Name: 세포 기반 분석 결과 의해 인간의 혈 청 안티-aquaporin-4 면역 글로불린 G 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: 배우세요 세포 기반 분석법을 사용하여 인간 혈청에서 anti-AQP4 IgG를 검출하는 방법을. 이 기술은 신경척수염 광범위 장애의 임상 진단에 높은 민감도와 특이도를 제공합니다.

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저자는 국립 과학 재단의 중국 (No. 31600820)는 건강 및 가족계획 위원회의 지린 (번호 2016Q036), 그리고 과학 기술 계획 프로젝트의 지린 (No.에서 보조금에서 지원에 대 한 감사 20180520110JH)입니다.

이 절차의 첫 번째 병원 길 림 대학 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 고 약 1500 과목에서 수행 되었다.
1. 환자 등록 및 혈액 샘플 컬렉션
<ol><li>아래 열거 된 수석 불만과 증상 병원 환자에 게 안티 AQP4 IgG 혈 청의 실험실 탐지를 적용 합니다. 또한 검 진을 수행 합니다. 광학 신경 염: 환자 시각 필드의 손실 및 시력의 감소와 같은 시각적인 적자와 고통을. 급성 척 수염: 환자 마비, 감각 적자와 자율 기능 장애가 발생할 수 있습니다. 지역 postrema 증후군: 환자의 설명할 수 없는 딸 꾹 질, 구역 질 또는 구 토 증상이 있을 수 있습니다. 급성 brainstem 증후군: Brainstem 병 변 다른 증상과 병 변의 위치에 따라 실제 표시 될 수 있습니다. 증상 narcolepsy 또는 NMOSD-전형적인 diencephalic MRI 병 변과 급성 diencephalic 임상 증후군. NMOSD-전형적인 뇌 병 변과 증상이 뇌 증후군. 참고: NMOSD5에 대 한 국제 합의 진단 기준에 따라 NMOSD의 진단 할 수 있다 경우에 환자는 혈 청 안티-AQP4 igg가 양성 및 핵심 임상 특성 중 적어도 하나 위에서 언급 한 했다. 그러나, 안티 AQP4 IgG만 광학 신경 염 환자에서의 테스트 하지 않는 것이 좋습니다.</li>
	<li>
혈액 샘플 컬렉션 참고: 환자 금식 할 필요가 없습니다.<ol>
<li>4 mL 진공 혈액 컬렉션 튜브에 정 맥 혈액의 2-3 mL를 그립니다.</li>
		<li>실 온 (RT)에서 30 분 동안 응고 혈 청을 수 있습니다. 참고: 머리말을 붙인 응고 혈소판에서 누설 때문에 혈 청 수준을 높일 수 있습니다.</li>
		<li>2100 x g 에서 원심 분리기는 5 분에 대 한 신중 하 게 새로운 튜브에 혈 청을 전송 합니다.</li>
		<li>혈 청을 즉시 또는 약 수를 분석 하 고-20에서 저장 또는-80 ° C 참고: -20 ° C에서 저장-80 ° C는 년의 저장에 대 한 개월, 저장을 위해 이다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 안티-AQP4 항 체 검출
주의: 환자 샘플 및 사용된 키트 시 약 전염 물질을 고려 한다. 나트륨 아 지 드 포함 시 약 키트에 독성이 있다. 프로토콜의 흐름 차트는 그림 1에 제공 됩니다.
<ol><li>
준비
	<ol>
<li>RT를 사용 하기 전에 키트를가지고. 참고: 2-8 ° c.에 키트를 저장</li>
		<li>0.2%를 포함 하는 PBS 워시 버퍼의 적어도 200 mL 준비 트윈 20. 워시 버퍼의 100 mL 500 mL 비 커에 붓으십시오.</li>
		<li>혈 청 샘플 워시 버퍼 10 배 희석. 배포자의 지시에 따라 긍정적이 고 부정적인 컨트롤을 준비 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
샘플 부 화
	<ol>
<li>시 약 트레이 (그림 2)의 반응 분야에 미리 희석된 샘플, 긍정적인 통제, 또는 부정적인 컨트롤의 30 µ L를 추가 합니다. 참고: 공기 방울을 피하십시오.</li>
		<li>바이오 칩 슬라이드에 보호 커버를 제거 합니다. 참고: 분리 및 고정된 셀의 오염을 방지 하기 위해 봄에는 만지지 마십시오. 덮개를 제거 하기 전에 슬라이드 사이드-의해-측면을 잡으십시오.</li>
