Name: 쥐 Adrenocortical 셀 및 Steroidogenic 기능의 분석 실험의 기본 문화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 33 s
Description: 학습하세요 쥐 부신 세포의 원발 배양 및 스테로이드 생성 기능 분석 방법을. 이 기술은 스트레스 관련 질환 연구와 호르몬 분비 메커니즘 이해에 활용됩니다.

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이 작품은 국가 과학 위원회 대만 (NSC102-2320-B-037-008-MY3)와 국립 쳉 쿵 대학 병원 연구 부여 (NCKUH-10102045)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

동물 주제를 포함 하 여 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 가오슝 의학 대학에 의해 승인 되었습니다.
1. 실험 절차
<ol><li>CO2 안락사에 의해 성인 (8 12 주 오래 된) 여성/남성 SD 쥐를 희생.</li>
	<li>70% 에탄올을 적용 하 고, 피부에 흡수 되 고는 티슈로 피부를 닦아 보자.</li>
	<li>부정사 위치에 깨끗 한 플라스틱 접시에 쥐를 넣어.</li>
	<li>"외부" 곡선된 겸 자는 중간에와 피부를 들어올리고 (subcostal 각도에 허벅지의 수준)에서 "Y" 모양 만들어 둔 해 부를 수행 합니다.<ol>
<li>70% 에탄올과가 위를 헹 구 고, 다음, "Y" 모양 만드는 근육을 잘라.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
위장 뒤에 왼쪽된 부 신 샘을 찾아. 참고: 오른쪽 신장 간 뒤에 깊이 찾을 수 있습니다.<ol>
<li>한 쌍의 집게를 사용 하 여 위 또는 간 고와 다른 곡선된 겸 자는 adrenals 분리.</li>
	</ol>
</li>
	<li>메 마른 그릇에 아드레날린 후, 조심 스럽게 잘 집게와 부 신 캡슐 제거.</li>
	<li>가 위는 섬세 한 쌍, 작은 작은 조각으로는 adrenals 잘라 혈 청 무료 Dulbecco의 비트의이 글의 중간 (DMEM)을 수정 / F-12 매체.</li>
	<li>
3 다른 기 공 크기의 파스퇴르 pipets를 준비 하 고 첫 번째 파스퇴르 피펫으로 콜라 II (~0.5–0.8 mg/mL)와 매체를 포함 하는 50 mL 원뿔 관으로 모든 부 신 조각 발음을 사용 하 여.
	<ol>
<li>부드럽게 triturate 조직 조각 약 10 배. pipets의 나머지를 사용 하 고 모든 조각을 더 작게 될 때까지 위의 단계를 반복 합니다. 참고: 파스퇴르 pipets의 다른 기 공 크기는 그들을 불으로가 열 하 여 만들 수 있습니다. 첫 번째 피펫으로 원래 크기 (약 1 m m), 두 번째의 기 공 크기는 약 0.8 m m 이며 세 번째 파스퇴르 피펫으로 약 0.5 m m 이다. 소화, 하는 동안 부 신 조각 작은 될 것입니다. 따라서, 기계적 절차를 통해는 adrenals 수 수 소화 더 많은 완료. (37 ° C)에서 물 욕조에 튜브를 품 어 및 5 분 마다 흔들어 총에서 4 배.</li>
	</ol>
</li>
	<li>20 분 부 화 후 (겹 볼륨; 예를 들어 조직의 5 mL + 멋진 DMEM/F-12 매체의 25 mL) 신선 하 고 차가운 매체 포함 2.5% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 5% 말 혈 청 효소 효과 중지를 추가 합니다.</li>
	<li>10 분 동안 800 x g 에서 원심 분리에 의해 셀 알 약을 수집 합니다.</li>
	<li>셀을 일시 중단 하는 매체의 적절 한 볼륨을 추가 합니다. 참고: 각 선 약 3 ~ 10 배를 만들 수 있습니다5 ~ 105 셀 x 4.</li>
	<li>성장 매체와 함께 원하는 격판덮개 또는 접시에 셀 접시 (DMEM 그리고 햄의 F-12 매체의 1:1 [v/v] 혼합 25 mM HEPES 및 1% 페니실린과 스 보충) 95% 공기와 5% CO2의 습도 환경에서 37 ° C에서 하룻밤 (0 일). 참고: 일반적으로, 우리 접시 24-잘 접시 (4 개의 샘/접시)에 셀 corticosterone 분석 결과 대 한 고 35에서 m m 요리 (요리 한 선/약 1 ~ 2) 서쪽 오 점 분석.</li>
	<li>신중 하 게 씻어 2 셀 세럼 무료 따뜻한 DMEM/F-12 매체 (주 1)와 x. 새로운 성장 매체를 교체 합니다.</li>
	<li>3 일까지 95% 공기와 5% CO2 의 습도 환경에서 37 ° C에서 세포를 유지 합니다.</li>
</ol>

