Name: 2 형광 색소에 의해 7 개의 면역 세포 하위 집합의 차별 Cytometry 흐름 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: 학습하세요 두 개의 형광 색소만으로 인간 말초혈액에서 CD4+ T세포, CD8+ T세포, B세포, NK세포, 단핵구 등 7가지 면역 세포 하위 집합을 식별하는 흐름 세포측정법을. 이 방법은 제한된 검출기를 가진 장비에서도 심층 면역 표현형 분석이 가능합니다.

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이 연구는 국립 연구소의 관절염과 Musculoskeletal와 피부 질환에 의해 지원 되었다 < https://www.niams.nih.gov/>, 보너스 번호 P30-AR053503; 스 테 블러 재단, www.stablerfoundation.org; 국립 연구소의 알레르기와 전염병, www.niaid.nih.gov, T32AI007247; 니 나 아일랜드 프로그램 폐 건강 (NIPLH)에 대 한 https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/.

인간의 물질의 모든 연구는 건강 보험 이동성 및 책임에 관한 법률에서 존스 홉킨스 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다. 환자 및 제어 샘플 드 확인 했다입니다. PBMCs와 건강 한 컨트롤에서 혈액은 동의 의해 얻은 했다.
참고: 이 프로토콜에 갓 테스트 되거나 고립 된 냉동 주변 혈액 세포와 전체 혈액.
1. 세포 준비
<ol><li>
전체 혈액에서 주변 혈액 세포 (PBMC)의 절연
	<ol>
<li>포함 된 나트륨 덤플링을 10 mL 그린 탑 튜브에 혈액을 그립니다. 피와 튜브를 작성 후 즉시 반전 튜브 여러 번 응고를 방지 하기 위해. 참고: 튜브 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 또는 나트륨 시트르산 등 다른 응고 제를 포함 하는 비교 결과 함께 사용할 수 있습니다. 혈액의 다른 금액을 수집 하는 경우 프로토콜에는 다음 단계 따라 조절 한다.</li>
		<li>신중 하 게 50 mL 원뿔 튜브로 그려진된 혈액 전송. 칼슘과 마그네슘 없이 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)의 동일한 금액으로 혈액을 희석.</li>
		<li>새로운 50 mL 원뿔 튜브의 하단에 밀도 그라데이션 매체 (예: Ficoll)의 15 mL를 추가 하 고 신중 하 게 피하는 어떤 혼합 밀도 그라데이션 매체 위에 희석된 혈액 오버레이 밀도 그라데이션 매체와 희석된 혈액 사이. 참고: 이것은 적혈구에서 PBMCs의 적절 한 분리에 대 한 중요 한 단계 이다.</li>
		<li>인터페이스의 혼란을 피하기 위해 아무 브레이크 (RT), 실 온에서 30 분 400 x g 에서 원심.</li>
		<li>원심, 후 신중 하 게는 피 펫을 사용 하 여 상위 계층을 발음 하 고 플라즈마 및 밀도 그라데이션 매체, PBMCs stratifies는 그 사이의 인터페이스에서 세포를 제거 하지 주목, 그것을 폐기. 50 mL 원뿔 튜브와 새로운 50 mL 원뿔 튜브에 하단에 레드 셀 펠 릿을 건드리지 않고 인터페이스에서 가능한 많은 세포 수집 합니다.</li>
		<li>하 마지막 볼륨 25 ml를 섞어 여러 번 반전 PBS를 추가 합니다. 세포 현 탁 액에서 밀도 그라데이션 중간 오염을 제거 하에 브레이크 RT에서 10 분 동안 300 x g 에서 원심.</li>
		<li>신중 하 게 방해 셀 펠 릿 없이 상쾌한 발음. 하 마지막 볼륨 25 ml를 섞어 여러 번 반전 PBS를 추가 합니다. 제거 혈소판에 브레이크와 RT에 10 분 동안 200 x g 에서 원심.</li>
		<li>조심 스럽게 셀 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한 발음. PBS/0.1% 나트륨 아 지 드의 1 mL에 PBMCs를 resuspend. 나트륨 아 지 드 상한, 흘리기, 항 체, 및 증가 세포 복구, 국제화 줄어들지만 그 독성 세포 생존 능력을 손상 할 수 있다. 이러한 이유로, 나트륨 아 지 드 피해 야 한다 모든 단계에 경우 셀 후속 실험에 대 한 경작 될 것 이다. 셀 고립과 나트륨 아 지 드 없이 얼룩 착 나트륨 아 지 드의 수행에 비슷한 결과 주었다. 주의: 나트륨 아 지 드 중앙 신 경계에 영향을 미치는 죽음을 발생할 수 있습니다. 연락처는 피부와 눈에 화상을 일으킬 수 있습니다.</li>
		<li>Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 PBMCs의 30 µ L를 전송 하 여 계산에 대 한 셀을 희석. 그런 다음 추가 PBS의 120 µ L의 휴대폰 번호 및 생존 능력 결정 Trypan 블루 150 µ L (1시 10분 희석 셀). 신중 하 게 resuspend.</li>
		<li>10 µ L hemocytometer, 수를 셀 따라 사용 계산을 챔버 가능한 셀의 수를 결정에 전송. 실행 가능한 세포 Trypan 블루 부정적인 세포 총 x 10 (이 프로토콜에 사용 되는 희석 요소)의 수 = x 104. 참고: 에 평균, 7-15 x 106 PBMCs의 혈액 10 mL에서 수집 한다.</li>
		<li>PBS/0.1% 나트륨 아 지 드의 mL 당 10 x 106 셀 resuspend 참고: PBMC 냉동 고 시간의 연장된 기간에 대 한 액체 질소에 저장 될 수 있습니다. 그러나, 마커 chemokine 수용 체 등의 표현이이 절차에 의해 변경할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
냉동된 PBMC에서 셀의 준비 참고: 다른 동결 절차 셀 복구 및 생존12에 영향을 미칠 수. 이러한 실험에 대 한 PBMCs 미디어 또는 소 태아 혈 청 (FBS)/10% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 비슷한 결과 특별히 공식화 냉동. 주의: DMSO는 흡입 (폐 자극)의 경우 약간 위험할 피부 접촉 (자극성, permeator), 섭취 (자극), 눈 접촉의 수 있습니다.<ol>
<li>액체 질소에서 냉동된 PBMC를 제거 하 고 얼음에. 37 ° C 물 욕조에 직접 얼음에서는 cryovial를 전송. 수 면에는 cryovial를 유지 하 고 작은 얼음 펠 릿 남아 때까지 부드럽게 튜브를 흔들. 얼음에는 cryovial를 전송 합니다.</li>
		<li>70% 에탄올 스프레이 지우기 모든 물을 제거 합니다. 4 ° C에서 PBS/0.1% 나트륨 아 지 드의 1 mL를 천천히 추가 하 고 신중 하 게 15 mL 원뿔 튜브에 셀을 전송. 천천히 15 mL의 최종 볼륨에 도달을 4 ° C에서 찬 PBS/0.1% 나트륨 아 지 드를 추가 합니다.</li>
