Name: 화학, 정량화, 고립과 파충류의 피부 지질 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: 배우세요 파충류 피부 지질 추출 및 정량화 방법을 통해 화학적 의사소통 신호 분자를 분리하는 기술을 익히세요. 이 프로토콜은 생태학 및 생화학 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 방법, 특히 창 고 피부 지질 추출의 개발 중에 발생 한 제임스 매디슨 대학 (JMU)와 미국 농 무부 동물 사이 협력 계약 (14-7412-1061-CA, 15-7412-1155-CA, 및 16-7412-1269-CA) 과 건강 검사 서비스 (진딧물) 공장. 창 고 스킨 방법의 개발을 다음 학생 들의 기여를 인정 하는 M.R.P.: S. 파 텔 (워싱톤과이 대학 [WLU]), 제이 Zachry (WLU), R. 플로레스 (JMU), J. Noll (JMU), 그리고 미 애쉬 튼 (JMU).

척추 동물의 사용을 포함 하는 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 제임스 매디슨 대학에 의해 승인 되었다.
1입니다. 추출
<ol><li>
창 고 스킨 추출
	<ol>
<li>단일 파충류, 머리 및 샘플 오염 수 cloacal 섹션에서에서 약 30 ㎝2 창 고를 수집 합니다. 클 장갑 착용 하 고 파편의 창 고를 청소.</li>
		<li>포장 가방 균형 또는 보트의 무게와 창 고 (± 0.01 g)를 무게. 참고: 대량 정밀 균형의 정밀도 의해 결정 됩니다. 창 고 피부 대량 추출된 피부 지질 질량 (아래 참조)에 대 한 표준화 요소 이며 크게 추출한 지질과 covaries 질량.</li>
		<li>더 작은 (5 c m2) 조각으로 창 고를 구분 하 고 (예를 들면, 금속 뚜껑 유리 메이슨 항아리 또는 PTFE 뚜껑 실험실 플라스 크) 헥 산 호환 뚜껑 접착성 유리 컨테이너에 추가 합니다. 완전 잠수함 헛간 피부 조각 컨테이너에 충분 한 헥을 가만히 따르다. 컨테이너 봉인. 주의: 제 초 제는 가연성, 호흡기 자극, 관련 된 여러 가지 단기 및 장기 건강 위험. 헥 산을 포함 하는 절차는 적절 한 개인 보호 장비 (PPE) (예:스플래시 고글, 클 장갑, 긴 소매, 가까이 터진 신발)을 착용 하는 동안 증기 두건 (실험실) 또는 야외 (필드)에서 수행 됩니다.</li>
		<li>연필 또는 용 매 저항 펜 벗길 레이블을 지정 합니다. 실내 온도 1 박 또는 최대 24 h에서 증기 두건에는 컨테이너를 둡니다.</li>
		<li>깨끗 한 금속 집게 또는 집게를 사용 하 여 창 고 조각을 제거 합니다. 컨테이너에 모든 나머지 hexane을 유지 하려면 조각을 흔들어. 종이 수건;에 건조 피부 조각 허용 다음, 그들을 삭제 합니다. 여러 기사를 수행 하는 경우 각 샘플 사이의 집게/집게 청소. 집게/집게 청소, ~ 50 mL 비 커에 헥에에서 린스.</li>
		<li>추출은 즉시 사용할 수, 경우 가만히 따르다 또는 플라스틱 유리 유리병의 적절 한 볼륨으로 추출, PTFE 줄지어 모자와 함께 봉인, 그것, 및-20 ° c.에 그것을 저장합니다 주의: 추출 물 hexane에 포함 되므로 방 냉장고에 튜브를 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
완전히 죽은 동물 추출
	<ol>
<li>주 둥이 통풍구 길이 기록 (SVL; 센티미터에서)와 질량 (그램) 동물의. 경우 총 지질 또는 페로몬 생산 단위당 피부 표면적의 결정 될 것 이다, (센티미터)에서 최대 몸 둘레를 재단사의 테이프 측정값을 사용 합니다.</li>
		<li>추출, 동물의 길이의 1/3는 직경을 가진 컨테이너를 선택 하십시오. 머리와 cloaca 컨테이너의 하단에 안전 하 게 시체를 위에 놓습니다. 본문의 침수 표면적을 최대화 하기 위해 컨테이너에 충분 한 헥을 가만히 따르다. 참고: 머리 또는 cloaca 추출에 시간의 금액에 대 한 침수 되 고, 주를가지고 가십시오.</li>
		<li>컨테이너, 라벨 및 실내 온도 1 박 또는 최대 24 h에서 증기 두건에 담가 뚜껑을 보호.</li>
		<li>시체를 제거, 깨끗 한 금속 집게 또는 집게를 사용 합니다. 머리 또는 꼬리에서가 아니라 몸에서 물방울을 함으로써 컨테이너에 시체에 잔여 hexane을 유지 합니다. 컨테이너 봉인.</li>
		<li>추출은 즉시 사용할 수, 경우 가만히 따르다 추출 또는 적절 한 볼륨의 유리 유리병에 플라스틱, PTFE 줄지어 모자와 함께 인감, 그것, 및-20 ° c.에 그것을 저장합니다</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 지질 대량 결정
참고: 추출 된 지질 질량은 두 가지 방법 중 하나로 결정 될 수 있다: 회전 증발 기를 사용 하 여 유리 유리병 또는 둥근 바닥 플라스 크.
<ol><li>추출 된 지질 대량 통해 유리 유리병 메서드를 결정 합니다.<ol>
<li>충분 한 크기 (7 mL, 22 mL, 50 mL, 등)의 preweighed 유리병을 사용 합니다. 총 질량에 뚜껑과 라벨을 포함 하거나 항상 모자와 레이블 없이 유리병 무게 (질량 또한 추가 라벨에 표시). 물 접촉을 피하기 위해 플라스 크의 목에 레이블을 배치 합니다. 참고: 유리 튜브에 증발 경우 연구원 가스 매니폴드 시스템에 액세스할 수 여러 튜브는 N2 스트림 아래 동시에 증발 될 수 효율적입니다.</li>
		<li>유리병을 추출 전송, 고무 전구 또는 큰 볼륨에 대 한 유리 피 펫을 사용 하 여 추출, 일회용 10 mL 유리 피 펫과 전자 피 펫 컨트롤러. 또한 유리병에 헥 산 및 전송의 ~ 3 mL와 함께 컨테이너를 씻어.</li>
		<li>부드러운 N2 스트림 아래 샘플 증발. 최대 용 매 표면 영역을 활성화 하는 각도에서 유리병을 기울기. 응축 수는 헥 산 증발로 유리병의 외부에 형성할 것 이다. 참고: 지질의 고리는 헥 산 증발로 유리병에 형성할 것 이다 그래서 주기적으로 추출 소용돌이.</li>
		<li>증발 건조;을 샘플 다음, reweigh입니다. 총 지질 수확량을 기록 합니다. 참고: 서로 다른 그룹 분석을 위해 표준화는 지질 질량을 창 고에 대량 (지질 질량 [그램] 헛간의 질량 [그램] 100 x로 나눈 수익률 헛간의 백분율 지질 질량) 또는 동물의 SVL (지질 질량 [밀리 그램] SVL로 나눈 값을 센티미터]; 단위 길이 당 지질 질량을 생성) 합니다. 더 큰 동물 생성 더 많은 지질, 그리고 많은 종은 강하게 성적으로 동종이 형, 어떤 데이터에 중요 한 바이어스를 부과.</li>
	</ol>
</li>
	<li>추출 된 지질 대량 통해 회전 증발 기를 결정 합니다.<ol>
<li>개별 샘플 당 빠른 증발, 추출 물 preweighed 둥근 바닥 플라스 크에 전송 하 고 회전 증발 기를 사용 하 여 증발.<ol>
<li>미 립 자 추출에서 눈에 띄는 경우, 필터 종이 콘; 플라스 크의 목에에 배치 하 여 샘플을 필터링 그리고 플라스 크를 추출 전송 중력 필터를 허용 합니다. 전체 추출 전송 후 필터 종이의 처분. 참고: 샘플 볼륨을 전송 (최대 ~ 80% 플라스 크 볼륨) 회전 증발 하기 전에. 로터리 증발 기의 콘덴서에 추출의 모든 버블링 오염 발생 하며 청소를 콘덴서. 범프 트랩 플라스 크와 콘덴서의 목 사이 거품 또는 "지원 해주" 대부분의 샘플에서 발생 하는 경우에, 놓일 수 있다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>로터리 증발 기 및 물 목욕을 전원을 켭니다 (50 ° C, 용 매 비등 점 보다 낮은). 콘덴서에 차 물 흐름을 켭니다. 참고: 회전 증발 기의 콘덴서 순환 냉각기 또는 드레인에 빠져나가 차 물 마 개에 연결 된다. 물이 플라스 크를 떠나 고 콘덴서 입력 용 매 증기를 압축 하는 주변 보다 쿨러 흐름 속도 느려질 수 있습니다.</li>
		<li>진공 소스 (물 진공 또는 펌프)를 켭니다. 진공 압력은 콘덴서의 목에 플라스 크를 잡고 충분 한 확인 하십시오. 플라스 크를 연결 하기 전에 콘덴서의 끝에 환기를 엽니다. 콘덴서의 목에 플라스 크를 밀어, 인감, 고 플라스 크를 놓을 때 플라스 크는 콘덴서에서 분리 수 없습니다 환기 있습니다.</li>
		<li>~ 50%는 목욕에 빠져들 때까지 플라스 크를 낮춥니다. 중간 속도에서 플라스 크의 회전을 시작 합니다. 진공, 속도, 콘덴서 흐름, 그리고 목욕 온도 최적의 플라스 크를 떠나 용 매 증기 코일에 응축 하 고 복구 플라스 크에 물방울 것입니다.<ol>
<li>샘플 비등 하는 경우 (예를 들어, 큰 거품 급속 한 가스), 즉시 진공 또는 회전 증발 기의 속도 감소. 계속 끓는 플라스 크 회전을 해제 하 고, 진공을 해제 하 고, 목욕에서 플라스 크 올리고 진공 봉인 해제. 2.2.3 및 2.2.4 단계를 반복 합니다. 참고: 복구 플라스 크에 없는 용 매를 수집 하지만 추출 분명 증발, 진공 대부분 nonoptimal 이며 재조정 해야 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>(대형-볼륨 추출 물), 플라스 크에서 용 매 남아 ~ 2 mL까지 진공 아래 샘플을 증발 또는 preweighed 플라스 크를 사용 하는 경우와 액체의 구슬까지 증발 한 < 1 cm 직경 플라스 크의 아래쪽에 표시 됩니다. 회전 및 진공; 다음, 목욕에서 플라스 크를 발생 시킵니다.</li>
		<li>봉인 해제; 진공 플라스 크 목 잡아 그런 다음 트위스트를 콘덴서에서 목. 큰 볼륨 플라스 크를 사용 하는 경우 압축 된 추출 물; 보이는 지질 분해를 플라스 크에 소용돌이 다음, 작은 볼륨, preweighed 플라스 크에 피 펫을 통해 솔루션을 전송. 큰 플라스 크를 씻어 그것은 소용돌이, 작은 플라스 크에 플라스틱, 다시 증발 헥 산 3 mL를 추가 (단계 2.2.3-2.2.5).</li>
