Name: 마우스 모델을 평가 타고 난 면역 반응 포도 상 구 균 감염 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: 배우세요 마우스 피부 상처와 Staphylococcus aureus 감염에 대한 선천성 면역 반응을 실시간으로 모니터링하는 방법을. LysM-EGFP 마우스를 활용한 이 기술은 감염 역학과 치료 전략 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 국립 연구소의 건강 보조금 R01 AI129302 (S.I.S.) 하 고 약리학의 교육 프로그램에 의해 지원 되었다: UC 데이비스에서 머리 맡에서 벤치 (NIH T32 GM099608 L.S.A에). 분자와 게놈 이미징 (CMGI) 캘리포니아 대학 데이비스에서 최상의 기술적 지원을 제공 했습니다.

모든 마우스 연구 검토 되었다 기관 동물 관리 및 사용 위원회 UC 데이비스에 의해 승인 및 동물 복지 행위와 건강 연구 연장 행위의 지침에 따라 수행 했다. 동물 들과 함께 작업 하는 경우 멸 균 장갑을 사용 해야 합니다.
1. 마우스 소스 및 주택
<ol><li>LysM-eGFP 마우스 C57BL/6J 유전 배경에 파생12위에서 설명한 대로. LysM-EGFP × MyD88-/- 마우스 C57BL/6J 배경에 MyD88-/- 생쥐와 건너 LysM EGFP 쥐에 의해 파생 됩니다.</li>
	<li>집 마우스는 물고기에서. 이러한 연구에 대 한 동물, 수술 및 단일 지 내게 다음 수술 전에 그룹에 데이비스가 주 대학에 보관 되어 있었다. 10-16 주 사이의 마우스를 사용 합니다.</li>
</ol>2. 세균성 준비 및 정량화
<ol><li>제거는 발광 얼음 해 동-80 ° C 저장소에서 관심의 S. 구 균 긴장. 5% 소 혈액 한 천 배지에서 행진. 37 ° C에서 하룻밤 (16h) 습도 인큐베이터에서 질주 된 접시를 품 어. 참고:이 프로토콜에서 ALC2906 SH1000 변형 사용 되었다. 이 긴장은 Photohabdus luminescens18 luxABCDE 기자 카세트를 융합 하는 페니실린 의무적인 단백질 2 모터와 셔틀 플라스 미드 pSK236를 포함 합니다.</li>
	<li>순수한 물, 그리고 오토 클레이 브 소독 하는 TSB의 mL 당 TSB 가루 0.03 g을 혼합 하 여 tryptic 간장 국물 (TSB)를 준비 합니다. 냉각 되 면, 모든 필요한 항생제 무 균 기술을 사용 하 여 추가 합니다. 이 프로토콜에서 생물 발광 luxABCDE 카세트 포함 된 pSK236 셔틀 플라스 미드의 표현에 대 한 선택 하는 TSB를 페니18 10 µ g/mL를 추가 합니다.</li>
	<li>TSB에 하룻밤 문화 시작 10 µ g/mL 페니와 S. 구 균 격판덮개에서 3-4 별도 식민지를 선택 합니다. 37 ° C에서 하룻밤 (16h) incubating 뿌리에 박테리아를 품 어.</li>
	<li>10 µ g/mL 페니와 TSB에 샘플 1시 50분을 diluting 하 여 하룻밤 문화에서 새로운 세균성 문화를 시작 합니다. 200 rpm와 37 ° C에서 incubating 셰이 커에 문화</li>
	<li>S. 구 균을 분한 후 두 시간 모니터링 600에서 광학 밀도 분 광 광도 계에 nm (OD600). OD600 대 중반 로그 단계 성장 찾는 데 시간을 관찰 합니다. ALC2906 SH1000 스트레인에 대 한 0.5 세600 중반 로그 이며 1 x 108 CFU/mL (그림 1)의 농도에 해당 합니다.</li>
	<li>OD600 0.5 이면 씻어 박테리아 얼음 DPBS와 1:1. 3000 x g 와 4 ° C에서 10 분 동안 박테리아 원심 신중 하 게 가만히 따르다는 상쾌한 고 추가 냉장된 DPBS와 소용돌이 철저 하 게 추가 합니다. G 와 4 ° C x 3000에서 10 분 동안 한 번 더 원심 분리기</li>
	<li>신중 하 게는 상쾌한을 가만히 따르다. 원하는 농도에 세균성 펠 릿을 resuspend. 이러한 연구에 대 한 ALC2906 SH1000 3 mL을 수집 하 고 1.5 ml PBS, 약 2 x 108 CFU/mL의 세균 농도에 연관의 resuspend. 사용까지 얼음에 박테리아를 유지.</li>
	<li>박테리아 농도 확인 하려면 100 µ L 세균 샘플 1:10,000 및 1:100,000 PBS에 희석. 한 천 배지에서 20 µ L aliquots 플레이트. 총 검사 16 헤 수 CFUs에 대 한 습도 인큐베이터에서 37 ° C에서 품 어 하 고 세균성 농도 다음 날을 계산.</li>
</ol>3. excisional 피부 Wounding 및 S. 구 균 으로 접종
<ol><li>복 주입을 통해 각 마우스를 0.03 mg/mL buprenorphine 염 산 염 (~0.2 mg/kg)의 100 µ L를 관리 합니다.</li>
	<li>20 분 후 주입, 2-4 %isoflurane 2-3 LPM 산소 챔버에 장소 2-4 마우스 일단 마우스는 완전히 마 취, 코 콘을 한 번에 한 2-4 %isoflurane 2-3 LPM 산소에 연결 된 마우스를 전송 합니다. 마우스는 완전히 단단히 각 후방 발 엄지와 집게 손가락 사이 곤란 하 게 하 여 마 취를 확인 합니다. 동물 핀치에 응답 하지 않는 경우 다음 단계를 진행 합니다.</li>
	<li>마우스의 뒷면에 2 인치 섹션 1 인치 전기 면도기로 면도 하 고 모피 잘라낸 깨끗 한 지우기 또는 거 즈를 사용 하 여 영역을 지웁니다. 초과 염증을 일으킬 수 있기 때문에 탈모 로션을 사용 하지 마십시오.</li>
