Name: 고속 원심 분리의 부재에서 U937 세포의 세포 분별 법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: 배우세요 U937 세포의 세포질, 미토콘드리아, 세포막 분리법을 고속 원심 분리 없이 수행하는 방법을. 면역블로팅을 통한 단백질 국소화 연구에 활용할 수 있는 효율적인 세포 분별 기술입니다.

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작업은 NIH-1R15HL135675-01 티모시 J. LaRocca에 의해 지원 되었다

1. 버퍼와 시 약 준비
주: 표 1을 참조 하십시오.
<ol><li>버퍼 A, 세포의 용 해 버퍼 B, 샘플 버퍼 및 digitonin의 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>NaCl의 8.77 g와 900 mL 이온된 물, HEPES (1 M, pH 7.4) 50 mL 조정 이온 물 1 L에 최종 볼륨을 추가 하 여 버퍼 A를 준비 합니다. 참고: 최종 농도 150 mM NaCl 및 50 mM HEPES.</li>
		<li>에틸렌 글리콜-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N의 2 mL KCl, MgCl2, Ethylenediaminetetraacetic 산 (0.5 M EDTA)의 2 개 mL의 0.19 g의 0.75 g HEPES (1 M, pH 7.4) 20 mL를 추가 하 여 세포의 용 해 버퍼 B 준비 ', N'-tetraacetic 산 (0.5 M EGTA) 38.26 g 마 니 톨 및 이온된 물 900 mL에 자당의 23.96 g 이온 물 1 L에 최종 볼륨을 조정. 참고: 최종 농도 20 mM HEPES, 10mm KCl, 2 m MgCl2m, 1 mM EDTA, 1mm EGTA, 210 m m 마 니 톨 및 70mm 자당.</li>
		<li>0.1 %SDS 최종 농도 대 한 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS)의 0.01 g을 추가 하 여 tris 버퍼 염 분 (TBS)의 10ml 샘플 버퍼를 준비 합니다.</li>
		<li>이온된 수 (최종 농도 250 µ g/mL)의 100 mL에 digitonin의 25 mg을 추가 하 여 digitonin의 재고 솔루션을 준비 합니다.</li>
		<li>실험의 시작까지 4 ° C에서 모든 버퍼 솔루션 및-20 ° C에서 digitonin를 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>셀에 추가 하기 전에 버퍼 솔루션에 추가 될 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제제의 새로운 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>100% 에탄올의 1 mL에 PMSF의 17.4 mg을 추가 하 여 phenylmethanesulfonyl 불 소 (PMSF)의 재고 솔루션을 준비 (최종 농도 100 mM). 주의: 적절 한 보호 장비와 운동 주의 PMSF 처리할 때 착용 하십시오. PMSF는 섭취 하는 경우에 유해 하 고 약간 위험한 (자극성) 피부 접촉, 눈 접촉 (자극성) 또는 흡입; 그것은 눈과 피부에 부식성입니다.</li>
		<li>제조업체의 지침에 따라 상용 프로 테아 제 억제 물 칵테일 (100 ×) 준비 ( 재료의 표참조).</li>
		<li>SOV의 92 mg 이온된 수 (최종 농도 500 m m)의 1 mL에 추가 하 여 나트륨 orthovanadate (SOV)의 재고 솔루션을 준비 합니다. 주의: 적절 한 보호 장비를 착용 하 고 처리할 때 주의 사용 합니다. SOV (자극성) 눈 접촉, 섭취 또는 흡입 위험입니다. 심한 노출은 죽음에 발생할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. PBS 워시
<ol><li>집중 하 고 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 분류 이전에 세포를 씻어.<ol>