		<li>추출에 액체의 비드는 헥 산 증발로 응고 됩니다. 일단 건조, 실내 온도 도달 수 있습니다. 지질은 반투명, 흰색 플라스 크 (~ 5 분)에서 노란 왁 스를 형성할 것 이다. 마지막 질량을 얻기 위해 플라스 크의 무게. 참고: 추출 된 지질 특성에 따라 그들은 있을 것 이다 (예를 들어, 왁 스) 고체 또는 반 고체 (예를 들어, 원유) 속성, 분류 한 지질 (아래 참조) 증발 하는 때에 특히.</li>
	</ol>
</li>
	<li>헥 헥 산의 1 mL 당 지질의 ≥1 mg 수익률의 기록된 볼륨에서 지질 solubilize 크로마토그래피를 진행에 대 한 작업 볼륨 ~ 5 mL 이다. 유리병, 유리병을 추출의 대부분을 전송 후 플라스 크를 씻어을 총 볼륨의 2 개 mL를 유지를 플라스 크에서 전송 하는 경우</li>
	<li>튜브 라벨, PTFE 줄지어 모자와 그들을 봉인 하 고-20 ° c.에서 그들을 저장합니다</li>
</ol>3. 칼럼 크로마토그래피
참고: 특정 분수, 추출한 지질으로 극성에 따라 알 수 없는 화합물을 분리 하기 위하여 질량 준비에 추가 액체 착 색 인쇄기 열 수 및 표준 차입을 사용 하 여 분류 한.
<ol><li>열의 준비
	<ol>
<li>추출에서 지질 질량에 따라 테 플 론 자 지와 큰-또는 작은-볼륨 유리 착 색 인쇄기 열 중 하나를 사용 합니다. 열은 장착 하거나 고정 볼륨 저수지 (큰 열 500 mL, 250 mL 작은 열에 대 한)에 융합. 이제부터,이 프로토콜만 대규모 크로마토그래피 열 저수지에 융합을 말합니다. 철저 하 게 어떤 새로운 유리 제 4;에 설명 된 대로 크로마토그래피에 사용 되는 부품을 청소 그런 다음, 헥 산 또는 다른 비 극성 용 매로 그들을 씻어.</li>
		<li>섬유 유리 모직의 조각을 접어 (길이 [L] x 4 ~ 14 cm 폭 [W] cm) ~ 4 cm x 4 cm의 사각형 형성 될 때까지 반복적으로. 열 보다 더 긴 나무은 못 막대를 사용 하 여 섬유 유리는 열에의 하단에 위치.</li>
		<li>두 개의 클램프 (예를 들어, 회전 또는 모듈) 표준 링 스탠드에 후드, 하나는 자 지 위의 저수지의 목 아래 하나 열을 보호 합니다. 열 수준입니다. 허용 열 아래에서 쉽게 맞게 500 mL 비 커에 대 한 충분 한 작업 거리에 높이에 열을 배치 합니다. 자 지를 엽니다.</li>
		<li>부 어 세차 하 고 모래 ~ 3 cm 유리 섬유 위에 달려있다 때까지 열에 모래를 건조. 열 아래 검은색 또는 어두운 종이 배치 하 고 부드럽게 누릅니다. 모래 모든 탭이 있는 열에서 떨어지면, 섬유 유리 장벽 충분 하지 않습니다. 3.1.4 3.1.2-단계를 반복 합니다. 참고: 아래쪽에서 유리 섬유를 인출 하는 펼친된 클립은 못 막대의 끝에 테이프를 사용 합니다.</li>
		<li>장소는 열 아래 500 mL 비 커입니다. 천천히 젖은 모래 열 저수지로 100 mL 비 커 또는 졸업된 실린더에서 헥 산 25 mL를 가만히 따르다. 모래 위의 헥 산의 ~0.5 cm 되는 자 지를 닫습니다.</li>
		<li>중립 알 루미나 밖으로 무게. 각 작은 열 사용 ~ 50 g; ~ 각 큰 열 175 g입니다. 1 L 삼각 플라스 크에는 알 루미나를 부 어. 플라스 크 1 L 당 400 g을 제한 합니다.</li>
		<li>알 루미나 (III 활동) 활성화, 6%는 알 루미나의 볼륨의 이온된 수를 플라스틱 질량 (즉, 알 루미나의 100 g에 대 한 추가 물 6 mL). 알 루미나에 걸쳐 방울으로 물을 추가 합니다.</li>
		<li>커버 알루미늄 호 일 또는 코르크 플라스 크. 적극적으로 소용돌이 (동요 하지 않는) 충전을 균등 하 게 분산. 아니 보이는 덩어리 남을 때까지 계속 합니다. 참고: 예상 되는 알 루미나와 물을 반응으로 플라스 크가 따뜻한 것입니다.</li>
		<li>알 루미나는 완전히 덮여, 헥 산 위에 알 루미나의 ~0.5 cm까지 제 초 제를 추가 합니다. 슬러리를 플라스 크를 소용돌이 친다.</li>
		<li>열과 열 아래 500 mL 유리 비 커의 저수지에 발명된 깔때기를 배치 합니다. 자 지를 엽니다. 소용돌이 알 루미나와 꾸준히 열에 그것을 붓는 다. 알 루미나를 균등 하 게 정착 하 여 열에 더 큰 거품 또는 알 루미나 열에 형성 되 고 균열을 확인 합니다. 부드럽게 열을 균등 하 게는 알 루미나를 정착의 측면을 누릅니다. 참고: 추가 hexane 슬러리를 유지 하기 위해 추가 쏟아지는 대 한 추가 되어야 합니다. 열 비 커에 수집 헥 산 유리 비 커에 깨끗 한 경우 재사용할 수 있습니다.</li>
		<li>열은 알 루미나의 상단은 안정적이 고 ~ 4 cm의 저수지의 열 목 아래 때 형성 된다. 한 피 펫을 사용 하 여 잔여 알 루미나에 대 한 제 초 제와 저수지의 내부를 헹 굴. 부드럽게 퍼 널을 사용 하 여, 저수지 아래 ~ 1 cm에 알 루미나, 위에 모래의 두 번째 레이어를 추가 합니다. 참고: 헥 산 것 이다 흐름 열에서 자 지는 계속 열려. 건조 열을 게 하지 마십시오. 경우에 열을 밖으로 마르면, 과정 시작 해야 합니다 다시 단계 3.1.2에서 시작. 프로토콜 열 분류 전날 준비 하는 경우 여기 중지 될 수 있습니다. 단단히 저수지 상단에 코르크를 배치 하거나 호 일로 단단히 커버. ~ 100 mL의 헥에 저수지를 채우십시오. 자 지를 조여.</li>
	</ol></li>
	<li>지질 추출의 분류 참고: 열 크기에 지질 추출의 분수 수 있습니다 개별적으로 수집 되며 어떤 알려진/식별 대상 화합물을 포함 하지 않는 경우 그들의 분수 극성에 따라 또는 폐기를 완전히 풀링된. 복제 차입의 라운드 (n = 3 볼륨) 지질의 충분 한 차입 되도록 열을 통해 전달 됩니다. 큰 열 차입에 대 한 표 1 에 따라 (발췌와 대량 > 30 mg) 또는 작은 열 차입 (발췌와 대량 < 30 mg). 표 2에 메 틸 ketones를 격리 하기 위한 맞춤형된 차입 프로토콜이입니다.<ol>
<li>대용량 피 펫을 사용 하 여 열의 상단에서 나머지 hexane을 제거 하거나 깨끗 한 비 커에 물방울을 헥 산을 허용 합니다. 열 위쪽에 모래 위에 헥 ~ 3 mL를 남겨 주세요. 참고: 경우에 연락을 깨끗 한 유리 첫 번째 분수에 재활용 될 수 있습니다 수집된 헥 산 순수입니다.</li>
		<li>긴 유리 피 펫을 사용 하 여 열을 지질 추출 전송. 천천히 모래 층을 방해 하지 않으려면 추출 플라스틱. 추출 유리병 또는 헥 산의 ~ 5 mL로 플라스 크를 헹 구 고 열에 그것을 전송. 참고: 추출 물-20 ° C에 저장 된, 침전 된 수는 지질. 더 이상 침전 표시 될 때까지 유리병을 따뜻한.</li>
		<li>자 지를 열고 샘플 열에 로드할 수 있도록 합니다. 추출의 큰 질량은 경우 (> 30 mg), 노란 밴드 알 루미나, 바로 상단에 모래 아래에 볼 수 있습니다. 이 제 초이 제는 더 이상 깨끗 한 폐기물 비 커를 통해 흐름을 수집 합니다. ~ 3 mL 모래 위에 남아 있는 자 지를 닫습니다. 주의: 이제는 알 루미나와 열에 바인딩된 추출에서 지질을 건조 수 없습니다 또는 샘플 손실 됩니다.</li>
		<li>첫 번째 분수 하 고 있는걸 전에 열 아래 preweighed 및 레이블이 라운드 바닥 플라스 크 (100 mL, 250 mL, 500 mL)를 배치 합니다. 일반적인 유리 용기에 폐기 하는 분수를 수집할 수 있습니다.</li>
		<li>첫 번째 분수 준비 (100% 헥 산: 0 %diethyl 에테르 [지금까지, "에테르"]) 졸업된 실린더에. 경우 사전에 분수와 코르크 마 개 또는 호 커버를 준비. 참고: 분수 진행에 극성; 따라서, 실린더 분수 사이 씻어 서 필요가 없습니다.</li>
		<li>추가 붓는 통해 발명된 유리 깔때기로 저수지에 첫 번째 분수 모래 레이어를 방해 하지 않도록 저수지 쪽으로 이동 합니다. 자 지는 차입을 시작을 엽니다. 헥 산의 ~ 3 mL 열의 상단에서 모래 위에 남아 있는 자 지를 닫습니다. 참고: 절대는 eluate의 대다수를 수집 하기 전에 자 지를 폐쇄 하 여 개별 분수 내 차입을 중지 합니다. 분수, 사이 지연 품질과 반복성은 차입의 변경할 수 있기 때문에 ~ 1 h 이상 폐쇄 자 지를 두지 마십시오.</li>
		<li>단계-3.2.4 3.2.6 분수 2와 3에 대 한 반복 합니다. 분수는 풀링된 되 고 하는 경우에 특히 headspace 회전 증발에 대 한 허용 하는 적절 한 크기의 플라스 크에서 분수를 수집 합니다.</li>
		<li>4 분수 (2% 에테르)를 준비 하 고 저수지에 추가. 열 아래에서 다음 플라스 크를 배치, 자 지, 열고 4 분수를 수집 합니다. 5 분수; 준비 그런 다음, 필요에 따라 계속. 참고: 그것은 첫 번째 fraction(s) 통해 로타리 증발 연속 분수를 수집 하는 동안 증발 수 있습니다.</li>
		<li>GC-MS 분석에 사용 되는 분수를 준비, 0.01 이나 0.1 mg 정밀도 균형을 사용 하 여 분수 질량을 얻을. 헥 산의 1 mL 당 지질의 1 mg를 지질 분수 solubilize</li>
	</ol></li>
</ol>4. 청소
<ol><li>자 지를 열어두고 하 고 폐기물 비 커에 열 반전. 알 루미나 및 모래 열; 실행할 것 또는, 과정을 신속 하 게 흔들. 못 막대를 사용 하 여 그것이 붙어있다 면 섬유 유리 모직을 인출 (유리를 긁힘 방지) N2 스트림과 함께 그것을 밖으로 날 려 나.</li>
	<li>Dissemble 고 모든 유리, 유리 브러쉬 (머리와 플라스틱 bristles) 플라스틱 욕조에 뜨거운 물에 실험실 급 세제를 사용 하 여 청소. 3 배를 씻어. 유리는 더 이상 접촉에 매끄러운 때까지 충분히 따뜻한 물으로 잘 헹 구 십시오.</li>
	<li>유리를 헹 구 고 이온을 제거 된 물으로 배를 도구. 건조 선반에 넣어. 건조를 가속, 작은 볼륨 추가 유리 그릇에 아세톤 (3 mL), 소용돌이, 그리고 그것을 건조 하거나 N2 스트림 아래 그것을 실행 하는 것을 허용.</li>
</ol>