	<li>깨끗 한 마우스의 뒤로 처음 10 %povidone-요오드 젖은 거 즈와 함께 다음 70% 에탄올 젖 었 거 즈. 나선형 패턴, 외과 영역의 중심에서 바깥쪽으로 이동 영역을 청소. 수술 전에 건조 외과 영역에 대 한 약 1 분을 기다립니다.</li>
	<li>
두 손가락 사이 느슨하게 마우스 뒷면 면도 잡고 누르고 단단히 준비 외과 영역의 중앙에 살 균 6 m m 펀치 생 검. 당겨 하지 마십시오 피부 긴장 늦추지.
	<ol>
<li>트위스트 원형 개요 개요의 적어도 한 부분에서 피부를 통해 완벽 하 게 인하 피부에 만들려고 펀치 생 검. 수 기본 근 막 또는 조직으로 잘라 하지 않도록 주의 하십시오.</li>
		<li>살 균가 위와 집게를 사용 하 여 표 피와 진 피 펀치 생 검에 의해 각 인 원형 패턴을 통해 잘라.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 미 균 접종
<ol><li>원하는 발광 세균 접종으로 28 G 인슐린 주사기를 채우십시오. 이 연구에서는 관리 1 x 108 CFU/mL의 농도 (50 µ L). 볼륨의 이상의 100 µ L를 관리 하지 않습니다.</li>
	<li>
마우스의 뒷면에 상처의 중심에 조직과 근 막 사이 접종의 50 µ L을 주입. 확인은 접종 최소한의 누설 또는 분산 상처의 중심에 거품을 형성 합니다.
	<ol>
<li>진 피 쪽으로 당겨, 주사기는 조직에 거의 평행한 누른 저항에 갑자기 감소 느낌, 근 막의 피어 싱 하는 것을 나타내는 때까지 천천히 조직에 주사기를 밀어. 조심 스럽게 상처의 중심으로 주사기를 리드 하 고 천천히는 접종을 분배. 동물에서 주사기를 천천히 제거 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>위에서 설명한 대로 감염된 동물의 상처에 살 균 PBS의 동일한 볼륨을 삽입할.</li>
	<li>그것의 감 금에 있는 동물을 반환 합니다. 케이지 열 램프 아래에서 또는 열 패드 위에 놓고 마 취에서 회복까지 동물을 모니터링 합니다.</li>
</ol>5.에 비보 씨 FLI
<ol><li>악기 소프트웨어를 통해 전체 동물 영상을 초기화 합니다. 2-4 %isoflurane 2-3 LPM 산소를 받고 챔버에 마우스 anesthetize Nosecones는 영상 내부에 마 취를 제공 합니다.</li>
	<li>
영상에 상처와 감염 된 마우스를 놓습니다. 상처는 가능한 평면 같은 마우스를 놓습니다. 다음 순서 대로 설치를 사용 하 여 이미지에 마우스를.
	<ol>
<li>이미지 모드와 발광 고 사진을 선택 합니다. 노출 시간은 작은 binning와 F/중지 1 (발광)와 F/중지 8 (사진)에서 1 분입니다. 배기 필터는 열려있습니다. 이미지를 기록 하기 위해 취득 버튼을 클릭 합니다.</li>
		<li>형광 및 사진 이미지 모드 선택 합니다. 노출 시간은 1 작은 binning 및 F/정지 1 (형광) s와 F/중지 8 (사진) 465/30의 여기 파장으로 nm와 높은 램프 강도 방출 파장 520/20 nm. 이미지를 기록 하기 위해 취득 버튼을 클릭 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>마 취에서 회복까지 그것의 감 금 소 및 모니터에 동물을 반환 합니다.</li>
	<li>이미지 마우스 매일 설명 대로 위의입니다.</li>
</ol>6. 이미지 분석
<ol><li>오픈 이미지를 측정할 수입니다.</li>
	<li>둘러싼 각 마우스 이미지에 대 한 피부를 포함 한 전체 상처 영역에 관심 (ROI)의 큰 원형 영역을 배치 합니다. Neutrophil vivo에서 FLI EGFP 신호 및 생체 조건 씨 미 균 신호 몇 일 후 상처 가장자리를 넘어 확장 하 고 이러한 연구 (그림 2A 와 2B)에 포함 됐다. 측정 ROI 와 각 마우스에 대 한 평균 유량에 대 한 레코드 값을 클릭 합니다. 각 시간 대 신호 (p/s)의 평균 유량을 플롯 합니다.</li>
	<li>
호 중구 또는 S. 구 균 은 상처에서의 절대 숫자는 원하는 경우 다음과 같은 실험을 수행 합니다.
	<ol>
<li>호 중구 수 FLI EGFP vivo에서 신호를 상관 관계, C57BL/6J 쥐, 위에서 설명한 대로 상처와 LysM EGFP 또는 LysM-EGFPxMyD88-/- 기증자 로부터 골 수 파생 된 호 중구 (5 x 105 1 x 107)의 범위를 전송 바로 위에 다른 상처. 이미지 설명으로 위의 상관 관계가 vivo에서 FLI EGFP 호 중구의 알려진된 수량을 신호 한다.</li>
		<li>S. 구 균 CFU vivo에서 라스 신호 상관 관계, 상처 하 고 위에서 설명한 대로 쥐를 감염. 하루에 1 감염 된 후 레코드 vivo에서 라스 신호 쥐에서 그리고 즉시 안락사 하 고 시체를 진정. 상처를 소비 세, 조직, 균질 하 고 접시에 야간 보육에 대 한 한 천 세균성 희석. 다음 날, 식민지 상처 당 CFU를 결정 하기 위해 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>상처 가장자리와 상처 (cm2)의 측정 영역을 통해 상처 치유 맞는 원형 ROI를 측정 하 고 대 시간 (그림 2C) 기준에서 변화를 플롯.</li>
</ol>7입니다. 통계
참고: 모든 데이터 표시 됩니다으로 의미 ±SEM. p < 0.05 통계적으로 간주 됐다
<ol><li>Holm Sidak 메서드를 사용 하 여 하루에 두 그룹 간의 차이점을 결정, 알파 = 0.05, 그리고 일관 된 sd. 가정 없이 각 시간 포인트를 개별적으로 분석 하는 방법</li>
	<li>Tukey 다중 비교 posttest 가진 일방통행 ANOVA에 의해 같은 날에 여러 그룹 간의 차이점을 비교 합니다. 실험 그룹 간의 생존 벽난로 콕스 방법으로 분석 했다.</li>
</ol>

