Name: 배아 조직과 Thymus 예제를 사용 하는 메 추 라 기-닭고기 공상 기관의 형성의 절연 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: 배우세요 메추라기와 닭 배아 조직을 분리하는 최적화된 방법을 통해 유전자 발현 연구와 기능 분석을 수행하는 기술입니다. 이 방법은 발생 생물학 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

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저자는 원고의 중요 한 독서에 대 한 감사 이사벨 Alcobia 비디오 나레이션 대 한 마리 Henriques Instituto de Histologia e Biologia의 조직학 서비스에서 Vitor 쾌속 범선을 할 Desenvolvimento, Faculdade de Medicina 드 리스보아 Universidade 드 리스보아, 기술 지원에 대 한입니다. 우리는 특히 파울로 카에 이루와 휴고 실바 Unidade 드 audiovisuais (시청각 단위), Faculdade 데에서에서 빚을 Medicina 드 리스보아,이 비디오의 생산에 그들의 뛰어난 노력에 대 한 Universidade 드 리스보아. 친절 하 게 제공 Interaves 비디오 시스템을 갖추고 stereoscope Leica 마이크로 시스템즈 인정-계란을 기름 지 게 하 고 있다 농업-Pecuária, 메 추 라 기와 기여에 대 한 활발. 이 작품은 Faculdade 드에 의해 지원 되었다 Medicina 드 리스보아, Universidade 드 리스보아 (FMUL).

