 34, 2666-2669 (2018).</li>
<li>Akabayov, B., Akabayov, S. R., Lee, S. J., Wagner, G., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+macromolecular+crowding+on+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Impact of macromolecular crowding on DNA replication.</a> Nature Communications. 4, 1615(2013).</li>
<li>Gabrieli, T., Sharim, H., Michaeli, Y., Ebenstein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-Assisted+Targeting+of+CHromosome+segments+%28CATCH%29+for+targeted+nanopore+sequencing+and+optical+genome+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Cas9-Assisted Targeting of CHromosome segments (CATCH) for targeted nanopore sequencing and optical genome mapping.</a> bioRxiv. , (2017).</li>
<li>Gabrieli, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+nanopore+sequencing+of+human+BRCA1+by+Cas9-assisted+targeting+of+chromosome+segments+%28CATCH%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Selective nanopore sequencing of human BRCA1 by Cas9-assisted targeting of chromosome segments (CATCH).</a> Nucleic Acids Research. , (2018).</li>
</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

원칙적으로, nanopore 시퀀싱 길이11,,1213megabase 읽기 100 킬로바이트를 생성할 수 있다. 4 주요 요인 시퀀싱 실행 및 데이터 품질의 성능에 영향을 미칠 것입니다: 1) 활성 공 숫자와 모 공;의 활동 nanopore를 통과 하는 DNA의 속도 제어 하는 2) 모터 단백질 3) DNA 템플렛 (길이, 순도, 품질, 질량); 4) 시퀀싱 어댑터 결 찰 효율성, 입력된 샘플에서 유용한 DNA를 결정 합니다. 처음 두 가지 요소는 흐름 세포와 제조업체에서 제공 하는 시퀀싱 키트의 버전에 따라 달라 집니다. 두 번째 두 가지 요소 (HMW DNA 추출, 전단 및 결 찰)이이 프로토콜에 중요 한 단계가 있습니다.
이 프로토콜에는 인 내와 연습이 필요합니다. HMW DNA의 품질은 매우 긴 DNA 라이브러리6중요 합니다. 높은 생존 된 셀으로 시작 하는 프로토콜 (> 85% 가능한 셀 선호), 죽은 세포에서 저하 DNA를 제한. (예를 들어, 강력한 방해, 떨고, 소용돌이, 여러 pipetting, 반복 중지 및 재개) DNA에 손해를 도입할 수 있는 어떤 가혹한 과정은 피해 야 한다. 프로토콜의 디자인에 우리는 전체 DNA 추출 과정에서 pipetting 생략 합니다. 넓은 구멍 팁 pipetting 필요한 경우 도서관 건설 중 기계 전단 및 시퀀싱 후 사용할 필요가 있다. nanopores 챔버 버퍼12에서 화학 물질에 민감한 때문에, 이어야 한다 적은 잔여 오염 물질 (예를 들어, 세제, 계면 활성 제, 페 놀, 에탄올, RNAs 단백질, 등) 가능한 DNA에서. 길이 및 수율을 고려 하면 페 놀 추출 방법 지금까지 테스트 하는 여러 다른 추출 방법에 비해 최고의 그리고 가장 재현성 결과 보여 줍니다.
이 프로토콜의 생산 능력을 오래 읽기 시퀀스에 불구 하 고 몇 가지 제한이 여전히 남아 있다. 첫째,이 프로토콜 nanopore 시퀀싱 장치 간행물;의 시간에 사용할 수에 따라 최적화 되었다 따라서, 그것은 선택적 nanopore 기반 시퀀싱 화학 제한 되며 다른 유형의 긴 읽기 시퀀싱 장치에서 수행 하는 경우 최적이 될 수 있습니다. 둘째, 결과 매우 시작 물자 (조직 또는 세포)에서 추출한 DNA의 품질에 의존 합니다. 읽기 길이 시작 DNA 이미 저하 또는 손상 된 경우 손상 될 것 이다. 셋째, 여러 품질 관리 단계는 DNA 품질을 확인 하려면 프로토콜에 통합 됩니다, 비록 최종 수율과 읽기의 길이 흐름 세포에 의해 영향을 받을 수 및 활동, nanopore 시퀀싱 플랫폼의 초기 단계에서 변수를 수 있는 기 공 개발입니다.
설명 하는 프로토콜은 여기 DNA 추출에 대 한 인간의 현 탁 액 셀 라인 샘플을 사용 합니다. 우리는 바늘 전단, transposase와 설명된 결과를 내 고 시간을 HMW DNA의 비율에에서 지나가는 시간을 최적화 했습니다. 프로토콜 4 가지 방법으로 확장 될 수 있다. 첫째, 사용자가 다른 경작된 한 포유류 세포와 세포, 조직, 임상 샘플, 또는 다른 생물의 다른 금액으로 시작할 수 있습니다. 세포 배양 시간, 반응 볼륨 및 원심 분리에 더 최적화가 필요 합니다. 둘째, 그것은 매우 긴 읽기 시퀀싱에 대 한 대상 크기를 예측 하기 어렵다. 읽기 길이 예상 보다 짧은 경우에, 사용자가 기계적인 전단 기반 방법에 지나가는 시간을 조정 하거나 transposase 조각화 기반 메서드에서 transposase을 HMW DNA의 비율을 변경할 수 있습니다. 바인딩 및 차입 장시간 정리 단계 동안 HMW DNA는 높은 점성 때문에 도움이 됩니다. 셋째, 다른 nanopore 시퀀싱 장치와 하나 양과 DNA 시퀀서의 기준을 충족의 볼륨을 조정할 수 있습니다. 넷째, 시퀀싱 어댑터에 출혈 하는 DNA에만 시퀀싱 합니다. 추가로 결 찰 효율성을 개선 하기 위해, 하나의 어댑터와 리가 농도 적정 시도할 수 있습니다. 수정된 결 찰 시간 및 분자 크롤 링 에이전트 못18 등 미래에 적용할 수 있습니다. CRISPR19,20 와 함께 매우 긴 DNA 시퀀싱 프로토콜 대상 농축 시퀀싱을 위한 효과적인 도구를 제공할 수 있습니다.

