Name: 향상 된 높은 처리량 호흡 Syncytial 바이러스 (RSV) 마이크로 중화 분석 결과 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: 배우세요 RSV 중화항체 정량을 위한 고처리량 이미징 기반 마이크로 중화 분석법을. A549 세포를 사용하여 10% 이하의 변동성으로 재현성 높은 결과를 얻는 이 방법은 다양한 RSV 계통에 적용 가능합니다.

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저자는 모든 참가자를 참여 감사합니다. 우리는 빅토리아 정부의 운영 인프라 지원 프로그램을 인정합니다. PVL은 NHMRC 경력 개발 장학금 받는 사람입니다.

참고: 모든 단계는 다르게 명시 하지 않는 한 BSL2 후드에서 수행 해야 합니다. 바이러스 성 적정이 PRN 분석 결과에 사용 되는 최적의 RSV 농도 결정 하는 PRN 분석 결과 사전 필요 합니다. 약 수를 한 번 해 동 되 고 각 NAb 분석 결과 대 한 사용 되는 작은 볼륨에서 바이러스 주식 추천 된다. 모든 NAb 분석 한 연구에서 모든 샘플에 대 한 수행에 대 한 같은 바이러스 성 주식을 사용 하 여 또한 것이 좋습니다. 문화 미디어와 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 셀 접시에 추가 하기 전에 37 ° C에서 예 열이 다는 것을 확인 하십시오.
1. RSV 바이러스 성 적정
참고: 바이러스 주식 수와 중복의 수에 따라 분석 결과 접시 그림 1에 따라 설정할 수 있습니다. 각 바이러스 주식 분석 결과 플레이트, 높은 바이러스 농도 (즉, 1:10)부터 아래로 3 중에서 적정 한다. 일반적으로 직렬 titrations 수 1시 10분. RSV 문화 절차 뿐만 아니라 A549 세포 배양 및 유지 보수 할 수 있습니다 표준 절차를 사용 하 고이 프로토콜에 포함 되지 않습니다.
<ol><li>시드 플레이트 (1 일)
	<ol>
<li>Dulbecco의 수정 이글스 매체 (DMEM) + 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS) + 1000 IU 페니실린/스 (펜/strep) 4 x 105/mL A549 세포 resuspend 100 μ/잘 4 x 104 A459 셀을 포함 하 시드 96 잘 평면-바닥 살 균 접시.</li>
		<li>37 ° C, 5% CO2 에서 하룻밤 번호판을 품 어 (셀 로그 단계 성장에 있을 것입니다). 참고: 23 통행 후 새로운 A549 세포 유리병을 사용 합니다. 그것은 권장 하지 시작 실험 때 새로운 셀 유리병은 처음 세 개의 구절에서 여전히.</li>
	</ol></li>
	<li>바이러스 감염 (주 2)
	<ol>
<li>바이러스 직렬 희석의 준비<ol>
<li>거의 완전히 해 동 하 고 얼음에 즉시 배치 될 때까지 37 ° C 물 욕조에 RSV의 단일 냉동된 유리병을 녹여 급속 하 게. 3 복제 준비 각 RSV 바이러스 재고 분석 수, 희석 바이러스/잘 100 μ 1시 10분의 초기 바이러스 재고 희석 사용 하 고 부정적인 제어에 대 한 열이 하나 이상 보유 합니다. 참고: 그림 1 triplicates에 부정적인 컨트롤을 보여 줍니다.</li>
			<li>각 희석된 바이러스의 100 μ A 96 잘 U-바닥의 행의 3 중에서 1:10 추가 살 균 판. DMEM + 1000 IU 펜/strep FCS 없이 90 μ/잘 헤 B 행에 추가</li>