		<li>10 분에 대 한 300 x g 에서 원심 분리기 조심 스럽게 제거 표면에 뜨는, resuspend 셀 PBS/0.1% 나트륨 아 지 드의 1 ml. 참고: 셀 RPMI에 resuspended도 수 10 %FBS 비슷한 결과 함께.</li>
		<li>Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 PBMCs의 30 µ L를 전송 하 여 계산에 대 한 셀을 희석. 그런 다음 추가 PBS의 120 µ L의 휴대폰 번호 및 생존 능력 결정 Trypan 블루 150 µ L (1시 10분 희석 셀). 신중 하 게 resuspend.</li>
		<li>10 µ L hemocytometer, 수를 셀 따라 사용 계산을 챔버 가능한 셀의 수를 결정에 전송. 실행 가능한 세포 Trypan 블루 부정적인 세포 총 x 10 (이 프로토콜에 사용 되는 희석 요소)의 수 = x 104.</li>
		<li>PBS/0.1% 나트륨 아 지 드에 mL 당 10 x 106 셀 resuspend</li>
	</ol>
</li>
	<li>
전체 혈액에서 세포의 준비
	<ol>
<li>포함 된 나트륨 덤플링을 10 mL 그린 탑 튜브에 혈액을 그립니다. 피와 튜브를 작성 후 즉시 반전 튜브 여러 번 응고를 방지 하기 위해. 참고: 나트륨 구 연산 염 또는 EDTA 비교 결과 함께 사용할 수 있습니다와 같은 다른 응고 제를 포함 하는 튜브. 혈액의 다른 금액을 수집 하는 경우 프로토콜에는 다음 단계 따라 조절 한다.</li>
		<li>12 x 75mm 출장 관에, 나트륨 아 지 드와 부드럽게 2에 대 한 소용돌이의 2 µ L을 추가 전체 혈액의 200 µ L s.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 세포 얼룩
참고: 사실상 더 스펙트럼 중복 형광의 쌍을 선택 하는 것이 다른 형광 색소 검출기에 형광 색소의 높은 파급으로 인해 데이터의 확산을 줄이기 위해 중요 합니다. 위해 알의 최적의 식별 셀 하위 집합, 높은 양자 수율과 형광 항 체 쌍 PE BV421와 PE APC 사용 되어야 한다.
<ol><li>
신선 하 고 냉동 PBMC의 얼룩
	<ol>
<li>96-잘 V-하단 플레이트에 PBMC (1 x 106 셀)의 100 µ L를 전송 합니다. 참고: 비슷한 결과2셀 1 x 106 보다 낮은 수를 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>RT에 3 분 동안 350 x g 에서 centrifuge 하 고 신중 하 게는 상쾌한 셀 펠 렛을 방해 하지 않고 발음. 죽은 세포를 10 분 동안 단백질에 자유로운 아민과 반응 하는 라이브/죽은 고칠 수 염료를 포함 하는 PBS의 각 잘 100 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>모든 항 체를 포함 하는 혼합의 각 샘플 30 µ L에 대 한 준비 (안티-CD3.-CD56, fluorchrome A, 및 안티-CD4, CD8, CD19, fluorchrome B에에서 CD14 TCRγδ). 항 체의 농도 표 1 과 테이블 2에 표시 됩니다. 이 단계에서 다른 표적 분자와 다른 형광에 적정 한 항 체도 추가 될 수 있다 (예를 들어, 표 3). 참고: 항 체 농도 및 로트 번호에 따라 달라질 수 있습니다. 따라서, 예비 테스트 최적의 신호를 달성 하기 위해 수행 되어야 합니다. PBS, PBS/0.5% BSA, PBS/0.2% 나트륨 아 지 드 또는 PBS/0.5% BSA/0.1% 나트륨 아 지 드 항 체2희석 비슷한 결과 함께 사용 되었다. 셀도 쉽게 통합이 방법론에 이미 30 µ L에서 다른 볼륨에 얼룩이 질 수 있다 얼룩 프로토콜.</li>
		<li>RT에 3 분 동안 350 x g 에서 centrifuge 하 고 신중 하 게는 상쾌한 셀 펠 렛을 방해 하지 않고 발음. 각 잘 하 항 체 칵테일을 추가 하 고 거품을 생성 하지 않고 신중 하 게 resuspend. 어둠 속에서 RT에서 30 분 동안 품 어. 참고: 그것은 비슷한 결과와 4 ° C에서 샘플 얼룩 수 있습니다.</li>
		<li>RT에 3 분 동안 350 x g 에서 얼룩 버퍼 및 원심 분리기의 150 µ L을 추가 하 고 신중 하 게는 상쾌한 셀 펠 렛을 방해 하지 않고 발음. PBS의 200 µ L에서 세포를 resuspend 하 고 데이터 흐름 cytometer에. 얼룩 볼륨 변경 되 면 항 체의 과잉을 세척 하는 데 사용 하는 원래 항 체 혼합의 적어도 20-fold 희석을 확인 하십시오. 참고: 스테인드 세포는 PBS/2% paraformaldehyde에 고정, 4 ° C에서 냉장고에 하룻밤 보관 고 교류 cytometer에 취득 다음 날 될 수 있습니다. 주의: Paraformaldehyde가 이다 삼 하 고 피부 자극을 일으킬 수 있는 유해</li>
	</ol>
</li>
	<li>
전체 혈액의 얼룩
	<ol>
<li>각 12 x 75mm 출장 관 추가 항 체의 칵테일 (안티-CD3.-CD56, 형광 색소 A, 및 안티-CD4, CD8, CD19, 형광 색소에 CD14 TCRγδ B)와 RT에 RT에 어둠 속에서 30 분 동안 품 어. 항 체의 농도 표 4에 표시 됩니다. 이 단계에서 다른 표적 분자에 대하여 항 체를 적정 하 고 다른 형광에 추가할 수 있습니다 뿐만 아니라. 항 체 농도 및 로트 번호에 따라 달라질 수 있습니다. 따라서, 예비 테스트 최적의 신호를 달성 하기 위해 수행 되어야 합니다. 참고: 그것은 비슷한 결과와 4 ° C에서 샘플 얼룩 수 있습니다.</li>
		<li>RT에 3 분 동안 350 x g 에서 centrifuge 하 고 신중 하 게는 상쾌한 셀 펠 렛을 방해 하지 않고 발음. 제조업체의 지침에 따라 붉은 혈액 세포 세포의 용 해 버퍼의 1 x 솔루션을 확인 합니다. 참고: 세포의 용 해 솔루션 RT 사용 하기 전에 해야 합니다.</li>
		<li>각 관에 붉은 혈액 세포 세포의 용 해 버퍼 x 1의 2.0 mL를 추가 하 고 잘 모자를 섞어 여러 번 반전. 호 일 커버 하 고 15 분 동안 앉아 보자.</li>
		<li>5 분은 신중 하 게 셀 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한을 발음에 대 한 300 x g 에 아래로 회전 합니다.</li>
		<li>5 분에 대 한 300 x g 에서 PBS 및 원심 분리기의 2 개 mL를 추가 합니다. 참고:이 시점에서, 셀 펠 릿 있어야 성공적인 적혈구 세포를 나타내는 창백한 백색 채색 합니다. 조심 스럽게 셀 펠 렛을 방해 하지를 상쾌한 발음 하 고 부드럽게 PBS의 200 µ L에서 세포를 resuspend.</li>