지난 10 년 동안 대규모 병렬 하 고 매우 정확 하 게 2 세대 높은 처리량 시퀀싱 기술 주도 생물 발견 및 기술 혁신1,2,3의 폭발. 기술 진보에도 불구 하 고 2 세대 플랫폼에 의해 생성 된 짧은 읽기 데이터 복잡 한 게놈 영역 해결에 효과가 및 게놈 구조 변형 (SVs), 인간에서 중요 한 역할을의 검출에 제한 됩니다. 진화와 질병4,5. 또한, 짧은 읽기 데이터 반복 변화를 확인할 수 없습니다 하 고 분별 haplotype 유전 이체6의 단계적 적합 하지 않습니다.
단일 분자 시퀀싱 제공 훨씬 더 최근 진행 길이, SVs7,,89, 전체 스펙트럼 및 제공 정확 하 고 완벽 한 복잡 한 검색을 용이 하 게 수 읽기 미생물 및 포유류 게놈6,10. Nanopore 플랫폼 직접 모11,,1213DNA 통행에 의해 중재 현재 변화를 측정 하 여 단일 분자 시퀀싱을 수행 합니다. 모든 기존 DNA 시퀀싱 화학, 달리 nanopore 시퀀싱을 생성할 수 있습니다 오래 (kilobases 수천 수만) 읽기 실시간 중 합 효소 활동에 의존 하지 않고 또는 인공 DNA 샘플의 증폭. 따라서, nanopore 긴-읽기 (NLR-seq) 낮은 복잡성 또는 반복 풍부한에서 특히 크게 게놈 및 생물 의학 분석14사전 것, 100kb 이상의 매우 긴 읽기 길이 생성 하기 위한 위대한 약속을 보유 하 고 시퀀싱 게놈15의 영역입니다.
Nanopore 시퀀싱의 독특한 기능은 잠재적인 긴 생성을 이론적인 길이 제한 없이 읽습니다. 따라서, 읽기 길이 DNA 무결성 및 시퀀싱 템플릿 품질에 의해 영향을 받는 직접 DNA의 물리적 길이에 따라 달라 집니다. 또한, 조작 및 단계, pipetting 세력 및 추출 조건 등의 수의 정도 따라 DNA의 품질이 매우 다양 합니다. 따라서, 그것은 단지 표준 DNA 추출 프로토콜 및 제조업체의 제공 된 라이브러리 공법을 적용 하 여 긴 읽기를 한 도전 이다. 이 끝으로, 우리는 강력한 개발 했습니다 매우 긴 생성 하는 방법 읽기 (kilobases 수백) 시퀀싱 데이터 수확된 셀 펠 릿에서 시작. 우리는 DNA 추출 및 라이브러리 준비 절차에서 여러 개선 채택. 우리는 DNA 저하 및 손상 시키는 불필요 한 절차를 제외 하려면 프로토콜을 간소화. 이 프로토콜은 고 분자량 (HMW)의 구성 된 DNA 추출, 매우 긴 DNA 도서관 건축 및 연속 nanopore 플랫폼에. 잘 훈련 된 분자 생물학에 대 한 일반적으로 걸리는 6 h HMW DNA 추출, 90 분 또는 도서관 건설 깎는 방법, 그리고 DNA 연속을 위한 추가 48 h 8 h의 완료에 수확 하는 세포에서. 프로토콜을 사용 하는 게놈 복잡성에 대 한 우리의 이해를 개선 하 여 인간의 질병에 게놈 변이에 새로운 통찰력을 얻을 유전체학 커뮤니티 권한을 부여 합니다.