		<li>바이오 칩 슬라이드 시 약 트레이 (그림 2)에 적용 됩니다. 실시간에서 30 분 부 화를 시작 참고: 모든 샘플은 다른 방울과 혼합 하지 않고 해당 바이오 칩에 연결 된 개별 방울 이어야 한다.</li>
		<li>부드럽게 린스 워시 버퍼와 한번 바이오 슬라이드. 바이오 칩 슬라이드 가득한 적어도 5 분 자리 가능 하면 통에 비 커에 대 한 워시 버퍼의 100 mL 500 mL 비 커에 담가.</li>
		<li>바이오 칩 슬라이드 워시 버퍼에서 꺼내 주세요. 신중 하 게 멀리 종이 타월로 반응 분야 이외의 잔여 워시 버퍼를 닦으십시오. 반응 분야에 잔여 워시 버퍼를 증발을 1-2 분 동안 야외에서 바이오 슬라이드를 표시 합니다. 참고: 반응 분야에 밖으로 건조 하지 마십시오. 종이 타월로 봄에는 만지지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
이차 항 체 외피
	<ol>
<li>배포자의 지시에 따라 이차 항 체 솔루션을 준비 합니다.</li>
		<li>깨끗 한 시 약 트레이의 반응 분야에 형광 이차 항 체의 25 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>이차 항 체와 함께 로드 시 약 트레이 바이오 슬라이드를 적용 합니다. 실시간에서 30 분 동안 품 어</li>
	</ol>
</li>
	<li>
장착
	<ol>
<li>사용된 워시 버퍼에 밖으로 부 어과 신선한 워시 버퍼의 100 mL 비 커에 추가. 2.2.4, 2.2.5 단계에 설명 된 대로 세척을 반복 합니다.</li>
		<li>신중 하 게 바이오 슬라이드 (한 방울 반응 필드)에 반응 필드에 포함 매체를 추가 합니다. 커버 글라스의 한 조각으로 바이오 칩 슬라이드 인감. 공기 방울을 피하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
형광 검출
	<ol>
<li>현미경 및 15 분 선택 488 nm 필터에 대 한 사전 열 형광 램프를 켭니다.</li>
		<li>오픈 사진 소프트웨어입니다. 다른 확대와 함께 모든 반응 분야의 transfected와 untransfected 지역에서 사진을 찍을. 먼저, 4 배 확대에 대 한 개요와 함께 한 사진의 찍을 다음 10 x 20 x 확대와 더 많은 사진을 찍어. 참고: 자세한 프로토콜은 표 1에 표시 됩니다. 해석 결과의 대표적인 결과 섹션에 설명 되어 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3입니다. 환자의 진단
<ol><li>경우 환자는 혈 청 안티-AQP4 IgG-긍정적인 NMOSD의 적어도 하나의 코어 임상 특성을 보여줍니다 (토론 섹션 참조), NMSOD5환자를 진단. 그러나, 환자는 안티-AQP4 경우 IgG-부정, NMOSD의 진단 배제 하지 않을 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Zekeridou, A., Lennon, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology+Neuroimmunology+%26+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4 autoimmunity.</a> Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 2 (4), 110(2015).</li>
<li>Ho, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+human+aquaporin+4+at+1.8+A+and+its+mechanism+of+conductance%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of human aquaporin 4 at 1.8 A and its mechanism of conductance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (18), 7437-7442 (2009).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

