Name: 작은 분자 조사를 시험관 및 셀 모양을 사용 하 여 사전 mRNA 구조 변화 유도 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: 배우세요 시험관 내 SHAPE 실험을 통해 RNA 표적 소분자 존재 하에서 pre-mRNA 이차 구조를 분석하는 방법을. 이 비용 효율적인 기술은 RNA 역학 및 상호 작용을 연구하는 신뢰할 수 있는 접근법을 제공합니다.

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<ol><li>Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+2%27-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+%28SHAPE%29%3A+Quantitative+RNA+structure+analysis+at+single+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): Quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution.</a> Nature Protocols. 1, 1610-1616 (2006).</li>
<li>Trausch, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+diversity+in+the+SAM+clan+of+riboswitches%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Structural basis for diversity in the SAM clan of riboswitches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 6624-6629 (2014).</li>
<li>Souliere, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+a+riboswitch+response+through+structural+extension+of+a+pseudoknot%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences.+110%2C+E3256-E3264%22%5BJournal%5D)">Tuning a riboswitch response through structural extension of a pseudoknot.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, E3256-E3264. , E3256-E3264 (2013).</li>
<li>Rice, G. M., Busan, S., Karabiber, F., Favorov, O. V., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHAPE+Analysis+of+Small+RNAs+and+Riboswitches%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">SHAPE Analysis of Small RNAs and Riboswitches.</a> Methods in Enzymology. , 165-187 (2014).</li>
<li>Spitale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+SHAPE+analysis+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA SHAPE analysis in living cells.</a> Nature Chemical Biology. 9, 18-20 (2013).</li>
<li>Wang, J., Schultz, P. G., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+studies+of+a+small-molecule+modulator+of+SMN2+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mechanistic studies of a small-molecule modulator of SMN2 splicing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, E4604-E4612 (2018).</li>
<li>Price, I. R., Gaballa, A., Ding, F., Helmann, J. D., Ke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mn+2%2B+-Sensing+Mechanisms+of+yybP-ykoY+Orphan+Riboswitches%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Mn 2+ -Sensing Mechanisms of yybP-ykoY Orphan Riboswitches.</a> Molecular Cell. 57, 1110-1123 (2015).</li>
<li>Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tertiary+contacts+control+switching+of+the+SAM-I+riboswitch%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Tertiary contacts control switching of the SAM-I riboswitch.</a> Nucleic Acids Research. 39, 2416-2431 (2011).</li>
<li>Abulwerdi, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Small+Molecules+with+a+Noncanonical+Binding+Mode+to+HIV-1+Trans+Activation+Response+%28TAR%29+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Development of Small Molecules with a Noncanonical Binding Mode to HIV-1 Trans Activation Response (TAR) RNA.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 59, 11148-11160 (2016).</li>
<li>Shortridge, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Macrocyclic+Peptide+Ligand+Binds+the+Oncogenic+MicroRNA-21+Precursor+and+Suppresses+Dicer+Processing%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">A Macrocyclic Peptide Ligand Binds the Oncogenic MicroRNA-21 Precursor and Suppresses Dicer Processing.</a> ACS Chemical Biology. 12, 1611-1620 (2017).</li>
<li>Warner, K. D., Hajdin, C. E., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+for+targeting+RNA+with+drug-like+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Principles for targeting RNA with drug-like small molecules.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17, 547-558 (2018).</li>
<li>Mullard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+against+RNA+targets+attract+big+backers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Small molecules against RNA targets attract big backers.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16, 813-815 (2017).</li>
<li>Shortridge, M. D., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+based+approaches+for+targeting+non-coding+RNAs+with+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure based approaches for targeting non-coding RNAs with small molecules.</a> Current Opinion in Structural Biology. 30, 79-88 (2015).</li>
<li>Gallego, J., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+RNA+with+Small-Molecule+Drugs%3A+Therapeutic+Promise+and+Chemical+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Targeting RNA with Small-Molecule Drugs: Therapeutic Promise and Chemical Challenges.</a> Accounts of Chemical Research. 34, 836-843 (2001).</li>
<li>Rizvi, N. F., Smith, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+as+a+small+molecule+druggable+target%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">RNA as a small molecule druggable target.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 27, 5083-5088 (2017).</li>
<li>Connelly, C. M., Moon, M. H., Schneekloth, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Emerging+Role+of+RNA+as+a+Therapeutic+Target+for+Small+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">The Emerging Role of RNA as a Therapeutic Target for Small Molecules.</a> Cell Chemical Biology. 23, 1077-1090 (2016).</li>
<li>Palacino, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMN2+splice+modulators+enhance+U1-pre-mRNA+association+and+rescue+SMA+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">SMN2 splice modulators enhance U1-pre-mRNA association and rescue SMA mice.</a> Nature Chemical Biology. 11, 511-517 (2015).</li>
<li>Ratni, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+Risdiplam%2C+a+Selective+Survival+of+Motor+Neuron-2+%28+SMN2+%29+Gene+Splicing+Modifier+for+the+Treatment+of+Spinal+Muscular+Atrophy+%28SMA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Discovery of Risdiplam, a Selective Survival of Motor Neuron-2 ( SMN2 ) Gene Splicing Modifier for the Treatment of Spinal Muscular Atrophy (SMA).</a> Journal of Medicinal Chemistry. 61, 6501-6517 (2018).</li>
<li>Naryshkin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMN2+splicing+modifiers+improve+motor+function+and+longevity+in+mice+with+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">SMN2 splicing modifiers improve motor function and longevity in mice with spinal muscular atrophy.</a> Science. 345, (2014).</li>