이러한 모든 실험 동물 관리 및 센트 Académico 드 메디 시 나의 윤리적 지침 따라 리스보아.
1. 수정 된 메 추 라 기 그리고 닭 계란 외피
<ol><li>장소는 3 일 동안 38 ° C 습도 인큐베이터에서 일본 메 추 라 기 (Coturnix coturnix japonica)의 알을 수정 된. 공기 챔버에 향하도록 계란 (계란 무뚝뚝한 끝)를 품 어. 참고: 습도 환경 인큐베이터의 밑에 물 컨테이너를 배치 하 여 이루어집니다.</li>
	<li>38 ° C 습도 인큐베이터에 2.5 일 동안 치킨 (갈 루스 갈 루스)의 수정 된 알을 품 어. 수평 위치에 알 품 어 고 상부 태아 위치를 식별할 수 숯불의 한 조각을 사용 하 여 표시 합니다. 참고:이 실험을 설정할 때 40 메 추 라 기 계란과 60 닭고기 달걀으로 시작.</li>
</ol>2. 격리의 메 추 라 기 endoderm thymic rudiment의 예비 도메인을 포함 하
참고: 메 마른 조건에서 수평 층 류 두건 및 멸 균된 악기와 계란 조작 절차에 대 한 자료를 사용 합니다.
<ol><li>Thymic rudiment의 추정 영역을 포함 하는 배아 지역 제거, 3층 및 4회 를 포함 하는 인 두 아치 지역 설명된7,8로 (3/4PAR), 아치.<ol>
<li>큰 붕 규 산 유리 그릇 (100 x 50 mm, 100 cm3) 차가운 인산 염 버퍼 염 (PBS) 60 mL을 채우십시오.</li>
		<li>곡선된가 위의 도움으로 누르고 잘라 원형 구멍을 메 추 라 기의 껍질에 계란을 3 일 동안 incubated 되었습니다. 무딘 계란의 반대 측에 있는 구멍을 확인 하 고 차가운 PBS와 그릇에 노 른 자 (태아)와 전송.</li>
		<li>여분의 배아 선박 곡선된가 위를 사용 하 여 외부 vitelline 멤브레인을 절단 하 여 노 른 자에서 태아를 제거 합니다.</li>
		<li>얇은 겸의 도움으로, 작은 사 발 (60 m m x 30 m m, 15 cm3) 배아 전송 차가운 PBS의 10 mL으로 가득합니다.</li>
		<li>스키 머, 100 mm 페 트리 접시 블랙 기지와 태아 이동 ( 재료의 표참조) 차가운 PBS의 10 mL를 포함 하 고 있는 stereomicroscope에서.</li>
		<li>앞에서 설명한83/4PAR를 해 부.</li>
		<li>Aspirate 3/4PAR 및 유리 접시 4 분의 3에 가득 찬 PBS 2 mL 살 균 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Thymic rudiment (3/4PP endoderm)의 추정 영토를 포함 하는 pancreatin와 효소 소화에 의해 endoderm를 격리 합니다.<ol>
<li>주걱과 얇은 겸의 도움으로 유리 접시 3/4 3/4PAR 이동 찬 pancreatin (8 mg/mL; 25 mg/mL 차가운 PBS와의 1:3 희석)으로 가득합니다.</li>
		<li>효소 소화에 대 한 얼음에 1 시간에 품 어. 참고: 소화 효소의 시간 개발 (표 1)의 무대의 따라 달라 집니다.</li>
		<li>3/4PAR에서 endoderm을 stereomicroscope (40 x-60 배 확대)에서 유리 접시를 놓습니다. 참고: 모든 표면 및 유지 솔루션 감기이 절차 동안에. 해 부 조직 하는 데 시간이 오래 복용 하는 경우 새로운 차가운 pancreatin 솔루션 변경 (> 15 분). 조명 원으로 통합 또는 광학 섬유는 stereomicroscope에서 제한 된 열 부하를 고려 하는 LED 빛을 사용 합니다.</li>
		<li>주변 조직에서 endoderm를 격리 하려면 핀 홀더 2 개의 스테인레스 스틸 microscalpels 사용 하 여. 참고: microscalpels를 사용 하 여 턱 오프닝 직경 1 m m 0 m m의 직경이 0.1 m m와 0.2 m m 니켈 핀 홀더 사이.<ol>
<li>먼저 신경 튜브 및 mesoderm pharyngeal endoderm의 등 쪽 표면에 연결을 제거 합니다.</li>
			<li>최대 지 면, 신중 하 게 분리 및 제거 인 두 아치 사이 mesenchyme 고 노출 인 두 파우치. 3/4PAR의 양쪽에서이 절차를 수행 합니다.</li>
			<li>심장 관 및 mesenchyme 둘러싼 앞쪽 주머니를 제거 합니다.</li>
			<li>복 부 쪽으로 2차 및 3rd 인 두 아치 ectoderm 잘라내어 mesenchyme는 파우치에 연결 된를 조심 스럽게 제거. 3/4PAR의 다른 측면에서이 절차를 반복 합니다. 이 단계에서 갑 상선 rudiment 표시 되어야 합니다.</li>
			<li>두 개의 microscalpels와 인 두 endoderm에 연결 된 모든 나머지 중간 엽 세포를 제거 합니다.</li>
			<li>2차 및 3rd 3rd 및 갑 상선 rudiment 및 2nd endoderm의 앞쪽 부분에서 4번째 파우치 포함 하 인 두 endoderm 해리 PP 사이 횡단 컷 만들기 인 두 주머니입니다.</li>
			<li>주걱과 얇은 겸의 도움으로 전송 격리 3/4PP endoderm 유리 접시 4 분의 3에 100% 찬 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)으로 가득합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>생체 외 분석 실험의 준비 하는 동안 얼음에 고립 된 조직 유리 접시를 유지. 또는 격리 된 조직을 3 차원으로 보존 될 수 하 고 현장에서 유전자 발현에 대 한 분석.</li>