<li>원심 분리기 세포 현 탁 액 만드는 펠 릿을 적절 한 속도로. 예를 들어 10 분 400 × g 에서 U937 세포의 현 탁 액을 원심.</li>
		<li>제거는 상쾌한, 4 × 106 셀/mL 및 덩어리 헤어를 부드럽게 피 펫의 최종 농도에서 실내 온도 PBS에 셀 펠 릿 resuspend.</li>
		<li>셀 서 스 펜 션 10 분 작은 셀 400 × g 에서 원심</li>
		<li>상쾌한을 제거 하 고 셀 펠 릿 2 × 107 셀/mL의 최종 농도에 차가운 얼음 버퍼 A에에서 resuspend. 참고: 모든 후속 단계 4 ° C 에서 실행 되어야 한다 또는 얼음 및 모든 버퍼에 미리 냉장되어야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. cytosolic 단백질 격리
<ol><li>세제 digitonin 가진 외피에 의해 cytosolic 단백질을 추출 합니다.<ol>
<li>셀 (단계 3.1.3)의 물의 resuspension 직전 추가 재고 PMSF (100 m m), 프로 테아 제 억제제의 10 µ L 10 µ L (100 ×), SOV (500mm) 주식의 2 µ L 및 버퍼 A의 878 µ L 재고 digitonin (250 µ g/mL)의 100 µ L (최종 농도 1 밀리미터 PMSF 1 × protease 억제제, 1 mM SOV와 25 µ g/mL digitonin; 사용 되는 셀의 수에 의하여 최종 볼륨 조정). 셀 펠 릿에 추가 될 때까지 얼음 에 솔루션을 계속.</li>
		<li>10 분 동안 400 × g 에서 세포 현 탁 액을 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
		<li>억제제 및 digitonin (단계 3.1.1에서에서 준비) 2 × 107 셀/mL, 덩어리 헤어를 부드럽게 피 펫의 최종 농도에 포함 하는 버퍼 A 솔루션에서 셀 펠 릿을 resuspend.</li>
		<li>셀 서 스 펜 션에서 20 분 동안 4 ° C 이상 끝 회전에 품 어.</li>
		<li>원심 10 분 수집에 대 한 400 × g 에서 셀 서 스 펜 션은 상쾌한 하 고 깨끗 한 원심 분리기 튜브에.</li>
		<li>작은 세포 파편을 20 분에 대 한 18000 × g 에서 수집 된 상쾌한 원심</li>
		<li>깨끗 한 원심 분리기 튜브는 상쾌한 전송.</li>
		<li>때까지 아무 펠 릿은 원심 분리에 따라 3.1.5-3.1.6 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>Cytosolic 단백질 을 포함 하는 상쾌한을 수집 하 고 그것은 4 ° C (단기) 또는-20 ° C (긴 기간) 저장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>원심 분리에 의해 초과 digitonin 및 cytosolic 단백질을 제거 합니다.<ol>
<li>4 × 106 셀/mL 및 덩어리 헤어를 부드럽게 피 펫의 최종 농도에 버퍼 A에에서 resuspend (3.1.5 단계)에서 digitonin permeabilized 셀 펠 릿.</li>
		<li>10 분 동안 400 × g 에서 digitonin permeabilized 세포 현 탁 액을 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다. 참고: 초과 cytosolic 오염 물질을 제거 하는 버퍼 A에에서 반복된 세척을 수행할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 세포 균질
<ol><li>세포 세포의 용 해 버퍼 B에에서 얼음에 품 어 및 기계적 방법으로 그들을 lyse.<ol>
<li>셀 (4.1.2 단계)의 물의 resuspension 직전 주식 PMSF (100 mM)의 10 µ L 및 추가 재고 SOV (500 m m)의 2 µ L B 세포의 용 해 버퍼의 988 µ L (최종 농도 1 밀리미터 PMSF와 1mm SOV; 되 lysed 세포의 수에 맞게 최종 볼륨 조정) solu 유지 기 셀 펠 릿에 추가 될 때까지 얼음 에.</li>
		<li>차가운 얼음 세포의 용 해 버퍼 B 솔루션 PMSF 및 SOV (4.1.1 단계에서 준비) 4 × 106 셀/mL의 최종 농도에 포함 된 셀 펠 릿 (3.2.2 단계)에서 resuspend.</li>
