Name: 랫 트 태 반 천연 킬러 세포 세포 용 분해 기능의 평가를 위한 플레이트 기반 세포 독성 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: 배우세요 랫 태반에서 천연 킬러 세포를 분리하고 플레이트 기반 색도법으로 세포 독성 기능을 평가하는 방법을. 이 기술은 면역학 및 세포 생물학 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 국립 심장 폐와 보조금 R00HL130456에서 건강의 국립 연구소의 혈액 연구소에 의해 지원 되었다, 국립 의료 과학 연구소의 국가 학회에서 수상 P20GM104357에서, 그리고 미시시피 INBRE는 보조금 번호 P20GM103476 하에서 국립 건강 학회 국립 연구소의 기관 개발 상 (IDeA)에 의해 자금을 지원 했다. 콘텐츠는 전적으로 저자의 책임이 며, 반드시 건강의 국가 학회 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

모든 프로토콜은 미시시피 대학 의료 센터의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다. 동물의 치료와 취급은 윤리적 동물 치료를 위한 건강 지침의 국가 학회와 일치 했습니다.
1. 림프 구 세포 분리
<ol><li>쥐 자 궁 (임신 일 19)에서 태 반을 제거 하 고 얼음 차가운 PBS8의 10ml에 넣습니다.</li>
	<li>100 µm 필터에 1 개의 태 반을 놓고 RPMI 13.5 mL 및 1.5 mL의 FBS를 함유 하는 페 트리 디쉬에 앉 습니다 (총 부피는 15ml). 주사기 플런저의 평평한 면을 사용 하 여 태 반을 필터를 통해 페 트리 접시에 밀어 넣으십시오.</li>
	<li>각 조직에 대 한 3 15 mL 원뿔 튜브를 준비 합니다. 각 튜브에 3 mL 밀도 구배 매체 ( 재료 표참조)를 넣고 각 튜브에 5 ml의 균질 한 태 반을 조심 스럽게 겹쳐 놓습니다.</li>
	<li>브레이크 없이 실 온 (RT)에서 300 x g 에서 25 분 동안 원심 분리기. 전사 파이 펫을 사용 하 여 얇은 흰색 버 레이어 를 수집 합니다. 참고: 원심 분리 후에는 3 층이 보이고, 상단에는 적색 rpmi가, 중간에는 흰색 버 층, 하단에는 투명 한 밀도 그라데이션 매체 레이어가 있습니다. 전사 파이 펫을 사용 하 여 튜브에서 흰색 버 층을 당깁니다. 동일한 태 반의 모든 튜브에서 버 층을 1 튜브로 결합 하십시오.</li>
	<li>결합 된 버 층에 10ml의 rpmi를 추가 합니다. 10 분간 원심 분리기, 300 x g, 4°c에서 상층 액을 버리십시오.</li>
</ol>2. 자연 살해 세포의 분리
<ol><li>얼음-저온 PBS의 50 μ l에서의 소생 세포 펠 렛</li>
	<li>비오 틴-표지 된 CD3 항 체를 펠 라이 셀에 추가 하 여 제조업체의 프로토콜에 따라 피 펫과 잘 섞어 줍니다. 튜브를 튜브로 테이터에 넣고 4°c에서 20 분간 배양 한다.</li>
	<li>RPMI 1 mL을 넣고, 400 x g 및 4°c에서 10 분간 원심 분리 하 고 상층 액을 버리십시오.</li>
	<li>RPMI 1 mL의 소생 펠 렛을 1.5 mL 마이크로 원심 분리기 튜브에 150 μ l의 자기 비드와 결합 합니다. 마이크로 원심 분리기 튜브를 튜브 회전자에 놓고 4°c에서 30 분 동안 배양 하 여 회전 시킵니다. 참고: 이 때 방출 버퍼를 꺼내 생물학적 안전 캐비닛에 RT에 도달 할 수 있습니다.</li>
	<li>1 분 동안 자석에 튜브를 놓습니다. 상층 액을 수집 하 고 얼음에 15 mL 튜브에 CD3 세포 집단을 저장 합니다. 참고: 이것은 CD3 세포 의 인구입니다.</li>
	<li>자석에서 튜브를 분리 하 고 RPMI 1 mL을 추가 합니다. 세포와 구슬을 5 회 파이 펫과 섞어 줍니다.</li>