</ol>3입니다. 치킨 somatopleura mesoderm의 격리
참고: 수행 계란 수평 층 류 두건 및 소독된 기기 및 자료를 사용 하 여 무 균 상태에서 조작 절차.
<ol><li>Somites 19-24 (ss19-24)의 수준에서 somatopleura mesoderm 포함 된 배아 영토를 제거 합니다.<ol>
<li>외피의 2.5 일 후 인큐베이터에서 닭 계란을 제거 합니다.</li>
		<li>곡선가 위, 껍질에 작은 구멍을 엽니다. 바늘을 삽입 하 고 낮은 알 부 민 달걀 내부 볼륨 (포탄의 표시 영역 아래에 있는) 태아의 손상을 방지 하는 10 mL 주사기와 알 부의 2 개 mL를 발음. 발음된 알 부 민을 삭제 합니다.</li>
		<li>컷 원형 곡선된가 위를 사용 하 여 셸 표시 된 지역에 (최대-3 분의 2는 상단 표면 영역)를 구멍.</li>
		<li>잘라 vitelline 막 외부 extraembryonic 배 얇은 집게로 태아를 잡고 있는 동안.</li>
		<li>Stereomicroscope에서 차가운 PBS의 10 mL를 포함 하는 검은 기지와 태아 100 mm 페 트리 접시에에서 놓습니다. 참고:이 시점에서 stereomicroscope를 사용 하 여 미세 절차의 점진적 확대에 대 한.</li>
		<li>접시의 바닥에는 배아를 4 개의 얇은 곤충 핀을 사용 합니다. 사각형 모양을 형성 하는 extraembryonic 지역에 핀을 배치 합니다.</li>
		<li>19와 24 transversely 배아 축 somites wecker 눈이 위를 사용 하 여 모든 배아 영토를 건너 사이 두 컷을 수행 합니다.</li>
		<li>한계 배아 가장자리 절단 ss19-24, 배아 섹션을 놓습니다.</li>
		<li>Aspirate ss19 24 조직 및 유리 접시 4 분의 3에 차가운 PBS 2 mL 살 균 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 채워집니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pancreatin (8 mg/mL; 25 mg/mL 차가운 PBS와의 1:3 희석)와 효소 소화에 의해 somatopleura 지역 (ss19-24)에서 측면 mesoderm를 격리 합니다.<ol>
<li>주걱과 얇은 집게, 전송의 도움으로 유리 ss19 24 조직 접시 가득 찬 pancreatin 솔루션으로 3/4.</li>
		<li>효소 소화에 대 한 얼음에 30 분 동안 품 어.</li>
		<li>Stereomicroscope, 아래에 홀더 2 개의 microscalpels를 사용 하 여 주변 조직에서 mesoderm을 격리 합니다. 참고: 모든 표면 및 유지 솔루션 감기이 절차 동안에. 해 부 조직 하는 데 시간이 오래 복용 하는 경우 새로운 차가운 pancreatin 솔루션 변경 (> 10 분.). 조명 원으로 통합 또는 광학 섬유는 stereomicroscope에서 제한 된 열 부하를 고려 하는 LED 빛을 사용 합니다.</li>
		<li>Mesoderm 격리 하는 동안 먼저 ectoderm ventrally 위치 splancnopleura 조직의 주의 초연 뒤 표면에서 제거 합니다.</li>
		<li>릴리즈 신경 튜브를 병렬 동작에서 절단 하 여 somatopleura의 오른쪽 측면 mesoderm.</li>
		<li>태아의 왼쪽의 mesoderm 분리를 반복 합니다. 참고:이 절차 동안 microscalpel의 움직임을 느리게 합니다. 노출 된 엑스트라 세포 매트릭스 단백질 조직 및 유체 움직임을 방지 하는 악기에 충실.</li>
		<li>주걱과 얇은 겸의 도움으로 유리 접시 4 분의 3에 전송 격리 mesoderm 차가운 FBS 가득합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>생체 외 분석 실험의 준비 하는 동안 얼음에 고립 된 조직 유리 접시를 유지.</li>
</ol>4입니다. 생체 외에서 organotypic 분석 결과: 메 추 라 기 3/4PP endoderm와 치킨 somatopleura mesoderm heterospecific 협회
<ol><li>10 %FBS 1% 펜/Strep3,5보충 RPMI 1640 매체와 문화 매체를 준비 합니다.</li>
	<li>35 mm 페 트리 접시 배양의 5 mL에에서 금속 그리드를 배치 합니다. 참고: 격자의 상단 중간 표면을 액체의 과잉을 제거 합니다.</li>
	<li>얇은 포 셉의 도움으로 멤브레인 필터 문화 매체에와 공기와 접촉 한 표면에 그리드 위에 배치. 참고: 1/4의 막 (13 m m 직경) 조직 협회에 대 한 적절 한입니다.</li>
	<li>Stereomicroscope에서 멤브레인 필터 위에 고립 된 조직에 연결. 먼저 이식 숟가락 (또는 주걱)의 도움으로 부드러운 슬라이딩 유리 접시에서 3/4PP endoderm (2 단계)을 전송 하 고 얇은 집게. 격리 된 mesoderm (3 단계)에 대 한이 절차를 반복 합니다. 참고:는 microscalpel의 도움으로의 그것의 협회를 극대화 하기 위해 조직 믹스.</li>
	<li>48 h. 교양된 조직 chorioallantoic 막 (CAM)에 투입 될 수에 대 한 신중 하 게 5% CO2 와 37 ° C에서 습도 인큐베이터에 관련된 조직 배치 합니다. 참고: 카메라에 소성 기관 형성 이전 자세한8이었다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