		<li>40 µ m 필터 캡 셀 집계를 제거 하 고 데이터 흐름 cytometer에 12 m m x 75 m m 튜브를 통해 세포를 변형.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 항 체 적정
참고: 항 체 적정 높은-품질, 재현할 수 데이터를 얻기 위해 가장 중요 한 단계입니다. 안티-CD3의 적정-CD8,-CD14-CD19, TCR-γ는 최적으로 긍정적이 고 부정적인 봉우리를 별도의 항 체의 농도 최대 인덱스13,14얼룩에 의해 파생 된 표준 절차를 따릅니다. 피크 또는 얼룩 인덱스 곡선의 상승에 피크에 가까이에 희석 되어야 합니다 (그림 1A-C)을 선택. 안티-CD4 항 CD3 단일 긍정적인 인구와 CD3 CD4 긍정적인 인구의 피크를 적정 + CD8 + T 세포, 더 가까이 더 나은 CD8dim 인구 (CD8 + γ T 세포와 NK T 세포)를 차별 CD3 단일 긍정적인 신호. 같은 라인을 따라 위치 NK CD56 CD56 적정 목표+ 는 CD3 사이 세포+ 그리고에서 CD3- 인구.
<ol><li>
최대 얼룩 인덱스 곡선 참고: 안티-CD3의 적정-CD8,-CD14-CD19, TCR-γ는 최적으로 긍정적이 고 부정적인 봉우리를 별도의 항 체의 농도 최대 인덱스 곡선15얼룩에 의해 파생 된 표준 절차를 따릅니다. 다른 표식에 대 한 항 체는 패널에 추가 하는 경우 그들은 또한 최대 얼룩 인덱스 곡선으로 적정 해야 합니다.<ol>
<li>2-fold 항 체 희석 버퍼 얼룩의 40 µ L로 96 잘 접시의 10 웰 스를 작성 하 여 준비 합니다. 첫 번째 잘에서 얼룩 버퍼의 80 µ L 최종 볼륨을 증가 하 고 농도 4 회 집중 제조 업체에 의해 제안에 관심의 항 체를 추가 합니다.</li>
		<li>잘 혼합 하 고 두 번째 40 µ L을 잘 전송. 잘 혼합 하 고는 모든 다른 우물에 대 한이 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>10 샘플 PBMC 또는 전체 혈액의 항 체 전에 설명 하는 프로토콜을 다음의 10 가지 2-fold 희석의 30 µ L 얼룩.</li>
		<li>교류 cytometer와 데이터를 수집 하 고 각 희석 (그림 1A)에서 신호 플롯.</li>
		<li>각 항 체 농도 대 한 부정적이 고 긍정적인 인구에 게이트. 항 체의 농도 증가 하는 것은 높은 배경 귀 이어질 수 있습니다. 따라서, 그에 따라 부정적인 게이트를 크기 조정 합니다.</li>
		<li>각 항 체 농도 대 한 중간 및 부정적인 인구의 형광 강도 대 한 표준 편차 및 긍정적인 인구의 형광 강도 대 한 중간에 대 한 정보를 추출 합니다. 이 수식 사용 하 여 얼룩 인덱스 각 항 체 농도 대 한 계산: (긍정적인 인구의 중간 형광 강도-부정적인 인구의 중간 형광 강도) ÷ (2 x 표준 편차의 형광 강도 네거티브 인구) (그림 1B).</li>
		<li>얼룩 인덱스 vs. 항 체 희석의 분수로 표현 하는 항 체 농도 플롯 (예, 1시 10분 희석 = 0.1), 최대 얼룩 인덱스 값 (그림 1C)와 항 체의 농도 확인 하 고.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
안티-c d 4와-CD56 항 체 적정 참고: 이전 적정 2 형광 색소 패널에 다른 마커 의존 안티-c d 4와-CD56 항 체 적정. 적정 배치 안티-CD4 목표로 안티 CD4 항 체에 대 한 이중 CD8 사이 신호+/CD3+ 신호와 CD3 단일 긍정적인 인구 (그림 1D).<ol>
<li>적정 안티 CD4 및 이전에 설명한 대로 2-fold 희석 전략 CD56 항 체 CD4 분리를 허용 하는 가늘게 농도의 범위를 식별 하는 사이 추가적인 농도 추가+ T 세포 및 NK 세포는 다른 세포에서 인구입니다.</li>
		<li>이중 CD8 사이 안티 CD4 신호를 배치 하 여 안티-CD4 항 체를 적정+/CD3+ 신호와 CD3 단일 긍정적인 인구 (그림 1D). 참고: 특별 한 주의 CD4 명확 하 게 분리 할 수+ T부터 CD8 세포+ 인구를 흐리게.</li>
		<li>다음 전략 비슷합니다-안티-CD4 항 체 적정, CD3-부정과 CD3 양성 인구 사이 NK 세포를 배치 하 여 안티 CD56 항 체 적정</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 제어 전략
<ol><li>
림프 및 monocytic 세포 인구를 식별 하 고 분석에서 죽은 세포 및 잔여 적혈구의 대부분을 제거 합니다.
	<ol>
<li>림프 톨, monocytes 앞으로 대 면 산포 지역에 기반을 포함 하는 전체 인구를 선택 (FSC-A vs SSC-A). 앞으로 살포 높이 대 앞으로 분산형 폭 (FSC-H 대 FSC-W)를 통해 분석 및 측면 분산형 높이 대 측 분산형 폭 (SSC-H 대 SSC W)에서 셀 집계를 제거 합니다.</li>
		<li>라이브/죽은 차별 마커를 사용 하 여 밝은 긍정적인 죽은 세포 및 잔여 적혈구는 분석에서 제외. 림프 톨, monocytes 다른 FSC-A와 SSC-A 프로 파일에 따라에 게이트.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
2 형광 색소 7-마커 림프모구 인구의 제어 전략. 참고: CD3 긍정적인 비율, CD4 내+, CD8+ γ T 세포 CD4, CD8 고 γ 수용 체를 대상으로 하는 항 체를 사용 하 여 분리 될 수 있습니다. 유사한 방법에서는, CD3 부정적인 비율, 내 B 세포, NK 세포, monocytes 식별할 수 있습니다 유일 하 게 각각 CD19, CD56, CD14에 대하여 항 체를 사용 하 여.<ol>
<li>림프 구 게이트를 선택 하 고이 프로토콜 (그림 2B)에 사용 되는 두 개의 형광 중 각 축에 점이 음모를 만들.</li>
		<li>게이트에 CD8+ T CD3 됨으로 셀+/CD8+ 더블 도트-줄거리 (그림 2B)의 오른쪽 상단 모서리에 긍정적인 세포. Dim CD8 인구 NKT 세포 포함 될 수를 제외 합니다. CD4에 게이트+ T 세포 CD8 사이 인구로 식별+ T 세포와는 CD3 단일 긍정적인 인구. Γ T 세포 높은 CD3 셀으로 식별에 게이트. Γ CD8 긍정적인 부정적인 CD8 T 세포를 분할 합니다.</li>
		<li>CD3 양성 사이 인구로 식별 하는 NK 세포와 CD3-부정적인 셀에 게이트. CD8 긍정적인 및 부정적인 CD8 NK 세포를 분할 합니다. 문 CD3 음수가 CD19로 식별 하는 B 세포에+ 점 플롯의 오른쪽 하단 모서리에 인구.</li>
		<li>Monocyte 게이츠를 선택 하 고이 프로토콜 (그림 2C)에 사용 되는 두 개의 형광 중 각 축에 점이 음모를 만들. 게이트는 c d 3에-/CD14+ 인구.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