	<li>2.5 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>400 x g 및 4°c에서 10 분 동안 세포의 CD3를 원심 분리 하 고 상층 액을 버리십시오. 얼음-저온 PBS의 50 μ l에서 세포 펠 렛의 소생</li>
	<li>비오 틴-라벨링 된 CD161a 항 체 를 제조사의 프로토콜에 따라 CD3 세포에 첨가 하 고 잘 섞어 줍니다. 튜브를 튜브로 테이터에 놓고 4°c에서 20 분 동안 배양 한다.</li>
	<li>RPMI 1 mL을 넣고, 400 x g 및 4°c에서 10 분간 원심 분리 하 고 상층 액을 버리십시오. RPMI 1 mL의 소생 펠 렛을 1.5 mL 마이크로 원심 분리기 튜브에 150 μ l의 자기 비드와 결합 합니다.</li>
	<li>마이크로 원심 분리기 튜브를 튜브 회전자에 넣고 4°c에서 30 분 동안 배양 하 여 회전 시킵니다.</li>
	<li>튜브를 자석에 1 분 동안 놓습니다. 상층 액을 모으고 CD3-/Cd161a- 세포를 버리십시오.</li>
	<li>자석에서 튜브를 제거 하 고 RPMI 1 mL을 추가 합니다. 세포와 구슬을 5 회 파이 펫과 섞어 줍니다.</li>
	<li>2.12 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>자석에서 마이크로 원심 분리기 튜브를 제거 하 고 1 mL의 RT 방출 완충 제를 추가 하십시오. 튜브 회전자에 튜브를 놓고 RT에서 15 분 동안 배양 하는 동안 회전 합니다.</li>
	<li>1 분간 자석에 튜브를 놓습니다. 얼음에 새로운 15 mL 원추형 튜브에 상층 액을 수집 합니다. 참고: 이것은 NK 세포의 인구입니다.</li>
	<li>자석에서 튜브를 제거 하 고 RT RPMI 1 mL을 추가 합니다. 세포와 구슬을 5 회 파이 펫과 섞어 줍니다.</li>
	<li>2.16 단계를 반복 하 여 동일한 튜브에 상층 액을 배치 합니다. 잘 섞어 20 μ l 샘플을 복용 하 여 세포 수를 계산 합니다 참고: 얼음에 튜브를 보관 하십시오.</li>
	<li>원심 분리기 CD3-/cd161a+ 세포를 4°c에서 10 분, 400 x g , 상층 액을 제거 한다. 세포를 RPMI (10% FBS, 1% 펜/Strep, 2ng/mL)로 하 고, 2.5의 NK 세포 활성화 매체에 있는 6 웰 플레이트에서 3 x 105cell/웰의 농도로 종자를 소생 한다. 37 ° c에서 48 h의 세포 배양,가 습 인큐베이터 에서 5% co2.</li>
</ol>3. 세포 독성 분석: 배양 또는 전달 세포에서 NK 세포 또는 YAC1 검색
참고: 모든 단계는 내부적으로 수행 되어야 합니다. 모든 세포 관은 항상 얼음에 보관 해야 합니다.
<ol><li>유리 혈 청 학적 pipet을 사용 하 여 플라스 크에서 YAC1 세포 및 매체를 수집 하 고 얼음에 50 mL 튜브에 넣고 잘 섞어 줍니다. 셀 수를 계산 하기 위해 20 µ L을 복용 하십시오.</li>
	<li>300 x g 및 4°c에서 10 분 동안 YAC1 세포를 회전 시킵니다. 회전 하는 동안 셀 수를 계산 합니다.</li>
	<li>NK 셀 6 웰 플레이트에서 각 웰에 트립 신/EDTA를 추가 하십시오. 플레이트를 탭 하 고 인큐베이터에 배치 합니다.</li>
	<li>세포 후 37 ° c에서 ~ 5 분 동안 트립 신/EDTA로 배양 한 후, 멸 균 플레이트 스 크레이 퍼로 플레이트/플라스 크를 긁어 낸다. 각 웰에 1 mL의 NK 세포 배지를 추가 합니다.</li>
	<li>혈 청 피 펫으로 세포와 매체를 모으고 15 mL 원심 분리기 튜브에 수집 하십시오. 셀 수를 계산 하기 위해 20 µ L을 복용 하십시오.</li>