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<li>O'Hare, M. J., Neville, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+responses+to+corticotrophin+and+cyclic+AMP+by+adult+rat+adrenocortical+cells+in+monolayer+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Morphological responses to corticotrophin and cyclic AMP by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture.</a> Journal of Endocrinology. 56 (3), 529-536 (1973).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

아드레날린은 환경 적응3에서 핵심 역할을 한다. 부 신 피 질에서 분 비는 호르몬 조절 하 고 생리 기능 및 항상성3조정 수 있습니다. Vivo에서 모델 본문에 진짜 생리 적 효과 반영 한다. 그러나, 그것은 여전히 실험에서 불안정 한 효과 일으키는 많은 복잡 한 요인에 의해 좌우 된다. 대조적으로, 생체 외 세포 모델 때문에 동물 모델에 비교할 수 없는 이점이 있다. 첫째, 환경 조건이 생체 외에서 시스템에서 제어 하기 쉬운입니다. 호르몬은 어떤 자극에 의해 영향을 받을 것. 생체 조건 실험 동물 조 난 하는 경향이 있기 때문에 일반적인 반응에 이내 결과입니다. 둘째, 물질은 본문에 모니터링 하기 쉽지 않다 하지만 경작된 시스템에 책임 있다. 셋째, 생체 외에서 시스템 각 독립적인 실험 사이 차이 줄일 수 있습니다. 많은 과학적 보고서 표시 프로토콜 여기에 제시 된 반면 10%-20% FBS12<su...