<ol><li>Mason, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+pheromones+in+snakes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sex pheromones in snakes.</a> Science. 245 (4915), 290-292 (1989).</li>
<li>Mason, R. T., Parker, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+behavior+and+pheromonal+communication+in+reptiles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology+A%22%5BJournal%5D)">Social behavior and pheromonal communication in reptiles.</a> Journal of Comparative Physiology A. 196 (10), 729-749 (2010).</li>
<li>Martín, J., López, P. Pheromones and chemical communication in lizards. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMart%C3%ADn%2C+J+%22Reproductive+Biology+and+Phylogeny+of+Lizards+and+Tuatara%22">Reproductive Biology and Phylogeny of Lizards and Tuatara</a>. Rheubert, J. L., Siegel, D. S., Trauth, S. E. , CRC Press. Enfield, NJ. 43-77 (2014).</li>
<li>Mayerl, C., Baeckens, S., Van Damme, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+role+of+the+follicular+epidermal+gland+system+in+non-ophidian+squamates%5BTitle%5D)+AND+%22Amphibia-Reptilia%22%5BJournal%5D)">Evolution and role of the follicular epidermal gland system in non-ophidian squamates.</a> Amphibia-Reptilia. 36 (3), 185-206 (2015).</li>
<li>Mathies, T., Levine, B., Engeman, R., Savidge, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromonal+control+of+the+invasive+brown+treesnake%3A+potency+of+female+sexual+attractiveness+pheromone+varies+with+ovarian+state%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pest+Management%22%5BJournal%5D)">Pheromonal control of the invasive brown treesnake: potency of female sexual attractiveness pheromone varies with ovarian state.</a> International Journal of Pest Management. 59 (2), 141-149 (2013).</li>
<li>Parker, M. R., Patel, S. M., Zachry, J. E., Kimball, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feminization+of+male+brown+treesnake+methyl+ketone+expression+via+steroid+hormone+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Ecology%22%5BJournal%5D)">Feminization of male brown treesnake methyl ketone expression via steroid hormone manipulation.</a> Journal of Chemical Ecology. 44 (2), 189-197 (2018).</li>
<li>Parker, M. R., Mason, R. T. Pheromones in snakes: history, patterns, and future research directions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aParker%2C+MR+%22Reproductive+Biology+and+Phylogeny+of+Snakes%22">Reproductive Biology and Phylogeny of Snakes</a>. Sever, D., Aldridge, R. , CRC Press. Enfield, NJ. 551-572 (2011).</li>
<li>Parker, M. R., Mason, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+temperature+dormancy+affects+the+quantity+and+quality+of+the+female+sexual+attractiveness+pheromone+in+red-sided+garter+snakes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Ecology%22%5BJournal%5D)">Low temperature dormancy affects the quantity and quality of the female sexual attractiveness pheromone in red-sided garter snakes.</a> Journal of Chemical Ecology. 35 (10), 1234-1241 (2009).</li>
<li>Parker, M. R., Mason, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+make+a+sexy+snake%3A+estrogen+activation+of+female+sex+pheromone+in+male+red-sided+garter+snakes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">How to make a sexy snake: estrogen activation of female sex pheromone in male red-sided garter snakes.</a> Journal of Experimental Biology. 215 (5), 723-730 (2012).</li>
<li>Alberts, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constraints+on+the+design+of+chemical+communication+systems+in+terrestrial+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22American+Naturalist%22%5BJournal%5D)">Constraints on the design of chemical communication systems in terrestrial vertebrates.</a> American Naturalist. 139, S62-S89 (1992).</li>
<li>Martín, J., Ortega, J., López, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpopulational+variations+in+sexual+chemical+signals+of+Iberian+wall+lizards+may+allow+maximizing+signal+efficiency+under+different+climatic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Interpopulational variations in sexual chemical signals of Iberian wall lizards may allow maximizing signal efficiency under different climatic conditions.</a> PLoS ONE. 10 (6), e0131492(2015).</li>
<li>Baeckens, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+conditions+shape+the+chemical+signal+design+of+lizards%5BTitle%5D)+AND+%22Functional+Ecology%22%5BJournal%5D)">Environmental conditions shape the chemical signal design of lizards.</a> Functional Ecology. 32 (2), 566-580 (2018).</li>
<li>Greene, M. J., Mason, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+mediated+sexual+behavior+of+the+brown+tree+snake%2C+Boiga+irregularis%5BTitle%5D)+AND+%22Ecoscience%22%5BJournal%5D)">Chemically mediated sexual behavior of the brown tree snake, Boiga irregularis.</a> Ecoscience. 5 (3), 405-409 (1998).</li>
<li>Mason, R. T. Integrated pest management: The case for pheromonal control of habu and brown tree snakes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMason%2C+RT+%22Snakes+and+Man%3A+Controlling+Pest+Species+for+Conservation+and+Human+Health%22">Snakes and Man: Controlling Pest Species for Conservation and Human Health</a>. Rodda, G., Chiszar, D., Sawai, Y., Tanaka, H. , Cornell University Press. Ithaca, NY. 196-205 (1998).</li>
<li>Pruett, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+interactions+between+visual+and+chemical+signals%3A+chemosignals+compensate+for+the+loss+of+a+visual+signal+in+male+Sceloporus+lizards%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Ecology%22%5BJournal%5D)">Evolutionary interactions between visual and chemical signals: chemosignals compensate for the loss of a visual signal in male Sceloporus lizards.</a> Journal of Chemical Ecology. 42 (11), 1164-1174 (2016).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