	<li>NK 세포를 4°c에서 10 분, 400 x g 로 회전 시켰다. 이 원심 분리 동안 3.5 단계에서 세포의 샘플을 카운트. 참고: 웰의 바닥에 더 이상 부착 된 세포가 없는지 확인 하기 위해이를 폐기 하기 전에 현미경으로 배양 판을 봅니다. 이 실험은 NK 세포와 YAC1 세포를 사용 하기 때문에 각각 따로계산 해야 합니다.</li>
	<li>최적화 실험에서 결정 된 농도의 세포 및 소생을 카운트 하 여 적절 한 개수의 타겟: 이펙터 비율을 시험 한다. 이것은 그들의 상응 하는 매체에서 펠 릿을 재 현 탁 하 여 다음 세포 농도를 확인 함으로써 달성 될 것 이다: YAC1 세포/m l 및 NK 세포에서 2x107 세포/ml에 4 x 10.</li>
</ol>4. 세포 독성 분석: 분석 프로토콜
<ol><li>표 1에 제시 된 바와 같이 둥근 바닥, 배양 처리 된 96-웰 플레이트를 사용 하 여 플레이트를 설치 한다. 이 표는 실험 대조 군 및 3 개의 NK 실험 칼럼 세트를 보여준다. 이는 96-웰 플레이트에서 총 10 개의 NK 실험 칼럼으로 확장 될 수 있다.</li>
	<li>상기 분석 판을 250 x g 에서 4 분간 원심 분리 하 여 이펙터와 표적 세포가 접촉 하 고 있는지를 확실 하 게 한다. 37 ° c에서가 습 챔버 인큐베이터에서 5 시간 동안 96-웰 플레이트를 배양 하 고, 5 % co2는 타겟과 이펙터 세포 간의 충분 한 접촉을 달성 하 고 이펙터 세포에의 한 표적 세포 용 해를 실현 하였다. 참고: 여기서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.</li>
	<li>45 수확 하기 전에 상층 액, 10 µ L의 용 해 용액을 대상 셀에 최대 LDH 방출 웰 (우물 1E, 1F, 1G 및 1H)을 넣고가 습 챔버에 다시 플레이트를 배치 한다.</li>
	<li>인큐베이션 시간이 완료 된 후에, 플레이트를 250 x g 에서 4 분간 원심 분리 하 여 µ를 사용 하 여, 모든 웰에서 50을 이송 하 여 새로운 96-웰 플랫 바 텀 분석 플레이트를 이용 한다. 참고: 세포가 신선한 분석 판으로 전달 되지 않도록 우물의 바닥을 만지지 마십시오. 배양 처리 된 플레이트를 신선한 분석 플레이트로 사용 하지 마십시오.</li>
	<li>
분석 시 약을 만듭니다.
	<ol>
<li>분석 버퍼가 실 온에 도달한 후에는 1 개의 기질 혼합 병에 12 mL의 분석 버퍼를 추가 하십시오. 완전히 녹을 때까지 부드럽게 흔들어 주세요. 1 병은 2 96-웰 플레이트에 충분 합니다. 참고: 분석 완충 액은 해 동 되는 동안 빛 으로부터 보호 되어야 한다. 사용 직전에 섞어 주세요.</li>
	</ol>
</li>
	<li>4.6 단계에서 분석 플레이트의 모든 웰에 50 µ L의 분석 시 약을 추가 하십시오. 빛 으로부터 보호 하 고 실 온에서 30 분 동안 배양 하는 호 일로 플레이트를 덮으 십시오. 참고: 새로 만든 분석 시 약은 냉동 실에 보관 해야 합니다. 약 8 주 동안 시 약이 좋습니다.</li>
	<li>각 웰에 50 µ L 중지 솔루션을 추가 합니다. 중지 용액을 추가 한 후 1 시간 이내에 플레이트를 판독 하 고 490 nm에서 흡 광도를 기록 한다. 대표적인 데이터는 표 2에 나타내 었 다.</li>
</ol>5. 결과 계산
<ol><li>배양 배지 배경 웰 로부터 평균 흡 광도 값을 계산 하 고, 실험 대상 세포 자발적인 LDH 방출 및 이펙터 세포 자발적인 LDH 방출 웰에 대 한 모든 흡 광도 값 으로부터 감산 한다.</li>
	<li>볼륨 보정 제어 웰에 대 한 평균 흡 광도 값을 계산 하 고 최대 LDH 방출 제어 웰을 대상 셀에 대해 획득 한 흡 광도 값에서 뺍니다.</li>
	<li>다음 공식에서 5.1 단계 및 5.2 단계의 수정 된 값을 사용 하 여 각 이펙터에 대 한 세포 독성 퍼센트를 계산 합니다: 대상 웰. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58961/58961eq1.jpg">
</li>
</ol>