우리는 안티-AQP4 IgG 인간의 혈 청에서 검출 하는 광범위 하 게 액세스할 수 방법을 설명 했습니다. 안티 AQP4 IgG는 밀접 하 게 관련이 NMOSD, 그리고 신뢰할 수 있는 안티-AQP4 IgG 탐지 방법을 구축 하는 것는 NMOSD의 임상 진단에 대 한 중요 한. 첫째, 안티-AQP4 IgG NMOSD에 대 한 특정 이다. 다 발성 경화 증 또한 중앙 신경의 면역 중재 하는 질병 이며, NMOSD12와 많은 유사점을 공유. 그러나, 안티-AQP4 IgG만 NMOSD13에 긍정적 이다. 둘째, 안티-AQP4 IgG NMOSD 환자 중 일반적 이다. NMOSD 환자의 약 2/3는 세럼 안티 AQP4 igg가 양성4. 셋째, 가장 최근의 진단 기준 NMOSD 세럼 안티-AQP4 기반에 대 한 IgG 테스트5. 함께 찍은, 세럼 안티 AQP4 IgG 탐...

혈 청 AQP4 IgG neuromyelitis optica 스펙트럼 장애 (NMOSD)1코어 진단 바이오 마커 이다. 세포 기반 분석 결과 (CBA)은 높은 감도와 특이성 널리 안티-AQP4 IgG 감지 방법입니다. 여기, CBA에 대 한 상세한 프로토콜 소개 된다.
AQP4, 물 채널 단백질 막에 걸친 6 단위 있으며 수성 하나를 둘러싼 두 개의 헬리컬 도메인2기 공. 안티 AQP4 IgG를 대상 주로 이다3의 endfeet에 있는 AQP4 바인딩을 통해 NMOSD의 병 인에서 포함 된다. 그것은 안티-AQP4 IgG는 긍정적인 NMOSD 환자4의 약 2/3에 표시 되었습니다. NMOSD에 대 한 가장 최근의 국제 진단 기준, 안티-AQP4 IgG 코어 진단 바이오 마커5간주 됩니다. 이와 관련, 그것은 인간의 혈 청을 감지 하는 신뢰할 수 있는 프로토콜을 설정 하는 중요 한 안티-AQP4 IgG NMOSD의 임상 진단을 용이 하 게 하 고.
현재, 다양 한 안티-AQP4 IgG 탐지 방법 CBA, 조직 기반 분석 결과, 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과, 흐름 cytometry6,7등 사용할 수 있습니다. CBA 안티 AQP4 IgG를 잡으려고 인간의 AQP4와 페 EU90 셀을 사용 합니다. 캡처된 안티-AQP4 IgG 형광 이차 항 체에 의해 감지 하 고 이후에 현미경 검사 법에 의해 시각. 증거를 축적 하는 것은 CBA는 더 과민 하 고 다른 안티 AQP4 IgG 감지 방법6,7보다 구체적인 것을 보이고 있다. 메타 분석에 따르면 민감도 특이성 CBA의 76%와 99%, 조직 기반 보다 높은 표시 했다 하 고 효소 연결 된 immunosorbent 분석 실험6. 또한, 안티 AQP4 IgG의 진단 분석 실험의 되 비교가 했다 실시7. 15 유럽 진단 센터에서 과목은 193 연구 총 등록7. 4 가지 방법은 세럼 안티 AQP4 IgG7검색을 활용 했다. 그것은 CBA는 더 과민 하 고 특정 다른 방법7보다 시연 했다. AQP4 (AQP4-m 1과 AQP4-M23) 두 주요 isoforms로 표현 이다, 안티-AQP4 IgG 캡처 셀 AQP4 M1 또는 AQP4-M23 페입니다. 그러나, 어떤 유형의 캡처 셀 더 남아 논란입니다. 한 조사는 AQP4-M1 기반의 지원 CBA8, 다른 AQP4-M23 CBA를 기반으로 표명 하는 동안은 더 나은7,,910. 그러나, AQP4-M23 기반 CBA 난다 IgG 바인딩8거짓 긍정적인 결과 얻을 수 있습니다. Jarius 외입니다. 11 AQP4-m 1와 AQP4-M23 기반 CBAs 안티 AQP4 IgG 검출 률에 큰 차이 보도 했다.
요약, 세럼 안티-AQP4에 IgG는 NMOSD에 대 한 핵심 바이오 마커. CBA는 높은 특이성 및 다른 안티 AQP4 IgG 탐지 방법 보다 감도 있습니다. AQP4-M1-또는 AQP4-M23-CBA는 더 나은 여부 논란이 남아 있다. 이 문서에서는, CBA AQP4-M1-기반에 대 한 상세한 프로토콜 설명, 임상 진단 및 NMOSD의 연구에 적용할 수 있는 합니다.