여기에 제시 된 프로토콜 매우 유연 하 고 변화 버퍼, 온도 및 셀 표면에 혈통 마커의 높은 표현으로 인해 주변 혈액 세포 준비 얼룩에 구분 표시 되었습니다. 높은-품질, 재현할 수 데이터를 얻기 위해 가장 중요 한 단계는 항 체 적정. 주의 때문에 항 체의 적정 흐름 cytometric 패널의 설치 하는 동안 항상 수행 해야이 단계 추가 하지 않습니다 여분 벤치 타임 우리의 2-형광 색소 접근. 안티-CD3의 적정-CD8,-CD14-CD19, TCR-γ는 최적으로 긍정적이 고 부정적인 봉우리를 별도의 항 체의 농도 최대 인덱스13,14얼룩에 의해 파생 된 표준 절차를 따릅니다. 피크 또는 얼룩 인덱스 곡선의 상승에 피크에 가까이에 희석 되어야 합니다 (그림 1A-C)을 선택. 다른 한편으로, 안티-c d 4와 안티 CD56 항 체의 ad h...

Cytometry 이벤트 두 번째1당 몇 천의 속도로 단일 입자에 여러 매개 변수를 분석 하에 개발 된 기술입니다. 표본 cytometry 분석의 예는 포함 되지만 셀, 구슬, 박테리아, 소포 및 염색체에 국한 되지 않습니다. 유체 시스템 어디 하나 이상의 레이저와 그것의 경로 교차 하는 각 입자 및 여러 매개 변수는 추가 분석을 위해 기록 됩니다 심문 지점에서 입자를 지시 합니다. 앞으로 및 측면 살포, 순수한 레이저 빛의 산란에 의해 생성 된 대상 인구를 식별 하 고 각각 상대적인 크기와 입자의 내부 복잡성/단위에 대 한 정보를 검색 하는 데 사용 됩니다. 모든 다른 매개 변수, 흐름 cytometric 분석에서 데이터의 대부분을 담당 하는 형광 색소 표시 된 조사는 인식 하 고 바인딩할 특정 대상의 입자에 의해 파생 됩니다.
Cytometry 면역학 연구 특성화 세포 인구를 식별 하는 기본 도구입니다. 면역 시스템의 복잡성을 해 부하 다 색 패널은 세포 인구1의 깊은 immunophenotyping 동시에 기록 하는 마커의 수를 확장할 끊임없이 진화 된다. 이것은 20 형광 매개 변수를 초과 하는 최근 하이 엔드 흐름 cytometers 형광, 및 더 많은 능력의 개발을 선도 합니다. 이 결과 형광 색소 스펙트럼 중복으로 인해 복잡 한 연구 디자인 및 사용자 지정 항 체 라벨 및 숙련 된 연산자와 관련 된 높은 비용. 여러 인스턴스, 복잡성 및 비용 다른 세포 인구에 대 한 마커의 별도 패널을 사용 하 여 감소 된다. 그러나이 방법은, 오류가 발생 하기 쉬우며, 각 패널에 정보를 감소 이며 세포의 제한 된 수의 샘플에 적용 하기 어려울 수 있습니다. 또한, 적은 형광 매개 변수를 가진 계기에 깊은 immunophenotyping을 걸로 하겠습니다 마커 수 증가. 우리는 이전 주요 면역 인구를 식별 하는 얼룩 프로토콜을 개발 (CD4+ 와 CD8+ T 세포, γ T 세포, B 세포, NK 세포, monocytes) 7 혈통 마커를 사용 하 여 결합 하 여 주변 혈액 단 세포 (PBMCs) 7 대신만 두 형광 전통적인 "한 형광 색소 1 마커" 접근 (www.hcdm.org)2,3를 사용 하 여 필요 합니다. 우리의 초기 보고서 탐색 하 고 깊은 immunophenotyping에 대 한 두 가지 형광에 7 개의 마커를 결합의 개념을 확인. 이 보고서에서 우리는 단계에 의해 단계 프로토콜을 분리 하 고 주변 혈액 세포, 얼룩를 제시 하는 실용적인 측면에 초점을 맞추고 및 성공적인 얼룩을 달성 하는 단계를 문제 해결.
이 프로토콜은 그 혈통 마커 상수 식 세포 표면에 있고 각 셀 인구는 혈통 마커의 독점 조합 관찰을 기반으로 합니다. PBMCs에서 CD3 식 다시 나눈다 면역 세포 두 가지 주요 범주로: CD3 양성 T 림프 톨 및 CD3-부정적인 세포. CD3 긍정적인 비율, CD4 내+, CD8+ γ T 세포 CD4, CD8 고 γ 수용 체를 대상으로 하는 항 체를 사용 하 여 분리 될 수 있습니다. 유사한 방법에서는, CD3 부정적인 비율, 내 B 세포, NK 세포, monocytes 식별할 수 있습니다 유일 하 게 각각 CD19, CD56, CD14에 대하여 항 체를 사용 하 여. 표준 한 형광 색소 1 마커 접근, 안티-CD3-CD4,-CD8,-CD14,-7 다른 형광 CD19-CD56, TCR-γ 항 체는 검출. 우리의 접근 방식, 결합 한 안티-CD3-CD56, 그리고 한 형광 색소 (형광 색소 편의 A에 대 한 분류) 및 안티-CD4-TCR γ 항 체-CD8,-CD14와-CD19 항 체에 다른 형광 색소 (형광 색소 B). 이 항 체 적정 및 차동 항 식의 조합에 의해 가능 하다. 두 CD4+ 와 CD8+ T 세포에 형광 색소, 안티-CD3 항 체에 대 한 긍정적인 하지만 형광 B는 CD8 사이 CD4 신호를 ad hoc 적정으로 배치 하면서 CD8 신호 표현의 극대화 색소에서 분리 될 수 있다 고 CD3 이중 부정 긍정적인-CD4/CD8 세포. Γ T 세포 표현 보다는 c d 4와 CD8, CD3의 높은 수준 그리고 그러므로 그들은 CD3 높은4로 식별할 수 있습니다. 이 신호는 라벨 γ 형광 색소 A CD3 낮은 T 세포와 CD3 높은 γ T 세포 구분 개선 한 안티 TCR γ 항 체와 T 세포에 의해 더 밀어 주었다. B 세포는 c d 3로 확인 될 수 있다- 형광 색소 A와 CD19+ 형광 색소 나에 CD3 부정적인 NK 세포 B 세포에서 분리, 안티 CD56 항 체는 형광 색소 A에에서 안티-CD3으로 사용 되었다. CD56 CD3 T 세포5보다 훨씬 낮은 수준에서 NK 세포에 표현 했기 때문에 이것이 가능 합니다. 마지막으로, monocytes는 앞으로 사이드 분산형 속성 및 형광 색소 B. CD14의 식의 조합을 통해 확인할 수 있습니다.
2 형광을 사용 하 여 최대 4 개의 마커를 결합의 아이디어6,7,8, 전에 이미 성공적으로 시도 하 고 악성 림프 인구9 식별 하는 임상 프로토콜에 사용 되었습니다. . 이전 보고서는 또한 7 개의 마커를 결합 (다른 특이성 표식에서와 우리가 우리의 프로토콜에서 사용 하는 보다) 다양 한 양의 형광 색소10각 항 체의 복잡 한 라벨에 의존 2 개의 형광, 하지만이 방법을 사용 하 여. 이 대조적으로 우리의 메서드는 상업적으로 사용할 수 있는 항 체를 사용 하 여 악기 구성에 적용할 수 있습니다 하 고 고분자 형광의 새로운 세대를 활용할 수 있습니다.
이 방법론의 전반적인 목표 대부분 교류 cytometers 복잡 한 세포 인구가 5 추가 마커의 녹음에 대 한 수의 광학 한계를 확장 하는 것입니다. 결과적으로, 저렴 한 6-10 형광 색소 교류 cytometers에 고급 면역학 분석을 수행할 수 있습니다 그리고 2-3 형광 색소 필드 악기 한정 된 자원 가진 지역에서 놀라운 결과 얻을 수 있습니다. 최고급 악기도 깊은 교류 cytometry 분석을 수행 하 고 동일한 시간11에서 여러 계보를 대상으로 하는 cytometric 패널 모듈형 흐름을 만들려면 추가 형광을 사용 하 여이 접근에서 활용할 수 있습니다. 이 잠재적으로 모듈형 immunophenotyping cytometry에 사용 되는 패널의 수를 감소 하 고 비용, 오류 및 처리 시간을 줄일 수 있습니다. 이 접근은 또한 매우 잘 임상 샘플 셀의 제한 된 수의 경우 적합 합니다.

