Name: 생산, 정화, 및 Adeno 관련 바이러스 기반 벡터에 대 한 품질 관리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: 학습하세요 고순도 고역가 AAV 벡터 생산 및 정화 방법을 HEK 세포와 초원심분리를 활용하여. 이 프로토콜은 다양한 혈청형 특이적 유전자 전달 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

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M.R.는 Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek 삼기엔 (FWO) 박사 친목 (133722/1204517N)에 의해 지원 되 고 인정 Fundación 심혈 관 드 콜롬비아 및 과학의 관리 부의 지속적인 지원 기술 및 혁신 (그랜트 CT-FP44842-307-2016, 프로젝트 코드 656671250485) Mm은 FWO 박사 친목 (1S48018N)에 의해 지원 됩니다. M.G.H.는 VIB 기관 그랜트와 외부 지원 티에리 Latran 재단 (잔디-VIP), 재단에서 알 츠 하이 연구 (상-FRA) (P #14006), FWO (그랜트 1513616N), 유럽 연구 회의 (ERC) (시작 그랜트에 의해 지원 되었다 281961-AstroFunc; 개념 그랜트 713755-광고-VIP의 증거). 저자는 Jeason Haughton 마우스 축산으로 그의 도움, 꼬리 정 맥 주사를 수행 그녀의 도움에 대 한 스테파니 Castaldo transfected HEK293T 셀의 이미지를 제공 하기 위한 캐롤라인 Eykens을 인정 합니다. M.G.H.는 마이클 던 롭, 피터 Hickman, 그리고 딘 해리슨을 인정 한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>솔루션</td>
			<td colspan="2">구성</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">세포 배양과 transfection</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">DMEM1</td>
			<td>DMEM 1 x</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="3"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="3"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="3"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="5"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="4"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="4"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="4"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="3"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td rowspan="4"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="4"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="4"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="3"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="6"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="7"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="8"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr></tbody></table> <ol><li> </li><li></li><li> </li><li><ol><li><li><li><li> </li></ol></li><li><li><li> </li><li><li></li><li><li></li></ol><img alt="Supplementary Figure" src="/files/ftp_upload/58960/58960sfig1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58960/58960sfig1large.jpg" target="_blank"></a><ol start="12"><li> </li><li></li><li><li> </li></ol><ol><li><li> </li><li><li><li></li><li><li> </li><li></li><li> <ol><li><li></li><li> </li><li> </li></ol></li><li><li></li><li> </li><li></li><li><ol><li></li><li> </li><li></ol></li></ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58960/58960fig1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58960/58960fig1large.jpg" target="_blank"></a><ol><li></li><li></li><li><li></li><li> </li><li> </li><li><li></ol><ol><li><ol><li><li> </li><li><li><li></li><li><ol><li> </li><li> </li><li> </li><li> </li></ol></li><li> </li><li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58960/Table_3._Stock_plasmid_volume_calculator.xlsx" target="_blank"></a><ol start="2"><li><ol><li> </li><li> </li><li> </li><li> </li><li></ol></li><li><ol><li></li><li><li></li><li></li><li></li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58960/58960fig2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58960/58960fig2large.jpg" target="_blank"></a><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="4"></td><td></td><td></td><td></td><td rowspan="4"></td></tr><tr><td></td><td></td><td rowspan="3"></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><ol start="4"><li><ol><li> </li><li></li><li><li> <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58960/58960eq1.jpg"> </li></ol></li></ol><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58960/Table_6_qPCR_data_template.xlsx"></a><ol><li><li><li> </li><li><li><li> </li><li></li><li><li><li><li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><ol start="12"><li><li> </li><li><li><li></li></ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58960/58960fig3.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58960/58960fig3large.jpg" target="_blank"></a>

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저자는 공개 없다.