<ol><li>Cornelius, D. C., Cottrell, J., Amaral, L. M., LaMarca, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+Mediators%3A+A+causal+link+to+hypertension+during+pregnancy-+Studies+in+Preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory Mediators: A causal link to hypertension during pregnancy- Studies in Preeclampsia.</a> British Journal of Pharmacology. , (2018).</li>
<li>Elfarra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cells+mediate+pathophysiology+in+response+to+reduced+uterine+perfusion+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Science%22%5BJournal%5D)">Natural killer cells mediate pathophysiology in response to reduced uterine perfusion pressure.</a> Clinical Science. 131 (23), 2753-2762 (2017).</li>
<li>Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assay+of+the+lytic+action+of+immune+lymphoid+cells+on+51-Cr-labelled+allogeneic+target+cells+in+vitro%3B+inhibition+by+isoantibody+and+by+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs.</a> Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).</li>
<li>Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+multiparametric+flow+cytometry-based+cytotoxicity+assay+simultaneously+immunophenotypes+effector+cells%3A+comparisons+to+a+4+h+51Cr-release+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay.</a> Journal of Immunological Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).</li>
<li>Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Method+for+Assessment+of+Natural+Killer+Cell+Cytotoxicity+Using+Image+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry.</a> PLoS One. 10 (10), 0141074(2015).</li>
<li>Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcein-acetyoxymethyl+cytotoxicity+assay%3A+standardization+of+a+method+allowing+additional+analyses+on+recovered+effector+cells+and+supernatants%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).</li>
<li>Karimi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+cytotoxicity+by+bioluminescence+imaging+outperforms+the+standard+chromium-51+release+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay.</a> PLoS One. 9 (2), 89357(2014).</li>
<li>Caporossi, C., Nogueira, P. L., Marques, J. C., Assis, R. M., Aguilar-Nascimento, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+the+gastroschisis+experimental+model+and+the+influence+of+the+mother%27s+diet+enriched+with+glutamine+in+the+fetal+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cir%C3%BArgica+Brasileira%22%5BJournal%5D)">Validation of the gastroschisis experimental model and the influence of the mother's diet enriched with glutamine in the fetal morphology.</a> Acta Cirúrgica Brasileira. 29 (3), 158-165 (2014).</li>
<li>Lv, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+distinction+of+rat+liver+natural+killer+cells+from+spleen+natural+killer+cells+under+normal+and+acidic+conditions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatobiliary+and+Pancreatic+Diseases+International%22%5BJournal%5D)">Functional distinction of rat liver natural killer cells from spleen natural killer cells under normal and acidic conditions in vitro.</a> Hepatobiliary and Pancreatic Diseases International. 11 (3), 285-293 (2012).</li>
<li>Flieger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+non-radioactive+cellular+cytotoxicity+test+based+on+the+differential+assessment+of+living+and+killed+target+and+effector+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel non-radioactive cellular cytotoxicity test based on the differential assessment of living and killed target and effector cells.</a> Journal of Immunological Methods. 180 (1), 1-13 (1995).</li>
<li>Jang, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+flow+cytometry-based+natural+killer+cytotoxicity+assay+involving+calcein+AM+staining+of+effector+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+Laboratory+Science%22%5BJournal%5D)">An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells.</a> Annals of Clinical Laboratory Science. 42 (1), 42-49 (2012).</li>
</ol>