		<li>30 분 동안 얼음에 세포 현 탁 액을 품 어.</li>
		<li>얼음에 (꽉 끼는 B 유 봉)과 미리 냉장된 Dounce 균질 화기에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 천천히, 심지어 스트로크를 사용 하 여 균질 화기 유 봉과 40 패스를 수행 합니다. 참고: 또는 토론 섹션에서 자세한 기계적 세포 세포의 용 해의 다른 수단을 사용 합니다.</li>
		<li>homogenate를 수집 하 고 깨끗 한 원심 분리기 튜브에 그것을 전송.</li>
		<li>균질 화기 유 봉 및 B 세포의 용 해 버퍼의 소량 (1 ~ 2 mL) 튜브를 세척 하 고는 homogenate에 그것을 추가.</li>
		<li>Homogenate 400 × g (또는 작은 손상 되지 않은 세포에 필요한 최소 속도)에서 10 분 원심.</li>
		<li>깨끗 한 원심 분리기 튜브는 상쾌한 전송. 참고: 중요 한 펠 릿 반복 단계 4.1.6로 분수의 수확량을 증가 시키기를 통해 4.1.4 경우 토론 섹션에 자세히. 프로토콜은 여기, 일시 중지할 수 있습니다 그리고는 homogenate 단기 (24 시간) 4 ° C에서 저장.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 차동 원심 분리
<ol><li>세포질 파편, 격리 미토 콘 드리 아 및 막 분수 제거 하는 속도 증가에서 homogenate 원심<ol>
<li>10 분 전송 상쾌한에 대 한 500 × g 에서 깨끗 한 원심 분리기 튜브 (4.1.8 단계)에서 상쾌한 원심 그리고 어떤 펠 릿을 삭제.</li>
		<li>원심 (5.1.1 단계)에서 10 분 전송에 대 한 1000 × g 에서 상쾌한 깨끗 한 원심 분리기 튜브에 상쾌한 고 어떤 펠 릿을 삭제.</li>
		<li>10 분 전송에 상쾌한에 대 한 2000 × g 에서 깨끗 한 원심 분리기 튜브 (5.1.2 단계)에서 상쾌한 원심 그리고 어떤 펠 릿을 삭제.</li>
		<li>깨끗 한 원심 분리기 튜브, 미토 콘 드리 아를 포함 하는 계속 펠 릿에 15 분 전송 상쾌한에 대 한 4000 × g 에서 (에서 단계 5.1.3) 상쾌한 원심</li>
		<li>B. 세포의 용 해 버퍼의 작은 볼륨 (0.5\u20121 mL)에서 미토 콘 드리 아 펠 릿 resuspend</li>
		<li>상쾌한, resuspend 4000 × g 15 분 제거에서 일시 중단 된 펠 릿을 원심는 미토 콘 드리 아 의 샘플 버퍼 (예를 들어, 250 ~ 500 µ L, 펠 릿의 크기에 따라 그리고 원하는 원하는 최종 볼륨에서 펠 릿 농도)입니다.</li>
		<li>원심 분리기 (5.1.4 단계)에서 상쾌한 4000 × g 에서 15 분에 대 한 깨끗 한 원심 분리기 튜브는 상쾌한 전송. 때까지 아무 펠 릿은 원심 분리에 따라이 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>3 h에 대 한 18000 × g 에서 상쾌한 스핀.</li>
		<li>상쾌한, 제거 하 고 막 단백질을 포함 하는 펠 릿을 유지. 작은 볼륨에서 막 펠 릿 resuspend (0.5-1 mL) 세포의 B. 버퍼</li>
		<li>1 시간에 대 한 18000 × g 에서 일시 중단 된 펠 릿 원심</li>
		<li>상쾌한을 제거 하 고 원하는 마지막 양의 샘플 버퍼 (250 ~ 500 µ L, 펠 릿 및 원하는 농도의 크기에 따라)에 막 펠 릿 resuspend.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3 샘플 펠 릿을 sonicate 5의 전원 설정에서 얼음 목욕에서 s (20 kHz에서 125 W 최대 전력의 50%는 테이블의 자료참조).</li>
	<li>샘플 4 ° C (단기) 또는-20 ° C (장기)를 저장 합니다.</li>
	<li>서쪽 오 점 단백질 마커는 세포의 세포질, 미토 콘 드리 아 막 구획에서 발견에 대 한 항 체를 이용 하 여 분류의 순수성에 대 한 샘플을 검사 (대표적인 결과 섹션을 참조 하십시오).</li>
</ol>