재조합 형 AAV 벡터의 생산 여기 사용 재료와 장비 대부분의 분자 생물학 실험실 및 셀 문화 시설에 공통을 설명합니다. 그것은 사용자를 생체 외에서 그리고 vivo에서 응용 프로그램의 범위에 걸쳐 여러 세포 및 조직 유형을 대상으로 사용할 수 있는 순수 하 고, 전 임상 등급 AAV 벡터를 얻을 수 있습니다. (즉, CsCl 기반 정화), 다른 사람에 비해이 프로토콜의 가장 큰 장점 중 하나는 필요한 짧은 작업 시간입니다. 준비-사용 AAV 벡터 HEK293T 셀의 초기 transfection 후 6 작업 일의 최대에서 얻을 수 있습니다.
여러 가지 요인 부정적인 최종 수확량 또는 AAV 벡터의 품질에 영향을 미칠 수 있습니다. 불 쌍 한 transfection 효율 낮은 바이러스 수익률33에 대 한 주요 이유 중 하나입니다. 주요 추천이 20 배 이상 passaged 하지 transfection21시간 90% 보다 큰 셀 합류 하지 않은 HEK293T 셀의 사용 이다. 또한, transfection 방법 선택 결과에 큰 영향을 있다. 이 프로토콜은 PEI의 사용을 기반으로 합니다. 페이 폴리머와 핵 산, 셀 및 매매 를 통해 endosomes34에 의해 촬영 되는 polyplexes로 알려진의 단지의 세대를 통해 세포 핵에 외 인 DNA를 제공 하는 능력으로 양이온 중합체 이다. 페이 기초를 둔 transfection은 쉽고 빠르게 다른 널리 사용 되는 방법, 칼슘 인산 염35와 DNA의 공동 강수량 등 달리 수행 하. 또한, 페이 기초를 둔 transfection는 양이온 지질과 자석 중재 transfection36의 사용 등 새로 도입된 된 다른 방법에 비해 훨씬 저렴 합니다.
정화 전략 프로토콜에 핵심 역할을 한다. 다른 방법에 비해, iodixanol 기반 담긴 빈 바이러스 성 입자 (20%)20의 더 높은 백분율을 포함 하는 경향이 있다. 이것은 오프셋, 정도, iodixanol 기반 정화 100의 입자 infectivity 비율 AAV 벡터 준비에 정기적으로 발생 하는 사실에 의해. 이는 입자 infectivity의 상당한 손실을 보고37은 기존의 CsCl 기반 절차에 비해 상당한 개선을 나타냅니다. 또 다른 일반적인 대체 AAV 벡터 정화 방법은 크로마토그래피 기반 정화입니다. 그러나,이 메서드는 특정 열이 사용 하는 각 벡터 capsid에 필요한 주요 단점: 예를 들어 AAV2 고전적인 덤플링을 열을 사용 하 여 격리 하는 동안이 방법을 작동 하지 않습니다 AAV4와 AAV5, 헤 파 린 바인딩을가지고 하지 않습니다 그들의 capsids38에 사이트입니다. 크로마토그래피 정화는 또한 비싼 고려 하 고, iodixanol 기반 정화는 일반적으로 더 작은 규모33,39, , AAV 벡터의 높은 품질 일괄 처리를 생성 하고자 하는 실험실에 적합 그러나 40. 최종 수율 및 순도 벡터의 극대화, 주의 필요 iodixanol 그라디언트를 만들 때. 다양 한 iodixanol 분수 누구의 팁 튜브의 벽에 닿아 살 균 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 ultracentrifugation 튜브에 전송 해야 합니다: 천천히 그리고 지속적으로 iodixanol는 피 펫에서 추방 되어야 한다. 40 %iodixanol 레이어, 벡터 입자 축적으로 케어 그라데이션 인터페이스20을 혼합 하지 않도록 주의가 필요 합니다. 마지막으로, 포함 하는 벡터 분수 하지 20 g. 보다 더 큰 계기와 스테인리스 무딘 바늘의 삽입으로 복구할 수 한다 벡터 복구를 최대화 하기 위해 분명 분수 전체에서 검색 해야 합니다. 이 단계 동안 타이밍이 중요 합니다. 준비의 순수성을 손상 시 키 지 않으려면 그라데이션 (오염) 다른 단계는 수집 하기 전에 컬렉션을 막으려고 필수적 이다.
가져온된 벡터 titer에 차이 포장된 입자를 생산 하는 벡터의 본질적인 기능을 또한 지정할 수 있습니다. 다른 AAV serotypes 비교 일부 AAV 벡터 더 어려운 다른 사람 (예를 들어, AAV2) 보다 더 높은 titer에서 생산 하는 보여주었다41. 강 수는 벡터의 염 단계 낮은 titer에 대 한 가능한 이유 고 쉽게 overconcentration33를 피 함으로써 막을 수 있습니다. 또한, 그것은 또한 iodixanol 그라데이션 기반 정화의 효율성은 serotypes 약간 다릅니다 있으며 따라서, 다른 serotypes 얻은 titer 불일치41관찰 될 수 있다.
마지막으로, 그것은 정량 Pcr는 DNA 정량화에 대 한 매우 정확한 방법 이지만 기술에서 몇 가지 고유의 가변성 관찰 될 수 있다 밖으로 지적 될 필요가 있다. 정확도 적정에 주로 정확한 pipetting 모든 솔루션의 적절 한 vortexing에 따라 다릅니다. 읽고 가장 정확한 titer를 보장 하는 정량 수 독립적으로 반복 하지, 그리고 얻은 값 평균. 이 프로토콜에서 제시 하는 뇌관의 선택 우리의 실험실에 사용 된 pTransgene 플라스 미드에 있는 CBA 발기인의 순서를 기반으로 합니다. CBA 발기인은 여러 세포 유형에 걸쳐 드라이브 식 벡터 필드에서 널리 이용 되는 강한 합성 발기인이 이다.입니다. 그것은 세포 (CMV) 초기 증강 요소;를 포함 하 여 여러 요소를 통합 발기인, 첫번째 exon 그리고 CBA 유전자;의 첫 번째 intron 그리고 토끼 β-globin 유전자의 결합 수락자. 그러나, 뇌관 식 카세트 (발기인, transgene, 및 규정 요소를 포함 하 여) 내에 있는 거의 모든 요소에 대 한 디자인할 수 있습니다. 일괄 처리를 통해 titer의 비교 뇌관에 벡터에 공통 영역에 대해 사용 되는 제공 가능, 이기도 합니다.
결론적으로,이 프로토콜 AAV 벡터 capsids, 게놈 구성, 발기인 유형 및 transgene 화물의 다양 한 생산에 사용할 수 있습니다. 이것은 쉽게 가장 실험적인 요구에 맞게 그들의 벡터의 마지막 특성에 맞게 사용자가 있게 됩니다. 예제 대표 결과는 PHP 사용 하 여 합니다. 효율적으로 BBB를 교차, B capsid CNS, 다음 꼬리 정 맥 주입32고효율 유전자 발현을 했다. CNS 침투 벡터의 체계적 관리 가능한 부작용2,,1732측면에서 상당한 장점이 있습니다. 침략 적 기법의 주의 피하고 있는 동안 주변 주입에 대 한 가능한 대안 intrathecal 배달, 배달 AAV 벡터의 중추 신 경계는으로 구성 된입니다. 이 배달 경로 효과적일, 주변 장기와 면역 응답42의 낮은 수준에 더 적은 오프 대상 효과 CNS에 걸쳐 transgene의 광범위 한 표현을 보여주는 입증 된다. 그러나, intrathecal 주사는 더 많은 도전, 그들은 꼬리 정 맥 주입 보다 높은 기술을 필요로.
이 기술은 수정 capsid 발전 AAV 벡터 사용 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 기회에 의해 구동 된다. 이러한 접근 등 루 경화 증, Charcot Marie이 질병, 파 킨 슨 병 알 츠 하이 머 병18현재 불 치 CNS 질환 치료에 매력적인 가능성을 제공.