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로이드 S. 밀러 MedImmune, 화, Regeneron, 그리고 찬 순 Shiong Nanthealth 기초 및 보고 작업에 관련 되지 않은 컨설팅 수수료 Noveome Biotherapeutics와 찬 순 Shiong Nanthealth 재단에서 교부 금 지원을 받고 있다 에이 종이. 다른 저자는 공개 없다.

S. 구 균 감염 모델 발광 S. 구 균 을 활용 하는 전체 동물 vivo에서 광학 이미징의 고급 기술 함께에서 형광 호 중구 기자 마우스에서 감염 고급는 타고 난의 우리의 지식을 감염에 면역 반응입니다. 이전 LysM EGFP 마우스를 사용 하 여 연구는 최대 S. 구 균 감염 된 상처를 감염의 첫 24 시간 동안을 1 x 107 호 중구 모집14, 그리고 상처 모집 neutrophils 확장 그들의 반감기 1.5 일에서 5 일 S. 구 균에 대 한 응답-감염 된 상처22. 감염을 방지 하기 위해 쥐에 의해 적응은 생존 전략은 인신 매매 조 혈 줄기와 조상 세포 (HSPC)의 감염 된 상처를 그들이 TLR2/MyD88/PGE2 살 균 EGFP+ 호 중구로 확장 하는 골 수에서 종속 방식으로...

