Name: 심장 세포 치료를 위한 줄기 세포 DNA 무결성을 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 배우세요 심장 세포 치료용 줄기 세포의 DNA 무결성 평가 방법을. 코메트 분석과 감마-H2AX 면역표지 기법을 활용하여 세포 품질을 검증하고 재생 의학 연구의 성공률을 높입니다.

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이 작품은 국가 심 혼, 폐, 혈액 연구소 보조금 RO1-HL-99507에 의해 부분적으로 지원 HL-114120, HL-131017, HL138023, 및 UO1-HL-134764 (하 제이 장)와 미국 심장 협회 과학적인 개발 그랜트 17SDG33670677 (R. Kannappan)에 의해.

1. 혜성 분석 결과
<ol><li>
시 약 준비
	<ol>
<li>낮은 용 해 점 agarose 낮은 녹는 agarose의 500 mg 100 ml의 DNA-장소/물 RNA-무료. agarose를 녹이 고 때까지 전자 레인지에서 병을 열. 37 ° C 물 목욕까지 필요에 병을 배치 합니다. 참고: 추가 읽기를 위해 Azqueta 그 외 여러분, DNA 해제 시간 및 여러 전기 요소23agarose 농도의 영향을 공부한 참조.</li>
		<li>재고 염료 솔루션 작업 x 1를 1:10,000 비에 트리 스-EDTA (테) 버퍼에 SYBR 녹색 DNA 염료 희석. 이 염료는 빛에 민감한, 그래서 어두운 장소에 보관.</li>
		<li>세포 세포의 용 해 버퍼에 대 한 분해 세포의 용 해 버퍼의 100 mL (2.5 M NaCl, 0.1 m M EDTA, 10 mM Tris, 1% 트라이 톤 X-100) 이온을 제거 된 물 (디 H2O). 그런 다음, 추가 10 M NaOH pH 10.0 조정. 4 ° c.에 버퍼를 냉각</li>
		<li>알칼리 성 DNA-해제/전기 실행 버퍼에 대 한 해산 디 H2o. 쿨 4 ° c 버퍼에에서 알칼리 성 해결책 (0.3 M NaOH, 1 mM EDTA) 1 리터 PH를 확인 > 13.</li>
		<li>도장된 혜성 슬라이드 유리 슬라이드에 0.5 %agarose 몇 방울을 놓습니다. 즉시, 다른 슬라이드의 평평한 표면에 사용 하 여, agarose 코팅의 얇은 층을 형성 하는 agarose 확산. 참고: 사용 하기 전에 슬라이드를 건조.</li>
		<li>IPS 세포 배양에 대 한 간단히 문화 iPS 세포 지하실 막 매트릭스 코팅 ( 재료의 표참조) 문화 접시 mTESR1 문화 매체에 confluency에이 때까지. 참고: 인간 심장 섬유 아 세포 파생 iPS 세포는이 프로토콜에 사용 되었다. 프로그래밍의 iPS 세포 파생 문화 우리 연구 그룹12,13,21에서 최근 기사에 설명 되어 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
샘플 준비
	<ol>
<li>문화 매체를 삭제 하 고 셀을 씻어. 해리 초연 솔루션을 사용 하 여 셀 ( 재료의 표참조). 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 셀 펠 릿을 세척 하 고 resuspend 1 x 105 셀/mL에 PBS에 셀.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
샘플 슬라이드 준비 참고: 자외선 빛 유도 하는 세포의 손상을 방지 하려면 낮은 조명 조건에서 다음 단계를 수행 합니다.<ol>
<li>세포 현 탁 액 및 agarose 솔루션의 90 μ의 믹스 10 μ (1시 10분 비율) 튜브에서. 장소는 37 ° C 물 목욕에서 튜브는 agarose 응고 하지 않도록.</li>
		<li>공기 방울을 소개 하지 않고 솔루션을 혼합 하 고 플라스틱 도장된 혜성 슬라이드에 70 μ/자리. 피 펫 팁을 사용 하 여 얇은 레이어를 셀 agarose 혼합 확산. 15 분 동안 4 ° C에 슬라이드를 놓습니다.</li>
		<li>컨테이너에 완전히 찬 세포의 용 해 버퍼에 슬라이드 잠수함. 1 시간에 4 ° C에서 어둠 속에서 컨테이너를 놓습니다.</li>
		<li>냉 알칼리 성 해결책에 세포의 용 해 버퍼를 바꿉니다. 슬라이드는 완전히 빠져들 다는 것을 확인 하십시오. 30 분 동안 4 ° C에서 어둠 속에서 컨테이너를 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
전기 이동 법
	<ol>
<li>수평 전기 탱크에 슬라이드를 놓습니다. 슬라이드는 완전히 빠져들 때까지 차가운 알칼리 성 전기 이동 법 버퍼 탱크를 채우십시오. 15 ~ 30 분 1 V/cm에 전압을 적용 합니다. 참고: 총 전압 = x 1 V 전극 사이의 거리</li>
		<li>컨테이너에 완전히 찬 디 H2o. 슬라이드 잠수함 2 분 후 디 h 조2O를 제거 하 고 신선한 디 H2o. 반복이이 단계를 추가 합니다.</li>
		<li>찬 70% 에탄올과 디 h 조2O를 교체 합니다. 부드럽게 5 분을 기다려 제거 슬라이드, 기울기, 없고 그것은 건조.</li>
		<li>건조 되 면, 각 자리를 희석된 DNA 염료의 100 μ를 추가 합니다. 실 온에서 15 분을 기다립니다. FITC 필터를 사용 하 여 epifluorescence 현미경에서, 샘플 당 총에서 50 ~ 100 혜성의 이미지를 가져가 라.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
이미지 분석 및 결과의 계산
	<ol>
<li>혜성, 점수는 국립 보건원의 (NIH) 사용 하 여 혜성 분석 결과 플러그인 ImageJ (ImageJ 여기 다운로드: https://imagej.nih.gov/ij/download.html; 여기 플러그인 다운로드: https://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/comet-assay/). 참고: 플러그인 분석을 수행 하기 위해 모든 세부 정보를 포함 하는 PDF 명령을 함께 제공 됩니다. 또한, 혜성 분석의 스크린샷은 그림 2A-C에 표시 됩니다. 제어 및 독 소 루비 (Doxo)의 대표적인 혜성 이미지-대우 iPS 세포 및 혜성의 정량화 그림 3A-C에 나와 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. DNA 손상 응답