<table><tbody><tr><td>시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>절대 에탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XPbeads</td><td>Beckman</td><td>A63881</td><td>클린업</td></tr><tr><td>BD 기존 바늘</td><td>Becton Dickinson</td><td>305136</td><td>27G용 마그네틱 비드, 기계 전단</td></tr><tr><td>BD Luer-Lok 주사기용</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>기계 전단</td></tr><tr><td>용 309628 Blunt/TA Ligase 마스터 믹스</td><td>NEB</td><td>M0367S</td><td></td></tr><tr><td>Countess 세포 계수 챔버 슬라이드</td><td>Invitrogen</td><td>C10228</td><td>세포 계수</td></tr>용 <tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9261</td><td>pH 8.0, 0.5 M, 500 mL</td></tr><tr><td>플로우 셀</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>FLO-MIN106</td><td>R9.4.1</td></tr><tr><td>HG00773 세포</td><td>Coriell 이</td><td>프로토콜에 사용된</td><td>HG00733</td>세포 연구소</tr>: <tr><td>결찰 염기서열분석 키트, 1D,</td><td>옥스포드 나노포어 테크놀로지</td><td>스, SQK-LSK108</td>, <td>나노기공 결찰 키트</td></tr><tr><td>, MaXtract, 고밀도 튜브,</td><td>Qiagen</td><td>129073</td><td>겔 튜브</td></tr>, <tr><td>NEBNext FFPE, DNA 복구 믹스,</td><td>NEB</td><td>M6630S,</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II, 엔드 수리/dA-테일링 모듈</td>, <td>NEB,</td><td>M7546S</td><td></td></tr><tr><td>뉴클레아제가 없는 물</td><td>Invitrogen</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수, PBS</td><td>Gibco 70011044</td><td></td><td>10X, pH 7.4</td></tr><tr><td>페놀:클로로포름:IAA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9730</td><td></td></tr><tr><td>Proteina K</td><td>Qiagen</td><td>19131</td><td>20 mg/mL</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR 어세이 키트</td> DNA 정량을 위한 <td>Invitrogen</td><td>Q32850</td><td>형광계 어세이</td></tr><tr><td>신속한 염기서열분석 키트</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>SQK-RAD004</td><td>나노포어 트랜스포사제 키트</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td>100 mg/mL</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Invitrogen</td><td>AM9822</td><td>10% (wt/vol)</td></tr><tr><td>염화나트륨 용액</td><td>Invitrogen</td><td>AM9759</td><td>5.0 M</td></tr><tr><td>TE 버퍼</td><td>Invitrogen</td><td>AM9849</td><td>pH 8.0</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Invitrogen</td><td>AM9856</td><td>pH 8.0, 1M</td></tr><tr><td>Triton X-100 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443</td><td>~10%</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</</td><td>strong>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad C1000 Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1851196EDU</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>22628180</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL 세포 계수</td><td>측정 AMQAF1000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td>마그네틱 랙</td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoMixer</td><td>Eppendorf</td><td>5382000023</td><td>인큐베이션</td></tr><tr><td>이</td> 프로토콜에 사용되는 Freezer <td>LabRepCo</td><td>LHP-5-UFMB</td><td></td></tr><tr><td>GridION</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>GridION X5</td><td>나노포어 장치</td></tr><tr><td>HulaMixer Sample Mixer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15920D</td><td>회전자 믹서</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기</td><td>벤치마크 Scientific</td><td>C1012</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000 분광 광도계</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-1000</td><td>UV 판독</td></tr><tr><td>Pippin Pulse</td><td>Sage Science</td><td>PPI0200</td><td>펄스 필드 젤 전기 영동 기기</td></tr><tr><td>Qubit 3.0 형광계</td><td>Invitrogen</td><td>Q33216</td><td>형광계</td></tr><tr><td>냉장고</td><td>LabRepCo</td><td>LABHP-5-URBSS</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-A236</td><td></td></tr><tr><td>수조</td><td>VWR</td><td>89501-464</td><td></td></tr></tbody></table>년

전체 게놈 dna 분석을 위한 매우 긴 읽기 시퀀싱

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

제 3 세대 단일 분자 DNA 시퀀싱 기술 제공 훨씬 더 이상 읽을 길이 복잡 한 유전자 및 복잡 한 구조 이체의 분석의 어셈블리를 촉진할 수 있다. Nanopore 플랫폼 직접 숨 구멍을 통해 DNA 통행에 의해 중재 현재 변화를 측정 하 여 단일 분자 시퀀싱을 수행 하 고 최소한의 자본 비용으로 kilobase (kb) 읽기의 수백을 생성할 수 있습니다. 이 플랫폼은 다양 한 응용 프로그램에 대 한 많은 연구자에 의해 채택 되었습니다. 긴 연속 읽기 길이 달성 nanopore 시퀀싱 플랫폼의 가치를 활용 하는 가장 중요 한 요소입니다. 매우 긴 읽기를 생성 하려면 특별 한 고려 DNA 파손 방지 및 생산성 시퀀싱 서식 파일을 생성 하는 효율을 얻이 필요 합니다. 여기, 우리는 매우 긴 DNA 시퀀싱 신선 또는 냉동 셀, 기계적 전단 또는 transposase 조각화, 도서관 건축에서에서 고 분자량 (HMW) DNA 추출 및 nanopore 장치에서 시퀀싱의 상세한 프로토콜을 제공 합니다. HMW DNA의 20-25 µ g에서 메서드 N50 읽기 50-70 kb 기계적 전단의 길이 달성할 수 있다 고 90-100의 transposase 길이 읽기 N50 중재 조각화 합니다. 프로토콜 구조 변형 및 게놈 어셈블리의 검색을 위한 전체 게놈 시퀀싱을 수행 하기 위해 포유류 세포에서 추출한 DNA를 적용할 수 있습니다. DNA 추출 및 효소 반응에 대 한 추가 개선 또한 읽기 길이 증가 하 고 그것의 유틸리티를 확장 합니다.