여기 상세한 배아 조직 격리 절차는 다른 생물학 문맥3,,56에 메 추 라 기-닭고기 공상 배아를 생산 하는 이전 기술에서 개선 되었다.
이 방식은 유전자 조작 이나 결정, 유전자 변형된 동물 모델의 사용을 제한 하지는 조직의 특정 마커를 사용 하 여 필요 없이 순수 배아 조직 분리에 적합 합니다. 그것은 능력을 제한 하는 요인이 되 고 순수한 조직 분리 개발 하는 동안 엽 상피 상호 작용을 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 개발 진행, 조직 및 두꺼운, 더 조밀한 그들의 별거는 더 어려운 같은 다른 인접 조직에 연결. 이 격리 절차가 아니다, 따라서, 개발, 즉 늦은 organogenesis의 나중의 단계에 적합.
이 메서드는 고유 3D 보존 배아 조직에서 유전자...

1970 년대 초반에 우아한 메 추 라 기-치킨 키메라 시스템 르 Douarin, 새로운 수익원 개발1,2중 세포 이동과 세포 상호 작용의 역할을 이해 하 여에 의해 개발 되었다. 모델 두 종 사이의 셀 교환 것 크게 embryogenesis, 나중에 긴장의 형성 하 고는 조 혈을 포함 하 여 수많은 발달 과정을 연구 하는 데 사용 하는 경우 확인을 방해 하지 않는 전제에서 고안 되었다 시스템1. 예를 들어 후자 복용, 조 혈 창시자 thymic 상피 rudiment 식민지의 주기적 파도 처음 관찰 되었다 메 추 라 기-치킨 키메라 시스템3를 사용 하 여. Thymus, 세 번째 및 네 번째 pharyngeal 주머니 (3/4PP) endoderm의 미래의 영토 15-30 somite 단계 [배아 일 (전자) 1.5-E2.5]에서 기계적 및 효소 메 추 라 기 (q) 배아에서 분리 했다. 이러한 단계는 닭고기 햄버거와 해밀턴4 (HH)-단계 12 월 17 일에 해당합니다. 격리 절차 트립 신 효소 연결 된 mesenchyme에서 endoderm 해리를 사용 하 여 시작 했다. 격리 된 endoderm E3-E3.5 (HH-단계 20-21)에서 호스트 치킨 (c) 태아의 somatopleura 지역에 투입 했다. 이 분리 mesenchyme thymic 상피 개발 기관 형성3에 기여를 "허용"으로 간주 되었다. 그 후, 닭고기 호스트 혈액을 매개로 조상 세포의 물결이 침투 메 추 라 기 기증자 thymic 상피 대응 호스트 태아3thymus 형성에 기여.
최근에,이 접근의 수정된 된 버전의 초기 단계-thymus 형성5엽 상피 상호 작용을 공부에 대 한 중요 한 것 또한 입증 되었다. 이 점에서 공상 배아3 에서 소성 thymus의 형성에 관련 된 조직 모두 기증자와 호스트 배아에서 분리 되었고 비보 전 관련. 메 추 라 기 3/4PP endoderm (E2.5-E3)와 치킨 somatopleura mesoderm (E2.5-E3)를 분리 하는 향상 된 프로토콜 사용 되었다. 간단히, 배아 조직 했다 생체 외에서 pancreatin 소화 및 미세 하 여 격리 된. 또한, 효소 소화 조건, 온도 시간 외피의 조직 유형 및 발달 단계 (표 1)에 따라 최적화 했다.
다음, 고립 된 조직 했다 관련 한 organotypic에서 48 h에 대 한 시험관 시스템에서 이전에 보고 된5,6. 조직의 생체 외 협회 vivo에서 조작의 몇 가지 제한 사항이 극복 배아에서 지방 세포 상호 작용을 모방 합니다. 이 시스템은 특히 유용 인 두 장치 개발 등 복잡 한 morphogenic 이벤트에서 세포 상호 작용을 공부.
Thymus histogenesis 각 조직의 기여 뿐만 아니라 한 thymus를 생성 하는 heterospecific 협회의 능력 더 탐험을 사용 하 여 캠 방법론, 이전 자세한5,,78일 수 있다. 간결, 교양된 조직 cE8 배아의 캠에 융합 되었고 10 일 비켜 개발 수 있습니다. 다음, thymus 형성 수확된 explants에서 형태소 분석에 의해 평가 되었다. 클래식 메 추 라 기-치킨 연구3, 메 추 라 기 thymic 상피 조상 조 혈 모 세포 (HPCs) 나중 장기 개발9,10 보여 줬던 닭 배아에서 파생 된에 의해 식민지 화 되었다 . HPCs 매우 vascularized 캠5,,78소성 공상 thymus 태아에서 마이그레이션. 메 추 라 기 파생된 thymic 상피 immunohistochemistry 종의 항 체 (즉, QCPN-MAb 메 PeriNuclear), 조직 관련 분자 마커를 위한 필요를 극복을 사용 하 여 확인할 수 있습니다
이 실험 방법은 이전 간행물8, 보고 2 단계 접근 체 외 중 고 비켜 개발에 약리학 대리인의 일반 관리 여 신호 통로의 변조를 허용 합니다. 또한, explants 실험8과정의 어떤 시간 시점에서 수확 될 수 있습니다.
마지막으로, 여기 상세한 격리 프로토콜 수 자연 속성의 보존 및 배아 조직, 그렇지 않으면 배아 영토의 현장에서 유전자 발현 패턴을 자세하게 설명 하는 데 특히 유용의 3D 아키텍처에 의해 액세스할 수 전통적인 방법입니다. 또한, transcriptome 분석 접근, RNA-seq 또는 microarrays를 포함 하 여 적용할 수 있습니다 또한 고립 된 조직에서 조직 관련 높은 처리량 "omics" 분석을 제공 하면서 유전자 마커를 필요로 하지 않고.

<table><tbody><tr><td>닭 수정란 (Gallus gallus)</td><td>Pintobar, Portugal</td><td></td><td>가금류 농장&nbsp;</td></tr><tr><td>메추라기 수정란 (Coturnix coturnix)</td><td>Interaves, Portugal</td><td></td><td>Bird farm&nbsp;</td></tr><tr><td>15 mL PP 원심분리기 튜브</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>50 mL PP 원심분리기 튜브</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>60 x 20 mm 파이렉스 접시</td><td>Duran 그룹</td><td>21 755 41</td><td></td></tr><tr><td>100 x 20 mm 파이렉스 접시</td><td>Duran 그룹</td><td>21 755 48</td><td></td></tr><tr><td>메탈 그리드</td><td>Goodfellows</td><td></td><td>세밀한 메시&nbsp; 스테인레스 스틸 그리드</td></tr><tr><td>멤브레인 필터</td><td>Millipore</td><td>DTTP01300</td><td>0.6 mm Isopore 막 필터</td></tr><tr><td>페트리 디쉬, 35 x 10 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5112&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>60 x 30mm 파이렉스 그릇 (작은 크기)</td><td></td><td></td> <td>슈퍼마켓에서&nbsp;</td></tr><tr><td>100 x 50mm 파이렉스 그릇 (대형 크기)</td><td></td><td></td> <td>슈퍼마켓에서&nbsp;</td></tr><tr><td>트랜스퍼 피펫</td><td>Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific</td><td>2041S</td><td>2 mL 플라스틱 피펫</td></tr><tr><td>유리 파스퇴르 피펫</td><td>Normax</td><td>5426015</td><td></td></tr><tr><td>슈퍼마켓에서 판매하는 투명 플라스틱 테이프</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>사이토케라틴(팬, 산성 및 염기성, 유형 I 및 II 사이토케라틴), 클론 Lu-5</td><td>BMA Biomedicals</td><td>T-1302</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Standart FBS</td></tr><tr><td>Pancreatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3292</td><td>제조업체의 지침에 따라 25mg/mL 용액을 준비합니다. 분취 전에 원심분리기 및 여과를 하고 -20°C에서 보관하십시오. 분취액은 냉동 보관할 수 있습니다. 몇 년.</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>인비트로겐, Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 (PBS)</td><td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>QCPN 항체</td><td>개발 연구 하이브리도마 은행</td><td>QCPN</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 매체, GlutaMAX 보충제&nbsp;</td><td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td><td>61870010</td><td></td></tr><tr><td>Bluesil RTV141A/B 실리콘 엘라스토머 1.1Kg 키트</td><td>ELKEM/Silmid</td><td>RH141001KG</td><td>페트리 디쉬를 위한 뒷받침을 준비하기 위해</td></tr><tr><td>Dumont #5 펜치</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11251-30&nbsp;</td><td>얇은 집게</td></tr><tr><td>매우 세밀한 Bonn 가위, 곡선</td>형 <td>Fine Science Tools</td><td>14085-08</td><td>곡선형 가위</td></tr><tr><td>곤충 핀&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>26001-30</td><td>0.3 mm 스테인리스 스틸 핀</td></tr><tr><td>마이크로 스패튤라&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>10087-12</td><td>이식 스푼</td></tr><tr><td>Minutien 핀</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td>0.2 mm 스테인레스 스틸 마이크로 메스</td></tr><tr><td>Minutien 핀</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>0.1 mm 스테인레스 스틸 마이크로 메스</td></tr><tr><td>Moria 니켈 도금 핀 홀더</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td>니켈 도금 핀 홀더</td></tr><tr><td>Moria 천공 스푼</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-17</td><td>Skimmer</td></tr><tr><td>Wecker Eye Scissor</td><td>Fine Science Tools</td><td>15010-11</td><td></td></tr><tr><td>카메라</td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td>MC170 HD</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td>DM2500</td><td></td></tr><tr><td>나노줌머&nbsp; S360 디지털&nbsp; 슬라이드 스캐너&nbsp;</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C13220-01</td><td></td></tr><tr><td>스테레오스코프</td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td>라이카 M80</td><td></td></tr></tbody></table>