			<li>수행 하는 직렬 1시 10분 희석 아래로 행을 5 번 위아래로 pipetting 콘텐츠 B. 믹스 솔루션 행 행 H. 폐기 최종 10 μ까지 ten-fold 희석 되도록 각 최종 볼륨 잘 90 μ A에서 10 μ를 전송 하 여 접시. 참고: 그것은 각 희석에 대 한 새로운 팁을 사용 해야 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
A549 세포에 바이러스 접종
		<ol>
<li>전날에 준비 A549 cell plate(s)를 검색 합니다. 96 잘 접시에서 A549 세포 monolayers ~ 80% 합칠 인지 확인 합니다. 부드럽게 접시를 반전 하 고 멸 균 흡수 성 종이 타월에 가볍게 blotting에 의해 미디어를 삭제 합니다.</li>
			<li>PBS의 100 μ와 모든 우물을 두 번 세척, 부드럽게 접시를 반전 하 고 가볍게 각 세척 후 살 균 흡수 성 종이 타월에 blotting에 의해 초과 PBS를 삭제. 접시 건조를 허용 하지 않습니다.</li>
			<li>A549 세포에 바이러스 성 적정 플레이트 (그림 1)에서 해당 우물 바이러스 희석을 전송. 37 ° C, 5% CO2에서 1 시간에 대 한 접시를 품 어. 1 h 부 화 후 supernatants를 (교차 오염 방지) 하는 피 펫을 사용 하 여 가만히 따르다. 90 μ/잘 꺼내 주세요.</li>
			<li>추가 1 x 매체 199의 100 μ (M199, 재료의 표 참조) + 1.5 %carboxymethylcellulose 나트륨 소금 (CMC) 낮은 점도 + 펜/strep 각 잘을 포함 하는 2 %FCS. 참고: 2 x M199 + 4 %FCS + 펜/strep 2%와 3 %CMC 솔루션 사전에 준비 하 여 나중에 사용할 4 ° C에 저장 해야 합니다. 솔루션은 접시에 추가 하기 전에 37 ° C에서 예 열 다는 것을 확인 하십시오.<ol>
<li>2 x M199 솔루션 준비: 1 향 주머니/500 mL 증류수 10 mL 펜/strep + 물 + 20 mL FCS (2를 만들기 위해 x MI99). 0.22 μ m 필터 단위를 사용 하 여 솔루션을 필터링 합니다.</li>
				<li>3의 준비에 대 한 %CMC, 증류수 500 mL에 천천히 CMC의 15 g 추가. 준비의 약 1 h는 50 ° C에서 금속 활동가 히터를 사용 하 여 물에 CMC를 분해. 믹스 3을 잘 %CMC 및 고압 솔루션. 참고: 단단한 CMC; 해산 하기 위하여 물에 추가 되어야 합니다. 건조 고체 물 추가 분해 하기 매우 어려운 고체의 "덩어리"를 생성 합니다.</li>
				<li>1 x M199 + 1.5 %CMC 낮은 점도 준비 + 펜/strep 혼합 하 여 1: 1를 포함 하는 2% FCS M199 및 3% x 2 CMC 단계 1.2.2.4.2에서에서 준비.</li>
			</ol>
</li>
			<li>37 ° C, 5% CO2에서 3 일 동안 접시를 품 어.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>분석 결과 플레이트 및 분석 (주 5) 개발
	<ol>
<li>고정 및 개발 분석 결과 플레이트<ol>
<li>부드럽게 접시를 반전 하 여 M199 CMC + 2 %FCS 포함 펜/strep를 삭제 합니다. 천천히 추가 (피하기 위하여 셀 레이어 방해) 고정 버퍼 (80% 아세톤, 20 %PBS,-20 ° C에서 저장 된)의 200 μ 셀을 해결 하기 위해. 20 분 동안-20 ° C에서 품 어.</li>
			<li>고정 버퍼를 삭제 하 고 부드럽게 흡수 성 종이 타월에 오 점. 플레이트 얼굴을 두고 10 분 동안 드라이까지. 참고: 앞으로이 단계에서 분석 결과 BSL2 후드 밖에 서 수행할 수 있습니다.</li>