황색 포도상구균 (S. 구 균) 피부 및 연 조직 감염 (SSTIs) 미국1의 대부분을 차지 한다. 발생률 감염 지난 2 년간2, 지 속성의 메커니즘 및 새로운 치료 전략의 발견의 연구 동기 부여 동안 꾸준히 증가 메 티 실린 내성 S. 구 균 (MRSA)의. MRSA 감염에 대 한 치료의 표준 조직 항생제 치료, 하지만 시간3 MRSA 항생제에 저항력이 점점 되고있다 그리고 이러한 약물에 특히 부정적인 건강 효과 일으키는 호스트의 유익한 미생물을 점감 할 수 있다 아이 들4. 전 임상 연구5MRSA 감염 치료 하는 대체 전략 검사 하지만 번역 클리닉에 이러한 접근 호스트 면역 반응6저지 독성 요인의 출현으로 인해 어려운 입증 했다. 드라이브 미 균 SSTIs 호스트 병원 체 역학을 해 부, 우리 비 침범 성 결합 및 호 중구 수의 경도 판독 상처 침대에 세균성 풍부의 운동 측정을 가진 모집 영역 상처.
호 중구는 인간과 세균 감염7초 동 조치에서 가장 풍부한 순환 백혈구. 호 중구는 반응성 산소 종, 프로 테아 제, 항균 성 펩 티 드 및 기능적인 응답의 생산을 포함 하 여 그들의 살 균 메커니즘으로 인해 미 균 감염에 대 한 효과적인 호스트 응답에 대 한 필요한 구성 요소 식 균 작용 및 호 중구 extracellular 함정 생산8,9를 포함 하 여. Chediak-히가시 증후군 등 만성 granulomatous 질환 호 중구 기능에 유전 결함을 가진 인간 환자는 S. 구 균 감염에 걸릴을 보여줍니다. 또한, 환자 유전자 (예: 선 천 성 호 중구 감소 증)와 인수 (예: 화학 요법 환자에서 호 중구 감소 증) 결함에 호 중구 수는 또한 S. 구 균 감염10에 매우 취약. 지우기 S. 구 균 감염에서 호 중구의 중요성을 감안할 때, 그들의 면역 능력을 강화 하거나 S. 구 균 병 변 내에서 그들의 숫자를 튜닝은 감염을 해결에 효과적인 전략을 증명할 수 있습니다.
지난 10 년간, 형광 호 중구 기자와 유전자 변형 쥐 그들의 밀매11,12연구 개발 되었습니다. 호 중구 기자 마우스 전체 동물 이미징 기술을 결합 조직 및 장기에 호 중구의 spatiotemporal 분석을 허용 합니다. S. 구 균의 발광 종자와 결합 하면, S. 구 균 풍요에 대 한 응답에서 호 중구의 축적을 추적 하 고 세균 독성의 맥락에서 지 속성 요소는 직접 및 간접적으로 영향을 받는 조직13,14,,1516호 중구 수 교란
마우스는 인간 보다 미 균 독성 및 면역 회피 메커니즘을 적습니다. 따라서, 야생-타입 마우스의 효능을 조사 하는 이상적인 동물 모델을 되지 않을 수 있습니다는 만성 S. 구 균 치료 치료 주어진 감염. MyD88 불충분 한 쥐 (즉, MyD88-/- 생쥐), 부족 기능 interleukin-1 수용 체 (IL-1R) 및 통행세 같이 수용 체 (TLR) 신호, 표시 S. 구 균 감염에 비해 더 큰 민감성 immunocompromised 마우스 스트레인 야생-타입 마우스17 그리고 피부18에 S. 구 균 감염의 사이트에 호 중구 매매에 장애. MyD88-/- 생쥐에서 형광 호 중구 기자를 보유 하 고 있는 마우스 스트레인의 개발 조사 현재 neutrophil에 비해 S. 구 균 감염을 치료 하는 요법의 효능에 대 한 대체 모델을 제공 하고있다 기자 쥐입니다.
이 프로토콜에서 우리 immunocompromised LysM EGFP × MyD88-/- 생쥐에서 S. 구 균 감염을 특성화 하 고 시간 과정 및 LysM EGFP 쥐과 감염의 해상도 비교. LysM-EGFP × MyD88-/- 생쥐 해결 되지 않으면, 만성 감염을 개발 하 고 8 일 후 감염에 굴복 하는 75%. 초기 호 중구 채용에 중요 한 결함 발생의 감염, 염증 성 단계 이상 72 h 그리고 감염의 후반 단계에서 50% 적은 neutrophils 모집. LysM-EGFP × MyD88-/- 생쥐에 게 특정 스트레인의 새로운 치료 기술 현재에 비해 S. 구 균 감염을 대상으로 효능을 평가 하는 엄격한 전 임상 모델의 증가 자화 율 모델을 야생-타입 쥐, 감염에 대 한 타고 난 면역 반응 향상을 목표로 특히 기법을 활용 합니다.