매우 긴 DNA 시퀀싱 프로토콜 라이브러리 건설 HMW DNA를 적용합니다. 따라서, 그것은 라이브 비율 잘 경작된 한 세포를 선택 하는 중요 한 &gt; 셀 수확 단계에서 85%. HMW DNA의 양과 질, DNA 추출에 사용 되는 셀의 크기에 영향을 미칩니다. 세포 세포의 용 해는 너무 많은 세포로 시작 하는 경우에 잘 작동 하지 않습니다. HMW DNA 강수량 고속 원심 분리 대신 손으로 부드러운 회전을 사용 하 여 수행 되기 때문에 너무 몇 가지 셀을 사용 하 여 라이브러리 건설에 대 한 충분 한 DNA을 생성 하지 않습니다. 얼음 처럼 차가운 100% 에탄올을 추가 하 고 회전 그림2에서 흰 목화 같은 침전으로 표시 됩니다 후 HMW DNA의 예입니다.
그것은 도서관 건축을 시작 하기 전에 입력 DNA의 품질을 확인 해야 합니다. 저하, 잘못 된 정량화, 오염 (예: 단백질, RNAs, 세제, 계면 활성 제, 그리고 잔여 석탄 산 또는 에탄올) 및 낮은 분자량 DNA 길이 읽고 마지막에 후속 절차에 상당한 효과 가질 수 있습니다. HMW DNA를 포함 하는 관에서 세 가지 다른 위치에서 DNA를 사용 하 여 품질 분석을 수행 하는 것이 좋습니다. UV HMW DNA에 대 한 결과 읽어에서 OD260/OD280 값 약 1.9 이며 OD260/OD230 값은 약 2.3 (그림 3AB). 이러한 비율 값은 좋은 HMW DNA 샘플에 대 한 세 가지 테스트 간에 일관. 다른 깎는 방법 입력된 DNA의 다른 볼륨을 필요 합니다. HMW DNA의 농도 필요 &gt; 기계적 전단 필요 동안에 µ 200 ng/L &gt; transposase 조각화에 대 한 µ 1 µ g/L. fluorometer에 의해 감지 농도 UV 읽기 보다 조금 낮습니다. 그러나, 동일한 HMW DNA 샘플의 농도의 변이 계수는 fluorometer와 UV 분석 실험을 읽고 미만 15% 필요 합니다. 기계적 전단 주사기 바늘을 통해 전달의 수 전단된 DNA의 크기에 영향을 줍니다 마지막 읽을 길이 있도록 HMW DNA를 바늘으로 적용 됩니다. 후 바늘 HMW DNA의 대부분을 위해 전단은 그림 4에서 볼 수 있듯이 50 kb 보다 큰 크기 품질 관리를 수행 하는 것이 좋습니다. 기계적 전단 방식에서 30 패스 길이 출력을 고려 최고의 시퀀싱 결과 생성.
기계적 전단 기반 라이브러리의 N50 transposase 조각화 기반 라이브러리는 90-100 킬로바이트 50-70 킬로바이트입니다. HG00733 셀 라인을 사용 하 여 4 개의 실행 결과 표 1에 표시 됩니다. 모든 4 개의 실행 100 kb 보다 긴 길이와 이상의 2300 읽기 있다. 최대 길이 transposase 조각화 기반 라이브러리에서 (455 kb 및 489 kb) 기계적 전단 기반 라이브러리 (348 kb 및 387 kb)와 비교 된 더 긴 동안 후자 더 총 읽습니다, 높은 수익률을 나타내는. 그것은 몇몇 짧은 조각을 소개 합니다 있도록 transposase 조각화 기반 라이브러리 건설 적은 단계와 짧은 준비 시간 있다. Transposase를 사용 하 여 두 개의 실행 긴 평균 길이 (&gt; 30 kb)와 중간 길이 (&gt; 10 kb). 또한, 데이터에서 모든 실행을 (평균 품질 평가 점수는 약 10.0, ~ 90% 기본 정확도) 일관 된 높은 품질을 보여줍니다. 총 기초의 97% 이상 인간의 참조 게놈 (hg19) Minimap216 을 사용 하 여 기본 설정으로 정렬 했다. 원시 읽기의 예상된 크기 분포는 그림 5에 나와 있습니다. 모든 실행 동안 transposase 조각화 기반 라이브러리는 매우 긴 읽기 (예: &gt; 100 kb)의 높은 비율 50 kb 이상의 데이터의 큰 비율이 있다. 이 프로토콜은 여러 개의 인간 세포 라인 (보충 표 1)에 성공적으로 적용 되었다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig1.jpg"> 그림 1: nanopore 긴 읽기 시퀀싱 (NLR-seq) 워크플로의 도식 개요. 오렌지, 복잡 한 transposase입니다. 노란색-녹색, nanopore 어댑터입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig2.jpg"> 그림 2: 페 놀-클로 프롬 적 출 방법에서 대표 DNA 강수량. 흰색 화살표 HMW DNA를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig3.jpg"> 그림 3: UV 독서에서 HMW DNA의 예제 QC 결과. 1.21.1 기계적 전단 기반 도서관 건축을 위한 준비 단계에서의 (A) HMW DNA 단계 1.21.2 transposase 라이브러리 조각화 기반 건설에서에서의 (B) HMW DNA <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig4.jpg"> 그림 4: 바늘의 QC 결과 펄스 분야 젤 전기 이동 법에 의해 HMW DNA 전단. L1: 빠른 부하 1 kb DNA 사다리; L2: 빠른 로드 1 kb DNA 사다리 확장. 1-8: DNA 전단 하는 바늘을 통해 다른 지나가는 시간. 1-3, 전단; 4, 10 번; 5, 20 번; 6, 30 시간; 7, 40 번; 8, 50 번입니다. 이 품질 관리 단계는 선택 사항입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig5.jpg"> 그림 5: nanopore 매우 긴 DNA 라이브러리의 크기 분포를 예상. MS, 기계적 전단 기반 라이브러리입니다. TF, transposase 조각화 기반 라이브러리 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>기계 shearing_rep1</td>