내 분 비 시스템은 생리 활동 및 항상성1규제에 대 한 책임. 두개골의 장 대는 신장에 있는 부 신 땀 샘 분 비 mineralocorticoids, 스테로이드 제제, 그리고 안 드로 겐2,3주요 내 분 비 장기 중 하나입니다. 부 신 동맥의 2 개의 명백한 부품이 있다: 피 질 하 고 모 수. 부 신 피 질은 3 개의 층으로 이루어져: 외부 glomerulosa, 중간 fasciculata 및 내부 reticularis3. Zona glomerulosa 호르몬, reabsorbing 나트륨 이온과 신장3물에서 에이즈는 mineralocorticoid의 원래 은닉 사이트입니다. Zona fasciculata 주로 정상적인 생리 적인 조건3스테로이드 제제의 기초 수준을 생성합니다. 설치류에서 코르 티 코 스테로이드 및 인 간에 있는 코 티 솔 통제 혈액 포도 당3스트레스 대처에 시체를 돕기 위해 행동. 어느 정도까지, 그들은 선 동적인 응답을 억제 하 고 면역 시스템4,5조절 수 있습니다. 다른 포유류, 쥐 및 쥐와 달리 필요가 없습니다 기능 zona reticularis 17α-hydroxylase 식의 부족으로 인해 부 신6,7. 따라서, 쥐 및 쥐에서 adrenals 없는 부 신 C-19 스테로이드 (코 티 솔 그리고 부 신 안 드로 겐)의 분 비는.
기본 교양된 adrenocortical 셀 부 신 생리학8제어 메커니즘을 조사 하는 데 유용 해야 표시 되었습니다. Steroidogenic 다른 조직 처럼 각 부 신 존 무료 콜레스테롤9에서 스테로이드 합성. Adrenocorticotropic 호르몬 (ACTH) 자극, 무료 콜레스테롤 고장 지질 작은 물방울에서 출시 고, 따라서, fasciculata 및 reticularis10스테로이드 생산을 향상 시킵니다.
많은 그룹은 adrenocortical carcinomas에서 안정적인 셀 라인을 설정 하려고 했습니다. 그러나, 몇 가지 우려 체 외 모델8에서 adrenocortical 셀 라인의 사용을 제한 했다. 세포의 스테로이드 응답 구절, 혈 청의 많은 수와 혈 청, 등의 품질 간에 달라질 수 있습니다. 또한, 상업 부 신 셀 라인 (y 1과 SW13) corticosterone, 부 신 steroidogenesis8공부 하기 더 어렵게 만드는 분 비 하지 않습니다. 사용 소 및 말 adrenals ex vivo 모델 좋은 선택이 될 수 있습니다 비록 조직이이 시장에서 몇 가지 알 수 없는 위험 모호한 수 있습니다. 그들에 비해, 쥐 아드레날린 관리 쉽게 이며 소스는 상대적으로 더 안정 되 고 병원 체-무료. 함께 찍은, 여기 설명 하는 현재 방법은 corticosterone 합성 쥐 부 신 fasciculata 세포에서의 관련된 메커니즘을 조사 하 사용 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>암컷/수컷, SD/Wistar 쥐(8-12주)</td><td>BioLASCO</td><td></td><td>수컷 또는 페말 쥐가 실험에 적합합니다. 암컷의 부신은 수컷 쥐보다 크지만 암컷 쥐는 실험에 영향을 미칠 수 있는 발정 주기를 소유</td></tr>합니다 <tr><td>콜라겐 분해 효소, 유형 II</td><td>시그마</td><td>C-6885</td><td>부신 세포 분리</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>12800-017</td><td>부신 세포용 분말 매체</td></tr><tr><td>Ham's F12</td><td>ThermoFisher</td><td>21700-075</td><td>부신 세포용 분말 매체</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>JT.baker</td><td>4018</td><td>완충액(분말)</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>JT.baker</td><td>3506-1</td><td></td></tr><tr><td>호스 세럼</td><td>Hyclone</td><td>16050014</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>SAFC</td><td>12103C</td><td></td></tr><tr><td>페니실린(10,000 U)-스트렙토마이신(10,000 ug/mL)Corning</td><td></td> <td>30-002-Cl</td><td>항생제</td></tr><tr><td>곡선 집게</td><td></td><td>BRAUN BD343R</td><td></td></tr><tr><td>집게</td><td></td><td>BRAUN BD331R</td><td></td></tr><tr><td>가위</td><td>BRAUN</td><td>BC224R</td><td>컷 쥐 피부와 근육</td></tr><tr><td>섬세한 가위</td><td>BRAUN</td><td>BC101R</td><td>컷 부신</td></tr><tr><td>지방 분화 관련 단백질</td><td>Abcam</td><td>ab108323</td><td>항체 지질 방울 관련 단백질</td></tr><tr><td>코르티코스테론 ELISA 키트</td><td>케이맨</td><td>500655</td><td>코르티코스테론 합성</td></tr><tr><td>분석 도립광 현미경 라이</td><td>카</td><td></td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>JT.baker</td><td>X198-07</td><td>면역형광 염색용</td></tr><tr><td>염소 안티 토끼 IgG Alexa 488 Fluor 2차 항체</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11034</td> 면역<td>형광 염색</td></tr><tr><td></td><td>면역형광 염색을 위한</td>Anti-ADFP <td>Abcam</td><td>108323</td></tr><tr><td>ProLong Gold 퇴색 방지 마운트,</td><td>ThermoFisher</td><td>P36935</td>, <td>면역형광 염색</td></tr></tbody></table>

쥐 adrenocortical 셀 및 steroidogenic 기능의 분석 실험의 기본 문화

Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

부 신 피 질에서 분 비 하는 호르몬은 스트레스와 질병에 대 한 동물에 대 한 중요 합니다. 여기에 설명 된 메서드는 기본 교양된 쥐 부 신 세포와 관련 된 기능 분석 실험 (corticosterone 분석 뿐 아니라 지질 작은 물방울 표면 단백질, 면역 형광 얼룩)의. Vivo에서 모델과 달리 단층 부 신 문화에 interexperiments의 변이 덜 이며 실험 조건을 제어 하기 쉽습니다. 게다가, 쥐의 소스 소 것 들과 같은 다른 동물 보다 더 안정적 이기도합니다. 또한 부 신 연구에 사용할 수 있는 여러 인간의 부 신 셀 라인 (NCI H295, NCI-H295R, SW13, 등)이 있다. 그러나,이 선의 스테로이드 생산 여전히 혈 청 로트 번호, 통로 번호, 돌연변이/손실 고유 유전자 등의 수많은 요인에 의해 좌우 됩니다. 17α-hydroxylase 부족, 제외한 쥐 adrenocortical 셀의 기본 문화 부 신 생리학을 공부 하는 더 편리 하 고 더 나은 기술 이다. 요약 하자면, 기본 쥐 부 신 문화 연구자 조사 부 신 시스템에 대 한 관심의 시 약의 메커니즘에 대 한 좋은 생체 외에서 플랫폼 수 있습니다.