<li>Chiriboga, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preliminary+Evidence+for+Pharmacodynamics+Effects+of+RG7916+in+JEWELFISH%2C+a+Study+in+Patients+with+Spinal+Muscular+Atrophy+who+Previously+Participated+in+a+Study+with+Another+SMN2-Splicing+Targeting+Therapy+%28S46.003%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Preliminary Evidence for Pharmacodynamics Effects of RG7916 in JEWELFISH, a Study in Patients with Spinal Muscular Atrophy who Previously Participated in a Study with Another SMN2-Splicing Targeting Therapy (S46.003).</a> Neurology. 90, (2018).</li>
<li>Sivaramakrishnan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+to+SMN2+pre-mRNA-protein+complex+elicits+specificity+for+small+molecule+splicing+modifiers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Binding to SMN2 pre-mRNA-protein complex elicits specificity for small molecule splicing modifiers.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li>
<li>Lee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+SHAPE+reagents+for+mapping+RNA+structures+inside+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Comparison of SHAPE reagents for mapping RNA structures inside living cells.</a> RNA. 23, 169-174 (2017).</li>
<li>Weeks, K. M., Mauger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+RNA+Structural+Codes+with+SHAPE+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Exploring RNA Structural Codes with SHAPE Chemistry.</a> Accounts of Chemical Research. 44, 1280-1291 (2011).</li>
<li>Smola, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHAPE+reveals+transcript-wide+interactions+%2C+complex+structural+domains+%2C+and+protein+interactions+across+the+Xist+lncRNA+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">SHAPE reveals transcript-wide interactions , complex structural domains , and protein interactions across the Xist lncRNA in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 10322-10327 (2016).</li>
<li>Flynn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+interrogation+of+RNA+secondary+structure+in+living+cells+with+icSHAPE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE.</a> Nature Protocols. 11, 273-290 (2016).</li>
<li>Smola, M. J., Rice, G. M., Busan, S., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+2+%E2%80%B2+-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+and+mutational+profiling+%28SHAPE-MaP%29+for+direct+%2C+versatile+and+accurate+RNA+structure+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Selective 2 ′ -hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct , versatile and accurate RNA structure analysis.</a> Nature Protocols. 10, 1643-1669 (2015).</li>
<li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+correction+of+SMN2+splicing+in+the+CNS+rescues+necrosis+in+a+type+III+SMA+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model.</a> Genes & Development. 24, 1634-1644 (2010).</li>
<li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+SMN+restoration+is+essential+for+long-term+rescue+of+a+severe+spinal+muscular+atrophy+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model.</a> Nature. 478, 123-126 (2011).</li>
<li>Wee, C. D., Havens, M. A., Jodelka, F. M., Hastings, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+SR+proteins+improves+SMN+expression+in+spinal+muscular+atrophy+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Targeting SR proteins improves SMN expression in spinal muscular atrophy cells.</a> PloS One. 9, e115205(2014).</li>
<li>Hammond, J. A., Rambo, R. P., Filbin, M. E., Kieft, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+and+functional+implications+of+the+3D+architectures+of+viral+tRNA-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Comparison and functional implications of the 3D architectures of viral tRNA-like structures.</a> RNA. 15, 294-307 (2009).</li>
<li>Singh, N. N., Singh, R. N., Androphy, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+role+of+RNA+structure+in+alternative+splicing+of+a+critical+exon+in+the+spinal+muscular+atrophy+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Modulating role of RNA structure in alternative splicing of a critical exon in the spinal muscular atrophy genes.</a> Nucleic Acids Research. 35, 371-389 (2007).</li>
<li>Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+SHAPE-directed+RNA+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Accurate SHAPE-directed RNA structure determination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 97-102 (2009).</li>
<li>Qi, H., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aQi%2C+H+%22Preparation+of+pyridopyrimidine+derivatives+and+related+compounds+for+treating+spinal+muscular+atrophy%22">Preparation of pyridopyrimidine derivatives and related compounds for treating spinal muscular atrophy</a>. , (2013).</li>
<li>Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+nucleotide+in+the+SMN+gene+regulates+splicing+and+is+responsible+for+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6307-6311 (1999).</li>
<li>Siegfried, N. A., Busan, S., Rice, G. M., Nelson, J. A. E., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+motif+discovery+by+SHAPE+and+mutational+profiling+%28SHAPE-MaP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">RNA motif discovery by SHAPE and mutational profiling (SHAPE-MaP).</a> Nature Methods. 11, 959(2014).</li>
<li>Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligoribonucleotide+synthesis+using+T7+RNA+polymerase+and+synthetic+DNA+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates.</a> Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).</li>
<li>Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNase+Footprinting+to+Map+Sites+of+RNA-Protein+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">RNase Footprinting to Map Sites of RNA-Protein Interactions.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2014).</li>
<li>Velagapudi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+small+molecule+against+an+oncogenic+noncoding+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Design of a small molecule against an oncogenic noncoding RNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 5898-5903 (2016).</li>
<li>Barnwal, R. P., Yang, F., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+NMR+to+structure+determination+of+RNAs+large+and+small%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Applications of NMR to structure determination of RNAs large and small.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 628, 42-56 (2017).</li>
<li>Scott, L. G., Hennig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+structure+determination+by+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA structure determination by NMR.</a> Methods in Molecular Biology. 452, 29-61 (2008).</li>
</ol>