<table><tbody><tr><td>CD3</td><td>BD Biosciences</td><td>562426</td><td>염색 항체 RRID: AB_11152082</td></tr><tr><td>CD56</td><td>BD Biosciences</td><td>562751</td><td>염색 항체 RRID: AB_2732054</td></tr><tr><td>TCRgd</td><td>BD Biosciences</td><td>331217</td><td>염색 항체 RRID: AB_2562316</td></tr><tr><td>CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>555347</td><td>염색 항체 RRID: AB_395752</td></tr><tr><td>CD8</td><td>BD Biosciences</td><td>555367</td><td>염색 항체 RRID: AB_395770</td></tr><tr><td>CD14</td><td>BD Biosciences</td><td>555398</td><td>염색 항체 RRID: AB_395799</td></tr><tr><td>CD19</td><td>BD Biosciences</td><td>555413</td><td>염색을 위한 항체 RRID: AB_395813</td></tr><tr><td>CD3</td><td>BD Biosciences</td><td>555335</td><td>염색을 위한 항체 RRID: AB_398591</td></tr><tr><td>CD56</td><td>BD Biosciences</td><td>555518</td><td>염색을 위한 항체 RRID: AB_398601</td></tr><tr><td>TCRgd</td><td>BD Biosciences</td><td>331211</td><td>염색용 항체 RRID: AB_1089215</td></tr><tr><td>CCR7</td><td>Biolegend</td><td>353217</td><td>염색용 항체 RRID: AB_10913812</td></tr><tr><td>CD45RA</td><td>BD Biosciences</td><td>560674</td><td>염색용 항체 RRID: AB_1727497</td></tr><tr><td>CCR4</td><td>BD Biosciences</td><td>561034</td><td>염색용 항체 RRID: AB_10563066</td></tr><tr><td>CCR6</td><td>BD Biosciences</td><td>353419</td><td>염색용 항체 RRID: AB_11124539</td></tr><tr><td>CXCR3</td><td>BD Biosciences</td><td>561730</td><td>염색 RRID에 대한 항체: AB_10894207</td></tr><tr><td>CD57</td><td>BD Biosciences</td><td>562488</td><td>염색에 대한 항체 RRID: AB_2737625</td></tr><tr><td>HLA-DR</td><td>BD Biosciences</td><td>563083</td><td>염색 RRID에 대한 항체: AB_2737994</td></tr><tr><td>CD16</td><td>BD Biosciences</td><td>563784</td><td>염색에 대한 항체 RRID: AB_2744293</td></tr><tr><td>Dead cells</td><td>Life technologies</td><td>L-23105</td><td>Live/dead discrimination</td></tr><tr><td>Falcon 5 mL 라운드 바닥 폴리스티렌 시험관 (세포 여과기 스냅 캡</td><td>포함) BD Bioscience</td><td>352235</td><td>유세포 분석기를 통과하기 전에 세포 현탁액을 필터링하는</td></tr><tr><td>BD</td><td>Bioscience</td><td>352001</td><td>염색 전 전혈</td></tr><tr><td>회수 세포 배양 동결 매체</td><td>Thermo fisher</td><td>12648010</td><td>동결 세포</td></tr><tr><td>96웰 V-바닥 플레이트</td>, <td>Thermo fisher</td><td>249570</td><td>염색용 플레이트</td></tr>, <tr><td>FACSAria IIu 세포 분류기</td><td>, BD Biosciences,</td><td></td><td>유세포 분석기</td></tr>, <tr><td>FCS Express, 6</td><td>De Novo 소프트웨어</td><td></td><td>, FACS 분석</td></tr>, <tr><td>Graphpad, Prism</td>, <td>GraphPad 소프트웨어</td><td></td>, <td>데이터 분석</td></tr></tbody></table>

