Name: 정량 검사의 항생제 자화 율 Neisseria gonorrhoeae 집계를 사용 하 여 ATP 이용 상업적인 분석 실험 및 라이브/죽은 얼룩 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 학습하세요 Neisseria gonorrhoeae의 항생제 감수성을 ATP 측정 분석과 라이브/데드 염색을 사용하여 정량화하는 방법을. 이 기술은 세프트리악손 처리 후 세균 생존률을 측정하고 생물막 내 최소 억제 농도를 결정하는 데 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 D.C.S.를 되었다 AI123340 건강의 국립 연구소에서 교부 금에 의해 지원 되었다. L.-C.W., jw 메리어트, 교류, E.N. 부분/메릴랜드 대학에 의해 투자 하는 "첫 해 혁신 및 연구 경험" 프로그램에 참여에 지원 했다. Funders 게시, 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 또는 원고 준비에 전혀 역할을 했다. 우리는 모든 현미경 실험을 위한 UMD CBMG 이미징 코어를 인정합니다.

1. 일반적인 유지 보수의 GC 변종
<ol><li>N. gonorrhoeae 긴장 행진 1% GCK agar에 켈로그18 (표 1, 표 2) 냉장고 주식에서 보충 하 고 5% CO2 16-18 헤 사용 MS11 단계 변수 Opa (MS11Opa +), 아니 Opa (MS11ΔOpa), 표현에 대 한 37 ° C를 품 어 또는 잘린된 로스 (MS11ΔLgtE)입니다.</li>
	<li>신중 하 게 부정적인 pili (어두운 가장자리 없이 식민지) 또는 양성 (어두운 가장자리 식민지) 식민지 식민지 형태학19 해 가벼운 현미경 및 새로운 GCK 플레이트에 연속 사용에 따라 각 스트레인에서 선택 합니다.</li>
	<li>사용 하기 전에 16-18 h 5% CO2 와 37 ° C에서 품 어.</li>
</ol>2. 생존 GC 집계의 정량화
<ol><li>메 마른 주걱을 사용 하 여 GC를 수집 합니다. 면봉 접시에서 GC와 미리 데워 국물 (GCP, 표 3)에 다시 중단 GC 1%와 4.2% NaHCO3 켈로그 솔루션18보충. 분 광 광도 법을 사용 하 여 650의 파장에서 nm (1의 OD650 ~ 109 CFU/mL x 1 =) 중단된 박테리아의 농도 결정 하.</li>
	<li>~ 1 × 10로 GC의 농도 조정8 CFU/mL.</li>
	<li>96 잘 접시의 우물으로 조정 GC 중지 99 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>박테리아 수 있도록 5% CO2 와 37 ℃에서 6 h에 대 한 접시를 품 어 집계에.</li>
	<li>추가 1 µ L의 직렬 희석된 ceftriaxone (1000, 100, 50, 25, 12.5, 6.2, 3.1, 1.5, 0.8, 0.4, 0.2 µ g/mL) 각 우물에. 치료 컨트롤 역할을 일부 우물을 남겨 주세요.</li>
	<li>5% CO2와 37 ℃에서 24 h에 대 한 접시를 품 어.</li>
	<li>3 번에 5 144 W에서 s 및 20 kHz에 대 한 각 잘 정지 sonicate</li>
	<li>각 잘으로 100 µ L 상용 ATP 이용 발광 시 약의 추가, 최대 플라스틱-그리고 3 번, 아래로 5% CO2와 37 ° C에서 15 분 동안 품 어.</li>
	<li>신중 하 게 96-잘 검은 microplate에 새로운 우물에 각 우물에서 혼합물의 150 µ L를 전송 하 고 거품을 도입 방지.</li>
	<li>각 560에서의 흡 광도 측정 nm 플레이트 리더를 사용 하 여.</li>
	<li>직렬 ceftriaxone 치료 후 치료 우물에서 독서를 얻은 독서의 비율에 의해 생존 율을 계산 합니다.</li>
</ol>3. 라이브/죽은 GC의의 형광 현미경 분석
<ol><li>메 마른 주걱을 사용 하 여 GC를 수집 합니다. 접시에서 면봉 GC와 미리 따뜻하게 GCP 미디어 플러스 1%에서 GC 다시 중단 켈로그 보충.</li>
	<li>650의 파장에서 분 광 광도 법으로 박테리아의 수를 결정 nm ~ 1 x 10 GC의 농도 조정 하 고7 CFU/mL.</li>
	<li>8 잘 coverslip 아래쪽 챔버에 198 µ L로 GC 중지를 추가 합니다.</li>
	<li>집계 형성 수 있도록 5% CO2 와 37 ℃에서 6 h는 챔버를 품 어.</li>
	<li>각 잘 각 집계 조건 내에 ceftriaxone (100 µ g/mL 또는 다양 한 희석)의 2 µ L를 추가 합니다. 5% CO2와 37 ° C에서 원하는 시간에 품 어.</li>
	<li>각 우물에 라이브/죽은 얼룩 솔루션 혼합물의 0.6 µ L을 추가 하 고 5% CO2와 37 ° C에서 20 분 동안 품 어.</li>
	<li>Confocal 현미경 (동등한 현미경은 사용할 수 있습니다)를 사용 하 여 Z-시리즈 이미지를 취득 합니다.</li>
	<li>ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 GC 집계와 라이브-에-죽은 각 집계에 얼룩의 형광 강도 비율 (FIR)의 크기의 측정에 대 한 이미지를 분석 합니다.</li>
</ol>4. 이미지 분석
<ol><li>세균의 크기 추정<ol>
<li>ImageJ 열고 ImageJ 메뉴 모음에는 raw 이미지 파일을 드래그 하 여 이미지를 엽니다.</li>
		<li>ImageJ 메뉴 막대에서 프리 핸드 라인 을 클릭 하 고 이미지에서 각 집단의 영역 원형.</li>
		<li>클릭 분석 | 측정 ImageJ 메뉴 표시줄에서.</li>
		<li>지역 열 아래에서 새 창에 번호를 가져올.</li>
	</ol>
</li>
	<li>집계의 라이브-에-죽은 비율의 정량화<ol>
<li>ImageJ 열고 ImageJ 메뉴 모음에는 raw 이미지 파일을 드래그 하 여 이미지를 엽니다.</li>
		<li>클릭 분석 | 설정 측정 ImageJ 메뉴 표시줄에서.</li>
		<li>팝업 창에서 통합된 밀도 확인 하 고 확인을 클릭 합니다.</li>
		<li>이미지 클릭 | 컬러 | 도구 채널 메뉴 막대에 있는 선택 색상.</li>
		<li>채널 1 라이브 박테리아 얼룩에 대 한 형광으로 확인 합니다.</li>
		<li>ImageJ 메뉴 막대에서 프리 핸드 라인 을 클릭 하 고 각 집단의 영역 원형.</li>
		<li>클릭 분석 | 측정 ImageJ 메뉴 표시줄에서.</li>
		<li>IntDen 열 수를 가져옵니다.</li>
		<li>죽은 세균성 얼룩에 대 한 형광으로 채널 2 를 확인 합니다. 4.2.6-4.2.8 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>숫자 단계의 4.2.8 단계의 4.2.9 숫자로 나누어 살고 죽은 비율을 얻을.</li>
	</ol>
</li>
	<li>통계 분석<ol>
<li>GraphPad Prism 열고 원하는 열에 ImageJ에서 얻은 번호를 입력 합니다.</li>
		<li>분석 을 클릭 하 고 열 분석에서 t 테스트 를 선택 합니다.</li>
		<li>비교에 대 한 원하는 열을 확인 하 고 확인을 클릭 합니다.</li>
		<li>분석 창에서 P-값을 구할.</li>
		<li>단계 4.3.3에서에서 XY 분석 에서 선형 회귀 를 선택합니다</li>
		<li>R-광장 및 분석 창에서 P-값 을 가져옵니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>CDC STD Facts. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.cdc.gov/std/gonnorrhea/STDFact-gonorrhea-detailed.htm">http://www.cdc.gov/std/gonnorrhea/STDFact-gonorrhea-detailed.htm</a> (2017).</li>
<li>den Heijer, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+overview+of+urogenital%2C+anorectal+and+oropharyngeal+Neisseria+gonorrhoeae+testing+and+diagnoses+among+different+STI+care+providers%3A+a+cross-sectional+study%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">A comprehensive overview of urogenital, anorectal and oropharyngeal Neisseria gonorrhoeae testing and diagnoses among different STI care providers: a cross-sectional study.</a> BMC Infectious Diseases. 17 (1), (2017).</li>