배아 조직과 thymus 예제를 사용 하는 메 추 라 기-닭고기 공상 기관의 형성의 절연

Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example

배아 조직 분리 용량 차례로 발달 생물학에서 공개 키 프로세스에 확실 한 공헌을 제공 했다 메 추 라 기-치킨 키메라 시스템을 설정 하기 위한 필수적인 단계를 했다.
여기는 메 추 라 기를 미세 및 그것의 생물 학적 속성을 유지 하면서 효소 소화에 의해 닭 배아 조직 분리 하는 최적화 된 방법 설명. 절연, 후 48 헤 메 추 라 기에 대 한 생체 외에서 organotypic 분석 결과에서 두 종에서 조직 관련 및 닭고기 조직 고유 핵 기능 및 분자 마커 사이 세포 잡담 연구를 수 있도록 하 여 차별 수 있습니다. heterospecific 협회 조직입니다. 이 접근은, 그러므로, 공부는 foregut의 형성과 pharyngeal morphogenesis 동안 발생 등 매우 역동적인 공간 수정, 개발 프로세스에 복잡 한 조직 상호 작용을 위한 유용한 도구 endoderm 파생 된 기관입니다. 이 실험적인 접근 thymus 형성의 초기 단계 동안 엽 상피 상호 작용 연구를 처음 개발 되었다. 이, 미래의 thymic rudiment endoderm 파생 및 mesoderm 파생 mesenchyme는 각각 메 추 라 기 및 닭 배아에서 분리 했다.
용량의 관련된 조직 기관 생성 하는 더 닭 배아의 chorioallantoic 막 (CAM)에 접목 하 여 테스트할 수 있습니다. 캠은 영양분을 제공 하 고 explanted 조직에 가스 교류를 허용 한다. 비켜 개발에서의 10 일 후 공상 장기 기존의 형태학 방법으로 수확된 explants에 분석 수 있습니다. 이 절차 또한 수 있습니다 초기 개발 (생체 외에서 개발)에서 기관 형성 동안 조직 관련 기여를 공부 (비켜 개발)에서 organogenesis의 최종 단계에.
마지막으로, 향상 된 격리 방법 또한 제공 한다 3 차원으로 (3D) 보존 배아 조직, 조직 관련 유전자 발현 패턴의 고해상도 지형 분석에도 사용할 수 있습니다.

프로토콜에는 여러 세포 및 개발 생물학 기술 접근에 사용 되는 조류 배아 조직 분리 하는 방법을 자세히 설명 합니다. 이 방법은 이전 thymus 형성5의 초기 단계 동안 엽 상피 상호 작용을 공부 고용 되었다. 여기, 새로운 결과 그림 1 과 그림 2, 비슷한 방법을 사용 하 여 표시 됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58965/58965fig1.jpg"> 그림 1 . 유전자 발현의 대표적인 결과 연구의 3 차원으로 보존 추정 영토를...

이 문서에는 ex vivo 공상 장기 형태로 결합 될 수 있는 메 추 라 기 및 닭 배아에서 순수 배아 조직 분리 하는 방법을 제공 합니다.

배아 조직과 Thymus 예제를 사용 하는 메 추 라 기-닭고기 공상 기관의 형성의 절연

The capacity to isolate embryonic tissues was an essential step for establishing the quail-chicken chimera system, which in turn has provided undisputed ...