이해관계의 상충, 재정 또는 기타는 저자에 의해 선언 되지 않습니다.

최적의 결과를 위해 고려해 야 할 중요 한 주요 참고 사항이 많이 있습니다. 이용 된 세포의 무 균은 매우 중요 합니다. 태 반의 채취 후, 생물 안전 내각에서 멸 균 조건 하에서 NK 세포의 조제 및 분리가 수행 되는 것이 중요 하다. 더욱이, 모든 세포는 세포 손상 시 LDH를 방출 하기 때문에, 분리 후 및 공동 배양 과정 동안 NK 세포의 높은 생존 능력을 얻기 위해 주의를 기울여야 한다. NK 세포에서 너무 많은 자발적 LDH 방출은 종종 부정적이 고, 사용할 수 없는 데이터를 초래
이 프로토콜의 몇 가지 측면은 사용자와 해당 요구에 따라 다릅니다. 예를 들어, 기계 및 효소 분해와 같은 본 기사의 방법 외에 태 반에서 단 핵 세포를 분리 하는 다양 한 방법이 있습니다. 추가적으로, 최적의 타겟 셀 수와 이펙터를 결정 하는 것은 사용자의 것이 고, 그들의 실험에 적합 한 타겟 비율 이다. 우리의 손에, 1만 표적 세포 및 이펙터: 50:1의 표적 비율은 우리의 실험을 위...

자간 전 증은 태아 성장 제한, 말단 장기 손상 및 만성 면역 활성화를 특징으로 하는 임신의 고혈압 질환 이다. 자간 전 증을 가진 여성에서의 만성 면역 활성화는 증가 된 순환 및 태 반 염증 성 사이토카인, CD4+ T 세포 집단의 불균형 및 활성화 된 천연 킬러 (NK) 세포의 증가 된 인구에 이르게 한다1. 우리 연구실에서 최근에 출판 된 연구는 자간 전 증의 자 궁 내 관류 압력 (파열)을 자간 전 증과 관련 된 일부 병 리 생리학의 원인에서 NK 세포에 대 한 역할을 증명 한다. 유 세포 분석을 이용 하 여 NK 세포에 대 한 활성화 마커의 표면 발현을 측정 하 고, 정상 임신 (NP) 쥐에 비하여 파열 된 랫 트의 순환 및 위치에서 활성화 된 NK 세포의 증가 된 인구가 관찰 되었다2.
유 세포 분석 관찰을 확인 하기 위해, 플 래 트에서 분리 된 NK 세포의 세포 독성 활성을 평가 하는 기능적 연구가 NP 및 파열 쥐의 수행 되었다. CD8+ T 세포 및 NK 세포의 세포 독성 기능에 대 한 평가에 사용할 수 있는 몇 가지 방법이 있다. 기능적 세포 독성 분석을 위한 금 표준은 크롬 방출 검정3이다. 사용 되는 기타 개발 된 프로토콜은 유 세포 분석4, 이미지 분석5, calcein 릴리즈6및 가장 최근의 생물 발광7을 포함 한다. 본 영상은 상업적으로 입수 가능한 LDH 세포 독성 분석 키트를 이용 하 여 잘 확립 된 락 테이 트 탈 수소 효소 (LDH) 방출 분석을 이용 하 여 NK cell의 세포 독성 기능을 측정 하는 자세한 프로토콜을 제공할 것 이다.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL Eppendorf tube</td><td>Fisher</td><td>5408129</td><td></td></tr><tr><td>100 &마이크로; L 필터</td><td>Fisher</td><td>22363549</td><td>나일론 메쉬</td></tr><tr><td>15mL 원뿔형 튜브</td><td>Fisher</td><td>0553859A</td><td></td></tr><tr><td>3mL 주사기</td><td>Fisher</td><td>14823436</td><td></td></tr><tr><td>50mL 원뿔형 튜브</td><td>Fisher</td><td>7203510</td><td></td></tr><tr><td>6웰 세포 배양 플레이트</td><td>Corning</td><td>720083</td><td></td></tr><tr><td>96웰 조직 배양 플레이트</td><td>CELLTREAT</td><td>229190</td><td>멸균, 둥근 바닥</td></tr><tr><td>AOPI</td><td>Nexcelom</td><td>CS201065ML</td><td></td></tr><tr><td>세포 스크레이퍼</td><td>Fisher</td><td>8100241</td><td></td></tr><tr><td>셀로미터 일회용 계수 챔버</td><td>Nexcelom</td><td>CHT4-SD100</td><td></td></tr><tr><td>셀로미터 비전 이미지 세포분석기</td><td>Nexcelom</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cytotox 96 비방사성 세포 독성 분석 키트</td><td>Promega</td><td>G1780</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Flowcomp Flexi Kit</td><td>Invitrogen</td><td>11061D</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 자석</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Aldrich</td><td>EDS-100G</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석 튜브</td><td>Corning</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Fisher</td><td>NC0460539</td><td>밀도 구배 보통; 4 x 250 mL</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher</td><td>SH3025801</td><td>10 x 500 mL</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Fisher</td><td>9720500</td><td>패드 없음</td></tr><tr><td>정제 마우스 anti-Rat CD161a</td><td>BD Biosciences</td><td>555006</td><td></td></tr><tr><td>정제 마우스 anti-Rat CD3</td><td>BD Biosciences</td><td>554829</td><td></td></tr><tr><td>재조합 쥐 IL-2</td><td>R& D Systems</td><td>502-RL</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>11875135</td><td>1640 미디엄</td></tr><tr><td>T25 플라스크</td><td>코닝</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>트립신</td><td>ThermoFisher</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>YAC-1 셀</td><td>ATCC</td><td>TIB-160</td><td></td></tr></tbody></table>

