Dictyostelium discoideum 셀 선택에 따라 성장과 박테리아에서의 유전 공학
January 25th, 2019
Dictyostelium discoideum 셀 마이그레이션, endocytosis, 개발 등 복잡 한 세포질 과정을 공부 하는 인기 모델 생물 이다. 생물의 유틸리티 유전자 조작의 가능성에 따라 달라 집니다. 여기, 우리가 transfect Dictyostelium discoideum 세포를 액체 매체에서 자란 셀의 기존 한계를 극복 하는 방법을 제시.
이 프로토콜의 가치는 그 균주가 액체 매체에서 도끼로 성장할지 여부에 관계없이 분자 유전학에 의해 조작될 수 있도록 하는 것입니다. 이 기술의 또 다른 장점은 빠르고 간단하다는 것입니다. 디티오스텔라늄을 혼합하기 시작하기 전에 엑조코모솜 플라스미드를 가진 트랜스펙트 세포로 전향한다.
결과는 현미경 검사를 사용하여 형질 전환 후 2 일 동안 이미 검증 될 수 있습니다. dictyostelium 세포 와 박테리아 현탁액으로 작동 하는 것은 특이 한. 시각화는 실험자에게 프로토콜의 다양한 단계가 어떻게 수행되는지 에 대한 아이디어를 제공하는 데 도움이 됩니다.
나와 함께 절차를 시연하는 것은 수다베 이마니키아, 내 실험실에서 포스트 독이 될 것입니다. 먼저 텍스트 프로토콜에 따라 염화 마그네슘과 염화칼슘으로 소렌센 완충제 작업 용액 1000밀리리터를 준비하십시오. 그 후, K 에어로게인의 단일 콜로니를 사용하여 LB 배지 의 1리터를 접종한다.
박테리아가 흔들림과 섭씨 37도에서 하룻밤 사이에 성장할 수 있도록 하십시오. 세포를 500 밀리리터 원심분리기 튜브 두 개로 감아 세포를 수확합니다. 그런 다음 500 밀리리터의 완충제로 박테리아를 한 번 씻으시다.
버퍼의 20 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 광미터를 사용하여 샘플의 광학 밀도를 확인하고 광학 밀도가 약 100이 될 때까지 샘플을 버퍼로 희석시. 그 후 텍스트 프로토콜에 따라 H40 전기기화 버퍼를 준비합니다.
K 에어로게인을 성장하여 실온에서 하룻밤 사이에 SM 배지에 합류합니다. SM 한천 플레이트에 세균 현탁액 400마이크로리터를 넣고 균등하게 펴보입니다. 그런 다음 멸균 루프를 가지고 dictyostelium 세포로 접종하고 접시의 한 가장자리에 세포를 확산시다.
2일 동안 22도의 플레이트를 배양하여 성장 영역이 트랜스펙트에 충분히 큰지 확인합니다. 10센티미터 조직 배양 처리 페트리 접시에 K 에어로진 서스펜션 10 밀리리터를 추가합니다. 이어서, 배양판의 성장 영역에서 세포를 긁어내는 10 마이크로리터 일회용 접종 루프를 사용한다.
얼음 차가운 H40 버퍼를 포함하는 1.5 밀리리터 튜브로 세포를 전송합니다. 10000배 의 중력으로 2초 간 셀을 회전시다. 그런 다음 상체를 버리고 H40 버퍼에서 셀을 다시 일시 중지합니다.
다음으로, 세포의 100 마이크로리터를 DNA 1~2마이크로그램을 포함하는 튜브에 추가합니다. 피펫을 위아래로 사용하여 세포 DNA 혼합물을 미리 냉각된 전기기공큐벳으로 혼합하고 전달합니다. DNA의 2 마이크로그램 이상을 추가하지 마십시오.
더 높은 DNA 농도는 세포에 대한 독성과 효율성을 감소. 전기기분기 후, 즉시 준비된 10센티미터 페트리 접시로 세포를 옮기고 세포가 5시간 동안 회복되도록 합니다. 녹아웃, 노크 인 또는 5 개의 노크 인 행위에 대한 변형을 선택하려면 표면 위에 액체를 피펫하여 페트리 접시에서 세포를 분리합니다.
그런 다음 텍스트 프로토콜에 따라 선택적 에이전트의 3개의 희석제를 설정합니다. 마지막으로, 준비된 희석제 150마이크로리터를 96웰의 평평한 바닥 조직 배양 플레이트의 각 웰에 분배한다. 이 프로토콜에서는 이중 기자 엑스트라크로모솜 플라스미드 시스템이 시연되었다.
32 회광 후, 세포의 대다수는 형광 표지 융합 단백질을 모두 표현했습니다. 5M 체리 노크인과 NC4도 시도했다. 아가로즈 젤에서 소화를 실행한 후 두 개의 밴드가 얻어졌다.
4127 베이스 쌍 밴드에는 원하는 구조가 포함되어 있습니다. 정제된 DNA는 NC4 세포의 전염을 위해 사용되었다. NC4 경질의 2개의 클론은 PCR를 통해 분석되었고 둘 다 예측된 대역 패턴을 보였다.
그런 다음 남부 얼룩이 PCR의 결과를 검증하는 데 사용되었습니다. NC4는 Ax2 세포보다 세균성 잔디에서 더 빠르게 성장했습니다. 4시간 후, 더 많은 NC4 세포가 Ax2 세포보다 아가로즈 아래에서 기어갈 수 있었다.