<ol><li>샘플 및 시 약 준비
	<ol>
<li>IPS CM 세포 배양에 대 한 문화 iPS-CM 세포 지하실 막 매트릭스 코팅 ( 재료의 표참조)에 confluency에이 때까지 B-27 (CMM) 보충 RPMI 매체에 문화 접시. 참고: 인간 iPS 세포 유래 cardiomyocytes은이 프로토콜에서 사용 되었다. Cardiomyocytes에 iPS 세포 분화에 대 한 프로토콜은 우리의 연구 그룹12,13,21에서 최근 기사에서 찾을 수 있습니다.</li>
		<li>IPS-CMs 챔버 슬라이드에 씨앗<ol>
<li>IPS-CM 우물에서 문화 매체를 버리십시오. 3 회 PBS로 세포 세척.</li>
			<li>잘 당 0.25 %trypsin 1 mL을 추가 하 고 37 ° C 5 분 표 셀 분리에 대 한 현미경 접시에서 품 어. CMM는 트립 신을 막으려고의 1 mL를 추가 합니다.</li>
			<li>15 mL 튜브와 4 ° C와 200 x g에 5 분 동안 원심 분리기에 세포 현 탁 액을 배치 합니다. 매체를 폐기, CMM의 1 mL를 추가 하 고 셀을 resuspend. 셀을 계산 하 고 20 x 105 셀 CMM의 1.6 mL를 셀 수를 조정 합니다.</li>
			<li>씨 8 잘 챔버의 당 세포 현 탁 액의 200 µ L 슬라이드 ( 재료의 표참조). 부드럽게 잘 주위 세포를 확산 하 고 37 ° c.에 품 어 슬라이드를 누릅니다</li>
		</ol>
</li>
		<li>IPS-CM 독 소 루비 치료에 대 한 Ip CM 우물에서 문화 매체를 삭제 합니다. PBS로 세포 세척. 1 μ M 독 소 루비 셀 치료 4 헤 대 한 CMM 매체를 발음 하 고 PBS로 세포 세척.</li>
		<li>블로킹 버퍼에 대 한 준비 10 mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 솔루션 3 %BSA 및 0.05%의 트라이 톤 X-100. 블로킹 버퍼의 10 mL를 준비 하려면 준비 BSA 솔루션의 9 mL를 정상 당나귀 혈 청 1 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>1 차적인 항 체 솔루션에 대 한 안티 토끼 인 히스톤 H2A의 1 μ를 추가 합니다. 블로킹 버퍼의 200 μ 항 체 (Ser139) X.</li>
		<li>이차 항 체 믹스에 대 한 블로킹 버퍼의 200 μ에 형광 색소 활용 된 항 토끼 이차 항 체, DAPI, 및 형광 색소 활용 된 phalloidin의 각 1 μ를 추가 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunolabeling
	<ol>
<li>3 회 PBS로 세포 세척 하 고 각 우물에 갓된 4 %paraformaldehyde (PFA)의 200 μ를 추가. 실 온에서 어둠 속에서 20 분에 대 한 셀을 수정 합니다. PBS로 세포 세척.</li>
		<li>PBS를 제거 하 고 실내 온도에 습도 챔버에 잘와 30 분에 대 한 블록 당 블로킹 버퍼의 200 μ를 추가. 블로킹 버퍼를 제거 하 고 기본 항 체 솔루션의 200 μ를 추가 합니다. 실내 온도, 습도 챔버에 45 분 동안 품 어. 다음, 세 번 PBS와 웰 스 워시.</li>
		<li>PBS를 제거 하 고 이차 항 체 혼합의 200 μ를 추가. 실내 온도, 습도 챔버에 45 분 동안 품 어. 다음, 세 번 PBS와 웰 스 워시. Antifade와 함께 그들을 장착 하기 전에 디 H2O 세척. coverglass 놓고 4 ° c.에 어둠 속에서 슬라이드 저장</li>
		<li>Epifluorescence 현미경을 사용 하 여, 샘플 당 임의의 필드의 3-5 이미지 그림 4A와 같이 고 이미지 분석을 진행.</li>
	</ol></li>
	<li>DDR foci의 계산
	<ol>
<li>다운로드 및 설치 CellProfiler24 (http://cellprofiler.org).</li>
		<li>
참고: 이 연구에서 처리 하는 이미지는 CellProfiler 버전 2.1.1 사용 하 여 수행 되었다. 사용 된 CellProfiler에 대 한 자습서는 다른 곳에서 찾을 수 있습니다 (https://www.youtube.com/watch?v=PvhRL9xpduk & 목록 = PL7CC87670239B4D10). CellProfiler의 최신 버전은 사용 되는 경우 파이프라인 부 적응이 필요할 수 있습니다.</li>
		<li>파이프라인 punctae_gH2AX.cpipe를 다운로드 합니다. 선택 파일 > 가져오기 > 파이프라인 파일에서 punctae_gH2AX.cpipe를 선택 하 고.</li>
		<li>분석 (그림 5A)에 대 한 입력 모듈/이미지 섹션에서 파일 목록 창에 γH2A.X foci의 인수 이미지가 포함 된 폴더 끌어서 놓습니다. 그림 5A-L와 같이 그런 다음 지침을 따르십시오.</li>
		<li>이미지에 대 한 다음 매개 변수를 설정:<ol>
<li>분석을 위해 원하는 이미지 파일 목록끌어다 놓습니다. 입력 모듈에서 이미지 를 선택 합니다 ( 그림 5A 모듈 설정 참조). 입력 모듈에서 메타 데이터 를 선택 합니다 ( 그림 5B 모듈 설정 참조). 입력 모듈에서 NamesAndTypes 를 선택 합니다 ( 그림 5C 모듈 설정 참조).</li>
			<li>그룹선택 없음. 분석 모듈에서 ColorToGray 를 선택 합니다 ( 그림 5D 모듈 설정 참조).</li>
		</ol>
</li>
		<li>분석 모듈에서 선택 부드러운 ( 그림 5E 모듈 설정 참조). 참고: 이 값은 이미지 해상도 따라 최적화 할 수 있습니다.</li>