파충류의 피부 지질 추출 헛간 피부,이 기술 실험 적용에 다양성을 제공 이외에 생활 또는 죽은 피부에 적용할 수 있습니다. 또한, 피부 지질 기사 생물학2,13의 다양 한 방법의 동적 응용 프로그램을 사용 하는 필드에서 수행할 수 있습니다. 피부 지질 추출은 간단 하다; 따라서, 그것은 쉽게 실험 또는 디자인, 필요에 따라 추출 최대 규모 이며 실무자 메서드를 실행 하려면 상당한 전문성을 가질 필요가 없다. 확장에 대 한 유일한 제한 요소는 연기 후드 공간의 가용성, 깨끗 한, 접착성 유리와 용 매 저장 공간입니다.
피부 지질 추출 분류 연구자의 요구에 맞게 수 있으며, 따라서, 지질 추출에 비슷한 유연성. 예를 들어, 중립 지질 eluted 고 후 삭제, 대상 분수 관심사의 화합물을 정화 하거나 단순화 생물 검정에서에서 결과. 분류 및 지질 샘플에서 여러 스케일에서 수행할 수 있습니다. 예를 들어 여러 열 보다 효율적으로 프로세스를 동시에 실행할 수 있습니다. 또는, 총 지질 추출의 단지 부분에, 따라서, 시 약 및 시간 작은 열에 fractionated 수 있습니다. 분류 총 지질 추출의 질량 및 연구원 수 장비의 정밀도 의해 주로 제한 됩니다. 예를 들어 있으면 연구원 10.0 mg 정밀도, 분수의 균형 질량 및, 따라서, GC-MS 분석을 위한 시료 준비의 정확성은 크게, 아니라면 완전히 장애가. 유리는 마찬가지입니다. 연구원 분류에 대 한 대규모 열만 별도로 작은 총 지질 질량, 경우 차입 또는 화합물의 분리 진행 된다 하지만 용 매, 시 약, 시간, 및 잠재적으로, 대상의 중요 한 소모를 요구할 것 이다 스스로 화합물.
표 2에서 보듯이 차입 계획을 결정 하기 전에 품질 관리 검사를 수행 하 고 어떤 분수 삭제 될 수 있습니다 결정 하는 것이 좋습니다. 원하는 지질, 열의 차입을 확인 하 수 있습니다 실행 각 분수, 1-15를 개별적으로 수집 하 고 다음 분석 하는 어디 사용 GC-MS. 그림 3에서는 대표적인 가스 크로마 토 그래프 추적이 터 훈장 뱀이에서 메 틸 케 톤만에 특정 열에서 elute 보여줍니다. 이 품질 관리 단계를 수행 하 여 관심의 화합물의 최대 수익률을 보장 하기 위해 특정된 종족에 대 한 수정 된 차입 계획을 개발할 수 있습니다. 공급 업체 또는의 많은 diethyl 에테르의 나이 등 재료에 변화 차이 대 한 품질 관리 테스트를 수행 하 여 제어 해야 하는 차입에 절대적으로 발생 합니다.
설명 된 기술은 얻을 수 있는 단서의 화학 본질에 의해 주로 제한 됩니다. 주로, 이러한 메서드는만 연구원 분리 하 고 긴 체인 지질 파충류의 피부에서 분리 수 있습니다. 많은 종의 파충류 화학 신호로 공 수 및 배치할 신호를 사용 하 고 설명된 방법 분리 했다 단서와 호환 되지 않습니다. 또한, 비 극성 용 매 하지 파충류의 표면 또는 큐 증 착의 (예를 들어, 케이지 물, 대변, 수생 기판) 참으로 풍부한 화학 신호를 포함할 수 있는 소스에서 수성 신호를 추출할 것 이다. 비록, 이러한 유형의 신호 캡처에 대 한 적절 한 메서드 (예를 들어, 고체 상 미 [SPME] 휘발성 신호를 고성능 액체 크로마토그래피 [HPLC] 수성 단서), 연구원에 게 사용할 수 있습니다 같은 방법 위에서 설명한 기술 학습 곡선입니다.
가장 중요 한 것은, 연구원을 최종 화학 혼합물의 유틸리티 사용 방법을 안내 한다. 예를 들어 연구원 경우 남성 초점 동물 대상된 생물 검정에 남성 대 여성 conspecifics를 제작한 신호를 구별할 수 있습니다 알고 싶다면, 추출 하는 유일한 방법 필요한2,3입니다. 그러나 성적으로 동종이 형 화합물의 식별 목표 하는 경우에,, 추출에 게 서, 특정 분자 또는 분자를 통해 화학 분석1,의 그룹에 식별 할당에 큰 자신감 수 있도록 정화 6,,911. 그러나, 심지어 지질 소스와 크로마토그래피를 실시, 추출 시작의 중요 한 대량은 필요 측정 분수 질량은 얻어질 수 있다; 그렇지 않으면, 샘플의 풀링 추구 될 수 있지만 최적의14아니에요.
이 프로토콜의 미래 개발 활용 하 고 더 많은 파충류 종에 대 한 절차를 적용 하는 조치를 포함 합니다. 피부 지질을 추출의 추가 비 침 투 적인 방법 또한 개발 되고있다.