2 형광 색소에 의해 7 개의 면역 세포 하위 집합의 차별 cytometry 흐름

Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry

면역 세포 특성화는 무 겁 게 차동 식 표면 표식에 따라 모집단을 식별 하기 위해 여러 가지 빛깔 cytometry에 의존 합니다. 클래식 멀티 컬러 패널의 설치에는 최고급 악기, 사용자 지정 레이블이 지정 된 항 체, 및 스펙트럼 중복을 최소화 하기 위해 주의 깊은 연구 디자인 필요 합니다. 우리 주요 면역 인구를 식별 하는 multiparametric 분석 개발 (CD4+ 와 CD8+ T 세포, γ T 세포, B 세포, NK 세포, monocytes) 두 형광을 사용 하 여 7 개의 혈통 마커를 결합 하 여 말 초 혈액에서. 우리의 전략은는 혈통 마커 독특한 조합에 각 세포 인구에 의해 표현 됩니다 끊임없이 관찰을 기반으로 합니다. 항 체의 주의 적정와 함께이 정보를 결합 하 여 대부분 교류 cytometers의 광학 제한 확대 5 추가 마커를 기록 하는 조사 수 있습니다. 머리 비교 시연 주변 혈액에서 면역 세포 인구의 대다수 우리의 방법과 고전적인 "한 형광 색소 1 마커 접근", 사이 대 등 한 정확도로 나타낼 수 있다 비록 후자는 여전히 NKT 세포 등 γ T 세포 인구를 식별 하는 데 더 정확 하다 두 형광을 사용 하 여 7 개의 마커를 결합 하 여 복잡 한 면역 세포 인구와 저렴 한 6-10 형광 색소 교류 cytometers, 그리고 한정 된 자원 가진 지역에서 2-3 형광 색소 필드 악기에도 임상 샘플의 분석에 대 한 수 있습니다. 최고급 악기도 깊은 교류 cytometry 분석을 달성 하기 위해 여분의 형광을 사용 하 여이 접근에서 활용할 수 있습니다. 이 접근은 또한 매우 잘 임상 샘플 셀의 제한 된 수의 경우 여러 세포 인구를 심사 적합 합니다.

설정 및 인간 주변 혈액 세포의 흐름 cytometry 실험의 분석 물 7 혈통 마커 (안티-CD3-CD4,-CD8,-CD14,-CD19-CD56, TCR-γ 항 체)만 두를 사용 하 여 형광 표시 됩니다.
한 안티 CD8-CD56 항 체 적정 대표적인 결과 설명 합니다. 각 항 체에 대 한 (이 예제에서는 안티-CD8), 10 연속 2-fold 희석에서 데이터 얼룩 인덱스 곡선 (그림 1A-C)을 계산 하기 위해 기록 되었다. 최적의 항 체 농도 최대 얼룩 인덱스 신호13,14에 의해 결정 되었다. 희석 피크 또는 얼룩 인덱스 곡선의 상승에 피크를 가까이에서 선택 되어야 합니다. 안티-c d 4와-CD56 항 체 (적정 이전) ...

여기, 선물이 CD4를 식별 하는 흐름 cytometric 프로토콜+ 와 CD8+ T 세포, γ T 세포, B 세포, NK 세포와 7 대신만 두 형광을 사용 하 여 인간의 말 초 혈액에 monocytes. 이 방법을 5 추가 마커 대부분 교류 cytometers에 기록할 수 있습니다.

2 형광 색소에 의해 7 개의 면역 세포 하위 집합의 차별 Cytometry 흐름

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. ...