		<li>분석 모듈에서 IdentifyPrimaryObjects 를 선택 합니다 ( 그림 5 층 모듈 설정 참조). 참고: 이 값을 전체 핵 선택 되어 있는지 확인 최적화. 이 단계 후 컴퓨터 지연 될 수 있습니다.</li>
		<li>분석 모듈에서 선택 부드러운 ( 그림 5G 모듈 설정 참조). 참고: 이 값은 이미지 해상도 따라 최적화 할 수 있습니다.</li>
		<li>분석 모듈에서 EnhanceOrSuppressFeatures 를 선택 합니다 ( 그림 5 H 모듈 설정 참조).</li>
		<li>분석 모듈에서 IdentifyPrimaryObjects 를 선택 합니다 ( 그림 5I 모듈 설정 참조). 참고: 이 값은 punctae가 선택 되어 있는지 확인을 최적화 합니다. 이 단계 후 컴퓨터는 다시 지연 될 수 있습니다.<ol>
<li>분석 모듈에서 RelateObjects 를 선택 합니다 ( 그림 5J 모듈 설정 참조). 분석 모듈에서 ClassifyObjects 를 선택 합니다 ( 그림 5 K 모듈 설정 참조). 분석 모듈에서 ExportToSpreadsheet 를 선택 합니다 ( 그림 5 L 모듈 설정 참조).</li>
			<li>이미지 분석을 수행 하려면 하단 왼쪽된 패널에서 이미지 분석 을 클릭 합니다. 분석의 성공적인 완료에 여러 이미지 생성 됩니다 (그림 6A-F). 참고: 사용자는 미래의 참고를 위해이 이미지를 저장 해야 합니다.</li>
			<li>생성 되 고 컴퓨터에 적절 한 위치에 저장 하는 추가 분석을 위해 정량 데이터를 포함 하는.csv 파일 note MyExpt_Image라는 스프레드시트에서 열 B와 D는 각각 5와 더 많은 punctae에는 핵의 수가 있을 것 이다. 핵의 총 수를 B 및 D 열을 추가 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>단계 2.3.3-2.3.8 (모든 분석 하기 전에 MyExpt_ 파일 이름 변경) 모든 이미지를 반복 합니다. 그림 4C와 같이 DNA 무결성을 평가 하기 위한 음모를 만들 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Bolli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+stem+cells+in+patients+with+ischaemic+cardiomyopathy+%28SCIPIO%29%3A+initial+results+of+a+randomised+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).</li>
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<li>Cottage, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+progenitor+cell+cycling+stimulated+by+pim-1+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac progenitor cell cycling stimulated by pim-1 kinase.</a> Circulation Research. 106 (5), 891-901 (2010).</li>
<li>Angert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+the+injured+adult+heart+involves+new+myocytes+potentially+derived+from+resident+cardiac+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Repair of the injured adult heart involves new myocytes potentially derived from resident cardiac stem cells.</a> Circulation Research. 108 (10), 1226-1237 (2011).</li>
<li>Kannappan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+Modulates+the+Fate+of+Cardiac+Progenitor+Cells+Ex+vivo+and+in+the+Diabetic+Heart+In+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">p53 Modulates the Fate of Cardiac Progenitor Cells Ex vivo and in the Diabetic Heart In vivo.</a> EBioMedicine. 16, 224-237 (2017).</li>
<li>Hatzistergos, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+stimulate+cardiac+stem+cell+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Bone marrow mesenchymal stem cells stimulate cardiac stem cell proliferation and differentiation.</a> Circulation Research. 107 (7), 913-922 (2010).</li>
<li>Okita, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: opportunities and challenges.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1575), 2198-2207 (2011).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).</li>
<li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+repair+in+a+porcine+model+of+acute+myocardial+infarction+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