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</ol>

저자 아무 상충 선언

이 프로토콜의 개발은 미토 콘 드리 아를 분리 하는 무 능력 하 고 막 샘플, necroptosis14동안 단백질 지 방화의 분석을 위해 상용 키트를 사용 하 여에서 발생 했다. Premade 키트의 주요 한계는 그들의 무 능력 개인 연구자의 요구에 적응 될 샘플 및 샘플 처리 수의 제한 된 수의 비용. 비싼 시 약의 사용과 고가의 장비에 대 한 필요성 없이 여기에 제시 된 메서드를 수행할 수 있습니다. 이 메서드는 셀의 수에 맞게 확장 될 수 있습니다 하 고 연구자의 요구에 맞게 변경 되는. 이 메서드의 실행에 증가 각 분수의 수익률, 수행 중인 연구 단계 조정 및 유연성 수 있습니다. 버퍼에서 나트륨 orthovanadate의 추가 연구 최종 샘플에 있는 단백질의 인 산화 상태를 검사 하지는 경우 생략할 수 있습니다. 마지막 버퍼에 SDS의 포함 마찬가지로 더 밀도 그라데이션 원심을 통해 샘플을 정화 하고자 하는 연구 하는 경우 생략할 수 있습니다. 우리만이 방법은 ...

단백질 지 방화의 신뢰할 수 있는 id는 진 핵 세포에 있는 분자 통로 조사할 때 경우가 많습니다. 방법 subcellular 분수를 더 밀접 하 게 검사 세포 구성 성분의 연구자에 의해 활용 됩니다.
기존의 셀 분류 방법의 대부분은 일반적으로 두 개의 넓은 범주로, 세제 기반1,2 , ultracentrifugation 기반3,,45, 될 수 있는 속도, 정확성 및 비용에 의해 분화 된다. 셀의 고유 구성 요소를 solubilize 세제 힘 증가 함께 버퍼의 사용에 의존 하는 세제 기반된 프로토콜. 이 샘플을 처리 하는 신속 하 고 편리한 방법 이며, 비용 효과적일 수 있다 수와 샘플의 크기는 작은 하는 경우. 세포질, 막/세포 기관이 (혼합된 분수), 및 세포에서 핵 분수 분리 세제 기반 키트를 구입할 수 있습니다. 그러나, 이러한 장비와 관련 된 몇 가지 단점이 연구원에 게 그들의 유용성을 제한 한다. 그들은 쉽게 셀의 하나 또는 두 개의 구성 요소를 분리 하도록 설계 되었습니다 하지만 샘플에서 모든 분수를 동시에 차단 할 수 있다. 세제의 사용 의미는 원형질 막과 세포 막 동봉 하는 것입니다 수 똑같이 solubilized 및, 그러므로, 서로에서 분리 될 수 없습니다. 추가 합병증이 키트 연구원은 특정 응용 프로그램에 대 한 조건을 변경 하지 못하도록 독점 구성 요소에서 발생 합니다. 마지막으로, 그들은 사용에 제한 되 고 엄청나게 큰 규모의 실험에 대 한 비용이 있을 수 있습니다. 그러나 비 세제 기반된 키트 미토 콘 드리 아의 격리에 대 한 존재,, 원형질 막 분리 설계 되지 않았습니다 및 샘플 수율은 훨씬 밀도 원심에서 저것 보다는 더 적은 격리 프로토콜6,7 기반으로 .
분수를 ultracentrifugation를 사용 하는 메서드는 더 시간이 소모, 하지만 종종 세제 기반 키트 보다 순수한 분수에 결과. 그들 뒤에 세포질 분 대를 통해 차동의 분리 비 세제 메서드에서 lysed 첫 solubilizing 그들 (막 세포와 오염 결과로) 하지 않고 셀에서 플라즈마 막 분리 필요 원심 분리-원형질 막 절연 요구를 달성 하기 위해 100000 × g 의 속도. 대부분의 경우, isopycnic 밀도 그라데이션 원심 분리 추가 대 한 셀룰러 분수 또는 오염 물질의 제거의 차등 원심을 뒤 합니다. 이러한 방법은 철저 하 고 수정할 수 있지만, 단점 등 비용, 시간 소비, 분수와 더 정화를 통해 밀도 그라데이션 원심 분리에 대 한 ultracentrifuge에 대 한 필요. 대부분 고속 원심 분리기는 개별 조사와는 종종 교육 기관에서 장비를 코어 공유, 금지는 비용에 있습니다. 따라서, ultracentrifuge 가용성 이러한 상황에서 금지 된다.
이 분류 프로토콜 solubilizing 세제의 사용 없이 및 고속 원심 분리 하지 않고 subcellular 분수의 보여 줍니다. 이 메서드는 원형질 막, 미토 콘 드리 아 및 분수 사이 최소한의 오염으로 진 핵 세포의 세포질 구성 요소를 분리 하는 연구자 수 있게 됩니다.