이 절차의 전반적인 목표는 메추라기와 닭 배아에서 배아 조직을 격리하기 위한 최적화된 실험적 접근법을 제시하는 것입니다. 이 기술을 사용하여 유전자 발현 연구 및 기능적 검사에 사용할 수 있는 순수한 배아 조직을 얻습니다. 메추라기와 닭 배아의 조직은 미세 수술에 의해 격리되고 생물학적 특성을 보존하면서 체외 효소 소화의 대상이됩니다.격리 후, 3차원 보존 조직은 고해상도 지형 유전자 발현 패턴 분석에 사용될 수 있다. 이 접근법은 기존의 방법에 의해 달리 접근할 수 없는 배아 지역에서 시투 유전자 발현을 자세히 설명하는 데 특히 유용합니다. 또한, 전사 분석 접근법은 조직별 높은 처리량 오믹 분석을 제공하면서 유전 적 마커를 필요로하지 않고 격리 된 조직에 적용 될 수 있습니다.대안적으로, 두 종에서 분리된 조직은 48시간 동안 체외 조직 분석에서 연관될 수 있다. 이 접근법은 메추라기와 닭 세포가 뚜렷한 핵 특징과 분자 마커에 의해 차별될 수 있기 때문에 조직 상호 작용을 연구할 수 있습니다. 장기를 형성하는 문화 조직의 용량은 ovo 분석에서 더 테스트 할 수 있습니다.이 방법은 따라서 높게 동적 간격 수정을 가진 발달 프로세스에 있는 복잡한 조직 상호 작용을 연구하기 위한 유용한 공구이고 또한 기관의 대형에 특정 배아 영토의 잠재력을 드러내는 것을 도울 수 있습니다. 예를 들어, 본명중에서 분리된 배아 조직으로부터 메추라기 닭 키메라 티무스의 형성을 기술한다. 첫째, 세 번째와 네 번째 인두 파우치의 내분, 미래의 흉부 기초는 3 일간의 발달로 메추라기 배아의 인두 부위로부터 분리된다.그런 다음, 이 조직은 그것의 발달을 지원할 수 있는 mesenchyme, somatopleura 중소근과 연관됩니다. 마지막으로, 조직의 이종특이적 협회는 체외와 오보에서 키메라 흉부를 형성하기 위해 배양된다. 수평 라미나르 플로우 후드와 멸균 된 기기 및 재료를 사용하여 멸균 조건에서 모든 계란 조작 절차를 수행하십시오.수정된 메추라기 알은 공중 챔버를 향하고 있는 것으로 배양되었습니다. 먼저 인큐베이터에서 메추라기 알을 제거합니다. 차가운 PBS로 채워진 큰 보로실리케이트 유리 그릇을 준비합니다.곡선 가위를 사용하면 3일간의 배양으로 메추라기 달걀 껍질의 원형 구멍을 탭하고 자릅니다. 달걀의 반대편에 구멍을 무딘 만들고, 차가운 PBS와 그릇에 노른자를 전송합니다. 외장 혈관으로 외부로 비텔린 멤브레인을 절단하여 노른자에서 배아를 제거합니다.얇은 집게의 도움으로, 차가운 PBS로 채워진 작은 그릇에 배아를 전송한 다음 스키머가있는 검은 색 베이스가있는 페트리 접시로 배아를 옮춥시다. 이전 Jove SPA 결찰에 설명된 바와 같이 세 번째 및 네 번째 인두 파우치를 포함하는 인두 부위를 제거합니다. 그런 다음 세 번째와 네 번째 인두 아치 부위를 차가운 췌장으로 채워진 유리로 옮기고 얼음 위에 1 시간 동안 인큐베이션하여 효소 소화를 합니다.효소 소화의 잠복기는 발달 단계에 따라 다릅니다. 스테레오 현미경 아래에 유리 접시를 놓고 홀더에 두 개의 마이크로 메스를 사용하여 세 번째 및 네 번째 인두 아치 영역에서 엔도드름을 분리합니다. 먼저 등쪽 면을 위로 하는 인두 부위를 배치하여 외부 표면에 내분과 이외 절제술을 내부적으로 표시합니다.신경관의 자궁 절제술, 내도, 메센키메, 심장 관 및 복부 부분을 관찰한다. 인두 내막의 등쪽 표면에 부착 된 신경 관과 중체를 제거합니다. 인두의 엔도름, 네 번째와 세 번째 인두 파우치, 심장 관을 관찰한다.등쪽을 위로 올려두면 인두 아치 사이의 메센키메를 조심스럽게 분리하고 제거하고 인두 파우치를 노출시보있습니다. 인두 영역의 반대편에서 이 절차를 수행합니다. 엔도름의 가장 후방 부분에 부착 된 메센키메를 제거하고 네 번째 인두 파우치를 관찰하십시오.후방 쪽을 위로, 왼쪽과 오른쪽 네 번째 인두 파우치를 모두 관찰. 엔도름의 가장 후방 부분과 두 번째 파우치에 부착 된 메센키메를 제거하여 계속합니다. 내부 파우치를 둘러싼 심장 튜브와 메센키움을 제거합니다.복부 쪽을 위로, 인두 엔도드름을 관찰하고, 두 번째 인두 아치의 오른쪽을 관찰한다. 이 단계에서, 갑상선 기초의 엔도름을 볼 수 있어야합니다. 두 번째와 세 번째 인두 아치의 자궁 절제술을 분리하고 아치의 관저를 조심스럽게 제거합니다.오른쪽에 있는 두 번째 인두 아치의 메세나키메 제거를 관찰한다. 네 번째와 세 번째 파우치와 갑상선 초보의 위치를 유의하십시오. 인두 파우치에 부착 된 중간 엽 세포에 유해를 제거합니다.오른쪽의 세 번째와 네 번째 파우치와 왼쪽에서 네 번째 파우치를 관찰한다. 왼쪽의 중간 분리를 반복합니다. 이제 왼쪽의 세 번째 파우치를 관찰하십시오.왼쪽에 있는 두 번째 아치의 중간 엽 분리를 관찰한다. 이 절차 동안 모든 표면과 솔루션은 차갑게 유지되어야 합니다. 조직을 해부하는 데 시간이 오래 걸리는 경우 새로운 차가운 췌장 용액과 접시로 변경합니다.