DNA 무결성을 셀 무결성을 그렸다. 손상된 DNA와 세포 스트레스에 자주 하 고 결국 그들의 완전성을 잃고. 줄기와 줄기 세포 유래 세포 이식 목적으로 전파 되 고 되는 그들의 원하는 기능을 수행 하는 셀에 대 한 주은. 손상된 DNA와 세포 이식 셀8,20의 성능과 가난한 engraftment 속도 발생할 것 이다. 따라서, 세포 이식 전에 DNA 무결성 검사는 필요한 품질 관리 프로토콜입니다. 여기 우리 두 비용 효과적인 접근 방식, 즉는 혜성 분석 결과 및 γH2A.X 면역 형광 라벨, DNA 손상 및 줄기와 줄기 세포 유래 세포의 품질 평가를 설명 합니다.
세포 노화의 주요 원인 세포에서 DNA 손상의 축적 생각. 혜성 분석 결과 사용 하 여, 알 베이커 그 외 여러분 분석22젊고 노화 인간 피부 섬유 아 세포 DNA 손상....

실험 및 임상 증거 세포 이식 적당히 마음1,2,,34,5 실패의 좌 심 실 수축 성능을 향상 시킬 수 보여줍니다. ,6,7,,89. 최근 진보 심혈 관 재생;에 대 한 기회를 더 매력적인 연 이러한 체세포 pluripotency 유도 다른 심장 계보, 중요 한 것은 cardiomyocyte (CM)10, 으로이 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)를 구분 하기에 재활 요인의 강제 식 포함 11 , 12 , 13. 인위적으로 생성 된 Ipsc, iPSC 파생 CM (iPS-CM)를 포함 하 여 모든 세포에서 유전 물질은 DNA. DNA에 저장 된 유전 지시 지시 성장, 개발 및 셀, 조직, 장기, 그리고 유기 체 기능. DNA는 불활성; 세포 대사 산물, 반응성 산소, 생성, 질소 종 등 하 고 에이전트 alkylating 손상 될 수 있습니다 원인 DNA 생체 외에서 그리고 vivo에서14,15,,1617. 중요 한 것은, DNA 손상 중요 한 주파수를 가진 모든 셀에 직관적으로 발생합니다. 경우 이러한 손해는 해결 되지 않으면, 그것은 DNA 돌연변이, 세포 노화, DNA와 세포 무결성, 그리고 아마도, 질병, 생명을 위협 하는 암 등의 손실 이어질 것입니다. 따라서, DNA 무결성 유지 특히 Ipsc, 병원에서 엄청난 잠재력을 가진 어떤 셀에 필수적 이다.
수량 및 고립 된 게놈 DNA의 무결성을 평가, 고가의 장비 시장에 유효 하다. 그러나, 셀을 분리 하지 않고 셀에 DNA 무결성을 평가 하기 위해 아무 간단 하 고 비용 효율적인 방법이 있다. 또한, DNA 분리 하는 동안 DNA 저하 사용자 유도 이러한 메서드를 사용 하 여 주요 단점 중 하나입니다. 단일 셀 젤 전기 이동 법 (혜성 분석 결과 라고도 함)18,19 와 γH2A.X immunolabeling8 기술 연구 실험실에서 DNA 손상 평가 대 한 근본적인 접근 있습니다. 이러한 두 가지 방법 고가의 장비 또는 DNA 무결성8,,2021분석 하 고립 된 게놈 DNA를 필요 하지 않습니다. 이후, 이러한 기술은 전체 셀; 수행 되었습니다. 샘플 준비 하는 동안 사용자 유도 DNA/RNA/단백질 저하는 이러한 프로토콜에 영향을 미치지 않습니다. 여기, DNA 손상 및 줄기와 줄기 세포 유래 세포에서 DNA 손상 응답 평가, 우리 혜성 분석 결과 및 γH2A.X immunolabeling를 모두 수행 하는 단계별 프로토콜을 제공 합니다. 또한, 결합이 두 가지 방법, 제안 한다 순진한 평가 이식에 대 한 셀의 적합성을 평가 하는 데 사용할 수 있습니다.
혜성 분석 결과, 또는 단일 셀 젤 전기 이동 법, 세포에서 DNA 나누기를 측정 한다. 낮은 녹는 agarose에 포함 된 셀은 supercoiled DNA를 포함 하는 양식 nucleoids을 lysed. 전기 이동 법, 그들의 거 대 한 크기와 매트릭스 단백질 그들의 활용 그대로 DNA 제한 마이그레이션 갖습니다 반면 agarose 숨 구멍을 통해 작은 조각 조각난된 DNA와 깨진된 DNA 가닥의 마이그레이션합니다. 형광 현미경으로 얼룩진된 DNA의 패턴은 혜성을 모방합니다. 그대로 DNA를 포함 하는 혜성 머리와 꼬리 조각의 구성 및 고장 DNA 가닥. DNA 손상의 분수는 그대로 DNA (혜성 머리) 강도 기준으로 손상 된 DNA (혜성 꼬리)의 형광 강도 의해 측정할 수 있습니다. 그림 1과 같이 매개 변수 꼬리 순간을 계산할 수 있습니다.
DNA 손상 히스톤 H2A의 인 산화를 유도 한다. ATM, ATR, 및 DNA-PK kinases 여 Ser139에서 (γH2A.X) X. 인 산화 그리고 H2A의 모집입니다. DNA 가닥 나누기에서 X DNA 손상 응답 (DDR) 이라고 하 고 DNA 손상 후 급속 하 게 일어난다. 이 과정, 세포 주기 검문소 중재 체포 및 DNA 복구 프로세스가 시작 됩니다. DNA 수리 완료 후 γH2A.X dephosphorylated 이며 가수분해에 의해 비활성화. 연장 하 고 여러 개의 DNA 가닥 나누기 DNA에 γH2A.X foci의 축적으로 이어질. 이 DNA 손상 및 DNA 무결성의 손실 복구 하 셀의 무 능력을 나타냅니다. 이러한 γH2A.X foci DNA에 의해 확인 될 수 있다 그리고 2 절에서 프로토콜을 사용 하 여 DDR foci의 수를 계산 하실 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>0.25% 트립신</td><td>코닝</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>8웰 챔버 슬라이드</td><td>밀리셀</td><td>PEZGS0816</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7920</td><td>세포 분리 솔루션</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson Immuno Research Laboratories</td><td>711-545-152 (RRID: AB_2313584)</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마-알드리치</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure 당나귀 안티 래빗 IgG</td><td>잭슨 면역 연구소</td><td>711-165-152 (RRID:AB_2307443)</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>시그마-알드리치</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>Gibco B-27 보충제, 무혈청,</td> <td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel 성장 인자 감소</td><td>코닝</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>스템셀 기술</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>팔로이딘A488</td><td>라이프 테크놀로지</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>포스포-히스톤 H2A. X (Ser139) 항체</td><td>세포 신호 기술</td><td>2577 (RRID: AB_2118010)</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>SYBR&nbsp; 녹색 I 핵산 젤 얼룩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9430</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 저융점 Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>Antifade</td></tr></tbody></table>