파충류에 표 피, 피부 세포에서 직접 또는 동료 평가 추적, 세력권이, 내부-그리고 interspecific 인식1,2 등 사회적 통신에 사용 되는 개별 동맥에서 지질 생산 ,,34. 이러한 피부 지질 격리는 유틸리티 진화 패턴 및 지질 지상파2,3의 진화에의 방수 역할을 이해 뿐 아니라 화학 통신의 메커니즘에 초점을 맞춘 연구에 ,4. 또한, 많은 파충류 squamates (도마뱀, 뱀), 특히 민감한 생태계에 관심사의 침략 적인 종 그리고 페로몬 기반 미끼 트랩 및 제거 향상의 개발은 지속적인5,6. 파충류 피부의 불 침투성의 화학 신호의 잠재적으로 강력한 소스의 비교적 순수한 기사를 현재 지질 추출 용이. 설명된 프로토콜에 파충류 피부 지질을 측정 하는 원리 단계 추출, 총 지질 결정 및 분류를 통해 열 크로마토그래피1,,67포함 됩니다. 방법을은 정기적으로 그들은 많은 메이 트 선택과 뱀2에 특히 선택에 대해 설명 하는 생리 활성 격리 항복으로 사용 되었습니다.
피부 지질 생활 피부, 헛간 피부, 또는 비 극성을 사용 하 여 죽은 모든 파충류 또는 극 지 유기 용 매1,7,,89에서 추출할 수 있습니다. 박물관 표본 에탄올 같은 용 매에 저장 된 피부 지질 추출에 최적 되지 않습니다 고만 싱싱한 갓 냉동 시체 추출 위한 가능한 근원으로 고려 되어야 한다 주목 한다. 피부 지질은 불활성,이 그들이7추출 하기 쉬운 피부를의 표면에 안정적인 게. 파충류 생태에서 그들의 신호 역할, 피부 지질 신호는 가혹한 환경에서 입금 자주 하지만 그들의 강력한 화학 특성 때문에 이러한 신호 수 시간10,11 의 오랜 기간 동안 그들의 정보 가치를 유지 , 12. 추출 과정 지질 추출7 의 측정 질량을 두고 솔벤트의 증발에 의해 다음 시간 동안 흠뻑 젖어 통해 지질, 비 극성 용 매 (예를 들어, 헥 산, 벤젠, 톨루엔)를 사용 하 여 solubilizes , 8. 피부 지질은 매우 비 극성 용 매에 혼합할 수 있는 마찬가지로 다양 한 소스에서에서 다양 한 탄화수소를 추출할 수 있습니다.
분류 추출 보다 더 힘 드는입니다 하지만 특정 분수를 통해 열 착 색 인쇄기, 화합물의 정화 및 가능한 식별에 도움이 거기에1, 로 총 지질 추출 분리 하는 역 6 , 7 , 8. 총 지질 추출 기판 기반 열에 바인딩되어 있고 다음, 용 매 특정 볼륨에서의 개별 있다 ("분수") 열 elute 일반적인 있는 지질 혼합물에서 화합물의 집합을 통해 순차적으로 전달 됩니다 극성6,,78. 지질 크로마토그래피, 일부 극성에 분수 진행 비 극성 용 매에서 극 지 용 매 (예를 들어, diethyl 에테르)의 상대적인 양을 늘려 시퀀스 표준화 (일반적으로 백분율로 표시: 0%, 2%, 4% 에테르, 등. )6,,78. 방법 처럼 얇은 층 크로마토그래피 (TLC) 지질 혼합물에는 간단 하 게 분리 하는 데 사용할 수 있습니다, 열 착 색 인쇄기는 제어, 수 쉽습니다 선호 하는 닫힌된 시스템을 사용 하기 때문에 별도 더 집중 혼합물, 고 호환 효율성에 대 한 다중화 한다. 이 원고에서 우리 파충류의 피부 지질을 추출 하기 위한 여러 가지 방법을 설명 하 고, 다음, 제공 표준 프로토콜 기반 극성 화합물의 다른 세트를 격리 하기 위한 전통 칼럼 크로마토그래피를 사용 하 여. 화학 신호의 격리와 관련 된 많은 연구 프로젝트에 궁극적인 목적은 그 단서에 노출 하는 수신기에 효과 변화입니다. 전체 지질 추출 또는 특정 분수, 사용할 수 있습니다 생물 검정에서 어떤 생물 활성 화합물에 의해 elicited1,2,,67거기에 결정을. 기본적인 생물학 연구, 예를 들어 특정 분수를 사용 하 여 생물 검정 밝힐 수 있다 연구는 페로몬의 순화 소스 고립 되었으며 다음, 대상 화합물의 식별을 위한 방법 추구 될 수 있습니다. 야생 동물 관리 관점에서 식별 목표, 되지 않을 수도 있습니다 그리고 대신, 활성 분수 사용할 수 필드에 트랩 conspecifics를 유치 또는 억제 nonnative 서식 지13,14에서 추적 하는 친구.