지난 30 년 동안 야생-타입 AAVs 입증 CNS1,2,,34로 유전자 전송 위한 매우 유용한 도구, 재조합 형 AAV 벡터를 만드는 설계 되었습니다. 5,6 , 유전자 치료 접근 (를 포함 하 여 FDA 및 EMA 승인 요법) 질병4,7. CNS에 사용 하기 위해 그들의 적합성은 크게 비 나눈, 포스트 mitotic 세포 감염, CNS8에서 일반적으로 발견에 그들의 능력에서 파생 됩니다. 그러나, AAV 근거한 벡터는 또한 다른 바이러스 성 벡터7에 비해 온화한 면역 응답을 도출 하는 동안 어떤 주어진된 치료 transgene4,9 장기 표현의 허용의 이점이 있다 8,10,,1112.
어떤 AAV 벡터의 주요 요소는 게놈과는 capsid. 야생-타입 AAVs는 단일 가닥 (ss) 약 5 kilobases (kb)13의 게놈 DNA 바이러스. 재조합 형 AAV 벡터의 생산에 대 한 (게놈 복제 및 바이러스 성 capsid의 조립에 필요한) 담당자 와 모자 유전자는 강포한 유형 AAV 게놈에서 삭제 하 고 트랜스에위해 제공 된 식 카세트 transgene14,15를 포함 하. 원래 바이러스 성 게놈의 거꾸로 단말기 반복 시퀀스 (ITRs) 복제 및3,,1014포장을 위해 필수적으로 AAV 벡터에 유일한 유지 요소입니다. AAV 벡터는 transgene 식;을 향상 시키기 위해 설계 될 수 있다 하나는 ITRs의 돌연변이 효과적으로 보완 DNA 가닥3,,715의 생성을 허용 하는 머리 핀 루프의 형성에 지도 한다. 자체 보완 (sc) 게놈 불리는이 구성의 주요 장점은 AAVs transgene 식 의 수준과 속도 상당히 증가의 전통적인 라이프 사이클에 전형적인 2 가닥 합성에 대 한 필요를 무시 1. 그럼에도 불구 하 고, 약 2.4 kb 벡터의 화물 용량 감소 scAAV 게놈을 사용 하 여. 발기인 또는 예측에 관한 바인딩 사이트, 특정 세포 유형16식 제한 등 규제 어떤 순서 뿐만 아니라 transgene 시퀀스 포함 됩니다.
AAV capsid 벡터 호스트 세포 상호 작용을 결정 하 고 세포 유형 또는 조직 차 있는 굴곡 운동 transgene 식 특정 위치로 제한 하도 개발 될 수 있는 AAV serotype에 대 한 학위를 수 여. 반면 다른 재조합 방법 (즉, PHP 통해 실험실에서 생산 된 여러 AAV serotypes 자연에서 찾을 수 있습니다. B). 또한, 일부 capsids 또한 조직의 관리 후 transgenes는 CNS에 걸쳐 배달 결과 BBB를 교차 하는 기능 등 다른 유용한 특성을 수 여. 이 AAV9, 뿐만 아니라 최근 설명된 PHP에 대 한 표시 되었습니다. B capsid17. 결과적으로, 이러한 serotypes는 특히 신경 질환1,,1718에 대 한 새로운 유전자 치료 접근에 대 한 관련성이 증명 하 고 있다.
이 프로토콜의 목적은 높은 titer와 순도 AAV 벡터의 소규모 생산을 위한 비용 효율적인 방법을 설명입니다. 비록 결과 여기에 제시 된 PHP를 사용 합니다. B capsid 그리고 scAAV 식 카세트, 프로토콜은 여러 AAV 벡터 serotypes 및 게놈 구성, 최대 실험 유연성을 허용의 생산에 적합. 그러나, 벡터 수율과 최종 순도 선택한 serotype에 따라서 달라질 수 있습니다.
프로토콜 자체 생산 바이러스 성 벡터에 대 한 고전적인 트라이-transfection 방법의 변형 이며 벡터 정리는, 세 슘 염화 물 (CsCl) 그라디언트를 사용 하 여 클래식 비교에 대 한 iodixanol 그라디언트를 사용 하 여 통합 생산 시간 효율적인 방식으로19,20,21에서 높은 순도의 AAV 벡터에 보고.
Transfection, 정화 및 농도 단계 바이러스 성 벡터 작업에 대 한 평가 조직 배양 실험실에서 좋은 연구실 관행 (GLP)에 따라 수행을 위한 것입니다. 각 작업 바이러스 성 벡터 생산에 관한 관련 지역 및 국가의 법률에 따라 수행 하 여 사용 해야 합니다. 일 층 흐름 후드와 살 균 조건에서 밖으로 실행 되어야 한다. 벡터 시설 내 일반 조직 배양 실험실 코트 뿐만 아니라 랩 앞치마를 착용 하는 것이 좋습니다. 또한, 장갑, 플라스틱 overshoes의 두 배 쌍 항상 착용 되어야 한다.
모든 필요한 장비 확인 벡터 생산을 시작 하기 전에 플라스 미드를 사용할 수 있습니다. 1) pCapsid 플라스 미드 복제, 즉 Rep78, Rep68, Rep52, 및 Rep40, 필요한 4 개의 비 구조 단백질을 인코딩합니다 rep 유전자와 3 구조 capsid 단백질, 즉 VP1, VP2, 및 VP3 인코딩합니다 모자 유전자 포함 되어 있습니다. 2) pHelper 플라스 미드 유전자를 E4, E2A, 및 버지니아 에서 아 데 노 바이러스, HEK293T 세포에서 AAV 생산을 용이 하 게 포함 되어 있습니다. 3) pTransgene 플라스 미드에는 두 ITRs에 의해 형벌 transgene 식 카세트를 포함 되어 있습니다. 이 플라스 미드는 시퀀스 사용 가능한 온라인22를 사용 하 여 실험실에서 합성된 드 노 보 될 수 있습니다. 플라스 드 노 보를 만든에 대 한 특히 그들 포함 하는 소설 transgenes 시퀀싱은 transgene 및 ITRs 올바른지 있는지 확인 하는 데 필요한. 또는, premade 플라스 미드 플라스 미드 온라인 저장소를 통해 직접 취득 될 수 있다. 필요한 경우, 플라스 미드 증폭 될 수 있다 하 고 제조업체의 지침23에 따라 표준 키트를 사용 하 여 정화.
벡터 titer 고 순도의 벡터 변환 능력을 저하 수 있습니다. 추가 프로토콜 생산된 벡터의 품질을 평가 하기 위해 제공 됩니다. 마지막 벡터의 생체 외에서 그리고 vivo에서 응용 프로그램에 CNS 세포 기능 연구에 대 한 유용할 것 이다.