저자는 충돌의 관심을 선언합니다.

생체 외에서 모양, 그것이 고품질 동종 RNA 서식 파일을 사용 하 여 중요 합니다. 그러나 T7 전사,, 종종 다른 유형의 시퀀스36을 생성합니다. 특히, ± 1에는 3'-무시할 수 없는 수익률36 와 뉴클레오티드와 시퀀스는 일반적으로 polyacrylamide 젤 정화에 의해 제거 될 어렵다. 유형이 다른 RNA 템플릿을 때로는 어려운 결과 해석 하는 뇌관 확장 제품의 시퀀싱 젤 프로 파일링 신호 하나 이상의 집합에 발생할 수 있습니다. Ribozyme에서 모두 5'-3'-끝 RNA 템플릿 식 카세트의 양쪽 균일 할 것입니다.
생체 외에서 그리고에서 셀 모양, 2'-오 수정 시 약의 부 화 시간은 또 다른 중요 한 요소 이다. 그것은 적어도 5 배 하프 라이프 2'-OH acylation 물 냉각 하는 시 약의 사용된1이어야 한다 주 그룹에 의해 제...

선택 2'-히 드 록 acylation 뇌관 연장 (모양)에 의해 분석은 관심사의 RNA 순서에 있는 각 뉴클레오티드의 활동을 측정 하 고 단일 뉴클레오티드 해상도1에서 이차 구조를 elucidating 방법입니다. 생체 조건2,,34 (정의 된 버퍼 시스템에서 정화 RNA)에 둘 다 모양 방법론 및 보조를 조사 하기 위해 개발 되었습니다 생활 포유류 세포5,6, 중간 길이가 RNA의 구조 (일반적으로 < 셀 모양에 대 한 1000 뉴클레오티드와 < 생체 외에서 모양에 대 한 200 뉴클레오티드). 특히 유용 바인딩 상호 작용 하는 RNA 분자 대사 산물2,4,7,8 시 수용 체 RNA에에서 구조적인 변화를 평가 하 고 기계 작업을 공부 하 약 개발9,10동안 RNA를 대상으로 분자.
RNA를 대상으로 약물 발견 최근 그려 관심 학술 연구소에서 및 제약 산업11,12 다른 접근 방식 및 전략13,,1415 를 통해 16. 최근 임상 사용에 대 한 RNA를 대상으로 하는 작은 분자의 예로 두 구조적으로 독특한 실험 약물, LMI-07017 및 RG-791618,19, 척수 근육 위축 증 (SMA), 유망 보여준 단계 II 임상 시험20에서 결과. 두 분자 했다 증명 대상 생존 모터 신경 (SMN)의 2 중-mRNA 및 SMN2 유전자6,,1721의 접합 과정을 조절. 우리는 이전의 생체 외에서 셀 모양 RG-7916 SMN C26으로 알려진의 아날로그의 대상 RNA 구조 변경 검사에 응용 프로그램을 설명 했다.
원칙적으로, 모양 편견 방식에서 자체 냉각 acylation 시 약의 초과 하는 금액의 RNA 순서의 각 뉴클레오티드의 2'-OH acylation 속도 측정합니다. Acylation 시 약은 물의 짧은 반감기에에서 불안정 (예를 들어, T1/2 = 17의 1-메 틸-7-nitroisatoic 무수 물; 또는 1 M 7, 2-methylnicotinic 산 imidazolide에 대 한 ~ 20 분 또는 NAI)22 와 무감각의 정체성 기지23. 각 뉴클레오티드의 역학의 정확한 평가로 변형 될 수 있는 유연한 기초 2'-OH 그룹의 더 유리한 acylation 발생 합니다. 특히, 뉴클레오티드 기본적인 쌍에 NAI 1 M 7 등 2'-오 수정 시에는 짝이 없는 하나 보다 일반적으로 덜 반응입니다.
RNA 템플릿과 2'-OH acylation 수행의 소스를 보면, 모양 수 있다 생체 외에서 그리고에서 셀 모양으로 일반적으로 분류 될 있다. 시험관 모양 사용에서 순화 T7 RNA를 변하게 하 고 실험 설계에서 셀룰러 컨텍스트 부족. 셀 모양에 RNA 서식 파일 녹음 및 2'-OH acylation는 살아있는 세포; 내에서 발생 따라서, 결과 세포 맥락에서 RNA 구조 모델을 정리 수 있습니다. 셀에서 모양은 하 비보 모양에서 문학24에서 살아있는 세포에 운반 하는 모양에 대 한 추천 되었습니다 했다. 이후이 실험 동물에서 수행 되지 않습니다, 우리 셀 모양 정확도 대 한이 실험 되 나.
체 외에서 세포 모양의 뇌관 확장 단계에 대 한 전략 또한 다르다. 생체 외에서 모양, 반전 녹음 방송의 Mg2 +2'-OH acylation 위치에서 중지합니다. 밴드의 강도 acylation 속도1에 비례와 32P 표시 뇌관 연장 따라서 밴드 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지)에 나타납니다. 셀 모양, 반전 녹음 방송 2'-OH에서 무작위 돌연변이 생성 adduct 미네소타2 +존재 위치. 각 뉴클레오티드의 mutational 속도 깊이 차세대 시퀀싱에서 캡처할 수 수 있습니다 그리고 단일 뉴클레오티드 해상도 모양 반응 다음 산출 될 수 있다.
셀 모양에 대 한 잠재적인 문제는 낮은 신호 대 잡음 비율 (즉, 2'-OH 그룹의 대부분은 수정, 수정 되지 않은 시퀀스 다음-세대 시퀀싱에서 읽기의 대부분을 차지 하는 동안). 최근, 2'-OH를 풍부 하 게 하는 방법 RNA, vivo에서 모양 (icSHAPE)를 클릭 하 여 참조, 수정 장 실험실25에 의해 개발 되었다. 이 농축 방법 RNA 상호 작용, 특히 전체 transcriptome 심문 등 약한 작은 분자를 공부에 유리한 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>>200 bp DNA 합성을 위한</td> <td>DNA 올리고뉴클레오티드</td><td>IDT</td><td></td> gBlock</tr><tr><td>Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR 마스터 믹스</td><td>Thermo Fisher</td><td>F566S</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin 겔 및 PCR 클린업 키트</td><td>Takara</td><td>740609.50</td><td></td></tr><tr><td>MegaScript T7 전사 키트</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM1333</td><td>10x 반응 버퍼, T7 효소, NTP 및 Turbo DNase 포함</td></tr><tr><td>DEPC 처리된 물</td><td>Thermo Fisher</td><td>750023</td><td></td></tr><tr><td>2x TBE-urea 샘플 버퍼</td><td>Thermo