이 방법론의 전반적인 목표는 연구원이 복잡한 세포 집단을 심문하기 위하여 5개의 추가 마커를 기록할 수 있게 함으로써 대부분의 유량 세포계의 광학 한계를 넘어 확장하는 것입니다. 이 기술을 사용하여, 제한된 수의 세포로 검출기 또는 샘플의 낮은 수와 기기로 작업 할 때 깊은 면역 페노티핑을 달성 할 수있다. 그려진 혈액을 50밀리리터 원내 튜브로 조심스럽게 이송하여 이 절차를 시작합니다.칼슘과 마그네슘없이 PBS의 동일한 금액으로 혈액을 희석. 새로운 50밀리리터 원판 튜브의 바닥에 밀도 그라데이션 배지 15밀리리터를 추가합니다. 밀도 그라데이션 배지 위에 희석된 혈액을 조심스럽게 오버레이하여 밀도 그라데이션 배지와 희석된 혈액 간의 혼합을 피합니다.원심분리기는 실온에서 30분 동안 400배 g의 원심분리기로, 브레이크없이 인터페이스의 중단을 방지합니다. 원심분리 후 파이펫을 사용하여 상층을 조심스럽게 흡인하고 폐기하여 플라즈마와 밀도 그라데이션 배지 사이의 인터페이스에서 세포를 제거하지 않도록 주의를 기울입니다. 50밀리리터 원핵튜브의 바닥에 있는 적혈구 펠릿을 만지지 않고 인터페이스로부터 가능한 한 많은 말초 혈액 단핵세포 또는 PBMC를 수집하고 새로운 튜브로 이송한다.PBS를 추가하여 최종 볼륨을 25 밀리리터에 가져오고 여러 번 반전하여 혼합합니다. 그런 다음 텍스트에 표시된 대로 PBMC를 두 번 세척합니다. 혈소판을 제거하고 텍스트에 설명된 바와 같이 PBMC를 계수한 후, PBS에서 세포를 재연한 후, 0.1%의 나트륨 아지드를 밀리리터당 7번째 세포에 1회 10분의 1의 농도로 재보페팅한다.염색을 위해 PBMC를 준비하려면 각 샘플의 100 마이크로리터를 96웰 V-바닥 플레이트로 전송합니다. 상온에서 3분 동안 350배g의 접시를 원심분리합니다. 셀 펠릿을 방해하지 않고 슈퍼나탄을 조심스럽게 흡인시합니다.각 우물에, 단백질에 무료 아민과 반응하는 라이브 / 죽은 고정 염료를 포함하는 PBS의 100 마이크로 리터를 추가하고, 신중하게 PBMC 혼합물을 다시 중단. 그 후, 플레이트가 죽은 세포의 라벨링을 위해 실온에서 10 분 동안 앉을 수 있도록하십시오. 각 샘플에 대해, 모든 7개의 항체를 포함하는 혼합의 30 마이크로리터를 준비합니다.이 단계에서, 다른 표적 분자및 다른 형광에 대하여 적정항체는 또한 추가할 수 있습니다. 실온에서 3분 동안 96웰 플레이트를 350배g에서 원심분리하고 셀 펠릿을 방해하지 않고 슈퍼나탄을 조심스럽게 흡인시합니다. 항체 칵테일을 각 웰에 넣고 거품을 일으키지 않고 조심스럽게 다시 일시 중지합니다.어둠 속에서 실온에서 30 분 동안 배양하십시오. 30분 후 각 웰에 150마이크로리터의 염색 버퍼를 추가하고 실온에서 3분 동안 350배의 플레이트를 원심분리합니다. 세포 펠릿을 방해하지 않고 슈퍼나탄을 조심스럽게 흡인시키고 PBS의 200 마이크로리터에서 세포를 재보힙합니다.세포는 이제 유동 세포 분석에 대 한 준비가 되었습니다. 안티 CD3, CD8, CD14, CD19 및 TCR 감마 델타 항체는 최대 염색 지수 곡선으로 적정화된다. 항체 적정은 2개의 불소크롬을 사용하여 7개의 면역 세포 서브세트를 제대로 확인하기 위하여 이 프로토콜에서 가장 중요한 단계입니다.2배 의 항체 희석을 준비하려면 96웰 플레이트 의 10웰을 우물당 40 마이크로리터의 염색 버퍼로 채웁니다. 이 비디오의 목적을 위해 안티 CD8의 적정만 표시됩니다. 첫 번째 우물에서는 최종 부피를 염색 버퍼의 80 마이크로리터로 늘리고 제조업체가 제안한 농도의 4배 의 농도로 안티 CD8을 첨가한다.잘 섞어서 40마이크로리터를 두 번째로 잘 옮기. 잘 섞어서 다른 모든 우물에 대해이 단계를 반복하십시오. 이전에 입증된 프로토콜에 따라 10개의 다른 2배 희석제 중 30개의 마이크로리터를 가진 PBMC 또는 전혈의 스테인 10 샘플.유동 사이토미터로 데이터를 획득하고 각 희석으로부터 신호를 플롯합니다. 각 항체 농도에 대한 얼룩 지수를 산출한 후, 항체 희석의 일부로 발현된 항체 농도 대 얼룩 지수를 플롯하고, 최대 얼룩 지수 값을 가진 항체의 농도를 식별한다. 반대로 CD4 및 반대로 CD56 항체를 적재하기 위하여는, 이전에 입증된 2배 희석 전략으로 시작하여, 다른 세포 집단으로부터 CD4 양성 T 세포 및 NK 세포의 분리를 허용할 농도의 범위를 미세하게 식별하기 위해 그 사이에 추가 농도를 추가한다.이중 CD8 양성, CD3 양성 신호 및 CD3 단일 양성 집단 사이에 안티 CD4 신호를 배치하여 안티 CD4 항체를 적시한다. CD3-음수 및 CD3 양성 집단 사이에 NK 세포를 배치함으로써, 안티 CD4 항체 적정과 유사한 전략을 따르는 항 CD56 항체를 적티레이. 이 두 불소, 7 마커 게이팅 전략을 시작하려면 림프구 게이트를 선택하고 각 축에서이 프로토콜에 사용되는 두 개의 플루오로크롬 중 하나와 함께 점 플롯을 만듭니다.CD8 양성 T 세포의 게이트는 점 플롯의 오른쪽 상단에 있는 CD3 및 CD8 이중 양성 셀로 확인되었습니다. NKT 셀을 포함할 수 있는 희미한 CD8 인구를 제외합니다. CD8 양성 T 세포와 CD3 단일 양성 집단 사이의 인구로 확인된 CD4 양성 T 세포의 게이트.높은 CD3 세포로 확인된 감마 델타 T 세포의 게이트. 감마 델타 T 셀을 CD8 양수 및 CD8 음수로 세분화합니다. CD3 양성 및 CD3 음성 세포 사이의 인구로 확인된 NK 세포의 게이트.NK 셀을 CD8 양수 및 CD8 음수로 세분화합니다. 점 플롯의 오른쪽 하단모서리에 있는 CD3-음수, CD19 양성 집단으로 확인된 B 세포의 게이트. 단두구 게이트를 선택하고 각 축에서 이 프로토콜에 사용되는 두 개의 플루오크롬 중 하나를 사용하여 도트 플롯을 만듭니다.CD3-음수, CD14 양성 모집단의 게이트입니다. 이 전략을 사용하여 다발성 골수종을 가진 환자의 림프구는 전방 산란 및 측면 분산 및 유동 세포 측정 프로파일에 기초하여 문이 되었습니다. CD8 양성 메모리 하위 집단 및 순진한 T 세포는 CD45RA 및 CCR7의 발현에 의해 확인되었다.HLA-DR 및 CD57의 발현은 CD8 양성 순진한, 메모리, 중앙 메모리, 이펙터 메모리 및 이펙터 메모리 CD45RA 양성 세포에서 T 세포 활성화를 연구하는 데 사용되었습니다. 유사한 방식으로, CD4 양성 순진한 기억 및 메모리 T 세포가 확인되었다. 메모리 집단 내에서 CCR4 및 CCR6는 CD4 양성 T 세포에서 T 도우미 하위 집단을 식별하는 데 사용되었습니다.NK 세포의 하위 집단은 CD16 및 CD57 발현을 특징으로 하였다. 이 전략은 줄기 세포 이식을 수신하는 다발성 골수종을 가진 기증자에게서 세로 견본의 면역 집단에 있는 역학을 조사하기 위하여 이용되었습니다. 시간이 지남에 따라 CD8 및 CD4 하위 집단의 특성화는 지속적인 CD4 양성 및 CD8 양성 T 세포 활성화 및 T 도우미-1 표현형에 T 도우미의 왜곡을 보였다.그러나 60일째에, B 세포의 백분율은 극적으로 증강되어 환자 재발을 예측했습니다. 적절한 세포 제제 및 항체 적정은 이 기술을 사용하여 신뢰할 수 있는 결과를 달성하기 위한 중요한 단계이다. 다른 마커를 표적으로 하는 항체는 더 깊은 유동 세포측정 분석을 달성하고 동시에 여러 혈통을 표적으로 하는 모듈형 흐름 세포 측정 패널을 생성하기 위하여 추가될 수 있습니다.기록 가능한 마커의 수를 확대하기위한 유사한 접근 법은 다양한 마커 세트를 사용하거나 다른 동물 모델에서 사용하기 위해 개발 될 수 있습니다. 아지드 나트륨이 피부와 눈에 화상을 입을 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 따라서 이 시약을 취급할 때는 실험실 코트, 보호 안경 및 장갑을 착용해야 합니다.