랫 트 태 반 천연 킬러 세포 세포 용 분해 기능의 평가를 위한 플레이트 기반 세포 독성 분석

A Plate-based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Rat Placental Natural Killer Cell Cytolytic Function

의사는 정상적인 임신의 확립과 유지에 중요 한 역할을 하는 것으로 알려져 있습니다. 최근의 연구에의 하면 재발 성 유산 및 자간 전 증과 같은 임신 합병증을 앓고 있는 여성들의 순환 및 의사 이중 NK 세포의 변화 된 인구가 입증 되었다. 우리 그룹의 연구는 임신 중 고혈압이 표면 활성화 마커의 발현을 기반으로 태 반에 활성화 된 NK 세포의 증가 된 인구와 연관 된다는 것을 보여주었습니다. 이 원고는 수술로 유도 된 태 반 허 혈의 자간 전 증 유사 동물 모델에서와 같이, 장소에서 분리 된 NK 세포의 세포 독성 기능을 평가 하기 위한 상세한 프로토콜을 제공 한다. 다음 단계는 상세히 설명 된다: 단일 세포 현 탁 액의 생성, NK 세포 분리, 전 생체 자극, 이펙터: 표적 세포 공동 배양 및 세포 독성 분석 법.

NP 및 파열 된 랫 트에서 얻어진 태 반 NK 세포는 50:1 (NK: target)의 비율로 각각의 매개체에서 표적 세포와 함께 5 시간 동안 인큐베이션 되었다. 흡 광도는 490 nm에서 기록 하였으며, 원시 데이터는 표 2에 나타내 었 다. 배양 배지 배경의 평균 흡 광도와 부피 보정 제어 웰을 계산 하였다. 이러한 평균은 제조자의 프로토콜에 표시 된 적절 한 웰 로부터 감산 되 고 표 3에 표시 된다. 그 후 수정 된 값은 제조자에 의해 제공 된 프로토콜을 이용 하 여% 세포 독성을 구하는 데 사용 되었다 (표 4).
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tcs</td>
			<td>Vcc</td>
			<td>ECSR...

여기, 우리는 분리 하 고에서 자연 킬러 세포의 세포 독성 기능을 평가 하는 상세한 방법론을 제공 합니다. 비 색 판 분석에 의해. 태 반 허 혈의 감소 된 자 궁 관류 압력 쥐 모형은 천연 킬러 세포의 세포 독성 기능의 항 체 매개 분리 및 평가를 입증 하기 위해 선택 되었다.

It is well known that decidual natural killer (NK) cells play a critical role in establishment and maintenance of normal pregnancy. Recent studies have ...