<table><tbody><tr><td>Anti-aquaporin-4 IIFT</td><td>Euroimmun</td><td>FA 1128-2005-50</td><td>AQP4-M1 transfected 및 untransfected EU 90 세포로 코팅된 바이오칩 슬라이드, 플루오레세인 표지된 anti-human IgG, 양성 대조군으로서의 anti-AQP4 항체, 항체 음성 샘플, PBS pH 7.2, Tween 20 및 임베딩 배지용 염을 포함합니다.</td></tr><tr><td>CellSens Dimension</td><td>OLYMPUS</td><td>N/A</td><td>사진 소프트웨어</td></tr><tr><td>젤 & 응고 활성제 튜브</td><td>의료</td><td>623040202</td> 개선 <td>중국 현지 회사</td></tr></tbody></table>

세포 기반 분석 결과 의해 인간의 혈 청 안티-aquaporin-4 면역 글로불린 g 검출

Human Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G Detection by Cell-based Assay

안티-aquaporin-4 (AQP4) 면역 글로불린 G (IgG) neuromyelitis optica 스펙트럼 장애 (NMOSD)에 대 한 핵심 진단 바이오 마커 이다. 세포 기반 분석 결과 (CBA) 높은 감도와 특이성 인간 혈 청에 안티 AQP4 IgG를 감지 하는 널리 사용 되는 방법 이다. 간단히, 세럼 안티 AQP4 IgG AQP4 페 셀은 바이오 칩에 고정 후 fluorescein 붙인 이차 항 체에 의해 감지에 의해 캡처됩니다. 형광 현미경 검사 법은 형광, 시각화를 활용 하 고 형광의 강도 두 개 이상의 경험이 풍부한 임상에서 평가. NMOSD의 최종 진단 안티 AQP4 IgG 검출 결과, 임상 발현 및 neuroradiological 발견의 조합에 따라 만들 수 있습니다. 이전 연구에 따르면 CBA는 더 과민 하 고 특정 다른 안티 AQP4 IgG 탐지 방법 보다 그리고 임상 진단 및 NMOSD의 연구에 적용할 수 있습니다. 메서드는 제한; 예를 들어 세럼 안티 AQP4 IgG titers를 평가 하는 국제 규모는 여전히 부족 합니다. 여기, 인간 혈 청 안티 AQP4 IgG 감지 CBA를 사용 하 여 상세한 프로토콜을 설명 합니다.

여기에 설명 된 절차를 사용 하 여, 혈 청 igg가 특정 안티-AQP4 감지입니다. 절차 동안, 미리 희석된 샘플, 긍정적인 통제 및 부정적인 제어 transfected untransfected 영역 (그림 2)를 포함 하는 반응 필드에 추가 되었습니다. Transfected 지역에 부정적인 컨트롤의 형광은 주로 봄에는 (그림 3)에 transfected 세포에 이차 항 체의 불특정 바인딩 표시. 균질 약한 형광 표시 (그림 3) 했다. 긍정적인 컨트롤, 안티-AQP4 항 체 반응 필드에 추가 되었습니다. (그림 4)의 transfected 세포에 AQP4-m 1에 안티 AQP4 IgG의 특정 바인딩 표시 transfected 영역에서 강한 형광 관찰 되었다...

세포 기반 분석 결과 세럼 안티-aquaporin-4 면역 글로불린 g.를 검출 하기 위하여 널리 사용 방법은 이 메서드는 임상 진단 및 neuromyelitis 광학 스펙트럼 장애의 과학적 연구에 적용할 수 있습니다.

세포 기반 분석 결과 의해 인간의 혈 청 안티-aquaporin-4 면역 글로불린 G 검출

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay ...