심장 세포 치료를 위한 줄기 세포 dna 무결성을 평가

Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy

줄기 줄기 세포 유래 세포는 다양 한 퇴행 성 질환 재생 치료로 서 엄청난 잠재력이 있다. DNA는 줄기 세포를 포함 하 여 모든 셀에서 유전 정보의 창 고입니다 그리고 그것의 무결성은 재생 능력에 기본적 이다. 줄기 세포가 식 위한 필요한 수를 달성 하기 위해 실험실에서 급속 한 전파를 받 다. 빠른된 세포 성장 반응 산소, 생성, 에이전트 alkylating 등 축적 된 대사 산물에 의해 DNA 무결성의 손실에 지도 한다. 이 세포를 이식 가난한 engraftment 및 악화 장기의 재생 발생할 것 이다. 또한, 돌연변이, DNA 불안정, 세포 노화, DNA 손상 세포 리드를 이식 하 고 가능 하 게, 생명이 암 같은 질병. 따라서,이 식 위한 세포의 적합성을 평가 하는 품질 관리 방법에 대 한 즉각적인 필요가 있다. 여기, 우리는 이전에 세포 이식 줄기 세포의 DNA 무결성의 평가 대 한 단계별 프로토콜을 제공합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포를 배양 하 고 DNA 무결성의 측정으로 사용 되었다, DNA 손상 및 꼬리 순간 혜성 분석 결과 의해 분석 되었다. iPS 세포는 낮은 녹는 점 agarose에 포함 되었고 유리 슬라이드에 배치. 셀, 다음, 세포의 용 해 버퍼, 이어서 supercoiled DNA를 알칼리 성 해결책으로 취급 됩니다. Nucleoids electrophoresed 했다 고 혜성 DNA 염료 (그림 1A-D)에 의해 시각화 했다. 혜성, 혜성 분석 결과 플러그인 (그림 2A-C)를 사용 하 여 ImageJ로 분석 되었다.
인간 iPS 세포 Doxo DNA 손상을 유도 하 고 긍정적인 컨트롤...

여기, 우리 세포 이식 전에 줄기 세포에서 DNA 무결성의 평가의 분석 실험 설정에 대 한 자세한 설명을 제공합니다.

심장 세포 치료를 위한 줄기 세포 DNA 무결성을 평가

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data ...