discrimination-seven-immune-cell-subsets-two-fluorochrome-flow

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 총뿐만 아니라 붉은 털원숭이 짧은 꼬리 원숭이의 CD4 +와 CD8 + T 세포, HIV / AIDS 백신 연구를위한 이상적인 모델의 메모리 하위 집합에 대한 자세한 phenotypic와 기능 특성에 대한 여러 가지 빛깔의의 유동세포계측법의 유틸리티를 보여줍니다.

붉은 털원숭이 짧은 꼬리 원숭이의 세포 면역 반응의 여러 가지 빛깔의의 유동세포계측법의 분석

이 동영상은 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포, γδ T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포 및 단핵구를 식별하기 위해 두 개의 형광 색소를 사용하는 유세포 분석 기반 기술을 보여줍니다. 표면 마커에 대해 형광 색소 접합 항체로 세포를 배양하면 최적의 유세포 분석 게이팅 전략을 사용하여 세포 subset을 식별할 수 있습니다.

말초 혈액 단핵 세포에서 면역 세포 subset을 식별하기 위한 유세포 분석 분석

유동 세포 계측법에 의해 면역 세포의 정의 모집단을 가진 나노 입자의 상호 작용의 분석.

유동 세포 계측법에 의해 주요 면역 세포 모집단과 형광 나노 입자의 상호 작용의 검출

면역 능력이 쥐의 흉강에 II-45 악성 세포의 이식에 의한 흉막 악성 중피종의 소성을 쥐 모델의 생성이 제공됩니다. 유세포 방법도 기재되어 25 ㎕의 혈액 샘플로부터이 동물 일곱 면역 세포 서브 세트를 분석한다.

II-45 동계 쥐의 Mesothelioma 모델에서 소성을 주입 및 주변 면역 세포 모니터링

염증은 허혈성 뇌졸중의 발병기전에서 중심적인 역할을 합니다. 점점 더 많은 증거에 따르면 그것은 초기 뇌 손상을 악화시키는 양날의 검으로 작용하지만 나중에 회복하는 데에도 기여합니다. 이 프로토콜은 허혈성 뇌에서 면역 세포를 분리하고 그에 따른 유세포 분석 표현형을 설명합니다.

허혈성 마우스 뇌에서 면역 세포의 분리 및 유세포 분석

이 문서 분광 계측법, 형광 색소를 구별하는 발광 스펙트럼의 형상을 사용하여 유동 세포 계측법에서의 새로운 접근 방식을 설명한다. 알고리즘은 보상을 대체하고 독립적 인 매개 변수로 자동 형광을 처리 할 수 ​​있습니다. 이 새로운 접근 방식은 고체 기관에서 분리 된 세포의 적절한 분석을 할 수 있습니다.

스펙트럼 유동 세포 계측법에 의해 고체 조직에서 분리 한 세포 현탁액의 분석

여기, 분리와 CD4의 특성에 대 한 프로토콜+ T-세포 인간 주변 혈액에서 하위 집합 설명. CD4 정화+ T-세포 cytometry T follicular 도우미 셀 하위 집합의 비율을 결정 하 여 분석 된다.

CD4의 격리+ T-세포 및 분석의 순환 T-follicular 도우미 (cTfh) 6 컬러 Flow Cytometry 주변 혈액을 사용 하 여에서 셀 하위 집합

여기, 선물이 murine thymus, 림프절, 비장 추가 연구를 cytometry를 사용 하 여 이러한 셀을 배출 췌 장에서 단일 셀을 준비 하는 프로토콜. 또한,이 프로토콜 cytometry 사용 규제 T 세포의 하위 집합을 결정 하는 데 사용 되었다.

Murine Thymus, 림프절, 비장 Cytometry 사용 하 여 배출 췌 장 하위 집합 규제 T 세포의 결정

여기에서, 우리는 뮤린 비장, 골수, 림프절 및 교압 조직 내의 엑스트라 세포 염색 분석체를 모두 사용하여 단세포/대식세포 및 T 세포 하위 세트를 식별하기 위해 상세하고 재현 가능한 유동 세포 측정 프로토콜을 설명하며, 골관절염의 확립된 수술 모델을 활용합니다.

골관절염 모델에서 뮤린 비장, 골수, 림프절 및 치압 조직 내의 면역 세포 하위 집합의 흐름 세포 분석

절개된 임플란트에서 세포를 분리하고 유세포 분석을 통한 세포 특성 분석은 임플란트에 대한 면역 반응 패턴을 이해하는 데 크게 기여할 수 있습니다. 이 논문은 절개된 임플란트에서 세포를 분리하고 유세포 분석을 위한 염색을 위한 정확한 방법을 설명합니다.

절개된 임플란트 조직의 면역 기능 분석을 위한 고차원 유세포 분석

학습하세요 두 개의 형광 색소만으로 인간 말초혈액에서 CD4+ T세포, CD8+ T세포, B세포, NK세포, 단핵구 등 7가지 면역 세포 하위 집합을 식별하는 흐름 세포측정법을. 이 방법은 제한된 검출기를 가진 장비에서도 심층 면역 표현형 분석이 가능합니다.

2 형광 색소에 의해 7 개의 면역 세포 하위 집합의 차별 Cytometry 흐름

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