			<td>기계 shearing_rep2</td>
			<td>Transposase fragmentation_rep1</td>
			<td>Transposase fragmentation_rep2</td>
		</tr>
<tr>
<td>셀 라인</td>
			<td>HG00733</td>
			<td>HG00733</td>
			<td>HG00733</td>
			<td>HG00733</td>
		</tr>
<tr>
<td>읽기의 N50</td>
			<td>55,180</td>
			<td>63,007</td>
			<td>98,237</td>
			<td>95,629</td>
		</tr>
<tr>
<td>100kb 이상 읽기 수</td>
			<td>2500</td>
			<td>3,082</td>
			<td>2,386</td>
			<td>2,355</td>
		</tr>
<tr>
<td>총 읽기 수</td>
			<td>97,859</td>
			<td>80,465</td>
			<td>24,166</td>
			<td>21,032</td>
		</tr>
<tr>
<td>최대 길이 (bp)</td>
			<td>348,482</td>
			<td>387,113</td>
			<td>454,660</td>
			<td>489,426</td>
		</tr>
<tr>
<td>평균 길이 (bp)</td>
			<td>17,861</td>
			<td>20,395</td>
			<td>33,528</td>
			<td>38,175</td>
		</tr>
<tr>
<td>중간 길이 (bp)</td>
			<td>5,335</td>
			<td>5,894</td>
			<td>10,249</td>
			<td>15,656</td>
		</tr>
<tr>
<td>읽기의 품질을 의미</td>
			<td>10.0</td>
			<td>10.1</td>
			<td>9.9</td>
			<td>10.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>원시 읽기의 총 기초</td>
			<td>1,747,849,822</td>
			<td>1,641,058,932</td>
			<td>810,229,733</td>
			<td>802,886,304</td>
		</tr>
<tr>
<td>정렬 된 읽기의 총 기초</td>
			<td>1,693,300,832</td>
			<td>1,607,975,925</td>
			<td>791,422,077</td>
			<td>778,417,627</td>
		</tr>
<tr>
<td>총 기초 (hg19, Minimap2)의 매핑된 비율</td>
			<td>96.9%</td>
			<td>98.0%</td>
			<td>97.7%</td>
			<td>97.0%</td>
		</tr>
<tr>
<td>활성 숨 구멍의 수</td>
			<td>1225: 480, 402, 254, 89</td>
			<td>1058: 480, 356, 176, 46</td>
			<td>958: 452, 328, 148, 30</td>
			<td>1092: 487, 367, 195, 43</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 다른 전단 프로토콜 성능 통계 요약에서 실행 됩니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>도서관 1</td>
			<td>도서관 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>셀 라인</td>
			<td>K562</td>
			<td>GM19240</td>
		</tr>
<tr>
<td>세포 주문 정보</td>
			<td>ATCC, 고양이입니다. 아니요. CCL-243</td>
			<td>Coriell 연구소, 고양이입니다. 아니요. GM19240</td>
		</tr>
<tr>
<td>프로토콜</td>
			<td>기계적 전단</td>
			<td>기계적 전단</td>
		</tr>
<tr>
<td>읽기의 N50</td>
			<td>60,063</td>
			<td>55,295</td>
		</tr>
<tr>
<td>총 읽기 수</td>
			<td>193,783</td>
			<td>120,807</td>
		</tr>
<tr>
<td>중간 길이 (bp)</td>
			<td>1,843</td>
			<td>4,688</td>
		</tr>
<tr>
<td>평균 길이 (bp)</td>
			<td>9,825</td>
			<td>17,408</td>
		</tr>
<tr>
<td>최대 길이 (bp)</td>
			<td>548,780</td>
			<td>212,338</td>
		</tr>
<tr>
<td>원시 읽기의 총 기초</td>
			<td>1,903,989,686</td>
			<td>2,103,015,331</td>
		</tr>
<tr>
<td>정렬 된 읽기의 총 기초</td>
			<td>1,837,350,047</td>
			<td>1,997,419,761</td>
		</tr>
<tr>
<td>총 기초 (hg19, Minimap2)의 매핑된 비율</td>
			<td>96.6%</td>
			<td>95.0%</td>
		</tr>
<tr>
<td>활성 숨 구멍의 수</td>
			<td>1111: 482, 371, 203, 55</td>
			<td>1032: 447, 333, 196, 56</td>
		</tr>
</tbody></table>기계적 전단 프로토콜 다른 셀 라인을 사용 하 여 두 NLR seq의 보충 표 1: 요약.