심근병증과 같은 신생아 질환의 경우, 유도된 만능 줄기 세포 유래 세포를 이용한 재생 요법은 엄청난 잠재력을 갖는다. 그러나, 체외 가속 세포 성장은 반응성 산소 종과 같은 축적된 대사산물에 의한 DNA 손상으로 이어집니다. 이 DNA 손상한 세포를 이식하는 것은 기관의 나쁜 이식 및 재생 귀착될 것입니다.이식하기 전에 세포의 품질을 평가해야합니다. 여기서 우리는 줄기 세포의 DNA 손상을 평가하기 위하여 2개의 단계별 프로토콜을 제공합니다. 절차를 시연하는 것은 제시카 밀러, 연구원, 니킬 마르데카르, 연구원, 바산티 라자세카란, 실험실 기술자가 될 것입니다.먼저, DNA-RNA 프리 워터 100 밀리리터에 500밀리그램의 저용 아가로즈를 배치하십시오. 아가로즈가 녹을 때까지 전자 레인지에 병을 가열합니다. 그런 다음 병은 필요할 때까지 섭씨 37도의 수조에 놓습니다.미리 코팅된 혜성 슬라이드를 준비하려면 유리 슬라이드에 0.5% 아가로즈 몇 방울을 놓습니다. 즉시 아가로즈를 확산하여 커버슬립을 사용하여 아가로즈 코팅의 얇은 층을 형성한다. 자외선으로 인한 세포 손상을 피하기 위해 저조도 조건에서 작업하고, 10 마이크로리터의 세포 현탁액과 90 마이크로리터의 아가로즈 용액을 튜브에 혼합합니다.아가로즈가 고화되는 것을 방지하기 위해 튜브를 섭씨 37도 의 수조에 놓습니다. 기포를 도입하지 않고 솔루션을 혼합하고, 피펫 70 마이크로리터는 미리 코팅된 혜성 슬라이드에 자리한 자리당 70마이크로리터를 제공합니다. 파이펫 팁을 사용하여 세포 아가로즈 혼합물을 확산하여 얇은 층을 형성합니다.슬라이드를 섭씨 4도에 15분간 놓습니다. 용기에 차가운 리시스 버퍼에 슬라이드를 완전히 잠급합니다. 용기를 1시간 동안 섭씨 4도에 어둠 안에 놓습니다.용해 버퍼를 차가운 알칼리성 솔루션으로 교체합니다. 슬라이드가 완전히 잠겨 있는지 확인합니다. 또 다른 30 분 동안 4섭씨에서 어둠 속에서 컨테이너를 떠난 후, 수평 전기 전도 탱크에 슬라이드를 배치합니다.슬라이드가 완전히 잠기면 탱크를 차가운 알칼리성 전기 포충제 버퍼로 채웁니다. 15~30분 동안 1볼트의 전압을 1센티미터로 바에 바치면 됩니다. 용기에 차가운 탈이온 물에 슬라이드를 완전히 잠급합니다.2분 후, 탈이온된 물을 제거하고 신선한 탈이온수를 추가한 다음 이 단계를 두 번째로 반복합니다. 다음으로, 탈이온수를 차가운 70%에탄올로 바꿉다. 5분 후, 슬라이드를 기울이지 않고 부드럽게 제거하고 공기를 건조하게 합니다.일단 건조되면, 각 지점에 희석 된 DNA 염료 100 마이크로 리터를 추가하고 실온에서 15 분을 기다립니다. 피플루오렌스 현미경에서 FITC 필터를 사용하여 샘플 당 총 50~100개의 혜성 이미지를 가져가십시오. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 문화 iPS 유래 심근세포.챔버 슬라이드에서 iPS 유래 심근세포를 보려면 먼저 우물에서 배양 배지를 버리고 PBS로 세포를 세 번 세척하십시오. 잘 하면 0.25%의 1밀리리터를 추가하고 5분간 섭씨 37도에서 배양합니다. 세포 분리를 위해 현미경의 밑에 접시를 확인하십시오.그런 다음 트립신을 중지 CMM의 1 밀리리터를 추가합니다. 세포 현탁액을 섭씨 4도에서 5분간 원심분리기와 원심분리기에 200배나 배치합니다. 매체를 폐기하고 CMM의 밀리리터 1밀리리터를 추가하고 셀을 다시 일시 중지합니다.세포를 계산하고 CMM의 1.6 밀리리터에서 2백만 개의 세포를 얻기 위해 세포 수를 조정합니다. 이제 8웰 챔버 슬라이드의 웰 당 셀 서스펜션의 200 마이크로 리터를 시드. 슬라이드를 부드럽게 눌러 셀을 우물 주위에 분산시다.섭씨 37도에서 세포를 배양합니다. iPS 유래 심근세포 독소루비신 치료의 경우, iPS 유래 심근세포 유정으로부터 배양 배지를 버리고 PBS로 세포를 세척한다. 섭씨 37도에서 4시간 동안 1마이크로몰러 독소비신으로 세포를 치료하십시오.매체를 흡인하고 PBS로 세포를 씻으세요. 면역 라벨링을 수행하려면 PBS로 세포를 세 번 씻고 새로 준비된 4% 파라포름알데히드 200마이크로리터를 각 웰에 추가합니다. 