<table><tbody><tr><td>파우더 프리 클로로프렌 장갑</td><td>Microflex</td><td>NEC-288</td><td>"1.1 헛간 추출 설정" 참조(1.1.2 "장갑" 단계) Ohaus</td></tr> <tr><td>Adventurer Precision Balance</td><td>Ohaus</td><td>AX622</td><td>"1.1 헛간 추출 설정" 참조(1.1.3 "균형") Freund</td></tr> <tr><td>Container Ball 16oz Mason Jar & 뚜껑</td><td>볼</td><td>NC9661590</td><td>"1.1 헛간 추출 설정"(1.1.5 단계 "메이슨 항아리") 참조</td></tr><tr><td>헥산, 이성질체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650544</td><td>혼합물 "1.1 헛간 추출 설정"참조 (1.1.6 "헥산")</td></tr> <tr><td>Hi / Lo 쓰기 온도 테이프</td><td>전자 현미경 과학</td><td>5029927</td><td>"1.1 헛간 추출 설정"참조 (1.1.8 "테이프")</td></tr><tr><td>단일 목 둥근 바닥 플라스크, 용량 500 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z414514</td><td>"2. 추출"(단계 2.1.2.4 "500 mL")</td></tr><tr><td>단일 목 둥근 바닥 플라스크, 용량 100 mL</td><td>시그마-알드리치</td><td>Z414492</td><td>"3.2 분획" 참조(단계 3.2.4 "100 mL")</td></tr> <tr><td>코르크 플라스크 지지 링</td><td>시그마-알드리치</td><td>Z512419</td><td>참조 "2. 추출"(단계 2.1.2.1 "코르크 지지 링")</td></tr><tr><td>Accu-jet Pro 피펫 컨트롤러</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z671533</td><td>"2. 추출"(2.1.1.3 단계 "전기 피펫 컨트롤러"),</td></tr> <tr><td>일회용 개별 포장 유리 혈청학 피펫, 10mL</td><td>Pyrex</td><td>13-666-7E</td><td>"2. 추출"(단계 2.1.1.3 "10mL 피펫")</td></tr><tr><td>Rotavapor R II</td><td>Buchi</td><td>2422A0</td><td>"2. 추출"(단계 2.1.2.1 "회전 증발기")</td></tr><tr><td>타원형 범프 트랩</td><td>Chemglass 생명 과학</td><td>501215241</td><td>"2. 추출"(단계 2.1.2.1 "범프 트랩")</td></tr><tr><td>7mL 바이알, 나사 상단, 투명 유리</td><td>Supelco</td><td>27151</td><td>"1.1 흘림 추출 설정"(단계 1.1.11 "7mL 바이알")</td></tr> <tr><td>참조 7mL 바이알 나사 캡, PTFE 라이너가 있는 단단한 상단</td><td>Supelco</td><td>27152</td><td>"1.1 흘림 추출 설정"(단계 1.1.11 "캡")</td></tr> <tr><td>참조 22mL 바이알, 스크류 탑, 투명 유리</td><td>Supelco</td><td>27173</td><td>"1.1 쉐드 추출 설정"(단계 1.1.11 "22 mL 바이알")을 참조하십시오</td></tr>.<tr><td>22 mL 바이알 스크류 캡, PTFE 라이너가 있는 솔리드 탑</td><td>Supelco</td><td>27174-U</td><td>"1.1 쉐드 추출 설정"(1.1.11 "캡")</td></tr> <tr><td>Excellence XS 분석 저울</td><td>Mettler-Toledo</td><td>XS205DU</td><td>"2. 추출"(단계 2.1.2.1 "균형")</td></tr> <tr><td>5 3/4 "일회용 유리 피펫</td><td>Fisherbrand</td><td>NC0418555</td><td>"1.1 헛간 추출 설정"(단계 1.1.11 "피펫") 참조</td></tr> <tr><td>PTFE 스토콕 어셈블리가있는 크로마토 그래피 컬럼</td><td>Kimble-Chase</td><td>17810-19300</td><td>"3.1 컬럼 준비"(3.1.1 "작은 유리 기둥") 주</td></tr><tr><td>철 L 자형 베이스 지지대 참조 스탠드</td><td>Fischerbrand</td><td>11474207</td><td>"3.1 컬럼 준비" 참조(3.1.1 "지지 스탠드")</td></tr> <tr><td>3-프롱 듀얼 조정 니켈 도금 아연 클램프</td><td>Troemner 2300203</td><td></td><td>"3.1 컬럼 준비" 참조(3.1.1 "clamps") 클램프</td></tr> <tr><td>레귤러 홀더</td><td>Fischerbrand</td><td>05754Q</td><td>"3.1 컬럼 준비" 참조(3.1.1 "클램프 홀더")</td></tr><tr><td>모래, 세척 및 건조</td><td>Macron Fine Chemical</td><td>MK-7062-212</td><td>"3.1 컬럼 준비"(3.1.5 "모래") 참조알</td></tr><tr><td>루미나, 중성</td><td>Sorbtech</td><td>15740-5</td><td>"3.1 컬럼 준비"참조 (3.1.7 "알루미나"단계); 미국에서 유일하게 알려진 제조업체</td></tr><tr><td>Narrow-Neck Heavy-Duty Glass Erlenmeyer Flask, 1000mL</td><td>Pyrex</td><td>4980-1L</td><td>"3.1 컬럼 준비"(3.1.6단계 "삼각 플라스크") 참조:</td></tr> <tr><td>단일 목 둥근 바닥 플라스크, 용량 250mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z100684</td><td>"3.1 컬럼 준비"(3.2.4단계 "250mL 둥근 바닥 플라스크")를 참조하십시오</td></tr>. 용매 <tr><td>저장소가 있는 보정된 크로마토그래피 컬럼</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z560553</td><td>"3.2 컬럼 준비" 참조(3.2.1 "대형 유리 컬럼") )</td></tr><tr><td>에틸 에테르 무수</td><td>피셔 화학 E138500</td><td></td><td>"3.2 분별"(단계 3.2.5 "에테르")를 참조하십시오</td></tr>.<tr><td>Alconox Detergnet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242985</td><td>"4. 청소"(단계 4.2 "Alconox")</td></tr><tr><td>아세톤(인증 ACS)</td><td>Fisher Chemical</td><td>A18P-4</td><td>"4. 청소"(단계 4.4 "아세톤")</td></tr></tbody></table>

화학, 정량화, 고립과 파충류의 피부 지질 분리

Chemical Isolation, Quantification, and Separation of Skin Lipids from Reptiles

파충류 conspecifics 친구 추적 및 평가에 주로 그들의 피부에 지질을 사용 하 여 신호. 이러한 지질 격리는 진화 패턴 및 지질 지구 생명의 진화에서의 방수 역할을 이해 하는 것 외에도 화학 통신의 메커니즘에 초점을 맞춘 연구에 유틸리티가 있습니다. 적용된 방법에서는 이러한 피부 기반 신호 침입 종으로 취급 하는 야생 동물 관리자에 대 한 사용 가능성 있다. 여기에 제시 된 프로토콜에 파충류 피부 지질을 측정 하는 주요 단계 추출, 총 지질 결정 및 분류를 통해 열 착 색 인쇄기, 다음에 할 수 있는 화합물의 순화 있다 결과 후자의 과정 포함 중 복합 신원 (예를 들면, 가스 크로마토그래피-질량 분석 [GC-MS])을 지정 하려면 분석 될 또는 더 세련 된 생물 검정에 직접 사용. 피부 지질 생활 피부에서 추출 될 수 있다, 피부, 또는 전체 죽은 동물, 비 극성 유기 용 매 (예를 들어, 헥 산, 벤젠, 톨루엔)를 사용 하 여 창 고. 추출 solubilizes 지질 그리고, 다음, 용 매 측정 지질 전용 추출을 증발 수 있습니다. 분별에 전통적인 칼럼 크로마토그래피를 통해 특정 있다 총 지질 추출의 분리를 포함 한다. 총 지질 추출 물 (예를 들어, 알 루미나) 기판 기반 열에 바인딩되어 먼저 하 고, 다음, 용 매 특정 볼륨에서의 개별 있다 ("분수") 열 elute 지질 혼합물에서 화합물의 집합을 통해 순차적으로 전달 됩니다. 일반적인 극성을 기반으로 합니다. 비 극성 용 매에서 극 지 용 매 (예를 들어, diethyl 에테르)의 상대적인 양을 증가 하 여 표준화 된 시퀀스에 극성에 분수 진행. 이 원고에서 우리 파충류의 피부 지질을 추출 하기 위한 여러 가지 방법을 설명 하 고, 다음, 제공 표준 프로토콜 기반 극성 화합물의 다른 세트를 격리 하기 위한 전통 칼럼 크로마토그래피를 사용 하 여. 전체 지질 추출 또는 특정 분수 사용할 수 있습니다, 다음, 생물 검정에는 화합물에 의해 거기에 elicited 어떤 생물 학적 활동을 결정 하.