긴 읽기 시퀀스는 크게 복잡 한 유전자 및 구조 변화의 특성의 어셈블리를 촉진 한다. 연속 nanopore 기반 플랫폼으로 매우 긴 시퀀스를 생성 하는 방법을 설명 합니다. 접근은 최적화 된 DNA 추출이 수정된 라이브러리 준비 인간 세포에서 kilobase 읽기 적당 한 보도 수백을 생성 하 여 다음을 채택 한다.

전체 게놈 DNA 분석을 위한 매우 긴 읽기 시퀀싱

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...

이 프로토콜은 초장거리 시퀀스 어레이를 생성하는 능력의 기술적 격차를 채웁니다. 그것은 우리가 게놈에 있는 현재 짧은 읽기 접근에 의해 제한되는 게놈 복잡성을 검토하는 것을 가능하게 합니다. 이 방법은 성능, 견고성, 다기능성 및 유망한 새로운 응용 프로그램과 통합할 수 있는 잠재력면에서 독특합니다.그것은 다른 재료에 적용 할 수 있으며 다른 인스턴트 크기에 맞게 변조 할 수 있습니다. 이 기술은 임상 풍경에 혁명을 시작했다. 반복 확장 장애의 진단 유틸리티는 많은 현재의 단점을 극복했습니다.일부 이식 레지스트리는 더 나은 임상 결과를 위해 고해상도 HLA 타이핑을 이용했습니다. 이러한 메서드는 이전에 는 변조 및 복잡한 구조 분산과 같은 액세스할 수 없는 장거리 정보를 제공합니다. 단일 테스트에서 후성 유전학 판독과 결합하면 정밀 의학을 가능하게합니다.그것은 많은 새로운 기술을 가진 긴 프로토콜이며 최종 시퀀싱까지 작동하는지 알기 가 어렵습니다. 샘플을 실행하기 전에 오래된 흐름 셀에 로딩을 연습하는 것이 좋습니다. 공동 작업자는 일부 기술이 짧은 읽기 접근 방식에 비해 혼란스럽다고 말했습니다.특히, 추출은 고품질, 고분자 DNA로 인해 더 부드럽습니다. HMW DNA의 추출을 시작하려면 먼저 50 밀리리터 튜브에 10 밀리리터의 리시스 버퍼에 세포 현탁액의 200 마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 3 초 동안 최고 속도로 소용돌이합니다.그리고 1 시간 동안 섭씨 37도에서 솔루션을 배양하십시오. 인큐베이션이 끝나면 용액에 RNS-A의 마이크로리터 2개를 추가합니다. 50 밀리리터 튜브를 부드럽게 회전하여 샘플을 혼합하고 1시간 동안 섭씨 37도에서 배양합니다.인큐베이션 후, 리자테에 페놀 클로로폼-이소아밀 알코올 혼합물의 페놀 층의 10 밀리리터를 첨가한다. 그리고 연기 후드 아래 10 분 동안 20 rpm에서 회전기에 튜브를 넣어. 젤 튜브를 원심분리한 후, 새로운 50밀리리터 튜브에 상피물을 조심스럽게 붓습니다.그런 다음, 얼음 차가운 100 % 에탄올의 25 밀리리터를 추가하고 DNA가 침전 될 때까지 손으로 튜브를 부드럽게 회전시합니다. 후크를 만들기 위해 20 마이크로 리터 팁을 구부립니다. 후크를 사용하여 HMW DNA를 조심스럽게 꺼내 액체를 떨어 뜨립니다.그런 다음 DNA를 70%에탄올의 40밀리리터를 포함하는 50 밀리리터 튜브에 넣고 튜브를 세 번 부드럽게 반전하여 DNA를 세척합니다. 기계 전단 기반 라이브러리를 준비하려면 먼저 100 밀리리터 바늘이없는 주사기를 사용하여 모든 DNA를 갈망하십시오. 그런 다음 27 게이지 바늘을 주사기에 넣고 모든 DNA를 부드럽고 천천히 접시에 배출합니다.29번 반복합니다. 다음으로, 다시 매달린 자기 구슬 143개와 DNA 수리 반응 혼합물의 143마이크로리터를 튜브에 첨가한다. 튜브를 6번 쓸어 서 부드럽게 섞고 튜브를 20 rpm에 회전기에 30분간 놓습니다.실온에서 2초 동안 1000G에서 튜브를 원심분리하여 시료를 회전한 다음 튜브를 자기 랙에 10분 동안 놓습니다. 다음으로, 튜브가 랙에 있는 동안 상체를 폐기합니다. 갓 준비된 70%에탄올의 마이크로리터 400기를 추가합니다.30초 동안 기다립니다. 그런 다음 에탄올을 제거합니다. 그런 다음 실온에서 2초 동안 1000G에서 튜브를 원심분리하여 시료를 회전시합니다.튜브를 마그네틱 랙에 다시 놓고 잔류 에탄올을 제거합니다. 펠릿을 30초 동안 공기 건조시합니다. 다음으로, 자기 랙에서 튜브를 제거하고 T-E 버퍼의 103 마이크로 리터를 추가합니다.그런 다음 튜브를 부드럽게 쓸어 서 구슬이 버퍼에 덮여 있고 30 분 동안 실온에서 회전에 튜브를 놓습니다. 마지막으로 튜브를 자기 랙에 10분 동안 다시 놓아 구슬을 펠릿합니다. P200 와이드 보어 팁을 사용하여 용액의 100 마이크로리터를 0.2 밀리리터 튜브로 전송하고 최종 수리 dA-tailing 및 어댑터 리칭 반응을 진행합니다.