실온에서 어둠 속에서 20 분 동안 셀을 고정합니다.PBS로 세포를 세척한 후, 우물당 200마이크로리터의 블로킹 버퍼를 추가하고 실온에서 가습 챔버에서 30분 동안 차단합니다. 차단 버퍼를 제거하고 1 차 항체 용액의 200 마이크로 리터를 추가합니다. 실온에서 어두운 가습 챔버에서 45 분 동안 배양 한 후 PBS로 우물을 세 번 씻으시다.PBS를 제거하고 이차 항체 믹스의 200 마이크로 리터를 추가합니다. 실온에서 어두운 가습 챔버에서 45 분 동안 배양하십시오. 그런 다음 PBS로 우물을 세 번 씻으시면 됩니다.페이드 페이드로 슬라이드를 장착하기 전에 탈이온물로 씻으십시오. 커버 글래스를 놓고 슬라이드를 섭씨 4도에 어둠 속에서 보관합니다. 공초점 현미경을 사용하여 샘플 당 무작위 필드의 3 ~ 5 개의 이미지를 가지고 이미지 분석을 진행합니다.DNA 손상 응답 포시를 계산하려면 CellProfiler를 다운로드하고 설치하십시오. 파일, 가져오기, 파이프라인을 선택하고 puncti 감마-H2AX라는 파이프라인 파일을 선택합니다. 감마-H2AX 초점의 획득된 이미지가 포함된 폴더를 분석을 위해 입력 모듈 이미지 섹션의 파일 목록 창에 드래그 앤 드롭합니다.그런 다음 텍스트 프로토콜에 표시된 대로 지침을 따릅니다. 이미지에 대한 매개 변수를 설정하려면 분석을 위해 원하는 이미지를 파일 목록에 드래그합니다. 입력 모듈에서 이미지를 선택합니다.또한 입력 모듈에서 메타데이터를 선택한 다음 이름과 유형을 선택합니다. 그룹의 경우 아니요를 선택합니다. 분석 모듈에서 작업할 경우 색상을 회색으로 선택합니다.그런 다음 매끄러운 선택을 선택하고 기본 개체를 식별하고 다시 원활하게 선택합니다. 그런 다음 피쳐를 향상시키거나 억제한 다음 기본 개체 식별을 선택합니다. 여전히 분석 모듈에서 작업하고 관련 개체를 선택한 다음 개체를 분류한 다음 마지막으로 스프레드시트로 내보내기를 선택합니다.왼쪽 아래 패널의 이미지를 분석하여 이미지 분석을 수행합니다. 분석이 성공적으로 완료되면 여러 이미지가 생성됩니다. 생성되어 컴퓨터의 적절한 위치에 저장되는 CSV 파일을 확인합니다.이 파일에는 추가 분석을 위한 정량적 데이터가 포함되어 있습니다. 내 실험 이미지라고 하는 스프레드시트에서, 열 B는 최대 5개의 펑크를 갖는 핵의 수를 가지며, 열 D는 5개 이상의 펑크를 갖는 핵의 수를 가질 것이다. 컬럼 B와 D를 추가하여 총 핵 수를 가져옵니다.모든 이미지에 대해 다음 단계를 반복하여 모든 분석 전에 내 실험 파일 이름을 변경합니다. 독소 처리 및 비처리 iPS 세포에서 혜성의 대표적인 현미경 표는 여기에서 도시된다. DNA 손상의 기저 양은 IPS 세포에서 발견되었으며, DNA 손상및 꼬리 모멘절의 일부로 표현되었습니다.그러나, 독소 치료는 예상대로 iPS 세포에서 DNA 손상을 증가시켰으며, 혜성 분석체가 다능성 줄기 세포에서 DNA 무결성을 평가하는 데 사용될 수 있음을 나타낸다. 감마-H2AX 면역 라벨링의 대표적인 현미경 사진은 낮은 배율과 더 높은 배율로 여기에 표시됩니다. 대조군 iPS 유래 심근세포에서, 세포의 90% 이상이 핵당 5개 미만의 DDR 포시를 가졌다.그리고 세포의 10% 미만의 총 핵 당 6 개 이상의 DDR foci했다. 6개월 동안 배양된 iPS 유래 심근세포의 경우, 세포의 90% 미만은 핵당 최대 5개의 DDR 포시를 가지고 있었으며, 세포의 총 13% 이상이 핵당 6개 이상의 DDR foci를 가졌다. 독소 처리된 iPS 유래 심근세포에서 반면, 세포의 80% 미만은 핵당 최대 5개의 DDR foci를 가졌다.그리고 세포의 대략 24%의 총에는 핵 당 6개 이상의 DDR foci가 있었습니다. 이 데이터는 장기간 iPS 유래 심근 세포 배양 및 독소 처리가 중요한 DNA 손상을 유도한다는 것을 나타내지 않으며, 세포 이식에 적합하지 않습니다. 이 전기 포에 영향을 미칠 수 있기 때문에 세포 현탁액을 혼합하는 동안 변수를 피하는 것이 매우 중요합니다.이 절차에 따라, 당신은 혜성 분석 및 다양한 유형의 세포와 면역 라벨링 절차를 수행 할 수 있습니다. 이 기술은 세포 이식 연구 결과에서 이용되기 전에 각종 종류의 세포가 DNA 손상을 위해 평가될 수 있게 할 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