마지막으로, 두 번째와 세 번째 인두 파우치 사이에 트랜스 버단을 잘라 두 번째 파우치와 갑상선 초보를 제거합니다. 이 시점에서, 고립 된 엔도드름은 세 번째와 네 번째 인두 파우치와 인두의 후방 끝으로 구성된다. 두 개의 마이크로 메스의 도움으로 분리 된 메센키움을 제거합니다.차가운 태아 소 세럼으로 채워진 유리 접시에 고립 된 엔도드름을 옮기고 체외 분석과정을 준비하는 동안 얼음 위에 보관하십시오. 계란은 수평 위치에 배치하고 상측은 숯을 사용하기 위해 표시되었다. 먼저 인큐베이터에서 계란을 제거합니다.곡선 가위를 사용하면 껍질에 작은 구멍을 열고 바늘을 삽입하고 10 밀리리터 주사기로 알부민 2 밀리리터를 흡입합니다. 쉘의 표시된 부위에 원형 구멍을 열고 얇은 집게로 배아를 유지하면서 외부로 혈관 막을 여분의 배아 혈관으로 절단합니다. 스테레오 현미경의 밑에, 차가운 PBS를 포함하는 검은 기지와 페트리 접시에 태아를 놓습니다.4개의 곤충 핀을 사용하여 배아를 접시 바닥에 고정시하십시오. 사각형 모양을 형성하는 외피 성 영역에 핀을 놓습니다. 소미트(19)와 24사이의 두 컷을 배아 축으로 변환하여 배아를 횡단한다.한계 배아 가장자리를 절단하여이 섹션을 해제합니다. 측면 플레이트, 신경관 및 소염을 관찰합니다. 조직을 흡입하고 차가운 췌장으로 채워진 유리 접시에 티슈를 옮춥춥시다.효소 소화를 위해 얼음에 30분 동안 배양하세요. 스테레오 현미경의 밑에, 홀더에 있는 2개의 마이크로 메스를 사용하여 주변 조직에서 중구를 분리합니다. 소마토플라우라 중소, 스플란치노플라, 신경관 및 이토더름을 관찰하십시오.먼저 표면에서 자궁 절제술을 제거합니다. 자궁 에서 해리 된 소토 플라 우 막 을 관찰하십시오. 그런 다음, 소마토플라에서 심플치노플레라에 위치한 통풍구를 조심스럽게 분리합니다.소마토플라의 오른쪽 측면 중소포름을 관찰한다. 신경관에 평행한 동작으로 절단하여 놓습니다. 이 절차 동안 모든 표면과 솔루션은 차갑게 유지되어야 합니다.조직을 해부하는 데 시간이 오래 걸리는 경우 새로운 차가운 췌장 용액과 접시로 변경합니다. 소마토플라, 소마이트, 신경관 및 자궁 절제술의 왼쪽 측면 중소를 관찰하십시오. 이 쪽의 중구 방출을 반복합니다.마이크로 메스로 느린 움직임을 만듭니다. 노출된 세포외 매트릭스 단백질은 조직과 계측기를 통해 앉아 유체 의 움직임을 방지합니다. 신경관에 평행한 동작으로 소마토플라우라를 조심스럽게 잘라냅니다.고립 된 중소포름을 차가운 태아 소 혈청으로 채워진 유리 접시에 옮기고 체외 분석 을 준비하는 동안 얼음위에 보관하십시오. 페트리 접시에 미세메쉬 금속 화격자를 놓고 문화 매체로 채웁니다. 과도한 액체를 제거하여 화격자 상단으로 중간 표면을 평평하게 합니다.얇은 집게의 도움으로 멤브레인 필터를 배양 매체에 담그고 창살 위에 조심스럽게 놓고 그녀와 접촉하는 표면을 갖습니다. 스테레오 현미경으로, 주걱과 얇은 집게의 도움으로 부드러운 슬라이딩에 의해 유리 접시에서 멤브레인 필터에 고립 된 endoderm을 전송합니다. 격리된 중습에 대해 이 절차를 반복합니다.마이크로 메스의 도움으로 조직을 혼합하여 협회를 최대화하십시오. 관련 조직을 48시간 동안 5%CO2로 37도에서 가습된 인큐베이터에 조심스럽게 배치합니다. 잠복기 후, 배양 조직을 코리오란 형 멤브레인에 접목하고 이전에 설명한 대로 장기 형성을 완료하기 위해 10 일 동안 타원형으로 개발할 수 있습니다.다음은 조류 배아 조직의 분리가 뚜렷한 실험 접근법에 사용될 수 있도록 하는 망상 적인 방법이다. 예를 들어, 인두 파우치의 형성에 관여하는 것으로 알려진 유전자의 발현은 또한 3일째에 닭의 배아로부터 두 번째, 세 번째 및 제4 인두 파우치를 포함하는 고립된 엔도름을 평가하여 시상 혼성화에서 전체적으로 산으로 평가하였다. 소닉 고슴도치의 표정은 중앙 인두의 엔도름에서 검출되고 파우치에서 제외되었으며, BMP7은 두 번째와 세 번째 인두 파우치의 엔도름에서 발현되어 중앙 인두 및 네 번째 인두 파우치에서 제외되었습니다.고립 된 조직은 또한 48 시간 동안 시험관 내에서 구체적으로 연관된 시험관, 코리오란 형 막에 이식하고, 추가 10 일 동안 개발할 수 있습니다. 식생은 종래의 히스토로지와 면역히스토화학에 의해 분석될 수 있다. 닭 소토플라 중소균을 가진 세 번째와 네 번째 인두 파우치로부터메추리 내막의 협회의 일부 대표적인 결과는 다음과 같은 이식편이 QCPN 및 닭 림프구 세포에 대해 양성 메추라기 유래 흉선 흉선 흉선 을 보였다.또한, 사이토케라틴 양성 흉부 상피는 일반적인 망상 건축을 표시하는 일반적인 형태학적 특징을 보였다. 이 비디오를 시청 한 후, 당신은 유전자 발현 연구에서 사용할 수있는 메추라기 와 닭 배아 조직을 분리하는 방법을 잘 이해해야하며 키메라 장기를 형성하면 장기 유전학의 복잡성을 해독하는 데 도움이 될 수 있습니다.