트랜스포사제 단편화 기반 라이브러리를 준비하기 위해 먼저 HMW DNA의 22마이크로리터, 10 밀리머 트리스 10개, pH 8의 마이크로리터, 0.02%트리톤 X-100, 단편화 믹스의 1마이크로리터를 0.2밀리터 튜브에 첨가하여 DNA 태그화 반응을 유도한다. 다음으로, P200 넓은 보어 팁을 사용하여 반응을 6번 혼합하고 1분 동안 섭씨 30도에서 배양한 다음 1분 동안 섭씨 80도가 됩니다. 섭씨 4도에 잡습니다.마지막으로 P200 와이드 보어 팁을 사용하여 반응을 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 빠른 어댑터 믹스 1 마이크로리터를 빠르게 추가합니다. P200 와이드 보어 팁을 사용하여 반응을 6번 혼합합니다. 실온에서 1시간 동안 반응을 배양하고 시퀀싱을 진행한다.시퀀싱을 시작하려면 먼저 나노포어 장치의 채널 중 하나에 새 유량 셀을 삽입합니다. 그런 다음, 함께 시퀀싱 제어 소프트웨어에서 유동 셀의 위치 상자를 확인합니다. 올바른 흐름 셀 유형을 선택하고 검사 흐름 셀의 워크플로를 클릭합니다.시작 테스트 버튼을 클릭하여 흐름 셀 QC 분석을 시작합니다. 다음으로, P1000 파이펫을 100 마이크로리터로 설정하면 30마이크로리터 미만의 버퍼를 다시 그려 유동 셀에서 거품을 제거합니다. 프라이밍 믹스의 마이크로리터 30를 추가하여 프라이밍 포트의 상단을 덮어 거품을 도입하지 않도록 합니다.그런 다음 프라이밍 포트에 프리밍 믹스의 파이펫 800 마이크로리터가 유동 셀을 로드합니다. 프라이밍 믹스의 약 50 마이크로리터가 남아 있을 때 팁을 꺼내 프라이밍 포트 상단에 프라이밍 믹스의 나머지 부분을 추가합니다. 다음으로 P1000 파이펫을 사용하면 프라이밍 믹스 200 마이크로리터를 유량 셀에 추가합니다.그런 다음 로딩 직전에 80 마이크로리터로 설정된 P200 파이펫을 사용하여 DNA 라이브러리를 6번 위아래로 피펫합니다. 마지막으로, 라이브러리믹스드롭와이즈를 샘플 포트를 통해 유량 셀에 로드하고, 시퀀싱 및 데이터 분석을 진행한다. 기계전계 라이브러리 시공을 위한 DNA의 QC 분석은 약 1.9의 260~280의 순도 비, 그리고 260 대 230 비율의 약 2.3의 결과, 좋은 DNA 샘플을 나타냈다.동일한 결과는 DNA 에 대한 트랜스포세아제 단편화 기반 라이브러리 구조를 사용하여 보였다. 펄스 필드 젤 전기포에 의한 바늘-시어드 HMW DNA의 크기 품질 관리는 HMW DNA의 대다수가 50킬로베이스보다 큰 것으로 나타났다. HG00733 셀을 사용한 4개의 실행 결과, 기계식 전단 기반 라이브러리의 N50이 트랜스포지아제 조각화 기반 라이브러리보다 짧다는 것을 보여주었습니다.또한, 네 개의 실행 모두 100 킬로베이스보다 긴 길이와 2300 개 이상의 읽기를했다. 기계 전단 기반 라이브러리에 비해 준비 시간이 짧은 트랜스포사제 조각화 기반 라이브러리에서 최대 길이가 더 길어졌습니다. 기계전 기반 라이브러리는 트랜스포사제 조각화 기반 라이브러리에 비해 총 읽기가 더 많이 생성되어 수율이 더 높습니다.두 라이브러리 모두 일관된 고품질을 보였으며 전체 염기의 97% 이상이 인간 기준 게놈과 일치했습니다. 예상 크기 분포는 네 개의 실행 모두 50킬로베이스 이상의 데이터 비율이 큰 반면, 트랜스포세이션 조각화 기반 라이브러리는 초장기 판독 비율이 더 높은 것으로 나타났습니다. 전반적인 목표는 DNA를 그대로 유지하는 것이므로 DNA의 가혹한 취급을 피하는 것이 중요합니다.메서드의 값을 최대화할 수 있는 핵심 요소는 계산 해석입니다. 우리 팀은 높은 감도로 모든 범위의 SV를 감지 할 수있는 PICKY라는 긴 읽기 분석 파이프 라인을 개발했습니다. 복잡한 SV 를 감지하고 단일 분자 수준에서 재배열 및 수정을 단계적화하는 것과 같은 흥미로운 영역에 새로운 길을 열 것입니다.이것은 게놈 건축에 대한 우리의 이해를 크게 향상시킬 것입니다. 페놀은 매우 부식성입니다. 장갑, 안전 안경, 실험실 코트, 긴 바지 및 신발을 포함한 개인 보호 장비가있는 연기 후드에서 작업해야합니다.

ultra-long-read-sequencing-for-whole-genomic-dna-analysis

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 높은 처리량 시퀀싱 (DamID-SEQ)에 DNA 아데닌의 메틸화 식별 (DamID)을 결합하여 여기에 분석을 설명합니다. 이 개선 된 방법은 높은 해상도와 넓은 동적 범위를 제공하며, 허용 등과 칩 서열, RNA-SEQ 같은 다른 높은 처리량 시퀀싱 데이터와 함께 DamID-서열 데이터 분석...