			<li>준비 5% 우유 희석제 차단 솔루션 0.05%를 포함 하는 필터링 된 PBS에 폴 20 (PBS-법무부, 재료의 표참조). 한 접시, 200/잘 고 110 우물에 따라 차단에 필요한 볼륨 계산: 200/잘 x 110 웰 스 = 22 mL (1.1 집중 mL 우유 20.9 ml에서 희석제 필터링 PBS-법무부). 이 단계에서 또한 1 차 및 이차 항 체에 대 한 충분 한 차단 솔루션을 확인 합니다. 한 접시에 대 한 계산 50/잘 고 110 우물에 따라 각 항 체 솔루션에 필요한 볼륨: 50/잘 x 110 웰 스 5.5 mL =. 따라서, 단일 플레이트 분석 결과에 필요한 솔루션을 차단 하는 우유 희석 액의 총 볼륨 33 mL 이다.</li>
			<li>차단 솔루션의 200 /well을 추가 합니다. 품 어 플레이트 실 온 (RT)에서 30 분 삭제에 대 한 솔루션 부드럽게 접시를 반전 하 여 고 흡수 성 종이 타월에 오 점.</li>
			<li>1: 500 염소 X RSV 항 체 (mAb-1 차적인 항 체) 솔루션을 차단에 희석을 준비 합니다. MAb 솔루션의 50 /well을 추가 하 고 37 ° C 1 h. 세척 접시 3 번 필터링 된 PBS-폴에서 품 어.</li>
			<li>1:5,000 알 렉 사 Fluor 당나귀 솔루션을 차단에 희석 방지 염소 IgG (이차 항 체)를 준비 합니다. 이차 항 체 솔루션의 50 /well을 추가 하 고 37 ° C 1 h. 세척 접시 5 번 필터링 된 PBS-폴에서 품 어.</li>
			<li>읽기 fluorescein isothiocyanate (FITC) 채널을 사용 하 여 자동화 된 명소 리더에 접시 및 그림 2와 같이 설정. 접시를 호 일에 포장 및 4 ° c.에 저장 악기는 사용 하지 않는 96 잘 문화 플레이트를 사용 하 여 및 분석 결과 전에 수 설정을 입력 보정. 참고: 몇 일 이내에 다시 검사 하는 것이 필요한 경우 가능 합니다. 교정 및 개수 설정을 저장 하 고 분석 결과 보정에 사용 하는 접시의 동일한 유형을 사용 하는 경우 미래의 검색을 위해 사용할 수 있습니다.</li>
			<li>인 위 플 라크 또는 방해 셀 monolayers (그림 3)에 대 한 웰 스의 이미지를 확인 하십시오. 교란된 셀 monolayers와 웰 스 제외. 참고: 인 위 패의 크기에 따라 수동 카운트 그 우물에 대 한 수행 해야 할 수도 있습니다 또는 그 우물 데이터 분석에서 삭제 할 수 있습니다. 유효한 결과 대 한 기준 이상의 복제에서 잘 발견 아무 방해 셀 단층 또는 인 위 패와 부정적인 우물 (추가 바이러스 없이 우물)에서 검색 된 없음 PFU 포함.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
바이러스 농도 결정
		<ol>
<li>마지막 두 희석 명소 명확 하 게 계산 될 수 있는 곳을 선택 합니다. 관광 명소 같은 희석에 복제 우물에서의 평균 수를 계산 합니다. 아래 수식을 사용 하 여 재고 샘플의 바이러스 titer (mL 당 PFU) 계산: PFU/mL = 플 라크의 평균 수 (희석 비율 × 희석된 바이러스 양의 우물에 추가) / 참고: 각 RSV 주식에 대 한 결정 하는 바이러스 농도 이제 PRN 분석 결과 (2 단계)에서 사용할 수 있습니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. RSV 중화 분석 결과
<ol><li>
시드 플레이트 (1 일)
	<ol>
<li>DMEM + 10 %FCS + 4 x 105/mL에서 1000 IU 펜/strep A549 세포 resuspend 시드 96 잘 평면-바닥 살 균 판 100 μ/잘 포함 하는 4 x 104 A459 세포 및 37 ° C, 5% CO2 에서 하룻밤 번호판을 품 어 (셀 로그 단계 성장에 있을 것입니다). 참고: 23 통행 후 새로운 A549 세포 유리병을 사용 합니다. 3 번 통과 하기 전에 A549 세포를 사용 하는 권장 하지 않습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