이 방법은 특수 장비를 필요로하지 않는 간단하고 저렴한 방법을 사용하여 다른 세포 유형의 세포 독성 활성을 비교하는 데 도움이됩니다. 이 기술의 주요 장점은 유해 물질의 사용을 필요로하지 않으며, 저렴하며 특수 장비의 사용을 요구하지 않는다는 것입니다. 이 방법은 CD8 플러스 세포 세포 세포와 같은 다른 세포 유형의 세포 독성 활성을 측정하거나 세포 활성 효과 세포없이 인큐베이팅없이 세포의 자발적 인사를 평가하기 위해 적용 될 수 있습니다.이 기술에 새로운 개별은 가능성이 이펙터 세포 비율에 표적의 최적화와 투쟁할 것입니다. 내 조언은 프로토콜을 최적화 할 때 테스트 할 비율을 결정하기 위해 문학의 철저한 검색을 수행하는 것입니다. 이 방법은 피펫팅 을 정확하게 하는 것 이외에 전문적인 기술이 필요하지 않지만, 단일핵 세포의 분리및 분석판의 설정은 시각적으로 관찰될 경우 쉽게 이해하고 모방할 수 있는 단계이다.절차를 시연하는 것은 내 실험실의 기술자 인 첼시 Jekelley가 될 것입니다. 이 절차를 시작하려면 100 마이크로미터 필터가 들어있는 페트리 접시에 1.5 밀리리터의 FBS에 13.5 밀리리터의 RPMI를 추가하십시오. 필터에 태반 1개를 놓고 주사기 플런서의 평평한 면을 사용하여 필터를 통과하여 페트리 접시에 넣습니다.다음으로, 각 조직에 대해 3개의 15 밀리리터 원내관을 설치했습니다. 각 튜브에 밀도 그라데이션 배지 3밀리리터를 추가하고 각 튜브에 균질화된 태반 5밀리리터를 천천히 오버레이합니다. 300배 G의 원심분리기와 실온에서 25분 간 휴식을 취하십시오.그런 다음, 얇은 흰색 버피 층을 수집하기 위해 전송 파이펫을 사용합니다. 결합된 버피 레이어에 10밀리리터의 RPMI를 추가합니다. 원심분리기는 300배, 섭씨 4도에서 10분간 폐기하고 상주합니다.첫째, 얼음 차가운 PBS의 50 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 비오틴 라벨 CD3 항체를 추가하고 파이펫과 잘 섞습니다. 튜브를 튜브 회전에 넣고 섭씨 4도에서 20분 동안 배양합니다.다음으로 RPMI 1 밀리리터를 추가합니다. 원심분리기는 G 400배, 섭씨 4도에서 10분 간. 상체를 버리고 RPMI의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하십시오.1.5 밀리리터 마이크로센심분리기 튜브에 마그네틱 비드 150 마이크로리터와 셀 서스펜션을 결합합니다. 튜브를 튜브 회전기로 옮기고 섭씨 4도에서 30

a-plate-based-cytotoxicity-assay-for-assessment-rat-placental-natural

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

HIV에 감염된 세포 자연 킬러 세포 lytic 응답을 측정하기 위해 세포 독성의 assays는 대상 세포의 순도에 의해 제한됩니다. 우리는 여기서 CD4 아래로 조절하는 HIV - 1의 능력을 활용하여 HIV - 1 감염 기본 T - 세포 폭발의 고도 정화 인구의 절연을 보여줍니다.

준비 및 사용 HIV - 1 차 감염된 CD4 + 대상 세포로 T 세포 자연 킬러 세포 세포 독성 Assays에서

이 비디오는 Calcein AM 염색을 사용하여 암세포에 대한 자연 살해 세포의 세포 독성을 측정하는 분석을 보여줍니다. 자연살해세포(natural killer cell)와의 배양 후 형광암세포의 수가 감소한 것은 암세포에 대한 자연살해세포 매개 세포독성을 나타냅니다.

암세포에 대한 자연살해세포매개 세포독성을 평가하기 위한 Calcein Acetoxymethyl 염색

이 비디오는 암세포에 대한 사이토카인 유도 살해(CIK) 세포의 세포독성 능력을 측정하는 체외 기술을 보여줍니다. 표적 암세포와 CIK 세포를 공동 배양하면 형광 생존도 염료를 사용하여 죽은 암세포를 식별하고 유세포 분석을 사용하여 정량화하여 CIK 세포의 세포독성 효과를 추정합니다.