<li>Hein, K., Marks, A., Cohen, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymptomatic+gonorrhea%3A+prevalence+in+a+population+of+urban+adolescents%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Asymptomatic gonorrhea: prevalence in a population of urban adolescents.</a> The Journal of Pediatrics. 90 (4), 634-635 (1977).</li>
<li>Hananta, I. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonorrhea+in+Indonesia%3A+High+Prevalence+of+Asymptomatic+Urogenital+Gonorrhea+but+No+Circulating+Extended+Spectrum+Cephalosporins-Resistant+Neisseria+gonorrhoeae+Strains+in+Jakarta%2C+Yogyakarta%2C+and+Denpasar%2C+Indonesia%5BTitle%5D)+AND+%22Sexually+Transmitted+Diseases%22%5BJournal%5D)">Gonorrhea in Indonesia: High Prevalence of Asymptomatic Urogenital Gonorrhea but No Circulating Extended Spectrum Cephalosporins-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strains in Jakarta, Yogyakarta, and Denpasar, Indonesia.</a> Sexually Transmitted Diseases. 43 (10), 608-616 (2016).</li>
<li>Chlamydia, W. H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+trachomatis%2C+Neisseria+gonorrhoeae%2C+syphilis+and+Trichomonas+vaginalis.+Methods+and+results+used+by+WHO+to+generate+2005+estimates.+World+Health+Organisation%2C+2011.+Prevalence+and+incidence+of+selected+sexually+transmitted+infections%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organisation%22%5BJournal%5D)">Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, syphilis and Trichomonas vaginalis. Methods and results used by WHO to generate 2005 estimates. World Health Organisation, 2011. Prevalence and incidence of selected sexually transmitted infections.</a> World Health Organisation. , accessed Oct 5 (2011).</li>
<li>Mayor, M. T., Roett, M. A., Uduhiri, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+management+of+gonococcal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22American+Family+Physician%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and management of gonococcal infections.</a> American Family Physician. 86 (10), 931-938 (2012).</li>
<li>Alirol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidrug-resistant+gonorrhea%3A+A+research+and+development+roadmap+to+discover+new+medicines%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Medicine%22%5BJournal%5D)">Multidrug-resistant gonorrhea: A research and development roadmap to discover new medicines.</a> PLOS Medicine. 14 (7), (2017).</li>
<li>Workowski, K. A., Bolan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexually+transmitted+diseases+treatment+guidelines%2C+2015%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR+Recommendations+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2015.</a> MMWR Recommendations and Reports. 64, 1-137 (2015).</li>
<li>Lahra, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+Recognition+of+Internationally+Disseminated+Ceftriaxone-Resistant+Neisseria+gonorrhoeae+Strain%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Cooperative Recognition of Internationally Disseminated Ceftriaxone-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strain.</a> Emerging Infectious Diseases. 24 (4), (2018).</li>
<li>Wi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+resistance+in+Neisseria+gonorrhoeae%3A+Global+surveillance+and+a+call+for+international+collaborative+action%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Medicine%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae: Global surveillance and a call for international collaborative action.</a> PLOS Medicine. 14 (7), 1002344(2017).</li>
<li>Singh, S., Singh, S. K., Chowdhury, I., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+Mechanism+of+Bacterial+Biofilms+Resistance+to+Antimicrobial+Agents%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Microbiology+Journal%22%5BJournal%5D)">Understanding the Mechanism of Bacterial Biofilms Resistance to Antimicrobial Agents.</a> Open Microbiology Journal. 11, 53-62 (2017).</li>
<li>Greiner, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+Formation+by+Neisseria+gonorrhoeae%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Biofilm Formation by Neisseria gonorrhoeae.</a> Infection and Immunity. 73 (4), 1964-1970 (2005).</li>