<table><tbody><tr><td>Plasmid production</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pTransgene plasmid</td><td>De novo design 또는 plasmid 저장소에서 획득</td><td>N/A</td><td>자세한 내용은 주 프로토콜의 1단계를 참조하십시오</td></tr>. <tr><td>pCapsid</td><td>De novo 설계 또는 plasmid 저장소에서 획득</td><td>N/A</td><td>자세한 내용은 메인 프로토콜의 1단계를 참조하십시오</td></tr>. <tr><td>pHelper</td><td>Agilent</td><td>240071</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid Plus maxi kit</td><td>Qiagen</td><td>12963</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 정제 키트</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>AAV Helper-Free System</td><td>Agilent</td><td>240071</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 및 transfection </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>둘베코' s DMEM(Modified Eagle Medium), 고포도당, 글루타민 없음</td><td>Life Technologies</td><td>11960-044</td><td>FBS(1% 또는 10% v/v) 및 GlutaMAX 200mM(1% v/v)으로 DMEM을 보충한 다음 0.22 &micro를 사용하여 배지를 여과 살균합니다. m 필터</td></tr><tr><td>소 태아 세럼 (FBS)</td> <td>GIBCO</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 보충제</td><td>GIBCO</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>(200 mM)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>코닝 보틀 탑 진공 필터 시스템</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430769</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco ' 칼슘과 마그네슘이 없는 DPBS(Phosphate Buffered Saline)</td><td>GIBCO</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T 세포</td><td>American Tissue Culture Collection CRL3216</td><td></td><td>수령 시 프로토콜에 설명된 대로 세포와 배양을 해동합니다. 최소한의 통과 후, 분취량에서 미래를 위해 부분 분획을 동결합니다.&nbsp; 항상 통로 번호 20 아래의 셀을 사용하십시오. 배양된 세포가 20회 이상 계대측정된 후에는 저장된 분취량에서 배양을 다시 시작합니다.</td></tr><tr><td>세포 배양 접시</td><td>Greiner Cellstar</td><td>639160</td><td>15cm 지름 배양 접시</td></tr><tr><td>세포 스크레이퍼</td><td>VWR</td><td>10062-904</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌이민(PEI)</td><td>Polyscience</td><td>23966-2</td><td>분말 형태의 PEI는 1 &마이크로에서 용해됩니다. g/&마이크로; L, pH=2에서 탈이온수(ddwater)의 L(HCl 사용). 비커에 넣고 2-3시간 동안 저어줍니다. 용해되면 NaOH로 pH를 다시 7로 가져옵니다. 여과, 멸균, 재현탁액을 -20°C의 1ml 분취량에 보관합니다. PEI 분취량은 
 여러 번 동결/해동하십시오.</td></tr><tr><td>Virkon 용액</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9821357</td> Virkon 용액 Mutexi 긴팔 앞치마<td>로 조립된 벡터 입자와 접촉한 모든 물질을 소독</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>11735423</td><td>일반 실험실 코트 위에 앞치마 착용</td></tr><tr><td>Fisherbrand 최대 보호 일회용 덧신</td><td>Fisher Scientific</td><td>15401952</td><td></td></tr><tr><td>AAV 정제 및 탈염</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optiprep 밀도 구배 매체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td>Optiprep은 물(멸균) 내 요오딕산올의 60%(w/v) 용액입니다. 주의. 층류 후드 아래에서 사용하십시오. 장갑 착용</td></tr><tr><td>페놀 레드</td><td>시그마-알드리치</td><td>P0290</td><td>주의. 층류 후드 아래에서 사용</td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z627992</td><td>사용 전 살균</td></tr><tr><td>OptiSeal 폴리프로필렌 튜브</td><td>Beckman</td><td>361625</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase(250 U/&micro; L)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td>즉시 사용 가능한 솔루션으로 공급</td></tr><tr><td>Acrodisc 주사기 필터</td><td>Pall corporation</td><td>4614</td><td></td></tr><tr><td>Omnifix 주사기 (5 mL)</td><td>Braun</td><td>4617053V</td><td></td></tr><tr><td>블런트 주사기 바늘</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z261378</td><td>스테인리스 스틸 316 주사기 바늘, 피펫팅 블런트 90°C; 팁 게이지 16, L 4 in. 텍스트에서는 뭉툭한 바늘</td></tr><tr><td>Aqua Ecotainer</td><td>B. Braun</td><td>0082479E</td><td>멸균 내독소가 없는 물이라고 합니다. '초순수'라고 하는</td></tr> <tr><td>Amicon ultra-15 원심 필터 장치</td><td>, Millipore</td><td>UFC910024</td><td>이 필터는 연속적인 원심분리 단계에서 벡터 입자를 수집하여 최종 제품을 농축</td></tr>합니다: <tr><td>Pluronic F68 (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>24040032</td><td>비이온 계면활성제. 멸균 PBS에 희석하여 0.01% (v/v)에서 사용Fisherbrand</td></tr> <tr><td>스크류 캡이 있는 멸균 마이크로 원심분리기 튜브(2mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-374</td><td>취급이 용이하도록 스커트 튜브 사용</td></tr><tr><td>AAV 적정 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Restriction enzyme: StuI(10 U/&micro; L)</td><td>Promega</td><td>R6421</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I (1 U/&마이크로; L)</td><td>Fisher Scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>단백질분해효소 K</td><td>시그마-알드리치</td><td>3115852001</td><td>초순수에서 재구성하여 최종 농도 10mg/mL에서 사용합니다. 용액은 -20 &deg에서 저장할 수 있습니다. C</td></tr><tr><td>EasyStrip Plus 튜브 스트립(캡 부착)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AB2000</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf microtube 3810x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z606340-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 멀티웰 플레이트, 96웰</td><td>Roche</td><td>4729692001</td><td>White 폴리프로필렌 플레이트(고유 식별 바코드 포함)</td></tr><tr><td>Microseal 'A' PCR 플레이트 및 PCR 플레이트 밀봉 필름</td><td>Bio-Rad</td><td>msa5001</td><td></td></tr><tr><td>AAV Purity control </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate (APS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td>초순수에서 10%(v/v)로 재구성합니다. 주의. 층류 후드 아래에서 사용하십시오. 장갑</td></tr><tr><td>착용 테트라메틸에틸렌디아민(TEMED)</td><td>시그마-알드리치</td><td>T9281</td><td>주의. 층류 후드 아래에서 사용하십시오. 장갑 착용</td></tr><tr><td>Tris Base ULTROL Grade</td><td>Merck</td><td>648311</td><td>주의: 층류 후드 아래에서 사용하십시오. 착용 장갑</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Thermo Fisher</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>Rotiphorese&reg; 젤 30 (37,5 : 1)</td> <td>Carl Roth</td><td>3029.3</td><td>30 % 아크릴 아미드 및 비스 아크릴 아미드 수용액을 37.5 : 1의 비율로 사용합니다. 주의 : 층류 후드 아래에서 사용하십시오. 장갑을 착용</td></tr>하십시오 <tr><td>Serva Blue G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6104-58-1</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus 사전 염색 마커</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374edu</td><td></td></tr><tr><td>1-Butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7906</td><td>주의: 층류 후드 아래에서 사용하십시오. 장갑 착용</td></tr><tr><td>Immunohistochemistry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-GFP</td><td>Synaptic Systems</td><td>132002</td><td>1:300 dilution</td></tr><tr><td>Anti-rabbit Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td>1:1,000 dilution</td></tr><tr><td>Equipment</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호 </td><td>코멘트</td></tr><tr><td>Vector production lab</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotina 380 벤치탑 원심분리기 *</td><td>Hettich</td><td>1701</td><td></td></tr><tr><td>Optima XPN 80 초원심분리기 *</td><td>Beckmann Coulter</td><td>A95765</td><td></td></tr><tr><td>Type 50.2 Ti 고정각 티타늄 로터 *</td><td>Beckmann Coulter</td><td>337901</td><td></td></tr><tr><td>Entris digital 스케일 *</td><td>Sartorius</td><td>2202-1S</td><td></td></tr><tr><td>온수 목욕 *</td><td></td><td></td><td>37°C로 설정; C</td></tr><tr><td>얼음 양동이 *</td><td>VWR</td><td>10146-290</td><td>벡터 생산 실험실에서 사용되는 재료를 표준 실험실 영역에서 사용되는 재료와 분리하십시오</td></tr><tr><td>Pipetboy pro *</td><td>Integra</td><td>156,400</td><td></td></tr><tr><td>눈금이 매겨진 파이펫: 셀 스타 *</td><td>Greiner bio-one</td><td>606180</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>눈금 파이펫: 셀 스타 *</td><td>Greiner bio-one</td><td>607180</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>의 용량눈금이 매겨진 피펫: Cell star *</td><td>Greiner bio-one</td><td>760180</td><td>용량 25 mL</td></tr><tr><td>CO2 incubator CB150 *</td><td>Binder</td><td>9040-0038</td><td>37°C로 설정; C, 5% CO2 및 95% 습도</td></tr><tr><td>Nuaire 안전 캐비닛 NU 437-400E *</td><td>Labexchange</td><td>31324</td><td>사용 전후에 70% 에탄올과 Virkon으로 모든 표면을 청소</td></tr><tr><td>Conventional lab</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T100 thermal cycler *</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Instrument II *</td><td>Roche</td><td>5015278001</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer *</td><td>Eppendorf</td><td>C 5382000015</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop *</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND 2000</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean Tetra Cell*</td><td>Bio-Rad</td><td>1658001FC</td><td>수제 또는 프리캐스트 겔</td></tr><tr><td>ProteoSilver 실버 염색 키트</td>와 함께 사용 <td>Sigma-Aldrich</td><td>PROTSIL1</td><td>낮은 배경의 고감도 단백질 검출</td></tr><tr><td>Centrifuge 5804 R * </td><td>Eppendorf</td><td>B1_022628045</td><td>중간 용량(최대 250 mL)을 위한 고속 원심분리기</td></tr> <tr><td>Cell star *</td><td>Greiner bio-one</td><td>606180</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>Graduated pipettes Cell star *</td><td>Greiner bio-one</td><td>607180</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>Graduated pipette Cell star *</td><td>Greiner bio-one</td><td>760180</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>필터 팁 *</td><td>Greiner bio-one</td><td>750257</td><td>1250 &마이크로; L</td></tr><tr><td>필터 팁 *</td><td>Greiner bio-one</td><td>738257</td><td>300 &micro; L</td></tr><tr><td>필터 팁 *</td><td>Greiner bio-one</td><td>771257</td><td>10 &micro; L</td></tr><tr><td>뚜껑이 있는 얼음 양동이 *</td><td>VWR</td><td>10146-290</td><td></td></tr><tr><td>미니 다이어프램 진공 펌프, VP 86 *</td><td>VWR</td><td>181-0065</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P2</td><td>Gilson</td><td>F144801</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P20</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P100</td><td>Gilson</td><td>F123615</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P200</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P1000</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>* 별표가 표시된 재료는 고가의 장비이며 일반적으로 여러 실험실에서 공유되는 중앙 인프라 항목입니다. 가능한 경우 이러한 항목을 동등한 항목으로 교체할 수도 있습니다. 다른 초원심분리기를 사용하는 경우 올바른 로터와 원심분리기 튜브를 선택하는 데 주의를 기울여야 합니다.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