Fisher</td><td>LC6876</td><td></td></tr><tr><td>40% 아크릴아미드/비사아크릴아미드 용액 (29:1)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610146</td><td></td></tr><tr><td>10x TBE 버퍼</td><td>Thermo Fisher</td><td>15581044</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Rapid-Flow&trade; 필터 유닛</td><td>Thermo Fisher</td><td>166-0045</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34133</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Thermo Fisher</td><td>17919</td><td></td></tr><tr><td>SYBR-Safe dye</td><td>Thermo Fisher</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>6% TBE-urea mini-gel</td><td>Thermo Fisher</td><td>EC6865BOX</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>&gamma;-32P-ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG035C005MC</td><td></td></tr><tr><td>하이퍼스크린&트레이드; 강화 스크린</td><td>GE 헬스케어</td><td>RPN1669</td><td>칼슘 텅스텐 산염 형광체</td></tr><tr><td>스크린 형광체 저장 스크린</td><td>분자 역학</td><td>BAS-IP MS 3543 E</td><td></td></tr><tr><td>아머샴 태풍</td><td>GE 헬스케어</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NAI (2M)</td><td>EMD 밀리포어</td><td>03-310</td><td></td></tr><tr><td>글리코블루</td><td>써모 피셔</td><td>AM9515</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV Reverse 전사 효소</td><td>Thermo Fisher</td><td>18090010</td><td>5x RT 버퍼, SuperScript IV</td></tr><tr><td>dNTP 믹스 (10 mM)</td> 포함<td>Thermo Fisher</td><td>R0192</td><td></td></tr><tr><td>ddNTP 세트 (5 mM)</td><td>Sigma</td><td>GE27-2045-01</td><td></td></tr><tr><td>대형 여과지</td><td>Whatman</td><td>1001-917</td><td></td></tr><tr><td>젤 건조기</td><td>Hoefer</td><td>GD 2000</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td>RNase A 및 프로테아제 K</td></tr><tr><td>SMN2 minigene34</td><td>Addgene</td><td>포함72287</td><td></td></tr><tr><td>열 비활성화 FBS</td><td>Thermo Fisher</td><td>10438026</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>FuGene HD</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>TrpLE</td><td>Thermo Fisher</td><td>12605010</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (Ca/mg 제외</td>) <td>Thermo Fisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Thermo Fisher</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy 미니 컬럼</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>RW1, RPE 완충액</td></tr><tr><td>RNase-Free DNase Set</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>DNase I 및 RDD 완충액</td></tr><tr><td>포함 탈이온화 포름아미드</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9342</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2&bull; 4H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3634</td><td></td></tr><tr><td>랜덤 노나머</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7647</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript First-Strand Synthesis System</td><td>Thermo Fisher</td><td>11904-018</td><td>10x RT 완충액, SuperScript II 역전사효소</td></tr><tr><td>AccuPrime pfx DNA polymerse</td><td>Thermo Fisher</td><td>12344024</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq500</td><td>Illumina</td> <td>포함</td><td></td></tr><tr><td>NucAway 컬럼</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM10070</td><td>탈염 목적</td></tr></tbody></table>