바이러스 및 혈 청 준비 (주 2) 참고: 샘플 유형에 따라 NAb 분석 결과 전에 미리 처리 샘플에 대 한 필요한 단계 있다. 생물학 표준 및 컨트롤 (NIBSC) 국립 연구소에서 요청 시 사용할 수 있습니다 RSV 국제 표준 세라를 사용 하는 것이 좋습니다.<ol>
<li>
혈 청 희석의 준비
		<ol>
<li>인간의 RSV 참조 원으로 (참조 혈 청, REF)를 녹여 및 혈 청 혈 청 샘플 실시간 열 비활성화 샘플 테스트 원으로 사용 하기 30 분 전에 56 ° C에서 물 욕조에 참조. 플레이트 템플릿 (그림 4)에 의하여 희석을 준비 합니다.</li>
			<li>참고 준비의 1: 100 희석 DMEM + 시험 접시 당 FCS 없이 펜/strep 희석 ref 110 μ의 준비 (예:, 150 μ의 전체 볼륨에 REF의 1.5 μ). 1: 100의 110 μ 희석 96 잘 U-바닥의 잘 A12에 REF 추가 살 균 판.</li>
			<li>웰 스 B12 H12 열 12 DMEM + 펜/strep FCS 없이 55 μ를 추가 합니다. 행 A에서에서 행 B 55 μ를 전송, 5 번 위아래로 pipetting 콘텐츠 솔루션을 혼합 하 고는 각 최종 볼륨 잘 55 μ 미디어의 최종 55 μ 행 H. 삭제 될 때까지 계속 하 여 시리얼 접시 내려 1:2 희석을 수행 합니다. 각 희석에 대 한 새로운 팁을 사용 합니다.</li>
			<li>1: 100 희석 혈 청의 테스트 샘플을 준비 합니다. 모든 혈 청 샘플은 3 중에서 분석, 준비의 110 μ/3 = 330 x 최소 볼륨 혈 청 테스트 샘플 당 μ.</li>
			<li>각 희석된 혈 청 테스트 샘플 (1: 100; 110 μ를 추가 S1 = 혈 청 1, S2 = 세럼 2, 등.) A9 하도를 그림 4에 따라 96-잘 살 균 격판덮개의 E9 E1 해당 웰 스 A1.</li>
			<li>DMEM의 55 μ 추가 + 모든 우물 FCS 없이 펜/strep 표시 X. 수행 직렬 1:2 희석 단계 2.2.1.3 당 행 D (예제 1, 2, 및 3)까지. 각 잘에서 최종 볼륨은 55 μ 미디어의 최종 55 μ를 삭제 합니다. 마찬가지로, 4, 5, 및 6 행 E H. 샘플에 대 한 직렬 1:2 희석 수행 참고: 그것은 각 희석에 대 한 새로운 팁을 사용 해야 합니다.</li>
			<li>열 10, 11에에서 웰 스 DMEM + 펜/strep FCS 없이 55 μ를 추가 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
바이러스의 준비
		<ol>
<li>거의 완전히 해 동 하 고 얼음에 즉시 배치 될 때까지 37 ° C 물 욕조에 RSV의 단일 냉동된 유리병을 녹여 급속 하 게.</li>
			<li>1.3.2 단계에서 결정 된 RSV 약 수의 농도에 따라 FCS 없이 DMEM + 펜/strep 바이러스를 희석. 약 200 PFU/잘 주는 희석을 적용 됩니다. 5.5 mL의 총 볼륨 (100 정)에 대 한 준비.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
바이러스 혈 청 혼합물의 준비
		<ol>
<li>열 1-9의 모든 우물과 행 E-H 10 및 11 (긍정적인 통제) 접시 템플릿 (그림 4)에 따라 열의 우물에 희석된 바이러스의 55를 추가 합니다.</li>