<li>Zollner, R., Oldewurtel, E. R., Kouzel, N., Maier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+and+antigenic+variation+govern+competition+dynamics+through+positioning+in+bacterial+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Phase and antigenic variation govern competition dynamics through positioning in bacterial colonies.</a> Scientific Reports. 7 (1), (2017).</li>
<li>Stein, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Opacity+Proteins+Interferes+with+the+Transmigration+of+Neisseria+gonorrhoeae.+across+Polarized+Epithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Expression of Opacity Proteins Interferes with the Transmigration of Neisseria gonorrhoeae. across Polarized Epithelial Cells.</a> PLoS One. 10 (8), 0134342(2015).</li>
<li>LeVan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+a+derivative+of+Neisseria+gonorrhoeae+strain+MS11+devoid+of+all+opa+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of a derivative of Neisseria gonorrhoeae strain MS11 devoid of all opa genes.</a> Journal of Bacteriology. 194 (23), 6468-6478 (2012).</li>
<li>Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+and+analyzing+static+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Growing and analyzing static biofilms.</a> Curr Protoc Microbiol. , Chapter 1., Unit 1B.1 (2005).</li>
<li>Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+multiple+methods+for+quantification+of+microbial+biofilms+grown+in+microtiter+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates.</a> Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).</li>
<li>White, L. A., Kellogg, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+Gonorrhoeae+Identification+in+Direct+Smears+by+a+Fluorescent+Antibody-Counterstain+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Neisseria Gonorrhoeae Identification in Direct Smears by a Fluorescent Antibody-Counterstain Method.</a> Journal of Applied Microbiology. 13, 171-174 (1965).</li>
<li>Swanson, J., Kraus, S. J., Gotschlich, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+gonococcus+infection.+I.+Pili+and+zones+of+adhesion%3A+their+relation+to+gonococcal+growth+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Studies on gonococcus infection. I. Pili and zones of adhesion: their relation to gonococcal growth patterns.</a> Journal of Experimental Medicine. 134 (4), 886-906 (1971).</li>
<li>Herten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+Vitro+Quantification+of+S.+aureus+Biofilms+on+Vascular+Graft+Surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid in Vitro Quantification of S. aureus Biofilms on Vascular Graft Surfaces.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2333(2017).</li>
<li>Gracia, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+development+of+Staphylococcus+aureus+biofilms+using+slime-producing+variants+and+ATP-bioluminescence+for+automated+bacterial+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Luminescence%22%5BJournal%5D)">In vitro development of Staphylococcus aureus biofilms using slime-producing variants and ATP-bioluminescence for automated bacterial quantification.</a> Luminescence. 14 (1), 23-31 (1999).</li>
<li>Webb, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilm development.</a> Journal of Bacteriology. 185 (15), 4585-4592 (2003).</li>
<li>Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+biofilm+formation+in+an+8-well+chamber+slide%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">In vitro biofilm formation in an 8-well chamber slide.</a> Journal of visualized experiments. (47), (2011).</li>
<li>Wang, L. C., Litwin, M., Sahiholnasab, Z., Song, W., Stein, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+gonorrhoeae+Aggregation+Reduces+Its+Ceftriaxone+Susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Neisseria gonorrhoeae Aggregation Reduces Its Ceftriaxone Susceptibility.</a> Antibiotics (Basel). 7 (2), (2018).</li>
<li>Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm-related+infections%3A+bridging+the+gap+between+clinical+management+and+fundamental+aspects+of+recalcitrance+toward+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 510-543 (2014).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+diagnostic+guidelines+for+biofilm-associated+infections%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunology+and+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Towards diagnostic guidelines for biofilm-associated infections.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 127-145 (2012).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