신경수염 광학 스펙트럼 장애에 대한 최근의 국제 진단 기준에 따르면, 안티 AQP4 IgG는 핵심 진단 바이오마커로 간주됩니다. 세포 기반 분석체에 의한 안티-AQP4 IgG 검출은 임상 진단을 용이하게 할 수 있다. 따라서 세포 기반 분석법은 다른 검출 방법보다 더 민감하고 특이적입니다.그리고 그것은 임상 진단과 과학적 연구 모두에 적용 될 수있다. 먼저, 냉장 된 세포 기반 분석 키트에서 환자의 혈청 샘플, 바이오 칩 슬라이드, PBS 분말 및 TWEEN 20을 실온으로 가져 온다. 그런 다음 각 바이오칩 슬라이드에 대해 0.2% TWEEN 20을 함유한 PBS 워시 버퍼 200밀리리터 이상을 준비합니다.워시 버퍼를 사용하여 각 혈청 샘플의 10배 연속 희석제를 만듭니다. 제조업체의 지침에 따라 양수 및 음수 컨트롤을 준비합니다. 시약 트레이의 5개의 개별 반응 필드에 시료, 양성 제어 및 음의 대조군의 10배 직렬 희석제 30마이크로리터를 추가합니다.슬라이드로 바이오칩 슬라이드를 잡고 반응 필드를 건드리지 않고 보호 커버를 제거합니다. 슬라이드를 시약 트레이 위에 놓고 실온에서 30 분 동안 설정을 배양하십시오. 세척 버퍼로 바이오칩 슬라이드를 부드럽게 헹구십시오.그런 다음 세척 버퍼의 100 밀리리터로 채워진 500 밀리리터 비커에 담그고 10 분 동안 실온에 둡니다. 세척 버퍼에서 바이오 칩 슬라이드를 꺼내. 종이 타월을 사용하여 반응 필드 외부에서 남은 버퍼를 조심스럽게 닦아냅니다.슬라이드를 1~2분 동안 공기 건조시키세요. 어두운 방에서, 시약 트레이의 각 반응 필드에 형광 이차 항체의 25 마이크로 리터를 추가합니다. 슬라이드를 시약 트레이 위에 놓고 실온에서 30 분 동안 설정을 배양하십시오.세척 버퍼로 바이오칩 슬라이드를 부드럽게 헹구십시오. 그런 다음 신선한 세척 버퍼 100 밀리리터로 채워진 500 밀리리터 비커에 담그고 10 분 동안 실온에 둡니다. 세척 버퍼에서 바이오 칩 슬라이드를 꺼내.종이 타월을 사용하여 반응 필드 외부에서 남은 버퍼를 조심스럽게 닦아냅니다. 슬라이드를 1~2분 동안 공기 건조시키세요. 생체 칩 슬라이드의 각 반응 필드에 포함 매체1 방울을 조심스럽게 추가하십시오.마지막으로, 공기 거품을 피하면서 커버 유리로 바이오 칩 슬라이드를 밀봉하고 이미징을 진행합니다. 감염된 부위에서 관찰되는 음수 대조군의 약한 형광 강도는 이차 항체의 특이하지 않은 결합을 나타낸다. 감염된 및 감염되지 않은 영역에서 양성 제어의 검출된 형광 강도 사이의 비교는 감염된 세포에서 AQP4 GG에 대한 항-AQP4 IgG의 특이적 결합을 나타낸다.항 AQP4 IgG 음성 혈청은 감염및 감염되지 않은 영역에서 음의 대조군과 유사한 결합 패턴을 보여줍니다. 양성 혈청은 감염된 부위와 감염되지 않은 영역에서 양성 대조군과 유사한 결합 패턴을 보여줍니다. 샘플은 감염된 지역에서 형광 이질이 증가할 때 안티-AQP4 IgG 양성으로 간주됩니다.형광의 강도는 혈청에서 안티 AQP4 IgG 티터와 상관 관계가 있습니다. 견본은 단지 전염된 지역에 있는 세포의 소수만이 검출가능한 형광 강도를 보여줄 때 아마 긍정적인 것으로 여겨질 것입니다. 샘플은 감염된 부위의 강도가 감염되지 않은 부위보다 균질적으로 더 강할 때 항 AQP4 IgG 음수로 간주되어야 합니다.기포를 피하는 것은 매우 중요하고 어렵습니다. 기포를 제거하려면 먼저 파이펫을 사용하여 물방울의 기포를 피하십시오. 둘째, 시약 트레이에 바이오칩 슬라이드를 적용하는 동안 먼저 슬라이드의 한쪽이 방울을 만지고 슬라이드를 천천히 평평하게 합니다.또한, 실험 전반에 걸쳐 반응 필드를 만지지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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바이러스 특수형에 걸쳐 혈청 항체의 폭을 측정하기 위해 인플루엔자 항원 마이크로어레이의 사용

배우세요 세포 기반 분석법을 사용하여 인간 혈청에서 anti-AQP4 IgG를 검출하는 방법을. 이 기술은 신경척수염 광범위 장애의 임상 진단에 높은 민감도와 특이도를 제공합니다.

세포 기반 분석 결과 의해 인간의 혈 청 안티-aquaporin-4 면역 글로불린 G 검출

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