작은 분자 조사를 시험관 및 셀 모양을 사용 하 여 사전 mrna 구조 변화 유도

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

RNA를 대상으로 작은 분자의 약 개발, 과정 대상 RNA 순서와 그들의 상호 작용에 구조적인 변화를 elucidating는 원한다. 우리 여기는 상세한 생체 외에서 제공 하 고 셀 선택 2'-히 드 록 acylation 뇌관 연장에 의해 척수 근육 위축 증 (SMA)의 생존에 대 한 실험 약물의 RNA 구조 변화 연구 (모양) 프로토콜 분석 모터 신경 (SMN)-c 2를 사전-SMN2 유전자의 mRNA의 exon 7에서. 생체 외에서 모양, SMN2 exon 7 포함 된 140 뉴클레오티드는 RNA 순서 T7 RNA 중 합 효소에 의해 복사할 SMN-C2, 존재 접혀 이며 가벼운 2'-OH acylation 시 약, 2-methylnicotinic 산 imidazolide (NAI)에 의해 연속적으로 수정. 이 2'-오-NAI adduct 추가 32P 표시 된 뇌관 연장에 의해 조사 되 고 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지)에 의해 해결. 반대로, 2'-OH acylation 셀 모양에서 일어난다 SMN-C2 바인딩된 세포질 RNA와 현장에서 살아있는 세포에서. 뇌관 연장에 모양 유발 돌연변이와 SMN2 유전자에서 exon 7의 사전 mRNA 순서는 다음 차세대 시퀀싱 및 PCR에 의해 증폭 됩니다. 두 가지 방법론을 비교, 생체 외에서 모양을 더 비용 효율적인 방법 이며 결과 시각화 하는 컴퓨팅 파워를 필요로 하지 않습니다. 그러나, 생체 외에서 모양을 파생 RNA 모델은 때때로 RNA 의무적인 단백질에와 함께 모든 상호 작용의 손실로 인해 가능성이 셀룰러 맥락에서 이차 구조에서 일탈 한다. 셀 모양 방사성 소재 직장을 필요 하지 않습니다 고 세포질 문맥에서 더 정확한 RNA 이차 구조를 생성 합니다. 또한, 셀에 형태는 일반적으로 해당 페이지 분석에 의존 하는 체 외에 비해 차세대 시퀀싱을 활용 하 여 더 큰 범위의 RNA 시퀀스 (~ 1000 뉴클레오티드) 모양 (~ 200 뉴클레오티드)는 일반적으로 대 한. SMN2 사전-mRNA에 exon 7의 생체 외에서 그리고에서 셀 모양 파생 하는 경우에 RNA 모델은 서로 비슷합니다.