박테리아는 인체 감염 시 biofilms을 형성할 수 있다. 전통적인 마이크 테스트는 biofilm에서 박테리아를 박멸 하는 데 필요한 농도 반영 되지 않을 수 있습니다. biofilm에 항균 효과 테스트 하려면 방법 biofilm 바이오 매스를 기반으로 CFUs 도금 biofilm 구조의 영향으로 인해 잘못 된 될 수 있습니다. 예를 들어 도금 방법은는 biofilm 중단 될 수 있습니다 하는 경우 작동 합니다. 따라서, 얻은 CFU 실행 가능한 박테리아의 실제 번호 보다 낮은 수 있습니다. 그러나 머릿속 죽은 및 라이브 박테리아는 biofilm 내의 측정 biofilm 내의 박테리아의 생존에 대 한 설립 되었습니다,, 구조와 biofilm의 밀도 따라 얼룩이 지는 실패할 수 있습니다는 biofilm에 침투 하 여 발생 한 부정확 하 고 과소 평가 생존 속도입니다.
여기 방법의 치료 후 세균 생존을 측정 하는 양적 및 시각화 분석 결과 사용 합니다. 이 방법의 장점은 실제 감염...

임 질은 일반적인 성병 감염 (STI)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), 그람 음성 diplococcal 박테리아는이 질병의 원인이 되는 대리인. 생식 기 감염의 증상 통증 배 뇨, 일반화 된 생식 기 통증, 그리고 요도 방전 하는 동안 발생할 수 있습니다. 감염이 종종 무 증상2,3,,45, 이며 이로써 확장된 식민. 그들은 유기 체의 전송을 촉진 가능성이 있고이 골반 염증 성 질환 (PID) 등의 합병증으로 이어질 수 있습니다 gonococcal 감염 (DGI)6전파 이러한 치료 감염 주요 건강 관심사는. 항생제 내성 임 질은 중요 한 공중 위생 위기와 증가 사회경제적 부담7. Cephalosporins 감소 민감성 ceftriaxone8azithromycin 또는 doxycycline 결합 듀얼 치료에서 단일 항생제 치료 처방 변경 결과입니다. Ceftriaxone 및 azithromycin9,10, 함께 무 증상 감염의 증가 실패 임 질 치료 실패를 이해 하기 위한 필요를 강조 한다.
한 천 희석 및 디스크 확산 테스트를 포함 하 여 최소 억제 농도 (MIC) 테스트는 항생제에 저항을 식별에 대 한 표준 의학 시험으로 사용 되었습니다. 그럼에도 불구 하 고, 마이크 테스트 세균성 항 생 저항 vivo에서 반영 하는 경우에 명확 하지 않습니다. 항생제의 살 균 농도의 박테리아의 생존에 기여 하는 박테리아 biofilms의 형성: 마이크 테스트 하는 것은이 효과11을 감지할 수. GC는12점 막 표면 biofilms을 형성할 수 있다, 때문에 우리가 가설 그 항생제 자화 율 집계 내 개별 GC에서 본 다른 것. 또한, 연구 3 상 가변 표면 분자, Pili, 불투명도 관련 단백질 (Opa), 및 lipooligosaccharides (로스), 규제 간 박테리아 상호 작용, 다른 크기의 집계13, 으로 이어질 14 , 15. 항생제 저항에 이러한 구성의 기여 적절 한 방법의 부족으로 검사 하지.
현재, biofilm 박멸을 측정 하기 위해 여러 가지 방법이 있다. 가장 널리 사용 되는 양적 방법 크리스탈 바이올렛16얼룩을 사용 하 여 바이오 매스의 변화를 측정 하는 것입니다. 그러나, 방법 중요 한 실험적인 조작 실험 반복17에서 잠재적으로 오류를 생성할 수 있는 필요 합니다. 여기에 사용 되는 라이브/죽은 착 방법 라이브 하 고 죽은 박테리아와 그들의 분포는 biofilm 내의 시각화 수 있습니다. 그러나, biofilm 구조의 염료 침투를 감소 시키는 물리적 장벽으로 발생할 수 있습니다. 따라서, 그룹 내에서 라이브/죽은 박테리아를 계량 하는 얼룩 작은 biofilms 또는 그것의 선구자-microcolonies 또는 집계로 제한 됩니다. 다른 방법을, 한 천 희석 및 디스크 확산 테스트를 포함 하 여 집단의 효과 측정할 수 없습니다. 것 필요 모두를 측정할 수 있는 정량적 분석 결과 박테리아 생활과 그들의 분포를 시각화 항생제 노출, 이상적인 방법 집계에서 GC 민감성을 검사 합니다.
여기에 설명 된 절차는 ATP 사용률 측정 결합 및 라이브/죽은 얼룩을 양적 분석 결과 항생제의 집계에서 GC 민감성을 시각적으로 검사.