생산, 정화, 및 adeno 관련 바이러스 기반 벡터에 대 한 품질 관리

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Adeno 관련 바이러스 (AAVs)에 따라 유전자 전달 도구는 유전자 치료 응용 프로그램을 포함 하 여 중앙 신경 시스템 (CNS)에 transgenes의 배달에 대 한 인기 있는 선택입니다. AAV 벡터는 비 복제, 분열 및 비 분열 세포를 감염 하 고 장기 transgene 식을 제공할 수 있습니다. 중요 한 것은, 일부 serotypes, 새로 설명된 PHP 같은. B, 수는 혈액-뇌-장벽 (BBB) 동물 모델에서 교차 조직 배달 다음. AAV 벡터는 실험실에서 효율적으로 생산 수 있습니다. 그러나, 강력 하 고 재현할 수 프로토콜은 충분 한 레벨을 순도 및 생체 내에서 응용 프로그램에 대 한 충분히 높은 titer 값 AAV 벡터를 얻기 위해 필요 합니다. 이 프로토콜 AAV 벡터 생산, iodixanol 그라데이션 정화 전략에 따라 효율적이 고 재현 가능한 전략을 설명 합니다. Iodixanol 정화 방법 다른 정화 방법에 비해 높은 순도의 높은 titer AAV 벡터의 일괄 처리를 얻기 위해 적당 하다. 또한, 프로토콜은 일반적으로 현재 설명 하는 다른 방법 보다 빠릅니다. 또한, 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량)-기반된 전략은 신속 하 고 정확한 결정 방법 얼룩은 벡터 titer의 벡터 일괄 처리의 순도 확인에 대 한 설명. 마지막으로, CNS, AAV-PHP의 체계적 관리를 다음에 유전자 배달의 대표적인 결과. B, 제공 됩니다. 이러한 결과이 문서에서 설명 하는 프로토콜을 사용 하 여 모든 실험실에서 가능 해야 합니다.