여기에 설명 된 절차를 사용 하 여, 기본 교양된 부 신 세포 단계 대조 현미경 (그림 1A) 구별 될 수 있습니다. 더 확인 하려면 소포 세포질 내의 지질 작은 물방울은, 지방 분화 관련 단백질 (ADRP)의 면역 형광 염색 3 일 문화 (그림 1B)에 실시 수 있습니다. 세포는 유리 coverslips에 성장 했다. 셀 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)로 세 번 세척 하 고 4 %paraformaldehyde 고정 했다. PBS로 3 회 세척, 후 셀 차단 하 고 permeabilized 0.1%와 5% 탈지 우유에 트라이 톤 X-100. 기본 ADRP 항 체 5% 탈지 우유에 희석된 (1:50) 고 밤새 껏 알을 품는. 후 세 번의 PBS 세척, 셀 염소 안티 토끼 알 렉 사 Fluor 488 2 차 항 체 (1: 100)와 incubated 했다. 세척 단...

부 신 피 질에서 분 비 하는 호르몬은 스트레스와 질병에 대 한 동물에 대 한 중요 합니다. 여기, 우리는 문화 기본 쥐 프로토콜 부 신 셀을 제시. 그것은 부 신 steroidogenesis와 지질 생 합성의 약의 메커니즘을 조사 하기 위한 좋은 생체 외에서 플랫폼을 수 있습니다.

쥐 Adrenocortical 셀 및 Steroidogenic 기능의 분석 실험의 기본 문화

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...

제시된 프로토콜은 아주 쉽고 연구원이 1차 부신 문화를 준비하는 것을 도울 것입니다. 그것은 부 신 스테로이드 발생을 시작 하기 위한 쉬운 절차를 제공 합니다. 이 기술은 스트레스 관련 질병, 에이전트 억제 염증 반응의 모든 잠재력을 선별에 적용될 수 있다.절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 석사 학생인 웨이창 이병창이 될 것입니다. 먼저 70%에탄올을 사용하여 안락사 된 SD 쥐를 살균하고 피부에 흡수시키는 것으로 시작합니다. 티슈 페이퍼로 피부를 닦은 후, 쥐를 수핀 위치에 깨끗한 플라스틱 접시에 놓습니다.다음으로, 외부 곡선 포셉을 사용하여 중간선에서 피부를 들어 올립니다. 가위를 사용하여 허벅지 수준에서 서브코스트 각도까지 Y 모양을 만들어 피부의 무딘 해부를 수행합니다. 70%에탄올로 가위를 헹구고 근육을 자르고 Y 모양을 만듭니다.간 오른쪽에서 위장 뒤에 왼쪽 부신을 찾습니다. 표준 집게 와 곡선 집게 한 켤레로 위와 간을 들어 올린 다음 부신을 다른 곡선 집게로 분리하고 멸균 접시에 넣습니다. 미세한 집게를 사용하여 각 선에서 부신 캡슐을 조심스럽게 이동시보도록 합니다.이제 섬세한 가위를 사용하여 부신을 충분한 양의 혈청 없는 DMEM F-12 배지로 작은 조각으로 잘라 조직을 덮습니다. 버너 위에 가열하여 세 가지 다른 붓는 크기의 저스티스 파이펫을 준비합니다. 콜라게나세 II.Gently 피펫과 함께 배지를 함유한 50mL 원전 튜브로 모든 부신 조각을 10회 위아래로 옮기는 가장 큰 개구부가 있는 첫 번째 파이펫을 사용하십시오.그런 다음 20 분 동안 섭씨 37도에서 수조에서 튜브를 배양하고 5 분마다 총 4 번 흔들어줍니다. 효소 소화 중 조직 분산을 제대로 수행하는 것이 매우 중요합니다. 두 번째 및 가장 작은 붓는 크기의 파이펫을 사용하여 모든 조직 조각이 작아질 때까지 파이펫팅과 인큐베이션을 반복합니다.그런 다음 4섭씨 차가운 매체에 6배의 브레시를 추가하여 효소 반응을 멈춥시다. 그런 다음 10 분 동안 800 회 G에서 센트라푸징을 하고 두 번 상퍼를 폐기하십시오. 적절한 양의 매체를 추가하고 셀을 다시 일시 중단합니다.원하는 접시 또는 요리에 세포를 심고 중간 하룻밤 에서 성장 중간 37 섭씨 에서 섭다 95%와 5% 이산화탄소. 다음 날, 세럼이 없고 따뜻한 DMEM F-12 배지로 셀을 두 번 조심스럽게 씻으시다. 신선한 성장 매체를 추가하고 3 일까지 섭씨 37도, 습도 95

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

부신 골수의 chromaffin 세포 배양 시스템은 체외 설정에의 자극 - 분비 커플링 연구를 위해 매우 유용합니다. 이 프로토콜은 adrenals을 해부하다 다음 부신 피질 멀리 벗겨진하여 골수의 영역을 분리하는 데 사용되는 방법을 보여줍니다. 단일 chromaffin 세포로 골수의 소화는 다음 증명됩니다.