<table><tbody><tr><td>14 mL 폴리프로필렌 라운드-바텀 튜브</td><td>팔콘</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>6 mm 일회용 생검 펀치</td><td>인테그라 밀텍스</td><td>33-36</td><td></td></tr><tr><td>생물발광 S. aureus</td><td>로이드 밀러, 존스 홉킨스&nbsp;</td><td>ALC 2906 SH1000</td><td></td></tr><tr><td>소 혈액 한천, 5%, Hardy Diagnostics</td><td>VWR</td><td>10118-938</td><td></td></tr><tr><td>부프레노프린 염산염 주사 가능한</td><td>Western Medical Supply</td><td>7292</td><td>0.3 mg/mL</td></tr><tr><td>C57BL/6J 마우스</td><td>잭슨 Labratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol(결정 분말)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP904-100</td><td></td></tr><tr><td>DPBS(1x)</td><td>기코&nbsp;</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>인슐린 주사기</td><td>Becton, Dickson and Company</td><td>329461</td><td>0.35 mm (28 G) x 12.7 mm (1/2'')</td></tr><tr><td>IVIS 스펙트럼 생체 내 이미징 시스템</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>Living Image Software &ndash; IVIS 스펙트럼 시리즈</td>, <td>Perkin Elmer</td>, <td></td> 128113 <td></td></tr><tr><td>LysM-eGFP 마우스</td><td>, 토마스 그라프, 알버트 아인슈타인, 뉴욕 대학&nbsp;</td><td></td><td></td>NA</tr><tr><td>Microvolume Spectrophotometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>MyD88 KO Mice</td><td>Jackson Labratory</td><td>009088</td><td></td></tr><tr><td>Non-woven sponges</td><td>AMD- Ritmed Inc</td><td>A2101-CH</td><td>5 cm x 5 cm</td></tr><tr><td>Povidone 요오드 10% 용액</td><td>Aplicare</td><td>697731</td><td></td></tr><tr><td>Prism 7.0</td><td>GraphPad 소프트웨어</td><td>라이선스&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tryptic Soy Broth</td><td>Becton, Dickson and Company</td><td>211825</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 모델을 평가 타고 난 면역 반응 포도 상 구 균 감염

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

황색 포도상구균 (S. 구 균) 감염, 메 티 실린 내성 얼룩을 포함 하 여 보건 의료 시스템에 대 한 엄청난 부담 있습니다. 매년 등반 S. 구 균 감염의 발병 률, 그것의 pathogenicity 추가 연구에 대 한 수요가 있다. 전염 성 질환의 동물 모델 호스트 병원 체 응답의 우리의 이해를 전진 하 고 효과적인 치료제의 개발으로 이어질. 호 중구는 감염 떨어져 벽 세균성 클리어런스; 촉진 하 농 양을 형성 하 여 S. 구 균 감염을 제어 하는 타고 난 면역 반응에서 기본 역 종종 S. 구 균 피부 감염을 침투 하는 호 중구 수가 질병 결과와 상관 한다. 향상 된 녹색 형광 단백질 (EGFP) Lysozyme M (LysM) 발기인 지역 (주로 호 중구에 의해 표현)에 삽입, 소유 하는 LysM EGFP 마우스와 함께에서 사용 될 때 vivo에서 전체 동물 형광 이미징 (FLI) 제공를 상처 입은 피부에 호 중구 이주 noninvasively 및 경도 측정을 의미 합니다. 발광 S. 구 균 과 결합 될 때 긴장과 순차적 vivo에서 전체 동물 발광 영상 (BLI), 그것은 경도 호 중구 모집 역학과의 사이트에서 vivo에서 세균성 부담 모니터링 가능 해상도 또는 죽음 감염의 발병에서 마 취 생쥐에 감염. 마우스는 더 효과적인 식민과 인간에서 감염을 촉진 하는 S. 구 균 에 의해 생산 독성 요인의 수를 방지. 영구 미 균 검사를 더 민감한 동물 모델을 제공 하는 immunodeficient 쥐 감염 및 치료의 능력을 타고 난 면역 반응 향상. 여기, 우리는 야생-타입 LysM EGFP 쥐 S. 구 균 피부 상처 감염 조사를 함께 MyD88 불충분 한 쥐 (LysM-EGFP × MyD88-/- 생쥐) 자란 LysM EGFP 마우스에 응답을 특징. Multispectral 동시 탐지 vivo에서 FLI, vivo에서 씨를 사용 하 여 세균성 부담을 사용 하 여 호 중구 모집 역학의 연구를 활성화 하 고 상처 치유 경도 noninvasively 시간이 지남에.