AAV9 고려 되었고, 최근까지 가장 효과적인 AAV 벡터 serotype BBB를 건너와 주변 관리를 다음 CNS의 세포를 시험 하. Capsid 디자인에서 중요 한 사전 달성 했다 때 Deverman 그 외 여러분 보고 Cre AAV 대상 진화 재결합 기반 (만들기)17라는 capsid 선택 메서드를 사용 하 여. 이 방법을 사용 하 여, 그들은 PHP 라는 새로운 capsid를 식별 합니다. B 그들은 조직의 주입17다음 이다와 여러 CNS 영역에 있는 뉴런의 대부분 transduce 수로 보고. 이 시점에서, 그것은 해야 비록 주의 PHP. B C57/Bl6 마우스 (이 초기 격리 실험에 사용 된 변형)에 긍정적인 결과 제공, 예비 보고서 제안 효율성 스트레인 종속 방식으로 다를 수 있습니다. 추가 실험, 의심의 여지가, 더 많은 빛이 문제31에 창.
그러나, 불구 하 고 이러한 문제에는 PHP. B-의 증거-개념 유전자 치료 실험을 포함 하 여 질병 모델에서 생쥐의 CNS에 비 침 투 적인 유전자 조작에 대 한 흥미 진 진한 가능성을 제공 합니다. 따라서, 우리는 PHP를 사용 하 여 transgene 식의 효율성을 평가 하기로 결정 했습니다. B 대 AAV9, CNS 변환 다음 20092이후 주변 관리에 대 한 ' 금 표준 ' 벡터 되었습니다. 두 serotypes transgene 식에 대 한 최적의 조건 하에서 직접적인 비교를 수행 하려면 우리는 sc 게놈 구성32를 사용 합니다. 두 벡터의 유비 쿼터 스 치킨 β-걸 (CBA) 발기인 통제 transgene 녹색 형광 단백질 (GFP)에 대 한 수행. 출생 후 하루 42 (무게에서 약 20 g)에서 여성 C57/Bl6 마우스 마우스 중 scAAV2/PHP의 당 1 x 1012 vg의 복용량을 받았다. B-CBA-GFP 또는 scAAV2/9-CBA-GFP. 벡터 행정 수행 통해 꼬리 정 맥 주입 했다. 실험 구 루벤의 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.
3 주 postinjection, 쥐 4% (w/v) 얼음 처럼 차가운 paraformaldehyde (PFA) 다음 얼음 처럼 차가운 PBS 가진 transcardial 관류를 받았다. 그들의 두뇌는 수확 했다 하 고 0.01% (w/v) 나-아 지 드/PBS 저장에 대 한 추가 분석까지 전송 하기 전에 동일한 정착 액에 하룻밤 외피에 의해 postfixation를 더 받았다. 그 후, 두뇌 진동 톰을 사용 하 여 구분 했다 그리고 immunohistochemistry 50 µ m 두께 섹션에서 수행 되었다.
Transgene 식의 수준을 평가 하기 위해 섹션 형광 염료 (안티 토끼 알 렉 사 Fluor 488)에 활용 된 이차 항 체를 사용 하 여 검출 GFP (토끼 안티-GFP)에 대 한 1 차 항 체로 얼룩진 했다 (그림 4A, B ). (임의의 단위 [au])에 형광 강도 측정 확인 GFP 식 때는 사우스 캐롤라이나에서에서 크게 증가 게놈 및 PHP. B capsid는 AAV9 기준으로 사용 되었다. GFP 증가 (2105 ± 161 대 1441 ± 99 au; 뇌에서 관찰 되었다 p = 0.0032), 소 뇌 (2601 ± 196 대 1737 ± 135 au; p = 0.0032), 그리고 brainstem (3082 ± 319 대 2485 ± 88 노 소; p = 0.0038) (그림 4C).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58960/58960fig4.jpg"> 그림 4: scAAV2/PHP의 조직 배달. B-CBA-GFP는 CNS에 높은 GFP 식으로 이어집니다. scAAV2/PHP. B-CBA-GFP 또는 scAAV2/9-CBA-GFP (1 x 1012 vg/마우스) 6 주 된 C57/Bl6 마우스 꼬리 정 맥 주입을 통해 관리 되었다. GFP은 immunohistochemistry 코로나 뇌 섹션 3 주 postinjection에 사용 하 여 검색 되었습니다. (A) 뇌 및 소 뇌와 brainstem 표시 됩니다 (B). 스케일 바 = 1 m m. (C) 상대 형광 농도의 정량화 GFP 신호 (마우스 당 10 섹션, 벡터 그룹 당 3 쥐) 각 벡터와 달성 수준을 결정 위해 수행 되었습니다. 일방통행 ANOVA 테스트 수행, 뒤에 양측 스튜던트 t-테스트; 데이터는 평균 ± 표준 편차;으로 표현 p &lt; 0.01; au입니다. 임의 단위입니다. AAV 벡터 생산을 위해 사용 하는 pCapsid serotype 2에서에서 유전자 담당자 및 serotype PHP에서에서 유전자 모자 포함 되어 있습니다. B 또는 AAV9, 그에 따라. 이 그림에서 링 콘 수정 되었습니다 외.32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58960/58960fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

여기, 우리가 생산 하는 효율적이 고 재현 가능한 전략, titer, 및 품질 관리 일괄 adeno 관련 바이러스 벡터의 설명 합니다. 그것은 높은 titer로 벡터 준비를 하면 (13 벡터 게놈/10ml x ≥1)와 고 순도, 생체 외에서 또는 vivo에서 사용에 대 한 준비.