우리는 이전 변조기를 접합 하는 RNA, SMN-C2, SMN2 유전자의 사전-mRNA의 exon 7에 AGGAAG 모티브로 작용을 SMN C26존재 RNA 구조 변화를 평가 하기 위해 모양 사용 설명 했다. SMN-c 2의 바인딩 사이트는 FDA 승인 센스 oligonucleotide (아소) SMA, 바인딩하고 차단 intronic 접합 소음 기 (ISS) intron 727,28 (그림 1A)에 nusinersen에 대 한 구분 이다. 가장 알려진된 접합 레 귤 레이 터 SMN2 exon 7의 범위 내에 있는 ~ 100 뉴클레오티드의 exon 7 사전 mRNA29; 따라서,는 140과 276 뉴클레오티드 긴 RNA 시퀀스 사...

둘 다 생체 외에서 그리고 세포에서 선택적 2'-히 드 록 acylation 뇌관 연장 (모양) 실험 사전 mRNA 시퀀스는 RNA를 대상으로 작은 분자의 존재의 2 차 구조를 결정 하 여 분석에 대 한 자세한 프로토콜은 이 문서에서 제시 하는.

작은 분자 조사를 시험관 및 셀 모양을 사용 하 여 사전 mRNA 구조 변화 유도

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

본 비디오는 작은 분자를 표적으로 하는 RNA의 존재에 관심 있는 RNA 서열의 이차 구조를 결정하기 위하여 체외 형상 실험을 위한 상세한 프로토콜을 제공할 것입니다. 체외 형상은 일반적으로 200 미만의 뉴클레오티드인 아미노 크기의 RNA 원소에 대한 각 뉴클레오티드의 역학을 이해하는 비용 효율적인 방법입니다. 원고에 설명된 바와 같이 RNA 템플릿을 준비한 후, 감마 32P ATP를 추가하여 라디오 라벨 리버스 전사 프라이머, 전사 프라이머를 반전시켰다.10XPNK 반응 완충제, 폴리뉴클레오티드 키나아제 및 RNA의 자유 수분은 총 20마이크로리터에서 1.7 밀리리터 미세원심분리기 튜브에 들어있습니다. 그런 다음 1 시간 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오. 그런 다음 65°C이후 20분 동안 샘플을 활성화한 다음 탈염 컬럼과 원심분리기에서 샘플을 1000회 G.25 마이크로리터2XTBE 샘플 버퍼및 혼합으로 필터링합니다.10%의 아크릴아미드 젤로 라벨이 부착된 제품을 낮추고 방사능이 상단 저수지로 출혈하지 않도록 하십시오. 젤을 20와트로 1시간 동안 실행합니다. 실행 후, 젤 카세트의 유리 판을 제거합니다.젤을 플라스틱 랩 조각에 놓습니다. 플라스틱을 젤 상단에 접어 서 꽉 끼는 샌드위치를 만듭니다. 젤 샌드위치를 칼슘 텅스테이트 인광스크린에 놓고 상상의 도구로 노출시다.젤의 가장자리가 어디에 있는지 알 수있는 일반 빛으로 젤을 다시 이미지. 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 두 이미지를 오버레이하고 밝고 어두운 이미지를 오버레이합니다. 그런 다음 두 이미지를 동시에 보려면 상단 이미지를 약간 불투명하게 만듭니다.인쇄된 이미지가 실제 젤과 동일한 크기인지 확인합니다. 그런 다음 인쇄 된 이미지에 젤을 정렬합니다. 마지막으로, 살균 된 면도날을 사용하여 젤에서 원하는 굴곡을 자르고 각 젤 조각을 별도의 1.7 밀리리터 미세 원심 분리 튜브에 놓습니다.수동 용용에 의해 젤 슬라이스에서 DNA를 복구하려면 용해 강수량 믹스의 0.3 밀리리터를 각 1.7 밀리리터 튜브에 추가합니다. 16시간 동안 섭씨 4도의 회전기에서 방사성 안전한 용기에 튜브를 배양합니다. 인큐베이션 후 액체를 새로운 1.7 밀리리터 튜브로 옮킨다.2.5배 얼음 차가운 200 개의 증거 에탄올을 넣고 튜브를 6 번 반전하여 액체를 섞습니다. 최소 한 시간 동안 영하 80도에서 튜브를 배양합니다. 