마우스 부신 Chromaffin 셀 절연

본 논문에서 우리는 성인 쥐 심장 myocytes를 분리하고 문화에 전형 방법을 설명했다. Collagenase와 단백 분해 효소는 단일 myocytes을 소화하고 격리하는 데 사용됩니다. Myocytes는 대부분의 실험 요구 사항을 충족이 프로토콜을 따라 교양.

성인 쥐 심장 Myocytes의 차 문화

기본 hepatocytes는 생리학 관련 실험 시스템의 생화학, 분자, 그리고 신진 대사 기능을 평가하는 유용한 도구를 제공합니다. 우리는 지속적으로 to1.0 × 10 백업 실행 가능한 hepatocytes를 생성 원위치 간 재관류에 쥐에 대한 신뢰할 수있는 프로토콜을...

쥐 간장 세포의 분리 및 차 문화

아르기닌 바소프레신​​ (AVP)는 신장 주요 세포에 의해 물을 재 흡수를 촉진을 통해 몸에 물 항상성의 미세 조정을 제어합니다. 여기, 우리는 AVP-매개 물 재 흡수를 기본 분자 메커니즘의 해명에 적합한 덕트 세포를 수집 차 쥐 내부 수질의 재배를위한 프로토콜을 제시한다.

덕트 세포를 수집 배양 차 쥐 내부 수질

차 세르 톨리 (Sertoli) 세포는 면역 보호 특성의 염증이나 감염, 및 이용 기간 동안 고환 면역 특권, 신호 전달 연구가 필요합니다. 여기에서 우리는 고도로 정제 차 세르 톨리 (Sertoli) 세포와 쥐의 고환에서 세뇨관 세포의 분리를 위해 효소 기반의 프로토콜을 설명합니다.

쥐 고환의 세르 톨리 (Sertoli) 세포의 분리 및 세뇨관 세포

희소돌기아교세포는 중추신경계의 수초세포입니다. 이 프로토콜은 쥐 피질에서 전구체인 희소돌기아교세포 전구 세포를 분리 및 배양하는 방법과 실험 요인에 따라 체외에서 희소돌기아교 형성을 평가하기 위한 빠르고 신뢰할 수 있는 정량적 방법을 설명합니다.

쥐 희소 돌기 아교 세포 전구 문화의 준비 및 Oligodendrogenesis의 정량화 이중 적외선 형광 스캔을 사용하여

여기 우리는 마우스에서 아드레날린을 분리, 조직, 그들, 섹션 고치고 면역 형광 염색 법을 수행 하는 방법을 제시.

절연, 고정, 및 마우스 아드레날린의 면역 형광 이미징

이 프로토콜은 NuTRAP 마우스 모델을 사용하여 세포 유형 특이적 번역 리보솜 mRNA를 분리하는 것을 목표로 합니다.

세포 분류 없이 스냅 동결 이종 조직 샘플에서 세포 유형 특이적 RNA 분리

여기에서는 쥐 자궁내막 상피 줄기세포(reESC)를 분리 및 배양하여 쥐 자궁내막 오가노이드를 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 자궁내막 질환의 체외 연구를 용이하게 하여 유전자 편집 및 기타 세포 조작을 가능하게 합니다.

쥐 자궁내막 상피 줄기세포에서 쥐 자궁 오가노이드의 생성 및 특성화

마우스 부신 피질에 대해 대(zona glomelosa) 및 다소 포시큘라타(zona fasciculata) 풍부 세포의 2D 1차 배양을 확립하는 견고하고 재현 가능한 접근법이 개발되었습니다. 이 시스템은 각 영역의 핵심 분자 및 기능적 특징을 보존하여, 신호 전달 경로, 호르몬 생성, 부신 피질 세포 행동에 대한 체 외 내 집중 연구를 가능하게 합니다.

마우스 부신 피질에서 존 강화된 1차 배양 형성

학습하세요 쥐 부신 세포의 원발 배양 및 스테로이드 생성 기능 분석 방법을. 이 기술은 스트레스 관련 질환 연구와 호르몬 분비 메커니즘 이해에 활용됩니다.

쥐 Adrenocortical 셀 및 Steroidogenic 기능의 분석 실험의 기본 문화

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