생산, 정화, 및 Adeno 관련 바이러스 기반 벡터에 대 한 품질 관리

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

이 프로토콜을 따르면 사용자는 시험관 내 또는 생체 내 응용 프로그램에 적합한 고순도 및 수율의 AAV 벡터를 생성할 수 있습니다. 이 프로토콜은 구성의 차이로 다양한 AAV 혈청형을 생산하고 정화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 두 가지 요소를 결합하면 세포 유형 및 조직 특정 발현을 얻는 데 유용할 수 있다.일부 혈청형의 생산은 낮은 수율을 줄 수 있습니다. 이것은 가까운 혈청형이 있고 개별적으로 평가되어야 하는 생산입니다. 이러한 절차를 시연하는 것은 실험실의 기술자인 셸리 프리퐁(Shelly Fripont)이 될 것입니다.HEK 세포를 성장한 후, 360 마이크로그램의 도우미 플라스미드, 벡터 캡시드를 인코딩하는 플라스미드 180 마이크로그램, DNA 혼합을 준비하기 위해 150 밀리미터 나트륨 염화물의 18 밀리리터에 트랜스진을 함유한 플라스미드 180 마이크로그램을 혼합한다. 이 믹스를 50밀리리터 원물 튜브 3개에 분배합니다. 새로운 원판 튜브에서 PEI 840 마이크로그램과 150 밀리머 나트륨 염화 나트륨 6 밀리리터를 혼합하여 6개의 세포 배양 요리에 대한 PEI 믹스를 준비합니다.그런 다음, PEI 믹스의 6 밀리리터를 첨가하고, 방울로 떨어뜨리고, DNA 혼합을 포함하는 원뿔형 튜브 중 하나에 첨가한다. 실온에서 20분 동안 배양하세요. 다음으로 인큐베이터에서 6개의 세포 배양 접시를 제거합니다.라미나르 플로우 후드에 각 접시에서 매체를 완전히 흡인시합니다. 미리 데워진 DPBS 5밀리리터로 접시를 헹구어 매체의 흔적을 제거합니다. DPBS가 전체 표면에 고르게 분포되도록 각 접시를 부드럽게 기울입니다.그런 다음 DPBS를 부드럽게 흡인합니다. DMEM 12 밀리리터를 각 접시에 천천히 넣고 파이펫을 접시 가장자리에 놓습니다. PEI와 DNA 혼합물을 3~5회 위아래로 배관하여 섞는다.이 혼합물의 2 밀리리터를 드롭 패션으로 한 방울씩 첨가하여 전체 표면에 조심스럽게 분배하십시오. 18 세포 배양 접시에 도달 할 때까지 한 번에 여섯 세포 배양 접시를 사용하여이 과정을 반복합니다. PEI DNA 혼합물을 분배하기 위해 세포 배양 접시를 부드럽게 흔들어 줍니다.전감염된 세포를 섭씨 37도에서 95%의 습도, 5시간 동안 이산화탄소5%로 배양합니다. 그 후 기존 배지를 제거하지 않고 18가지 요리에 각각 12밀리리터의 DMEM 10을 추가합니다. 동일한 조건에서 감염된 세포를 계속 배양하십시오.72시간 후 의질전환시, 세포 스크레이퍼를 사용하여 각 배양 접시에서 세포를 조심스럽게 분리합니다. 15 밀리리터 원모 튜브에서 두 배양 요리의 배지와 세포를 수집하여 얼음 위에 보관합니다. 원심분리기는 420배, 섭씨 4도에서 10분간 10분간 원심분리기의 가속과 감속을 최대로 설정합니다.조심스럽게 폐기물 처리 용기에 부어 각 튜브에서 상체를 폐기. 그런 다음 세포 펠릿을 함유한 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 우리는 리시스 버퍼의 두 밀리리터에 각 펠릿을 일시 중단하고 5 ~ 10 번 위아래로 파이펫을 하여 혼합합니다.세 개의 튜브에서 AAV를 함께 가져옵니다. 시작하려면 에탄올과 혼합된 드라이 아이스를 포함하는 양동이에 배치하여 다시 중단된 세포를 동결하십시오. 그런 다음 즉시 섭씨 37도에 설정된 수조에 배치하여 세포를 해동하십시오.이 동결 및 해동 주기를 세 번 반복하여 세포를 lyse하고 AAV 입자를 방출합니다. 세 번째 해동 단계 후, 원심분리기는 1167회 G, 섭씨 4도에서 15분 동안. 수퍼네이츠를 조심스럽게 옮겨 50밀리리터 원내 튜브를 청소합니다.각 튜브에 핵을 첨가하여 상피의 밀리리터당 50단위의 최종 농도를 가집니다. 30분 동안 섭씨 37도에서 배양하고, 10분마다 튜브를 소용돌이치며 핵이 상체와 철저히 혼합되도록 합니다. 원심분리기는 13490회 G의 경우, 섭씨 4도에서 20분간 상복부를 명확히 합니다.그런 다음 10 밀리리터 주사기의 플런저를 제거하고 0.45 마이크로미터 필터를 주사기에 부착하고 깨끗한 50 밀리리터 원유형 튜브 위에 놓습니다. 주사기를 명확히 한 상체로 조심스럽게 채웁니다. 플런저를 사용하여 필터를 통해 용해를 강제로 사용합니다.다음으로, 표에 설명된 대로 각 iodixanol 분획을 4개의 별도의 50 밀리리터 원뿔 튜브로 준비합니다. 파이펫 8 밀리리터의 15% iodixanol세 개의 초원심분리기 튜브 각각에 넣습니다. 파이펫 5.5 밀리리터25% 이오디산놀이 깨끗한 50밀리리터 원콘튜브에 들어간다.미립자 파스퇴 파이펫을 사용하여 15% iodixanol 솔루션보다 25% 미만의 5.5 밀리리터를 신중하게 층으로 레이어합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 40%와 60%의 솔루션을 추가합니다. Iodixanol 분수는 레이어링에 혼합해서는 안됩니다.파스퇴르 파이펫을 사용하여 원유 리세이트 15% 이오디산올 그라데이션 위에 원유 리세이트를 레이어링하여 드롭으로 떨어뜨려 원유 리세이트와 이오디산올 용액 사이의 인터페이스를 방해하지 않도록 합니다. 반월상연골이 튜브 목의 기저에 도달할 때까지 각 초원심심분리관을 충진하여 튜브가 극심분리 시 발생하는 매우 높은 힘 하에서 붕괴되지 않도록 한다. 적절한 뚜껑을 사용하여 튜브를 닫습니다.디지털 스케일을 사용하여 세 개의 초원심 분리 튜브가 모두 동일한 무게를 가지고 있는지 확인하십시오. 원유 리세이트 위에 더 많은 리시스 버퍼를 추가하여 필요에 따라 무게를 조정합니다. 고정 각도 티타늄 로터를 사용하여 튜브를 301580G, 최대 가속 및 감속을 사용하여 1시간 40분 동안 12도에서 원심분리합니다.다음으로 바늘을 5 밀리리터 주사기에 부착합니다. 로터의 튜브에서 스페이서를 제거하고 원심화 후 튜브를 복구합니다. 벡터 입자를 포함하는 40% iodixanol 분획만 흡인합니다.샘플을 처리하거나 섭씨 4도에 보관하십시오. 여기서, 프로토콜은 다양한 캡시드, 게놈 구성, 프로모터 유형 및 유전자 화물을 사용하여 AAV 벡터를 생성하는 데 사용될 수 있음을 입증한다. 이 예에서, 우리는 자기 무료 게놈에서 녹색 형광 단백질을 표현한 두 개의 다른 AAV 벡터를 생성하고 정제하였다.두 벡터는 서로 다른 capsids:PHPB 및 AAV9로 구별됩니다. 그(것)들은 꼬리 정맥 주입을 통해, 성인 C57 검은 6 마우스로 전달되었습니다. 3주 후 환원발수준을 평가하기 위해, 형광염에 컨쥬게이트된 이차 항체를 이용한 검출을 통해 GFP에 대한 1차 항체로 염색된다.형광 강도 측정은 PHPB 벡터가 AAV9에 비해 사용될 때 GFP 발현이 현저한 증가를 나타낸다. GFP의 증가는 뇌관, 소뇌, 그리고 뇌간에서 관찰되었다. 분획을 포함하는 벡터의 정확한 수집은 이 프로토콜에 매우 중요합니다.제대로 수행되지 않은 경우 벡터 수율뿐만 아니라 벡터 순도가 부정적인 영향을 받습니다. AAV 벡터를 생성할 수 있는 작은 실험실은 중추 신경계에 있는 유전자를 전달하기 위하여 수많은 실험가능성을 이용하는 위치에 있을 것입니다. 이 프로토콜은 초원심분리기의 사용을 필요로하며 사고를 피하기 위해이 작업을 처리하기 전에 적절한 교육을받는 것이 중요합니다.또한 AAV 벡터는 종종 바이오 해저드로 분류되므로 해당 벡터를 처리하고 관리하기 전에 현지 규정을 준수해야 합니다.