LysM-EGFP × MyD88-/- 생쥐는 LysM EGFP 마우스 보다 S. 구 균 감염에 더 취약
S. 구 균 이 연구, ALC290618, 에 사용 된의 스트레인 라이브 하 고 적극적으로 metabolizing 박테리아에서 발광 신호를 생성 하는 럭 스 구조를 포함 하는 플라스 미드와 함께 건설 되었다. 쥐에 주사 하는 경우 경도 측정 박테리아 감염 된 상처를 내에서 부담 하 vivo에서 생물 발광 영상 (BLI) 기법을 사용할 수 있습니다. 두 LysM EGFP × MyD88-/- 생쥐와 LysM EGFP 쥐 부상 되었고 1 x 107 CFU S. 구 균 감염의 민감성을 비교 하는...

피부 부상에 타고 난 면역 반응의 실시간 탐지 및 쥐의 포도 상 구 균 감염에 대 한 접근 방식을 설명 합니다. 비교 LysM EGFP 여 쥐 (형광 neutrophils 보유) LysM EGFP와 잡종 immunodeficient 마우스 스트레인, 우리가 미리 감염에 대 한 우리의 이해 및 감염을 방지 하는 방법의 개발.

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...

박테리아 부담을 모니터링하고 호중구 반응을 동시에 하는 기술은 Staph 아우레우스 지속성의 메커니즘과 치료 전략의 효능에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 여러 매개 변수가 감염 기간 내내 라이브 호스트에서 세로로 측정될 수 있다는 것입니다. 마우스 도르섬에 상처를 배치하는 곳, 피부를 소비하는 방법, Staph 아우레우스로 상처를 접종하는 방법을 보여주는 것이 중요합니다.먼저 얼음에 대한 음의 섭씨 80도 저장에서 관심의 생물 발광 Staph aureus 변형을 해동하여 시작합니다. 5%의 소 혈액 화마 접시에 문화를 줄무늬하기 전에. 섭씨 37도에서 하룻밤 잠복식.다음 날 아침, Staph aureus 플레이트에서 트립틱 콩 국물 또는 TSB로 3~4개의 개별 식민지를 옮기. 클로람페니콜 밀리리터당 10마이크로그램으로 보충하여 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 흔들리는 배양을 제공합니다. 다음 아침, TSB의 6 밀리리터에 문화 샘플의 120 마이크로 리터를 희석.클로람페니콜 밀리리터당 10마이크로그램, 섭씨 37도에서 2시간 배양, 분당 200회 회전. 600 나노미터의 광학 밀도가 0.5에 도달하면 세균 현탁액 3 밀리리터를 10 밀리리터 얼음 차가운 DPBS로 옮춥니다. 상체를 조심스럽게 탈수 한 후, 펠릿에 차가운 DPBS를 추가하고 다시 중단 된 박테리아를 철저히 소용돌이시다.두 번째 원심 분리 후, 얼음에 PBS의 1.5 밀리리터에서 세균 펠릿을 다시 중단. 박테리아 농도를 확인하기 위해 세균 현탁액의 마이크로리터 100개를 4대 10, 5번으로 1x 10으로 희석하여 신선한 PBS로 희석한다. 그리고 개별 한천 접시에 각 희석의 20 마이크로 리터를 플레이트.섭씨 37도에서 하룻밤 잠복 후, 전날의 세균 농도를 계산하기 위해 총 검사에 의한 식민지 형성 단위의 수를 계산합니다. 수령인 동물의 절제된 피부 상처의 경우 마우스 뒷면에 1 인치 씩 면도하기 전에 발가락 핀치에 대한 반응부족을 확인하십시오. 길 잃은 머리카락을 제거하기 위해 부드럽게 닦으십시오.순차적으로 10%의 포비도요오드, 70%에탄올에 젖은 거즈 어플리케이션으로 노출된 피부를 소독합니다. 나선형 패턴으로 외과 부위의 중심에서 바깥쪽으로 이동합니다. 피부가 약 1 분 동안 건조 할 수 있게 한 후 준비 된 수술 영역의 중앙에 멸균 6 밀리미터 펀치 생검을 단단히 누릅니다.펀치 생검을 비틀어 피부에 원형 윤곽선을 만들고 피부 조직을 완전히 잘라내고 윤곽선의 적어도 한 부분을 만듭니다. 기본 근막 이나 조직으로 잘라 하지 않도록 주의. 그런 다음 멸균 가위를 사용하여 표피와 진피를 잘라내고 펀치 생검에 의해 각인된 원형 패턴을 따라 절단합니다.Staph aureus 접종의 경우, 제조 된 생물 발광 세균 접종의 50 마이크로 리터와 28 게이지 인슐린 주사기를 채웁니다. 그리고 손가락을 사용하여 상처 입은 동물의 진피를 옆으로 당깁니다. 