<table><tbody><tr><td>100x Kellogg의 보충제</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>United States Biological</td><td>A0930</td><td></td></tr><tr><td>BacTiter Assay&nbsp;</td><td>Promega</td><td>G8232</td><td></td></tr><tr><td>Ceftriaxone</td><td>TCI</td><td>C2226</td><td></td></tr><tr><td>Difco GC 중간 베이스&nbsp;</td><td>BD</td><td>228950</td><td></td></tr><tr><td>질산철, 비수화물&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>254223-10G</td><td></td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP350-1</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민 결정성 분말</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP379-100</td><td></td></tr><tr><td>BacLight 생염색/사염색</td><td>Invitrogen</td><td>L7012</td><td></td></tr><tr><td>MS11 Neisseria gonorrhoeae 균주</td><td></td><td></td><td>Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute가 친절하게 제공했습니다. 연구</td></tr> 인<tr><td>산칼륨 이염기성 (K2HPO4)Fisher</td> <td>Scientific</td><td>P290-500</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기성 (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP329-1</td><td></td></tr><tr><td>프로테오스 펩톤&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>211693</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨 (NaCl)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>S671-10</td><td></td></tr><tr><td>가용성 전분</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9765</td><td></td></tr><tr><td>티아민 피로 인산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8754-5G</td><td></td></tr><tr><td>장비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>8-well 커버슬립 바닥 챔버&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>96웰 조직 배양 플레이트&nbsp;</td><td>Corning, Falcon</td><td>3370</td><td></td></tr><tr><td>Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood)</td><td>Nuaire</td><td>32776</td><td></td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; 라이브 이미징 챔버가 장착된 모델 3530</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Leica</td><td>SP5X</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; 96 웰 블랙 폴리스티렌 마이크로플레이트&nbsp;</td><td>코닝</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>글로맥스 일루미네이터&nbsp;</td><td>Promega</td><td>E6521</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁(0.1-10 &마이크로; L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-717-133</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁(1000 &마이크로; L)</td><td>VWR</td><td>83007-382</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁 (200 &micro; L)</td><td>VWR</td><td>53509-007</td><td></td></tr><tr><td>분광 광도계 Ultrospec 2000 UV</td><td>Pharmacia Biotech</td><td>80-2106-00</td><td></td></tr><tr><td>멸균 15ml 원추형 튜브</td><td>VWR</td><td>21008-216</td><td></td></tr><tr><td>멸균 마이크로 원심분리기 튜브(1.7mL)</td><td>Sorenson BioScience</td><td>16070</td><td></td></tr><tr><td>멸균 폴리에스터 팁 애플리케이터</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-122</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Kontes</td><td>9110001</td><td></td>에 상당</tr></tbody></table>

정량 검사의 항생제 자화 율 neisseria gonorrhoeae 집계를 사용 하 여 atp 이용 상업적인 분석 실험 및 라이브/죽은 얼룩

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

항생제 내성 Neisseria gonorrhoeae (GC)의 출현은 세계적인 건강 위협이 고 치료 하지 못하는 개인을 식별 하는 필요를 강조. 이 그램 음성 박테리아는 인간에서 독점적으로 임 질을 발생합니다. 감염, 동안 양식 집계 biofilms 하 수 있다. 최소 억제 농도 (MIC) 테스트 항생제 자화 율을 결정 하 고 적절 한 치료를 정의 하기 위해 사용 됩니다. 그러나, vivo에서 박멸 및 실험실 결과 관계의 메커니즘은 알려져 있지 않습니다. GC 집계 항생제 자화 율에 영향을 미치는 방법과 집계 크기와 항생제 자화 율 사이의 관계를 표시를 검사 하는 방법 개발 되었다. 때 GC 집계, 그들은 더 죽이 항생제에 저항력이, 센터에서 박테리아와 함께 주변에 그 보다 더 나은 ceftriaxone 치료를 생존. 데이터 표시 N. gonorrhoeae 집계 표준 한 천 격판덮개 기반 마이크 메서드를 사용 하 여 반영 되지 않습니다 ceftriaxone의 민감성을 줄일 수 있습니다. 이 연구에 사용 되는 방법은 연구자 임상 관련 조건 하에서 세균 자화 율 테스트를 수 있습니다.