<table><tbody><tr><td>세포질 추출을 위한</td> <td>Digitonin</td><td>TCI 화학물질</td><td>D0540</td></tr><tr><td>용해 완충액 B를 위한</td><td>D-Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125</td></tr><tr><td>Dounce 균질화</td>기 <td>VWR</td><td>22877-282</td><td>균질화</td></tr><tr><td>종단 간 회전자를</td> 위해 <td>Barnstead</td><td>N/A</td><td>세포질 추출을 위해</td></tr><tr><td>에틸렌 글리콜-비스(&beta;-aminoethyl ether)-N,N,N' ,N'-테트라아세트산 (EGTA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>J61721</td><td>용해 버퍼 B</td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)</td><td>시그마-알드리치</td><td>E7889</td><td>용해 버퍼 B</td></tr><tr><td>GAPDH (14C10)</td><td>Cell Signalling Technologies</td><td>2118</td><td>웨스턴 블롯의 세포질 분획 검출, 희석: 1:10000</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR</td><td>J848</td><td>용해 버퍼 A 및 B용</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>용해 버퍼 B</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Alfa Aesar</td><td>12315</td><td>용해 버퍼 B</td></tr><tr><td>Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)</td><td>Cell Signalling Technologies</td><td>23565</td><td>웨스턴 블롯에서 원형질막 분획 검출, 희석: 1:1000</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793566</td><td>용해 버퍼 A용</td></tr><tr><td>phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td><td>VWR</td><td>M145</td><td>세포질 추출 및 균질화 버퍼</td></tr><tr><td>프로브 초음파 발생기</td><td>Qsonica</td><td>Q125-110</td><td>최종 샘플용</td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일, 일반 사용</td><td>VWR</td><td>M221-1ML</td><td>세포질 추출용</td></tr><tr><td>냉장 원심분리기</td><td>Beckman-Coulter</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)</td><td>VWR</td><td>227</td><td>샘플 버퍼 용</td></tr><tr><td>오르토 바나 데이트 나트륨 (SOV)</td><td>시그마 -알드리치</td><td>450243</td><td>용해 버퍼 A 및 B</td></tr><tr><td>용 설탕</td><td>시그마 -알드리치</td><td>S0389</td><td>용해 버퍼 B</td></tr><tr><td>용 트리스 버퍼 식염수 (TBS)</td><td>VWR</td><td>788</td><td>샘플 버퍼</td></tr><tr><td>VDAC (D73D12)</td><td>세포 신호 기술</td><td>4661</td><td>웨스턴 블롯의 미토콘드리아 분획 검출, 희석: 1:1000</td></tr></tbody></table>