10, 000g 및 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리한 후, 파이펫팅으로 상체를 조심스럽게 제거합니다.펠릿을 세척하기 위해 80%에탄올 1밀리리터를 넣습니다. 15초 동안 소용돌이를 가졌고 원심분리기는 같은 조건에서 다시 합니다. 파이펫팅으로 상체를 제거한 후 DNA 펠릿을 5분간 공기 건조시다.RNA의 무료 물 50 마이크로리터를 넣고 10번 위아래로 배관하여 섞습니다. DNA 농도를 심미경화 카운터에서 마이크로리터당 분당 약 100, 000카운트로 정상화한다. 화학 적 변형을 위한 4개의 견본을 준비하려면, 1.7 밀리리터 미세 원심분리기 관에 0.5 XTE 완충제의 32개의 마이크로리터에 RNA의 8개의 피코몰을 추가합니다.섭씨 80도에서 2분간 가열하고 얼음 위에서 1분 이상 식힙니다. 그런 다음 5배 접이식 믹스의 8개의 마이크로리터를 추가하고, 이 RNA 혼합물의 9마이크로리터를 각각 4개의 PCR 튜브에 배분하여 1-4로 표시합니다. 10%DMSO의 마이크로리터 1개, 농축 된 소분자 용액 1편을 튜브 2에 넣고, 희석된 소분자 용액 1편을 튜브 3에 넣고 1마이크로리터의 물을 튜브 4에 넣습니다.모든 PCR 튜브를 37°C의 열 사이클러에 30분 동안 배양합니다. 두 개의 프라임 OH 수정 반응 직전에 DEPC 처리 된 물의 3 마이크로 리터에 두 개의 어금니 NAI 재고 용액의 마이크로 리터 1 개를 희석하여 0.5 어금니 작업 용액을 산출합니다. 즉시 튜브 1, 2 및 3에이 솔루션의 마이크로 리터 를 추가합니다.튜브 4에 25%DMSO의 마이크로리터 1개를 넣고 15분 동안 섭씨 37도의 열 사이클러에 인큐베이션합니다. 4개의 신선한 1.7 밀리리터 미세원심분리기 튜브를 준비하고 용출 강수량 믹스 100마이크로리터와 각 튜브에 글리코겐 2마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 이러한 각 튜브로 해당 PCR 튜브에서 모든 액체를 전달합니다.0.34 밀리리터의 얼음 차가운 200 증거 에탄올을 각 튜브에 넣고 5초 동안 소용돌이를 섞습니다. 튜브를 영하 80도의 냉동고에 적어도 한 시간 동안 놓습니다. 그런 다음 튜브를 섭씨 4도에서 14, 000배에서 15분 동안 원심분리합니다.RNA 펠릿을 방해하지 않고 각 튜브에서 상퍼를 제거하십시오. 튜브당 0.5 밀리리터를 넣고 RNA 펠릿과 소용돌이를 15초 동안 세척합니다. 다시 같은 조건에서 원심 분리 후, 상체를 제거하고 5 분 동안 RNA 펠릿을 공기 건조.혼합하기 위해 10번 위아래로 RNA의 무료 물과 파이프의 9마이크로리터를 추가합니다. 수정된 RNA를 4개의 새로운 PCR 튜브로 옮기고 이전 단계에서와 같이 1~4개의 라벨을 부착합니다. 4개의 추가 PCR 관의 각각에 DEPC 처리된 물의 7개의 마이크로리터에 RNA의 2개의 피코몰을 추가하고 숫자 5-8로 그(것)들을 레이블을 붙입니다.1~8개의 PCR 튜브에 복구된 방사성 라벨프라이머 2개를 추가합니다. 섭씨 65도에서 5분간 가열한 후, 열 사이클러에서 섭씨 4도까지 즉시 식힙니다. 5x RT 버퍼의 마이크로리터 4개, 어금니 DTT 1개, DNTP 믹스 1개를 각 튜브에 추가합니다.그런 다음 DEPC 처리 된 물의 마이크로 리터 2 개를 튜브 에 1 ~ 4 개의 튜브를 추가합니다. 5밀리몰러 ddATP의 마이크로리터 4개, 5밀리미터 ddTTP 의 마이크로리터 4개를 튜브에 넣고 6밀리미터 ddCTP의 마이크로리터 4개, 마이크로리터 5개, 마이크로리터 5개, 마이크로리터 3개를 튜브에 넣고 8번, 파이프에 4번 섞어 섞는다. 