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연구

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재조합 adeno - 관련 바이러스 (rAAVs) 벡터를 위해 점점 중요 해지고...

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모든 바이러스 코딩 염기서열이 결여된 고용량 아데노바이러스 벡터를 생성하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 벡터 게놈에 포함된 전이유전자의 클로닝은 homing endonucleases를 기반으로 합니다. 부착 세포로 성장하고 현탁액에서 생산자 세포의 바이러스 증폭은 트랜스에 바이러스 유전자를 제공하는 보조 바이러스에 의존합니다.

인간 아데노 바이러스 유형 5를 기반으로 대용량 아데노 바이러스 벡터의 클로닝 및 대규모 생산

여기서 는 세포 스택 및 친화성 크로마토그래피 정제에서 자란 부착 된 HEK 293 세포를 사용하여 연구 급 AAV 벡터의 대규모 생산을위한 상세한 절차를 제공합니다. 이 프로토콜은 지속적으로 &gt;1 x10 13 벡터 게놈/mL을 산출하여 대규모 동물 연구에 적합한 벡터 양을 제공합니다.

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본 프로토콜에서, AAV2 벡터는 바쿨로바이러스(BV)-AAV2-녹색 형광단백질(GFP) 또는 BV-AAV2-rep-cap 감염Sf9 세포를 현탁액 배양에서 감염한 Sf9 세포를 결합하여 스포드옵테라 검거다(Sf9) 곤충 세포를 공동 배양하여 생성된다. AAV 입자는 세제, 명확성, 친화열 크로마토그래피에 의해 정제되며 접선 흐름 여과에 의해 농축됨을 사용하여 세포로부터 방출된다.

바쿨로바이러스-곤충세포배양시스템을 이용한 아데노 관련 바이러스(AAV)2 벡터의 생산 및 정화를 위한 공정 개발

아데노 관련 바이러스는 현탁 세포 배양에서 생성되며 이중 요오드화놀 밀도 구배 원심분리로 정제됩니다. 총 바이러스 수율을 높이고, 바이러스 침전의 위험을 줄이고, 최종 바이러스 산물을 더욱 농축하기 위한 단계가 포함되어 있습니다. 예상되는 최종 역가는10,12 바이러스 입자/mL에 도달하며 전임상 in vivo 사용에 적합합니다.

In Vivo 응용 분야를 위한 Iodixanol Density Gradient Centrifugation에 의한 아데노 관련 바이러스의 현탁 배양 생산 및 정제

이 원고는 최적화된 헤파린 기반 친화성 크로마토그래피 방법을 사용하여 아데노 관련 바이러스 벡터의 생성 및 정제를 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 간단하고 확장 가능하며 비용 효율적인 접근 방식을 제시하여 초원심분리가 필요하지 않습니다. 생성된 벡터는 높은 순도와 생물학적 활성을 나타내며 전임상 연구에서 그 가치를 입증합니다.

단일 단계 및 반자동 Heparin Affinity Chromatography Protocol을 통한 Adeno-associated viral vectors 분리

유전자 치료 분야가 계속 발전함에 따라 이러한 문제를 해결할 수 있는 혁신적인 방법에 대한 필요성이 커지고 있습니다. 여기에서는 cell factory 플랫폼을 사용하여 고수율 및 고순도 AAV 벡터를 생성하는 프로세스를 간소화하여 in vivo 연구의 품질 표준을 충족하는 고유한 방법을 제시합니다.

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아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터 게놈 복제의 정확한 정량화는 매우 중요하지만 표준화된 프로토콜은 아직 확립되지 않았습니다. 이 프로토콜은 바이러스 게놈 역가를 신뢰성 있게 정량화하기 위해 정제된 AAV 샘플을 준비하고 디지털 액적 중합효소 연쇄 반응(dd_PCR)을 수행하기 위한 검증된 방법을 설명합니다.

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