두 가지 방법을 사용 했다: ATP 사용률 분석 결과 및 라이브/죽은 얼룩 분석 결과. 결과 결합 하거나 개별적으로 항생제 치료 후 집계 내 세균 생존을 검토를 위해 사용 될 수 있습니다 합니다. ATP 사용률 분석 결과 미 균 biofilms20,21에서 정확 하 게 실행 가능한 박테리아를 측정 하기 위해 표시 되었습니다. 여기, MS11Opa + 필 + 스트레인 항생제 자화 율에서 GC 집계의 역할 검사 사용 되었다. 비 집계 MS11Opa + 필 +, 집계 MS11Opa + 필 +, 또는 집계 및 다음 쥡니다 MS11Opa + 필에 의해 중단 + 직렬 희석 ceftriaxone 및 ATP 수준 측정 (그림 1A)로 치료 했다. 비교 백분율 생존와 항생제 치료를 하...

간단한 ATP 측정 분석 결과 및 라이브/죽은 방법 얼룩 계량 ceftriaxone 치료 후 Neisseria gonorrhoeae 생존을 시각화 하 사용 되었다. 이 프로토콜 검사 어떤 항생제의 항균 효과를 확장할 수 있습니다 고 박테리아 biofilms에서 항생제의 최소 억제 농도 정의 하기 위해 사용할 수 있습니다.

정량 검사의 항생제 자화 율 Neisseria gonorrhoeae 집계를 사용 하 여 ATP 이용 상업적인 분석 실험 및 라이브/죽은 얼룩

The emergence of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae (GC) is a worldwide health threat and highlights the need to identify individuals who fail ...