사이토카인 유도 살해 세포의 세포독성 능력을 연구하기 위한 체외 분석

이 비디오는 형광으로 염색된 표적 세포에 대한 자연 살해 세포의 용해 활성을 보여줍니다. 이 방법은 죽은 세포를 염색하고 유세포 분석기를 사용하여 살아있는 세포와 죽은 표적 세포를 정량화함으로써 NK 세포 유도 세포 독성을 측정할 수 있습니다.

유세포 분석을 위한 Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity Assay 시료 전처리

이 비디오는 표적 암세포에 대한 자연살해(NK) 세포의 세포독성을 결정하기 위해 젖산 탈수소효소 방출 분석을 수행하는 방법을 보여줍니다. 이 분석은 형성된 붉은 색 생성물의 흡광도를 측정하여 암세포에서 세포질 젖산 탈수소효소의 방출을 정량화합니다.

암세포에 대한 자연살해세포독성 평가를 위한 체외 분석

Marginating-hepatic leukocytes는 다른 백혈구 집단에 비해 독특한 특성과 뚜렷한 면역 기능을 나타냅니다. 여기에서 우리는 쥐 또는 생쥐의 간을 강제 관류하여 이 특정 간 세포 집단을 선택적으로 수확하는 방법을 설명합니다. 변두리-간 백혈구는 간 관련 질환 및 전이에 대한 감수성을 결정하는 데 중요한 것으로 보입니다.

Marginating-간 백혈구의 선택적 수확

양적 인간의 자연 킬러 세포의 세포 독성 활동을 결정 하는 흐름 cytometry 기반 방법은 여기에 표시 됩니다.

인간 NK 세포 활동의 평가 대 한 흐름 Cytometry 기반 세포 독성 분석 실험

암세포에 의한 자연살해(NK) 세포 매개 박멸의 회피는 암 개시 및 진행에 중요하다. 여기에서, 우리는 간 종양 세포를 향해 NK 세포 매개 세포 독성을 평가하기 위하여 2개의 비 방사능 기지를 둔 프로토콜을 제시합니다. 또한 NK 세포 마이그레이션을 분석하기 위해 세 번째 프로토콜이 제시됩니다.

간 종양 세포의 맥락에서 자연 킬러 세포 매개 세포 독성 및 이동의 측정

인간 자연 킬러 세포에서 치료 항체에 의한 FcγRIIIa 구동 이벤트를 연구하기 위한 프로토콜이 여기에 설명되어 있다. 이 인공 자극 플랫폼은 결합에 관여하는 항체의 FcγRIIa 및 Fc 부분에 의해 매개되는 디그라니션, 케모킨/사이토카인 생성, 시그널링 경로 와 같은 다운스트림 이펙터 기능의 심문을 허용합니다.

치료 항체의 존재에 FcγRIIIa 참여에 의해 구동 인간 자연 킬러 세포 이벤트의 평가

이 프로토콜은 세포 생존 가능성을 효율적으로 결정하기 위한 신속하고 높은 처리량, 신뢰할 수 있고 저렴하며 편견없는 분석서를 설명합니다. 이 분석은 세포의 미토콘드리아가 손상되어 다른 분석과 방해가 되는 경우에 특히 유용합니다. 분석은 두 개의 핵 염료로 염색 된 세포의 자동 계수를 사용합니다 - Hoechst 33342 및 프로피듐 요오드.

미토칸 세포 독성의 정확한 측정을 위한 자동화된 차동 핵 염색 분석

이 프로토콜은 생세포 영상과 유세포분석을 사용하여 인간 자연 살해 세포의 자연 키메라 항원 매개 매개 항체 의존성 세포독성을 일관되게 측정하기 위한 표준화된 시험 관 내 워크플로우를 제공합니다.

키메라 항원 수용체와 치료용 항체에 의해 증강되는 NK 세포 독성을 생세포 영상 및 유동 세포분석을 이용해 정량화합니다

배우세요 랫 태반에서 천연 킬러 세포를 분리하고 플레이트 기반 색도법으로 세포 독성 기능을 평가하는 방법을. 이 기술은 면역학 및 세포 생물학 연구에 활용됩니다.

랫 트 태 반 천연 킬러 세포 세포 용 분해 기능의 평가를 위한 플레이트 기반 세포 독성 분석

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