isolation-embryonic-tissues-formation-quail-chicken-chimeric-organs

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

본 논문에서 우리는 닭 배아의 중추 신경계의 여러 지역으로 인간의 줄기 세포를 이식하는 방법을 제시. 이것은을...

치킨의 배아에 인간 줄기 세포의 Xenotransplantation

이 문서는 craniofacial 개발 중에 신호 및 표면 두부 ectoderm의 patterning 속성을 테스트하도록 설계되었습니다 조직 이식 기술을 설명합니다.

Craniofacial 개발 과정 Ectodermal 상피 조직의 신호 특성을 평가

메추라기 - 병아리 키메라 배아에서 조류 신경 능선 세포의 마이 그 레이션 및 최종 운명을 분석을위한 접근 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은 unmanipulated 여자의 배아 내에 구별하기 어렵습니다 별도로 마이 그 레이션과 차별화하는 동안 신경 능선 세포를 추적하는 단순하고 간단 기법입니다.

크로스 종 이식에 의한 신경 크레스트 마이 그 레이션과 차별화 분석

이 문서에서는 두개 안면 개발에 신경 능선 및 / 또는 기타 조직의 종 특정 기여를 테스트하기 위해 설계 키메라 배아를 생성하는 방법을 설명합니다.

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이 문서에서는 소설 비켜 및 생체 외에서 실험 절차를 결합 하 여 기관 형성, 공부 클래식 메 추 라 기-치킨 키메라 시스템 업데이트 접근 합니다.

2 단계 접근-그리고 늦은-초기 조류 모델에서 기관 형성의 탐구: Thymus 및 부 갑 상선 동맥 Organogenesis 패러다임

여기, 선물이 배아 치킨 장기 성장 프로토콜을 경작 하는 organotypic 생체 외에서. 이 메서드를 사용 하 여 미 발달 닭 조직 개발 수 수 공부, 문화 환경에 통제의 고차를 유지 하면서.

Organotypic 문화 메서드 배아 치킨 조직 개발 연구를

이 기사에서는 두개안면 발달 중 기저 전뇌의 신호 전달 및 패턴 특성을 테스트하도록 설계된 조직 이식 기술에 대해 설명합니다.

얼굴 발달을 평가하기 위해 조류 전뇌 키메라 만들기

본 프로토콜은 육계 배아에서 지방 조직으로부터 지방전구세포를 단리하는 간단한 방법을 기술한다. 이 방법은 고수율, 일차 배양 및 지방전구세포의 아디포제닉 분화로 단리를 가능하게 한다. Oil Red O 염색 및 지질/DNA 염색은 분화 배지로 유도된 분리된 세포의 아디포겐 능력을 측정했습니다.

육계 병아리 배아에서 지방전구세포의 분리

여기에서는 조직 상호 작용, 4D 이미징 타임랩스 동영상(3D 플러스 타임), 분자 기능의 전역 또는 국소 섭동 및 시스템 생물학 특성화를 검사하는 데 사용할 수 있는 세 가지 유형의 조류 배아 피부 이식 배양에 대한 프로토콜을 설명합니다.

조직 패터닝 및 유기 형성을 연구하기 위해 조류 피부 이식물을 사용합니다.

Microarray 기술은 게놈 전체에 기초를 둔 transcripts의 정량적 측정 및 유전자 발현 프로파일링을 가능하게 합니다. 따라서 이 프로토콜은 적은 양의 총 RNA를 사용할 수 있는 타당성을 입증하기 위해 Day 7 소 배아를 사용하여 2색 맞춤형 소 어레이에서 최적화된 기술 절차를 제공합니다.

의 사체 프로파일 링 생체 제작 소 착상 전 배아

배우세요 메추라기와 닭 배아 조직을 분리하는 최적화된 방법을 통해 유전자 발현 연구와 기능 분석을 수행하는 기술입니다. 이 방법은 발생 생물학 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

배아 조직과 Thymus 예제를 사용 하는 메 추 라 기-닭고기 공상 기관의 형성의 절연

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