열 사이클러에서 1 분 동안 52섭씨52도에서 모든 PCR 튜브를 가열한 후 각 튜브에 역 전사제 1 마이크로리터를 넣고 4번 위아래로 파이프하여 혼합합니다.열 사이클러에서 20 분 동안 섭씨 52도에서 반응을 배양합니다. RNA를 가수분해하려면 각 튜브에 5개의 어금다 나트륨 1마이크로리터를 넣고 5분간 섭씨 95도에서 가열합니다. 그런 다음 1개의 어금음 염산의 5개의 마이크로리터를 추가하여 반응을 중화시키고 이전에 설명한 대로 에탄올 강수량을 반복한다.DNA 펠릿을 5분 동안 공기 건조한 후 10마이크로리터의 물과 10마이크로리터의 2xTBE 우레아 샘플 적재 버퍼를 1.7 밀리리터 튜브에 넣고 10배 위아래로 파이프하여 재용합니다. 샘플을 섭씨 70도에서 5분간 가열한 다음, 젤에 적재하기 전에 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 얼음 위에 놓인 샘플의 10마이크로리터를 8%의 폴리아크릴아미드 시퀀싱 젤에 적재합니다.젤을 2시간 동안 65와트로 또는 바닥 염료가 젤의 3/4에 도달할 때까지 젤을 실행합니다. 스페이서를 제거하고 주걱을 부드럽게 삽입하여 상단 실리콘 유리 판을 제거합니다. 큰 필터 용지로 젤을 덮고 부드럽게 눌러 젤이 필터 용지에 부착되도록 합니다.하단 끝에서 시작하여 필터 용지를 들어 올리고 용지와 함께 유리 플레이트에서 젤을 제거합니다. 이전에 수행된 것처럼 젤을 래핑 페이퍼로 옮은 후 진공 상태에서 1시간 동안 섭씨 70도에서 건조하여 젤과 건조기 사이에 여러 개의 필터 용지를 사용해야 합니다. 젤 샌드위치를 사진 표백 형 인광 저장 화면 카세트에 옮기고 젤의 방사능을 4 ~ 16 시간 동안 화면에 노출시하십시오.마지막으로, 이미징 장치에 인광저장 화면을 놓고 중간 해상도로 약 30분간 스캔합니다. 포광 저장 스크린에 폴리아크릴아미드 시퀀싱 젤을 노출한 후, 성공적인 형상 실험은 겔 의 상단에 하나 및 가장 강렬한 굴곡을 보여주었으며, 얼룩없이 단일 뉴클레오티드 해상도에서 겔 전체에 걸쳐 굴곡하였다. 젤은 또한 몇몇 굴곡의 강렬이 작은 분자의 존재에서 변경된다는 것을 보여주었습니다, 염기 페어링 강도의 변경을 표시하.페이지 분석에서 일반적인 문제점은 소금 전면으로 알려진 얼룩 영역이 겔 의 중간에 나타날 수 있다는 것입니다, 아마도 로딩 샘플에서 염, DMSO 또는 다른 원치 않는 물질의 높은 농도 로 인해. 그것은 에탄올 강수량에 의해 원치 않는 물질을 제거하여 피할 수 있습니다. 균질RNA 템플릿은 체외 형상에 바람직하다.우리는 이러한 RNA를 얻기 위해 5 개의 프라임 및 3 개의 주요 끝에서 리보솜을 사용합니다. 세포 내 형상은 또한 세포 맥락에서 RNA 이차 구조를 얻기 위해 수행될 수 있다. 기억, 체 외 모양 생체 RNA 바인딩 단백질 상호 작용에서 recapitulate 하지 않을 수 있습니다.체외 형상은 작은 분자의 존재로 인해 RNA 구조의 변화를 검출하는 강력한 방법입니다. 이는 역실제 정지의 패터닝 강도의 변화를 정량화하여 수행됩니다. 이 비디오에 설명된 모든 실험은 적절한 개인 보호 및 플렉시 유리 차폐를 가진 공인 방사성 작업장에서 수행되어야합니다.

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Research

연구

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Genetics

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작은 분자 조사를 시험관 및 셀 모양을 사용 하 여 사전 mRNA 구조 변화 유도

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