심장 핵​​은 밀도 침강 통해 격리 및 유동세포계측법 의해 cardiomyocyte 핵 파악하고 정렬하는 pericentriolar 소재 1 (PCM-1)에 대한 항체로 immunolabeled있다.

사후 조직에서 Cardiomyocyte 핵의 분리

여기서 우리는 LACI 유전자 변형 마우스 모델을 사용하여 정제 조혈 세포의 작은 숫자에 대한 생체 내 돌연변이 분석에 대해 설명합니다. LACI 유전자는 DNA의 돌연변이의 빈도, 위치 및 유형 자발적으로 일어 나 genotoxins에 노출 된 후를 결정하기 위해 분리 할 수있다.

정제 된 조혈 줄기 / 전구 세포에 DNA 돌연변이를 확인

이 기사는 효율적으로 선택적으로 참조 마커의 분석은 인구의 동질성과 정체성을 평가하기 위해 유동 세포 계측법 다음에 대한 Wnt 경로를 변조하여 심근에 인간 만능 줄기 세포를 구별하는 자세한 방법을 설명합니다.

유동 세포 계측법에 의한 고효율 심근에 인간 다 능성 줄기 세포의 분화 및 특성

심근세포 회전율의 정량화는 어렵습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 신심근세포 핵 생성 및 핵 ploidy의 정확하고 민감한 정량화를 가능하게 함으로써 이러한 과제에 중요한 기여를 합니다.

심근 DNA 합성 및 배수성의 동시 평가 : Method는 심근 재생 및 회전율의 정량을 지원합니다

우리는 심근 세포, 내피 세포, 평활근 세포 및 패치 - 매개 사이토 카인 배달 세포 주입을 조합함으로써 이식 된 세포의 생착을 향상 배송 방법으로 인간 유도 만능 줄기 세포를 구별하기위한 세 가지 신규하고보다 효율적인 프로토콜을 제안한다.

다 능성 줄기 세포는 심근 수리를위한 심장 세포를 유도

이 원고는 Gata4, Hand2, Mef2c 및 Tbx5의 레트로바이러스 매개 전달을 사용하여 다양한 재프로그래밍된 심장 아형의 생성 및 정량화를 위한 단계별 프로토콜을 설명합니다.

마우스 배아 섬유 아 세포의 전사 인자 매개 재 프로그래밍에 따라 심근 서브 타입을 평가

여기, 우리는 기능, 계약, cardiomyocyte 같은 세포를 생성 하기 위해서는 인간 중간 엽 줄기 세포의 젊은 소스의 심장 감 별 법 잠재력을 효율적으로 활용 하는 방법을 제시 생체 외에서.

생체 외에서 기능 Cardiomyocyte-같은 세포로 인간 중간 엽 줄기 세포의 분화

이 글의 전반적인 목표, 특성화, 고립과 성인 마우스 심장에서 심장 줄기 세포 (CSCs)의 분화에 대 한 프로토콜을 표준화 하입니다. 여기, 우리가 murine CSCs 분리 밀도 그라데이션 원심 분리 방법 및 CSC, 확산, 문화와 cardiomyocytes로 차별화에 대 한 정교한 방법을 설명 합니다.

절연, 특성, 및 성인 마우스 심장에서 심장 줄기 세포의 분화

이 프로토콜에서, 우리는 심근 세포 분화 및 정제를 위해 인간 유도 만능 줄기 세포를 사용하는 방법에 대해 설명하고 정교하게, 그리고 더 나아가, Rho 관련 단백질 키나아제 억제제와 함께 이식 효율을 개선하는 방법에 대해 마우스 심근 경색 모델에서 전처리.

로 키나아제 활성의 일시적인 억제를 통해 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포의 생착을 강화

여기에서는 비디오 기반 현미경과 결합된 유연한 기판에 도금된 2D 인간 유도만능 줄기 세포 유래 심근세포(hiPSC-CM) 단층을 사용하여 비침습적 심장 의료 기기 수축성 평가 방법을 시연합니다. 이 도구는 심장 전기 생리학 장치의 수축 특성에 대한 시험관 내 평가에 유용합니다.

2D 인간 줄기 세포 유래 심근 세포에서 심장 수축성 조절 요법의 평가

여기에서 우리는 세포핵 준비를 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 심장 조직을 단일 세포로 미세 해부 및 효소 해리한 후, 전구 세포를 동결한 다음, 순수 생존 세포를 분리하여 단일 핵 RNA 시퀀싱 및 고처리량 시퀀싱 분석을 통한 전이효소 접근 가능한 염색질에 대한 단일 핵 분석에 사용했습니다.

단일 세포 분해능에서 후성유전체 및 유전자 발현 프로파일링을 위한 마우스 심장 전구 세포에서 핵 분리

배우세요 심장 세포 치료용 줄기 세포의 DNA 무결성 평가 방법을. 코메트 분석과 감마-H2AX 면역표지 기법을 활용하여 세포 품질을 검증하고 재생 의학 연구의 성공률을 높입니다.

심장 세포 치료를 위한 줄기 세포 DNA 무결성을 평가

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