다음 추출, 총 지질 질량은 여기에 제시 된 프로토콜을 통해 취득 될 수 있는 데이터의 첫 번째 유형은. 그러나, 총 지질 질량 값 없이 얻은 값을 표준화 하려고 일부 결코 분석 되어야 합니다. 몇 가지 방법을 사용할 수 있습니다, 하지만 추출된 지질 질량 (센티미터)에서 동물의 SVL 또는 추출 된 헛간 피부의 질량을 표준화 하는 것이 좋습니다. 길이 당 지질 질량 값에 후자 전 결과 소스의 비율을 될 것입니다 질량. 표준화에 대 한 이유는 큰 총 피부 표면적을가지고 있기 때문에 더 큰 동물 자연스럽 게 더 많은 피부 지질을 생산. 그림 1A 는 어디의 질량으로 선형 추출된 피부 지질 대량 비늘 창 추출 피부 고이 협회를 예로 보여주. 일단 총 헛간 피부 대량 표준화,이 선형 관계는 완전히 제거 (그림 1B).
분별, 다음 동일한 표준화 접근의 개별 부분 (그림 2)와 함께 사용할 수 있습니다. 이 샘플 데이터 집합에서 각 분수는에 기여 하지 똑같이 총 추출된 지질 질량: 중립 지질 (분수 1-3) 더 많은 극 지 지질 (분수 4-6, 7-9, 및 10-12)의 각 세트에 비해 대량 비율에 의해 화합물의 지배적인 설정 됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59018/59018fig1.jpg"> 그림 1: 간의 관계 추출 지질 대량와 입력 자료. (A) 파충류, 총 창 고 간의 관계 피부 질량 및 추출 된 피부 지질 질량 긍정적으로 상관 (P &lt; 0.001). (B) 때 추출 된 피부 지질 질량은 질량 흘렸다 총 표준화 (대량 헛간을 나눈 지질 대량),이 관계는 더 이상 존재 (P = 0.46). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59018/59018fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59018/59018fig2.jpg"> 그림 2: 분수 대 중 차입에 따라 표준화. 칼럼 크로마토그래피를 사용 하 여, 피부 지질 추출 물 복합 극성에 따라 분수에 eluted 될 수 있습니다. 분수 질량은, 다음, 총 지질 추출 (분수 질량 [밀리 그램] [밀리 그램에 있는 총 지질 추출 물 질량으로 나눈 값)의 비율로 표현 차이 분수 또는 실험적인 그룹8결정. 막대는 의미를 나타냅니다. 최상위 오류는 SEM; 아래 오류는 95 %CI. 개별 데이터 요소는 편의상 제공 됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59018/59018fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59018/59018fig3.jpg"> 그림 3: 메 틸 케 톤 분수의 대표적인 가스 chromatographs. (A) 적절 한 차입으로 메 틸 케 톤 분수 7 표 2 에서 가장 풍부한 화합물 이며 봉우리의 대련으로 볼 수 있습니다 (유지 시간 = 24-34 분). 그러나 (B) 분수 6 표 2,, 단지 nontarget 화합물을 생성합니다. 이 같은 결과 극 지 용 매 모바일 단계에 사용 기간이 만료 된 때 또는 열 시간의 오랜 기간 동안 중지 된 경우 발생할 수 있습니다 (&gt; 1 h) 분수 사이. 두 추적 분자 풍부에서 차이 note <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59018/59018fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>분수</td>
			<td>제 초 제 (mL)</td>
			<td>Diethyl 에테르 (mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1,2,3</td>
			<td>100 [30]</td>
			<td>0 [0]</td>
		</tr>
<tr>
<td>4,5,6</td>
			<td>98 [29.4]</td>
			<td>2 [0.6]</td>
		</tr>
<tr>
<td>7,8,9</td>
			<td>96 [28.8]</td>
			<td>4 [1.2]</td>
		</tr>
<tr>
<td>10,11,12</td>
			<td>92 [27.6]</td>
			<td>8 [2.4]</td>
		</tr>
<tr>
<td>13,14,15</td>
			<td>84 [25.2]</td>
			<td>16 [4.8]</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 피부 지질 분류에 대 한 표준 차입 볼륨. 솔벤트 볼륨 및 백분율 크로마토그래피 열 알 루미나 (행위 III)를 사용 하 여 대규모 (예를 들어, 250 mL)와 [작은 볼륨] (예를 들어, 100 mL) 모두에 대 한 주어 집니다. 제 초 제는 캐리어 용 매; diethyl 에테르 모바일 단계입니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>분수</td>
			<td>제 초 제 (mL)</td>
			<td>Diethyl 에테르 (mL)</td>
			<td>노트</td>
		</tr>
<tr>
<td>1, 2, 3</td>
			<td>30</td>
			<td>0</td>
			<td>elute; 수집 하지 않습니다</td>
		</tr>
<tr>
<td>4, 5</td>
			<td>28.8</td>
			<td>1.2</td>
			<td>elute; 수집 하지 않습니다</td>
		</tr>
<tr>
<td>6, 7, 8</td>
			<td>28.8</td>
			<td>1.2</td>
			<td>개별적으로; 수집 메 틸 케 톤의 대다수 질량 분수 7;에 있을 것입니다 6, 8는 ketones의 적절 한 차입 되도록 GC-MS 품질 관리 검사를 실행 한다</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2:가 터 뱀 메 틸 케 톤에 대 한 수정 된 차입 계획. 이 볼륨은 현재 사용할 수의 브랜드와 작은 볼륨 크로마토그래피 열 함께 사용 하기 위해. 메 틸 케 톤에 대 한 긍정적인 eluted 분수 야생, 남성가 터 뱀1,7구애와 필드 분석에 강한 bioactivity를 있다. 메 틸 대상 분수, 샘플에서에서 ketones 1 mg/mL를 희석 수 있습니다 및 분석 을 통해 GC-미스의 존재를 확인 하려면 그림 3 차입에 따라 긍정적이 고 부정적인 결과 대 한 대표 chromatograms을 제공 합니다.

파충류, 피부 지질 conspecifics에서 성적 신호 침입 종 관리에서 잠재적인 사용에 대 한 중요 한 있습니다. 우리가 헛간 피부 또는 전체 동물에서 피부 지질을 추출 하기 위한 프로토콜을 설명 하는 여기, 결정 및 총 지질 질량 분석 및 분류를 통해 칼럼 크로마토그래피를 사용 하 여 지질을 분리.

Reptiles signal to conspecifics using lipids in their skin, primarily to enable mate tracking and assessment. The isolation of these lipids has utility in ...

우리의 프로토콜은 연구원이 화학 통신에서 파충류에 의해 사용되는 생리 활성 신호 분자를 격리 할 수 있습니다. 뿐만 아니라 추가 테스트를 위한 이러한 화합물의 분리 및 정제, 또는 식별. 이 방법을 사용하여, 연구원은 화학 신호의 근원을 얻고 그(것)들을 격리에 있는 그들의 정량화 또는 bioassay 사용을 위해 그(것)들을 추출할 수 있습니다.오늘 절차를 시연하는 것은 홀리 루커, 내 실험실에서 명예 의학 학생이 될 것입니다. 먼저 5센티미터 제곱 조각을 육산 과 호환 뚜껑이 있는 밀봉 가능한 유리 용기에 넣고 용기에 충분한 헥산을 추가하여 용기를 밀봉하기 전에 창고 피부 조각을 완전히 잠수합니다. 다음 날, 깨끗한 금속 집게를 사용하여 창고 조각을 제거하고, 용기 내에 남은 헥산을 유지하기 위해 포획될 때 조각을 흔들어 보입니다.추출된 지질 질량 전달을 결정하기 위해 추출물을 미리 계량하고 둥근 바닥 플라스크로 전환하여 진공 압력이 응축기의 목에 플라스크를 고정하기에 충분한지 확인하기 위해 진공 공급원을 회전 증발기로 켭니다. 응축기 끝에 통풍구를 열고 플라스크를 응축기의 목에 밀어 놓고 통풍구를 닫아 시스템을 밀봉합니다. 플라스크가 해제될 때 플라스크가 응축기에서 분리할 수 없도록 한 후.플라스크의 하부 10%만이 욕조의 물에 닿을 때까지 플라스크를 낮추고 중간 속도로 회전을 시작합니다. 진공, 속도, 응축기 흐름 및 목욕 온도가 최적이라면 플라스크를 떠나는 용매 증기가 코일에 응축되어 회복 플라스크로 떨어집니다. 직경이 1센티미터 미만인 액체의 비드가 플라스크 의 바닥에 보일 때까지 진공 아래의 샘플을 증발시한다.그런 다음 회전과 진공을 끄고 플라스크를 목욕에서 들어 올립니다. 진공 씰이 방출될 때 플라스크 목을 잡고 응축기에서 플라스크를 옆으로 비틀습니다. 추출물의 액체 비드는 헥산이 증발함에 따라 고화됩니다.비드가 실온에서 약 5분 동안 건조되면, 지질은 플라스크에 반투명 흰색에서 노란색 왁스를 형성합니다. 플라스크의 무게를 측정하여 최종 질량을 얻고 헥산의 기록된 부피에서 지질을 용해하여 헥산의 1 밀리리터당 1밀리그램 이상의 지질을 산출합니다. 크로마토그래피 컬럼을 준비하려면 기둥보다 긴 나무 다웰 로드를 사용하여 유리 크로마토그래피 기둥 바닥에 접힌 유리 섬유의 4-4센티미터 사각형을 배치합니다.연기 후드의 컬럼을 표준 링 스탠드에 고정하고 스톱콕을 엽니다. 다음으로, 약 3센티미터의 모래가 유리섬유 위에 놓일 때까지 씻고 말린 모래를 기둥에 붓습니다. 그런 다음 어두운 용지를 열 아래에 놓고 부드럽게 누릅니다.이제 기둥 아래에 500 밀리리터 비커를 놓고 육산의 약 25 밀리리터로 모래를 천천히 적시고 모래 위에 약 0.5 센티미터의 헥산이있을 때 스톱콕을 닫습니다. 중성 일루미나를 활성화하기 위해, 일루미나 전체의 낙하에 있는 일루미나 질량의 6%와 동일한 부피의 파이펫 을 산화하였다. 그리고 활성화 된 일루미나의 플라스크를 덮고 용액을 적극적으로 소용돌이어 전하를 균등하게 분산시합니다.일루미나의 눈에 보이는 덩어리가 남아 있지 않은 경우, 일루미나가 육산의 약 0.5센티미터로 완전히 덮일 때까지 육산을 추가합니다. 플라스크를 소용돌이모양으로 돌리면 슬러리를 형성하고 기둥 아래에 새로운 500 밀리리터 유리 비커를 놓습니다. 스톱콕을 열고 일루미나를 다시 소용돌이치게 한 다음, 일루미나를 기둥의 저수지에 보관한 환기 깔때기에 꾸준히 붓고, 일루미나가 기둥 안에 고르게 정착하고 큰 거품이나 균열이 형성되지 않도록 주의하십시오.기둥은 일루미나의 상단이 안정되고 저수지 의 기지에서 기둥의 목 아래 약 4 센티미터 때 형성됩니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 저수지 내부를 육산조명으로 헹구고, 저수지 아래 약 1센티미터에 일루미나 위에 두 번째 모래층을 부드럽게 넣습니다. 지질 추출물의 분획을 위해 긴 유리 파이펫을 사용하여 지질 샘플을 컬럼으로 옮기고 추출물을 천천히 피펫하여 모래 층을 방해하지 않도록 합니다.헥산 5밀리리터로 추출물을 헹고 세척을 기둥으로 옮겨버세요. 모든 추출이 추가되었을 때 스톱콕을 열고 샘플이 열에 로드되도록 합니다. 샘플이 추가되면 컬럼은 용매로 채도 상태를 유지해야 합니다.열이 마르면 샘플이 손실됩니다. 첫 번째 분획을 수집하기 위해 열 아래에 미리 계량되고 레이블이 표시된 둥근 바닥 플라스크를 배치합니다. 그리고 모래 층을 방해하지 않도록 저장기 의 측면에 100 % 헥산을 부어 환기 유리 깔때기를 사용합니다.그런 다음 스톱콕을 열어 용출을 시작하고, 헥산의 약 3 밀리리터가 기둥 의 상단에있는 모래 위에 남아있을 때 스톱콕을 닫습니다. 큰 동물은 피부 표면적이 커서 자연적으로 더 많은 피부 지질을 생성하므로 추출된 지질 덩어리를 동물의 주미 통풍구 길이로 표준화하는 것이 중요합니다. 일단 총 창고 피부 질량으로 표준화되면 추출된 피부 지질 질량과 추출된 피부 지질 덩어리의 선형 관계가 완전히 제거됩니다.다음 분획, 동일한 표준화 접근 방식은 개별 분획의 질량과 함께 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 여기서 각 분획은 총 추출지질 질량에 동등하게 기여하지 않으며, 중성 지질은 질량 비율에 의한 화합물의 지배적인 집합이기 때문에, 더 많은 극지 지질의 각 세트에 비해. 화합물의 식별이 궁극적인 목표인 경우 깨끗한 유리 제품을 사용하며 플라스틱을 피하여 시료의 오염을 방지해야 합니다.화합물 식별을 위해, 액체 또는 가스 크로마토그래피를 위해, 대량 분광과 결합하여 시료를 수집한 후에 추구될 수 있다. 대안적으로, 바이오아세이션은 시료의 생체 활성을 해명하기 위해 수행될 수 있다.