조직에 거의 평행주위를 잡고, 저항의 급격한 감소가 느껴질 때까지 천천히 조직에 주사기를 삽입합니다.근막의 피어싱을 나타냅니다. 바늘이 상처의 중앙에 놓이면, 천천히 부피의 전체 부피를 전달합니다. 난무제가 최소한의 누설이나 분산으로 상처 의 중심에 거품을 형성하는지 확인합니다.그리고 동물에서 천천히 주사기를 제거합니다. 그런 다음 동물을 열로 케이지로 되돌리고 완전히 회복될 때까지 모니터링합니다. 상처와 감염 후, 실험 하는 동안 매일, 생물 발 광 및 꽃 감기에 마취 된 마우스를 배치, 가능한 한 평평한 상처와 함께.이미저 소프트웨어에서 발광및 사진을 이미징 모드로 선택합니다. 노출 시간은 작은 비닝에서 1분, 발광용 F/Stop 1, 사진용 F/Stop 8, 방출 필터를 위해 열려 있어야 합니다. 그런 다음 이미지를 기록하려면 획득을 클릭합니다.생체 내 형광 이미징의 경우, 이미징 모드로 형광을 선택하고 사진을 찍습니다. 노출 시간은 작은 비닝에서 1초, 형광용 F/Stop 1, 사진용 F/Stop 8, 30나노미터 이상 465, 20나노미터 이상 520개의 광막 강도로 각각 1초로 미리 설정되어야 합니다. 그런 다음 이미지를 기록하려면 획득을 클릭합니다.두 세트의 이미지를 얻은 후, 전체 복구까지 모니터링과 함께 동물을 케이지로 되돌리게 하십시오. 이미지 분석의 경우 적절한 이미지 분석 소프트웨어 프로그램에서 정량화할 이미지를 열고 주변 피부를 포함한 전체 상처 영역에 기본 원형 영역을 배치합니다. 관심 영역을 측정하고 상처의 평균 플럭스의 값을 기록하여 각 신호의 평균 플럭스를 시간 대비 플롯할 수 있도록 합니다.상처 치유를 측정하려면 상처 가장자리에 관심있는 원형 영역에 맞추고 상처 영역을 곱곱한 센티미터로 측정하여 기준선과 시간 대비 분수 변화를 플로팅할 수 있습니다. 본 대표적인 실험에서 조건부 EGFP 발현 골수성 분화 1차 반응(88) 또는 MyD88 녹아웃 마우스는 비조건적인 EGFP발성 동물보다 포도상 구레나귀 접종에 더 큰 감수성을 입증하였다. 감염의 첫번째 8 일 도중 관찰된 80%의 치사로.마우스의 두 변종은 감염 직후 체중의 약 5%를 잃었습니다. 그러나, 마우스를 표현하는 조건부 EGFP는 둘째 날까지 원래의 무게를 회복시켰다. MyD88 마우스는 하지 않았다 하는 동안.Staph aureus 감염의 존재에 있는 상처 폐쇄는 두 긴장 사이에서 다르지 않았습니다. 그러나, 살균상처MyD88 녹아웃 마우스는, 동물을 표현하는 조건부 EGFP에 비해 상처 치유에 중요한 결함이 있었다. 전체 동물 화상 진찰은 MyD88 녹아웃 동물의 상처에 있는 증가한 생물 발광 신호에 의해 입증된 바와 같이, 조건부 EGFP에 비해 더 높은 세균성 부담을 제시했습니다.MyD88 녹아웃 동물의 감염되지 않은 상처에 대한 초기 호중구 인신 매매의 40 % 감소는 또한 동물을 표현하는 조건부 EGFP에 비해 관찰되었다. 1 x 10에서 Staph 아우레우스의 7식민지 형성 유닛이 상처 직후 도입되었을 때, 호중구 인신 매매는 동물을 표현하는 조건부 EGFP에 비해 녹아웃 동물에서 현저히 감쇠되었다. 박테리아를 분배하기 전에 주사기에 기포가 없고 바늘의 위치가 상처 의 중앙에 올바르게 위치되어 있는지 확인하십시오.동물 조직은 상처에서 관심있는 단백질과 세균 보급의 발현을 측정하기 위해 엔드 포인트에서 수확 될 수있다. 포도상 구균은 인간에게 전염됩니다. 따라서, 개인 보호 장비는 박테리아를 취급할 때 착용되어야 하고, 병원체를 포함하는 주사기를 취급할 때 주의해야 합니다.이 기술은 감염에 대하여 호스트선천적인 면역 반응을 강화하는 Staph aureus 감염을 위한 생물학 처리의 사용을 탐구하는 것을 도왔습니다.

a-mouse-model-to-assess-innate-immune-response-to-staphylococcus

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Murine 피부와 부드러운 조직 감염 모델은 methicillin 내성 포도상 구균 (MRSA) 및 호스트 면역 응답의 독성 기능을 평가하기위한 활용합니다. 여기, 우리는 피부와 부드러운 조직 감염 피하 감염 모델을 소개하고 있습니다.