이 기술은 우리가 더 임상적으로 관련있는 조건하에서 항생제 감수성을 측정할 수 있습니다. 기술은 또한 우리가 골재에 있는 박테리아를 죽일 수 있는 진정한 항생 사격을 결정할 수 있습니다. 이 기술은 GC 집계를 제거하는 데 필요한 농도를 결정하는 데 적용 될 수있다.이 방법은 또한 골재를 형성할 수 있는 임의의 박테리아의 항균 감수성을 측정하는 데 적용될 수 있다. lysis가 완료되었는지 확인하기 위해 lysis 단계에주의하십시오. 그렇지 않으면 ATP 측정 분석은 실행 가능한 박테리아의 수를 과소 평가합니다.이 방법의 시각화를 통해 다른 연구자들이 이 실험을 일관성있게 따르고 복제할 수 있습니다. 먼저 GCK 한천에서 1%켈로그로그를 1%켈로그로1%로 보충한 나이세리아 임질 또는 GC 균주를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 줄이도록 합니다. 다음 날 아침, 가벼운 현미경을 사용하여 어두운 가장자리나 각 판의 어두운 가장자리가있는 필리 양성 식민지가없는 필리 음성 식민지를 신중하게 선택하고 수확 한 식민지를 새로운 GCK 플레이트에 줄여 섭씨 37도및 이산화탄소 5 %에서 16 ~ 18 시간 문화를 제공합니다.다음 날 아침, 멸균 어플리케이터를 사용하여 각 플레이트에서 GC 콜로니를 수집하고 4.2 %의 중탄산 나트륨과 1 % 켈로그 용액으로 보충 된 따뜻한 국물에 각 면봉을 다시 중단하십시오. 650 나노미터 또는 OD650의 광학 밀도를 측정하여, 중단된 박테리아의 농도를 결정하고 밀리리터당 8개의 콜로니 형성 단위로 약 10배까지 GC 농도를 조절한다. 다음으로, GC 서스펜션의 마이크로리터를 96웰 플레이트의 개별 우물에 추가하고 박테리아가 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 6시간 동안 집계할 수 있도록 합니다.인큐베이션이 끝나면, 각 우물에 연속적으로 희석된 세프트리악손 의 마이크로리터 1개를 추가하여 컨트롤역할을 하고 플레이트를 인큐베이터로 24시간 더 되돌려 놓습니다. 다음 날, 초음파 처리당 5초 동안 144와트, 20킬로헤르츠에서 각각 3회 현탁액을 초음파 처리하고 100마이크로리터의 ATP 활용 글로우 시약을 각 웰에 추가합니다. 각 우물에서 150 마이크로리터의 혼합물을 새로운 96웰 블랙 마이크로플레이트의 개별 우물로 조심스럽게 옮기고 플레이트 판독기에서 560 나노미터에서 각 웰의 흡광도를 측정합니다.이어서, 연쇄 항생제 치료 후 얻어진 판독값의 비율로 생존율을 계산하여 치료되지 않은 우물에서 판독한다. 라이브/데드 GC 응재의 시각화를 위해 멸균 어플리케이터를 사용하여 하룻밤 배양 플레이트에서 GC를 수집하고 1%켈로그로그로 보충된 사전 동포 GCP 배지에서 GC를 재보습하십시오. 분광광법에 의한 OD650을 측정하고 밀리리터당 7개의 콜로니 형성 단위로 약 10배로 농도를 조절한다.다음으로, GC 서스펜션 198마이크로리터를 8웰 커버슬립 바닥 챔버에 추가하고 챔버를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 6시간 동안 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 응집 조건 당 세프 트리 악손의 두 마이크로 리터로 박테리아를 치료하고 적절한 실험 배양 기간 동안 인큐베이터에 챔버를 반환. 인큐베이션이 끝나면 0.6 마이크로리터의 라이브/데드 스테닝 용액을 각 우물에 넣고 챔버를 인큐베이터로 20분 더 돌려보도록 한다.그런 다음 공초점 현미경을 사용하여 z 시리즈 이미지를 얻습니다. GC 집계 크기를 측정하려면 ImageJ에서 첫 번째 이미지를 열고 프리핸드 라인을 선택하여 이미지의 각 집계 영역을 동그라미로 조정합니다. 분석 및 측정을 클릭합니다.집계 크기는 영역 열 아래에 표시됩니다. 각 골재에서 죽은 염색에 대한 라이브의 형광 강도 비율을 정량화하려면 측정을 분석하고 설정하고 팝업 창에서 통합 밀도를 확인합니다. 확인을 클릭하고 이미지, 색상 및 채널 도구를 클릭합니다.죽은 박테리아 염색에 대한 형광으로 색상과 채널 하나를 선택합니다. 프리핸드 라인을 선택하여 각 집계 영역을 동그라미화하고 분석 및 측정을 클릭하여 통합 밀도 컬럼의 각 집계에 대한 형광 강도 비율을 얻습니다. 살아있는 세균 염색을 위한 형광을 위한 채널 2를 선택하고 다만 입증된 것처럼 각 골재에 있는 형광 강도를 측정합니다.그런 다음 살아있는 형광 강도 데이터를 죽은 형광 강도 데이터로 나누어 죽은 형광 강도 비에 대한 살아있는 것을 얻습니다. 이 대표적인 실험에서, 비집계 된 pili 양성, 집계 된 필리 양성 또는 집계 및 중단 된 필리 양성 박테리아는 ATP 수준을 측정하기 전에 ceftriaxone의 직렬 희석으로 치료되었다. 사전 집계된 GC는 세프트리악손 이상의 동등한 농도로 치료할 때 GC를 방해한 비집계 또는 집계보다 훨씬 높은 생존을 입증하였다.더 큰 골재를 형성하는 Pili 양성 균주는 돌연변이 균주에 비해 세프트리악손 치료 후 가장 높은 ATP 수준을 나타냈다. 에 관계없이 변형 테스트, 항생제 치료 전에 살아있는 / 죽은 염색은 주로 문화의 외부 층에 위치한 죽은 박테리아를 밝혀, 라이브 GC는 주로 ceftriaxone 처리 집계의 핵심 내에서 확인 된 동안. 예상대로, 필리 양성 박테리아는 가장 큰 골재를 형성하고, 필리 음성 배양은 가장 작게 형성되었다.특히, pili 양성 골재는 항생제 치료 후 핵심 층에서 여전히 살아 있었고, 작고 느슨한 돌연변이 골재의 GC는 죽었습니다. GC의 크기와 생존에 기초하여, 상관 관계 그래프는 박테리아의 응집 크기와 항생제 생존 사이의 관계를 검사하기 위해 플롯 될 수있다. 초음파 처리는 각 개별 박테리아의 ATP가 단단히 결합된 골체 내에서 방출되는지 확인하는 데 중요합니다.그렇지 않으면 측정이 일관성이 없습니다. 박테리아를 집계한 후 박테리아를 플레이트화하고 항생제로 치료하여 실행 가능한 박테리아와 복제 능력이 있는 박테리아를 모두 측정하는 것이 중요합니다. 이 기술은 박테리아 응집 영향을 항생제 감수성에 영향을 측정하여 연구원이 질병 치료에 더 나은 약물을 개발할 수 있도록 합니다.

quantitative-examination-antibiotic-susceptibility-neisseria

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: Cayron, J. 및 Lesterlin, C. 스트레스 치료 하에서 박테리아 성장에 대한 다중 규모 분석. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 도금을 사용하여 생존율을 측정하고 유세포 분석을 사용하여 세포 분열 억제 항생제 처리에서 대장균 필라멘트 및 DNA 복제를 평가하는 절차를 보여줍니다.