NC4 세포는 Ax2 세포보다 엽산에 대한 더 강한 화학 반응으로 더 빨라졌습니다. 항상 갓 설정 SM 플레이트에서 셀을 사용합니다. 4 일 보다 오래 된 세포를 사용 하지 마십시오, 그렇지 않으면 효율성이 떨어질 것 이다.
갓 고립 된, nonextenic, 흰색 HAP 균주는 일반적으로 dictyosteliums의 ruching 또는 사회적 행동에 관한 질문을 해결하는 데 사용됩니다. 우리는 그 격리를 통해 분자 유전학을 적용 할 수 있습니다.
개요
Dictyostelium discoideum 세포를 형질주입하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 균주의 성장 조건에 관계없이 유전자 조작이 가능하게 합니다. 이 방법은 효율적이고 간단하여 결과의 신속한 검증을 가능하게 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 세포 생물학
- 유전자 조작
- 모델 생물
배경
- Dictyostelium discoideum는 세포 과정을 연구하는 데 널리 사용되는 모델 유기체입니다.
- 유전자 조작은 다양한 생물학적 질문을 탐구하는 데 중요합니다.
- 기존의 방법은 다양한 균주의 성장 조건에 따라 제한이 있습니다.
- 이 프로토콜은 이러한 제한을 극복하기 위한 것입니다.
연구 목적
- 다양한 Dictyostelium discoideum 균주를 형질주입하는 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.
- 자가영양으로 성장하지 않는 균주에서 분자 유전학 응용을 촉진합니다.
- 형질주입 과정의 효율성을 입증합니다.
사용된 방법
- 형질주입을 위한 세균 및 완충액 용액 준비.
- 플라스미드 DNA를 사용한 Dictyostelium discoideum 세포의 전기 충격법.
- 현미경 및 PCR을 사용한 형질주입 결과 검증.
- 형질주입에 대한 세포 행동 및 성장 평가.
주요 결과
- 다양한 Dictyostelium discoideum 균주의 성공적인 형질주입.
- 형질주입 후 32시간에 형광 단백질 발현 관찰.
- NC4 세포가 Ax2 세포보다 더 빠른 성장 및 화학 택시 반응을 보였습니다.
- PCR 및 Southern blot 분석을 통한 유전자 변형 검증.
결론
- 이 프로토콜은 Dictyostelium discoideum 균주의 효과적인 유전자 조작을 가능하게 합니다.
- 세포 행동 및 유전학에 대한 향후 연구를 위한 기반을 제공합니다.
- 신선하게 분리한 균주가 형질주입 효율성에서 최상의 결과를 제공합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This protocol enables genetic manipulation of wild-type Dictyostelium strains that grow on bacteria, overcoming limitations of axenic-adapted strains with perturbed Ras signaling. It provides a scalable, rapid method for target validation in a disease-relevant model system, supporting mechanistic de-risking in early discovery. The approach extends molecular genetics to environmentally isolated strains, enhancing translational continuity and predictive confidence in phenotypic screening workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in uncorrupted signaling and motility pathways by using non-axenic strains with intact Ras signaling.
- Operational Value: Reduces experimental confounding from macropinocytosis defects and migration impairments seen in axenic strains.
- Predictive Value: Supports functional target validation and biological de-risking by allowing mutagenesis in physiologically relevant growth conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates recombinant cells expressing dual fluorescent reporters within 32 hours, enabling rapid assay readouts for compound screening.
- Operational Value: Standardizes transfection workflow using bacterial lawns and electroporation, improving reproducibility across laboratories.
- Scalability: Accelerates timeline from transfection to validated clones in days rather than weeks, supporting high-throughput strain engineering.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates study of chemotaxis and social behavior in freshly isolated wild-type strains, improving disease model relevance.
- Operational Value: Enables direct application of molecular genetics to environmental isolates without prior axenic adaptation.
- Translational Continuity: Links discovery-phase target validation to preclinical phenotypes through measurable outputs like folate-induced chemotaxis and agarose penetration assays.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to lead identification stages by providing genetically tractable models for pathway interrogation and phenotypic screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing in chemotaxis, macropinocytosis, and development signaling using intact wild-type strains.
- Screening: Delivers quantitative fluorescence and growth readouts on bacterial lawns for reliable compound evaluation.
- Analytics: Enables PCR, Southern blot, and microscopy-based validation of genetic modifications within 32–48 hours post-transfection.
- Translational Research: Connects genetic manipulation to functional assays like chemotaxis and growth under agarose, informing risk-adjusted advancement.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for engineering any Dictyostelium strain, regardless of isolation source or growth condition.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by eliminating artifacts from axenic adaptation and restoring native signaling pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized buffer preparations, electroporation parameters, and selection protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by reducing strain engineering timelines and enabling rapid go/no-go decisions in target validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by generating mechanistically de-risked models with validated genetic modifications.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbiology for bacterial culture preparation and Dictyostelium handling on bacterial lawns.
- Depends on access to electroporation equipment and sterile tissue culture infrastructure for transfection and recovery steps.
- Necessitates standardization of bacterial inoculum density (OD ~100) and H40 buffer preparation across users.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to different wild-type isolates or environmental strains.
- Limited to strains capable of growth on bacterial lawns; efficiency declines with cells older than four days post-isolation.