DamID-SEQ : 아데닌 - 메틸화 된 DNA 단편의 높은 처리량 시퀀싱에 의해 단백질 DNA 상호 작용의 게놈 넓은 매핑

여기서 우리는 프로토콜이 메틸 바인딩 DNA 캡처 시퀀싱 (MBDCap-서열 또는 MBD-SEQ) 기술과 이후의 생물 정보학 분석 파이프 라인을 사용하여 대규모 임상 환자 스크리닝 연구에서 게놈 전체 DNA 메틸화를 조사하기 위해 제시한다.

환자 조직에 대한 메틸 결합 DNA 캡처 시퀀싱

여기에 설명된 방법은 장기 판독 게놈 염기서열 분석에 사용하기 위해 절대 생물영양 진균 병원균인 흰가루병에서 게놈 DNA를 추출, 정제 및 품질 관리하는 방법입니다.

긴 읽기 시퀀싱에 대한 흰가루병에서 높은 분자량의 게놈의 DNA의 정제

이 원고 ctDNA, 응급실이에서 낮은 주파수의 돌연변이 검출 하는 기술을 설명 합니다. 이 메서드는 두 방향 오류 수정, 특별 한 배경 필터 및 효율적인 분자 신안의 독특한 사용에 의해 분화 된다.

다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 CtDNA에서 희소 한 변이의 탐지

차세대 시퀀싱 (NGS) 플랫폼 (~0.5–2.0%)의 높은 오류 속도 의해 제한 되는 genomic 특성 분석을 위한 강력한 도구입니다. NGS 오류율을 제거 하 고 변형 대립 유전자 분수 0.0001 희귀에서 변이 감지 수 있는 오류 수정 시퀀싱의 우리의 방법을 설명 합니다.

드문 이벤트 감지 오류 수정 DNA와 RNA 시퀀싱을 사용 하 여

미세한 생물의 게놈 시퀀싱 하는 동안 오염에는 큰 문제가 남아 있다. 여기, 우리가 오염 위험을 최소화 하기 위해 전체 게놈 증폭 없이 genomic DNA의 작은 50 세와 단일 표본에서 tardigrade의 게놈을 시퀀싱 하는 방법을 보여줍니다.

Ultralow 입력된 게놈 시퀀싱 단일 Tardigrade 견본에서 라이브러리 준비

이 프로토콜의 목적은 계산의 조합 및 벤치 연구를 사용 하 여 부분적 으로만 알려져 있을 수 있습니다 공동 정화 시퀀스에서 쉽게 분리 될 수 없는 새로운 시퀀스를 찾을 것입니다.

빼기 게놈에 의해 소설 시퀀스 검색

나노 기 공 시퀀싱은 원격 지에서 비용 효과적인 시퀀싱을 허용 하는 새로운 기술 이며 리소스 부족 설정입니다. 여기서, 우리는 이러한 조건과 호환 되는 전 혈에서 mRNAs의 시퀀싱을 위한 프로토콜을 제시 한다.

나노 포어 시퀀싱을 사용 하 여 전 혈에서 mRNA의 시퀀싱

이 프로토콜은 오줌 박테리아의 배양, 시퀀싱 및 드 노보 하이브리드 게놈 조립에 대한 포괄적 인 접근 방식을 자세히 설명합니다. 그것은 오줌 식민지, 병기 발생 및 항균 저항 보급에 기여하는 염색체 및 외염색체 유전 요소 둘 다 공부에 유용한 완전하고 원형 게놈 서열의 생성을 위한 재현 가능한 절차를 제공합니다.

짧고 긴 읽기 시퀀싱 기술을 사용하여 요로나박테리아의 완전한 게놈 생성을 위한 하이브리드 드 노보 게놈 조립

이 프로토콜은 긴 판독 시퀀싱 플랫폼을 사용하여 결핵균 의 18개 약물 내성 영역에 대한 표적 심층 시퀀싱에 최적화되었으며, 이어서 장기 판독 데이터용으로 설계된 결핵 특이적 생물정보학 파이프라인으로 분석했습니다.

Long-Read Sequencing Technologies를 사용한 Amplicon Sequencing

학습하세요 초장기 DNA 서열 분석 방법으로 나노포어 시퀀싱을 활용하여 인간 세포에서 고분자량 DNA를 추출하고 라이브러리를 준비하는 전체 과정을 익히세요. 이 기술은 게놈 복잡성 연구와 정밀 의학에 활용됩니다.

전체 게놈 DNA 분석을 위한 매우 긴 읽기 시퀀싱

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