Methicillin 내성 황색 포도상 구균 아리 어스의 피하 감염 (MRSA)

Source: Zhang, C., et al., Development and Assessment of Intracellular Infection Models for Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (2025)The video demonstrates the isolation of kidneys containing Staphylococcus aureus-infected macrophages, followed by tissue homogenization to release intracellular bacteria. It quantifies bacterial persistence within macrophages in control and antibiotic-treated groups by counting colony-forming units.

Assessing Intracellular Bacterial Persistence and Antibiotic Resistance in a Mouse Model

이 비디오는 GFP 발현 호중구를 가진 면역 저하 형질전환 마우스의 감염 부위에서 호중구 모집 역학을 연구하기 위한 생체 내 이미징을 보여줍니다. 발광 박테리아를 주입하여 감염을 일으키는 것과 관련이 있습니다. 이는 감염 부위에 호중구가 동원되도록 유도하며, 이미징을 통해 추적이 이루어집니다.

Murine 모델에서 감염 부위의 호중구 모집 역학 및 박테리아 부담 모니터링

이 비디오는 피부 상처 감염의 쥐 모델을 생성하는 기술을 보여줍니다. 호중구에서 형광 단백질을 발현하도록 조작된 쥐를 유전자 변형 생물 발광 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 감염시키면 병원성 박테리아가 발생합니다. 감염 부위의 박테리아 부담과 호중구 동원 역학은 전체 동물 이미징을 사용하여 연구할 수 있습니다.

박테리아 병원체에 대한 면역 반응을 연구하기 위한 쥐 피부 상처 감염 모델

이 동영상은 뇌로 이동하는 자가반응성 T세포를 활성화하기 위해 미엘린 유래 펩타이드에 보조제를 주입하여 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 유발하는 방법을 보여줍니다. 백일해 독소는 혈액 뇌 장벽 투과성을 증가시켜 이러한 T 세포와 다른 면역 세포가 뇌로 들어갈 수 있도록 하기 위해 투여됩니다. 이러한 면역 세포는 탈수초화를 일으켜 신경 전달 장애와 EAE 발병을 유발합니다.

마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염의 발생

동물 모델은 만성 염증의 발달에 기여하는 호스트와 병원체의 특정 메커니즘을 규정하는 매우 중요한 도구로 입증되었다. 여기서 우리는 로컬 및 전신성 염증 부위에서의 진행을 평가하기 위해 인간 병원체 Porphyromonas 진지 발리 및 세부 방법론 경구 감염 마우스 모델을 설명한다.

로컬 및 전신 사이트에서 병원체에 의한 만성 염증을위한 마우스 모델

본 프로토콜은 새로운 나노에멀젼 보조제 백신의 물리적 특성, 면역 반응 및 생체 내 보호 효과를 준비하고 평가합니다.

메티실린 내성 황색포도상구균 (MRSA) 감염에 대한 나노에멀젼 보조제 백신의 면역 반응 평가

황색포도상구균 (S. aureus)은 몸 전체로 퍼질 수 있는 능력이 있어 지속적이고 재발성 감염을 일으킵니다. 이러한 과정을 더 잘 이해하기 위해 이 연구는 S. aureus에 대한 세포 내 감염 모델을 확립합니다. 이 모델은 세포 내 감염의 기전을 조사하는 데 중요한 토대를 제공할 것입니다.

황색포도상구균에 대한 세포 내 감염 모델의 개발 및 평가

본 프로토콜은 임플란트 관련 감염을 조사하기 위해 피하 등쪽 이식을 사용하는 마우스 모델을 설명하며, 이를 통해 병태생리학적 메커니즘을 포괄적으로 조사할 수 있고 표적 치료 전략으로 진단 기준 개발을 지원할 수 있습니다.

마우스의 임플란트 관련 감염에 대한 동물 모델

methicillin - 내성으로 인해 실험 쥐의 심내막염...

Methicillin 내성의 실험 심내막염 모델<em&gt; 황색 포도상 구균</em&gt; (MRSA) 쥐에서

배우세요 마우스 피부 상처와 Staphylococcus aureus 감염에 대한 선천성 면역 반응을 실시간으로 모니터링하는 방법을. LysM-EGFP 마우스를 활용한 이 기술은 감염 역학과 치료 전략 연구에 활용됩니다.

마우스 모델을 평가 타고 난 면역 반응 포도 상 구 균 감염

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