고속 원심 분리의 부재에서 u937 세포의 세포 분별 법

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

이 프로토콜에서 우리를 ultracentrifugation 또는 무차별 세제의 사용 없이 U937 세포의 subcellular 분수를 받는 방법을 자세하게. 이 메서드 사용 소형 버퍼, digitonin, 기계적인 세포 및 세포질, 미토 콘 드리 아 및 원형질 막 분리 차등 원심 분리 합니다. 과정은 연구자의 요구에 맞게 확장할 수 있습니다, 그리고 저렴 하 고 간단. 이 메서드는 특수 원심 분리기와 둘 다 엄청나게 비쌀 수 있는 상업용 키트를 사용 하지 않고 셀에 단백질 지 방화를 결정 하기 위해 연구원 수 있게 됩니다. 성공적으로 인간 monocyte 셀 라인 U937이 cytosolic 분리 하는 방법, 원형질 막 및 미토 콘 드리 아 단백질 사용 했습니다.

Undifferentiated U9378 셀 서 스 펜 션에서의 성공적인 분류는 위에서 자세히 설명 하 고 그림 1에 나와 있는 프로토콜을 사용 하 여 달성 되었다. 이 방법으로 얻은 샘플 polyvinylidene 불 소 (PVDF) 막에 젖은 전송 방법을 이용 하 여 서쪽 더 럽 히9 를 받게 했다. 막에 대 한 항 체와 조사 이후에 세포질, 미토 콘 드 리아 멤브레인 지역화 단백질 마커 (그림 2, 그림 3, 그림 4). 세포질 단백질의 추출은 일반적으로 세포의 세포질에 지역화 cytosolic 단백질 glyceraldehyde-3-인산 효소<sup class="xref...

여기, 선물이 원형질 막, 세포질 및 고속 원심 분리의 사용 없이 U937 세포의 미토 콘 드리 아를 분리 하는 프로토콜. 이 기술은 정화 subcellular 분수 immunoblotting 통해 단백질 지역화의 후속 검사에 대 한 사용할 수 있습니다.

고속 원심 분리의 부재에서 U937 세포의 세포 분별 법

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

이 프로토콜을 통해 연구원은 특수 장비, 고가의 시약 또는 복잡한 기술을 사용하지 않고 셀의 뚜렷한 분수를 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 수정 가능하고 수행하기 쉬운 기술의 단순성입니다. 절차를 시연하는 것은 맷 데라곤, 롭 할루스카, 알렉사 호지스.내 실험실에서 대학원생 3명입니다. 원심분리를 시작하려면 준비된 세포 현탁액을 생성하여 펠릿을 생성한다. 상체를 제거하고 실온 PBS에서 펠릿을 다시 중단하십시오. 10 분 동안 400 xg에서 세포 현탁액을 원심 분리합니다. 그런 다음 상체를 제거하고 얼음 차가운 버퍼에서 셀 펠릿을 다시 중단합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 버퍼 A 솔루션을 준비합니다. 10 분 동안 400 xg에서 세포 현탁액을 원심 분리하고 상체를 제거합니다. 완충액A용액을 ml당 2억개의 세포에 재농축하고, 파이펫을 부드럽게 하여 덩어리를 분해한다. 이 후 4에서 끝 회전기에 세포 현탁액을 인큐베이션

cell-fractionation-u937-cells-absence-high-speed

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 비디오는 백혈병 세포에서 세포 및 핵 분획을 생성하는 방법인 백혈병 세포에서 세포 내 분획을 준비하는 방법을 설명합니다. 핵 및 세포질 분획은 추가 다운스트림 분석에 사용할 수 있습니다.

백혈병 세포에서 Subcellular Fractions의 준비: 백혈병 세포에서 세포 및 핵 분획을 생성하는 방법

이 비디오에서는 콜라겐 분해 효소 E 및 실리카 기반 밀도 분리 매체 구배 분리를 사용한 효소 분해를 통해 쥐 결장 조직에서 lamina propria 단핵 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다. 분리된 단핵 셀은 후속 다운스트림 분석에 사용할 수 있습니다.