chemical-isolation-quantification-separation-skin-lipids-from

Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

이 프로토콜은 세포에서 유리 및 에스테르화된 생체 활성 지방산의 추출 및 분석을 보여줍니다. 지방산은 안정 동위원소 희석, 키랄 액체 크로마토그래피, 전자 포획, 대기 화학 이온화, 다중 반응 모니터링 질량 분석법(SID-LC-ECAPCI-MRM/MS)을 사용하여 정확하게 정량화됩니다.

타겟 안정 동위 원소 희석 액체 크로마 토그래피 - 질량 분광법 분석을위한 세포 지질 추출

이 비디오는 메탄올과 클로로포름을 사용하는 이위상 용매 시스템에 의한 인간 호중구로부터의 지질 분리를 보여줍니다.

Biphasic Separation에 의한 인간 혈액 유래 호중구에서 지질의 분리

그람 음성 박테리아 지질 다당류 (LPS)의 지질 도메인의 분리 및 특성은 세포 표면 항생제 내성의 기반 메커니즘, 세균의 생존과 건강, 어떻게 화학적으로 다양한 지질 분자 종은 차등 호스트 타고난 면역 반응을 조절에 대한 통찰력을 제공합니다.

그람 음성 박테리아에서 분리 및 지질의 화학 특성

포유류의 외피는 개별 종의 화학 성분 특성을 제공 할 수있는 용매 추출 지질이 포함되어 있습니다. 이 논문은 박막 크로마토 그래피를 사용하여 외피 조직으로부터 격리 광범위한 지질 클래스 분리 및 매트릭스 - 보조 레이저 탈착 / 이온화 비행 시간 형 질량 분광 분석에 의해 triacylglyceride 프로파일을 결정하기위한 통상적 인 방법을 제시한다.

제조 박층 크로마토 그래피 및 MALDI-TOF 질량 분석에 의해 박쥐 외피 지질의 Triacylglyceride 내용을 프로파일 링

우리는 인간 피부 생검에서 피부 상주 T 세포를 효율적으로 분리하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 유세포 분석 및 생체 외 배양을 위한 충분한 수의 생존 가능한 인간 피부 상주 림프구를 생성합니다.

표현형 분석 및 대한 인간의 피부에서 림프구 분리<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 세포 배양

지질 방울은 C 형 간염 바이러스 (HCV) 등 여러 가지 병원균의 복제에 중요한 소기관이다. 우리는 관련 단백질의 양적 질량 분석에 대한 지질 방울을 분리하는 방법을 설명; 그것은 바이러스 감염, 환경 스트레스, 또는 약물 치료와 같은 조건의 다양한에서 사용할 수 있습니다.

양적 질량 분광법 분석을위한 지질 물방울 절연

지방산 영양 마커 접근, 즉, 전체 분자와 소비자 조직으로 전송으로 지방산의 동화 없이 또는 사소한 수정, 작은 토양 무척 추 동물의 지방 산 성 대사에 지식 격차에 의해 방해 된다. Isotopologue 프로 파일링 풀 영양 상호 작용 하는 귀중 한 도구로 제공 됩니다.

영양 탄소 전송 및 무척 추 동물 소비자의 지질 대사에 대 한 통찰력을 제공 합니다 지방산 13C Isotopologue 프로 파일링

이 프로토콜 지질 작은 물방울 고립과 확고 바인딩과 그물 격리 키트를 사용 하 여 마우스 간에서 정화의 새로운 방법을 설정 합니다.

음 세포 기관이 격리 키트를 사용 하 여 급속 한 지질 작은 물방울 격리 프로토콜

이 프로토콜은 해수 및 생물학적 표본에서 지질의 결정을 위한 것입니다. 여과류의 지질은 고체의 경우 클로로폼 또는 클로로폼및 메탄올혼합물로 추출됩니다. 지질 클래스는 화염 이온화 감지와 막대 얇은 층 크로마토그래피에 의해 측정되고 그들의 합계는 총 지질 함량을 제공합니다.

해양 샘플의 총 지질 및 지질 수업 결정

이 프로토콜은 페놀 레드 스레드와 액체 크로마토그래피-탠덤 질량분석법(LC-MS/MS) 기반 워크플로우를 사용하여 인간 눈물액 샘플을 수집하는 독특한 임상 프로토콜을 설명하여 눈물 지질 프로필을 발견합니다. 간단한 메틸 테르-부틸 에터(MTBE)/메탄올 이상 분리법은 눈물 바이오마커 발견을 위한 높은 회수율로 빠른 눈물 지질 추출을 가능하게 합니다.

바이오마커 발견에서 표적되지 않은 눈물액 지피도믹스를 위한 페놀 레드 실 샘플링 절차

배우세요 파충류 피부 지질 추출 및 정량화 방법을 통해 화학적 의사소통 신호 분자를 분리하는 기술을 익히세요. 이 프로토콜은 생태학 및 생화학 연구에 활용됩니다.

화학, 정량화, 고립과 파충류의 피부 지질 분리

더 많은 동영상 탐색