도금 분석 및 유세포 분석을 사용한 대장균 의 항생제 유도 필라멘션 평가

출처: Maurakis, S. 및 Cornelissen, CN 금속 반응성 유전자의 특성화 및 숙주 리간드로부터의 금속 획득을 위한 Neisseria gonorrhoeae의 금속 제한 성장. J. Vis. 경험. (2020년)이 비디오는 리간드 결합, 항체 검출 및 비색 시각화를 포함하는 도트 블롯 분석을 사용하여 금속 제한 조건에서 성장한 임 균에서 표면 금속 수송체를 검출하는 절차를 보여줍니다.

Dot Blot을 사용한 Neisseria gonorrhoeae의 표면 금속 수송체 검출

이 비디오는 녹농균(Pa) 응집체에 대한 항균 처리의 영향을 연구하기 위한 시험관 내 기술을 보여줍니다. 형광 표지된 Pa 세포는 감염 중 성장 패턴을 모방하는 응집체로 성장합니다. 치사량 이하의 항생제 콜리스틴 농도로 응집체에 이의를 제기하면 형광 현미경을 통해 박테리아-항생제 상호 작용에 대한 실시간 평가가 수행됩니다.

박테리아 응집체에 대한 항균 처리를 연구하기 위한 In vitro 기술

이 동영상은 루시페라아제 글로우 시약을 사용한 간단한 ATP 측정 분석에 대해 설명합니다. 이 분석법은 세프트리악손 치료 후 Neisseria gonorrhoeae 생존을 정량화하는 데 사용됩니다.

항생제 투여 시 세균 생존율을 결정하기 위한 ATP 활용 분석

세균성 병인 분야의 중심에는 미생물이 진핵 세포에 노출 된 후 생존 방법 경우 정의 할 수있는 기능입니다. 이 문서는 내부와 숙주 세포와 관련된 개별 박테리아의 생존을 공개 형광 염료의 사용에 대한 프로토콜을 설명합니다.

포유 동물 세포와 관련있는 박테리아의 생존을 확인하는 방법에 대한 형광 현미경 방법

여기에서는 항균 활성을 위해 효소를 신속하게 스크리닝하고 특성화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 마이크로슬라이드 확산 분석법과 염료 방출 분석법은 정성적 및 정량적 효소 활성 평가를 위해 표적 박테리아 기질을 활용합니다.

정성 및 정량 검출을위한 시험 법 및 단백질 항생제 특성

프로토콜 선물 대장균-lactococcal 항균 성 펩 티 드 nisin에 비정규 아미노산 (ncAAs)의 선택적 압력 관을 기반으로. 재조합 식을 통해 대체 정의 된 성장 매체에서 원하는 ncAAs로 동안 그것의 속성을 변경할 수 있습니다. Bioactivity 결과 변화 성장 금지 분석 실험 및 형광 현미경 검사 법에 의해 매핑됩니다.

정식이 아닌 아미노산의 선택적 압력 관에 의해 생산 하는 항균 성 펩 티 드

형광 태그 항생제는 항균 저항의 다중 양상을 공부하기 위하여 이용될 수 있는 강력한 공구입니다. 이 문서는 형광 태그 항생제의 제조 및 박테리아에서 항생제 저항을 공부 하는 그들의 응용 프로그램을 설명 합니다. 프로브는 분광광도법, 유세포 분석 및 현미경 검사법에 의한 세균 저항(예: 유출)의 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

형광 항생제 프로브를 사용한 세균 저항성 시각화

합성 낭포성 섬유증 가래 배지(SCFM2)는 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사 및 형광 활성화 세포 분류와 함께 사용하여 고해상도에서 세균 응고체를 관찰할 수 있다. 이 논문은 향후 연구를 위한 플랫폼으로서 항균 치료 중 집계 인구를 평가하는 방법을 자세히 설명합니다.

슈도모나스 아에루기노사 감염 모델의 실시간 평가를 위한 도구

침착성 대 장균 균주에서의 항생제 내성은 전통적인 겐타미신 보호 검사법을 이용한 세균 침입 평가에 도전 과제를 제기합니다. 군락 형성 단위를 열거하여 정량적으로, 그리고 감염된 세포를 면역형광 공초점 현미경으로 시각화하여 정성적으로 평가하는 개선된 방법을 기술한다.

대장균 세포 침범의 정량화 및 시각화를 위한 아미카신 보호 분석

학습하세요 Neisseria gonorrhoeae의 항생제 감수성을 ATP 측정 분석과 라이브/데드 염색을 사용하여 정량화하는 방법을. 이 기술은 세프트리악손 처리 후 세균 생존률을 측정하고 생물막 내 최소 억제 농도를 결정하는 데 활용됩니다.

정량 검사의 항생제 자화 율 Neisseria gonorrhoeae 집계를 사용 하 여 ATP 이용 상업적인 분석 실험 및 라이브/죽은 얼룩

더 많은 동영상 탐색