Lamina Propria 단핵 세포 분리: 쥐 결장에서 단핵 세포를 얻기 위한 실리카 기반 밀도 구배 원심분리 기술

이 비디오는 기계적 해리와 효소 분해를 사용하여 쥐의 뇌에서 종양에 침투하는 말초 혈액 단핵 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다. 그 다음에는 추가 분석을 위해 면역 세포를 수집하기 위해 밀도 구배 원심분리가 수행됩니다.

쥐의 뇌에서 종양 침투 면역 세포 분리

이 프로토콜은 다양한 정상 및 악성 인간 조직에 존재하는 CD45+ 세포(림프구/백혈구)의 정성적 및 정량적 평가를 위해 신선한 인체 조직 조각의 신속한 비효소적 해리를 설명합니다. 또한, 일차 조직 균질액으로부터 얻어진 상등액은 추가 분석 또는 실험을 위해 수집 및 저장될 수 있습니다.

침투 림프구의 분석을위한 비 효소 해리 신선한 인간의 조직에 대한 간단하고 빠른 프로토콜

초기 뇌 종양 미세 환경에 진입 면역 세포의 수와 활성 상태에서 시간에 따른 양적 데이터를 산출 교종 함침 말초 혈액 단핵 세포의 분리 및 유세포 분석을위한 간단한 방법이 여기에서 제시 하였다.

분리 및 신경 교종-침투 말초 혈액 단핵 세포의 유세포 분석

이 프로토콜의 다른 세포 주기 단계에 기본 급성 림프 구성 백혈병 세포를 분리 하는 원심 elutriation 사용을 설명 합니다.

원심 Elutriation에 의해 다른 세포 주기 단계에서 기본 급성 림프 구성 백혈병 세포의 준비

이 프로토콜은 1 차적인 만성 림프구성 백혈병 세포에서 핵 및 세포질 분획의 최적화 그리고 연속적인 효율적인 생성을 가능하게 합니다. 이 견본은 세포 자극 및 약 처리에 핵과 세포질 구획 사이에서 일어나는 단백질 인신 매매에 있는 단백질 현지화 그리고 변경을 결정하기 위하여 이용됩니다.

핵/세포질 단백질 인신 매매를 모니터링하기 위한 1차 만성 림프구성 백혈병 세포의 세포 분열

이 분획 프로토콜을 통해 연구자들은 포유류 세포에서 세포질, 핵, 미토콘드리아 및 막 단백질을 분리 할 수 있습니다. 후자의 2 개의 세포 내 분획은 isopycnic 밀도 구배를 통해 추가로 정제됩니다.

아이소피크닉 밀도 구배 정제에 의한 U937 세포의 세포 분획

우리는 살아있는 효모와 포유류 세포에서 포름알데히드가 교차하는 번역 (단백질 생합성) 복합체를 급속하게 안정화시키는 기술을 제시합니다. 접근은 과도 중간및 동적 RNA:단백질 상호 작용을 해부할 수 있습니다. 교차 연결된 복합체는 심층 시퀀싱 기반 프로파일링 방법, 현미경 검사법 및 질량 분석법과 같은 여러 다운스트림 응용 분야에서 사용할 수 있습니다.

진핵 세포에서 번역 단지의 신속한 생체 내 고정 및 격리

이 연구는 고립된 뇌 미세아교세포에서 핵내 유세포 분석을 사용하여 전역 히스톤 변형의 정량화를 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 작업에는 데이터 수집에 사용된 미세아교세포 격리 프로토콜도 포함되어 있습니다.

분리된 마우스 뇌 미세아교세포에서 핵내 유세포 분석을 사용한 글로벌 히스톤 번역 후 변형의 정량화

배우세요 U937 세포의 세포질, 미토콘드리아, 세포막 분리법을 고속 원심 분리 없이 수행하는 방법을. 면역블로팅을 통한 단백질 국소화 연구에 활용할 수 있는 효율적인 세포 분별 기술입니다.

고속 원심 분리의 부재에서 U937 세포의 세포 분별 법

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