			<li>DMEM + 펜/strep FCS 없이 55 행 열 10, 11 (부정적인 제어)의 A-D의 모든 우물을 추가 합니다. 37 ° C, 5% CO2에서 1 시간에 대 한 접시를 품 어.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
A549 세포에 바이러스 접종
		<ol>
<li>잠복기의 완료 이전 단계 2.1.1에서에서 준비 A549 cell plate(s)를 검색 합니다. 96 잘 접시에서 A549 세포 monolayers ~ 80% 합칠 인지 확인 합니다.</li>
			<li>부드럽게 접시를 반전 하 고 멸 균 흡수 성 종이 타월에 가볍게 blotting에 의해 미디어를 삭제 합니다. PBS의 100 μ와 모든 우물을 두 번 세척, 부드럽게 접시를 반전 하 고 가볍게 각 세척 후 살 균 흡수 성 종이 타월에 blotting에 의해 초과 PBS를 삭제. 접시 건조를 허용 하지 않습니다.</li>
			<li>다음 접시 템플릿 품 37 ° C, 5% CO2에서 1 시간에 대 한 접시 A549 세포에 바이러스 혈 청 혼합물의 100 /well 해당 웰 스 전송.</li>
			<li>피 펫을 사용 하 여 1 h 90/잘 꺼내 고 추가 후의 100 x M199 + 1.5 %CMC + 2 %FCS + 펜/strep 1 prewarmed. 37 ° C, 5% CO2에서 3 일 동안 접시를 품 어. 참고: 솔루션은 접시에 추가 하기 전에 37 ° C에서 예 열 다는 것을 확인 하십시오.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
분석 결과 플레이트 및 분석 (주 5) 개발
	<ol>
<li>개발 단계 1.3.1.1 1.3.1.8 고정 및 분석 결과 격판덮개.</li>
		<li>50% 무력화 titer를 결정<ol>
<li>계산 하 여 50% 무력화 titer 비례 거리 '혈 청' 컨트롤의 50% 아래와 위의 상호 혈 청 희석 사이 우물 (긍정적인 바이러스 컨트롤-열 10, 행 E-H)를 결정 합니다.</li>
			<li>PFU (즉, 플 라크)의 수를 세어 혈 청 우물과 아무 혈 청 제어 우물에서 개별 바이러스 성 감염에서 발생. 없음 혈 청 제어 우물의 PFU의 평균 수를 계산 하 고 50% 값을 결정 합니다.</li>
			<li>혈 청 희석 카운트는 바로 위와 아래 아무 혈 청 제어 우물의 50% 값을 식별 합니다. Using 세미 로그 그래프 또는 스프레드시트 서식 파일, 플롯 (선형 눈금) x 축 및 y 축 (로그10 규모)에 상호 혈 청 희석 PFU의 수 있습니다. 두 점 사이 선을 인출 하 고이 라인에서 혈 청 샘플 시험의 50% 무력화 titers를 읽고. 참고: RSV PRN 분석 결과 워크시트 (워크시트 보충)는 50% 무력화 titer를 결정 하는 데 사용 됩니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

우리가 개발 하 고 최적화는 간단 하 고 효율적인 RSV 마이크로 중화 분석 결과 대부분 실험실에서 쉽게 적용할 수 있습니다. 이 분석 결과 컴퓨터 이미지 검색을 사용 하 여 세포 수준에서 NAb 바이러스 성 감염의 억제를 측정 뿐만 아니라 바이러스 감염 능력을 측정할 수 있다. 이미징 기반 플랫폼 및 특정 항 체 기반 시스템을 사용 하 여 특이성 및 전통적인 패 감지 방법6,7에 비해 자리 탐지의 감도 증가 했다. 이로써 RSV의 낮은 infectivity와 변종 및 또한 PRN 분석 결과에서 사용 하기 전에 RSV의 정확한 정량화를 제공 합니다.
바이러스 성 주식의 동일한 배치 RSV 주식 사이 어떤 일괄 배치 변화를 최소화 하기 위해 각 연구에 사용 되도록 하는 것이 좋습니다. 분석 결과의 다른 중요 한 측면의 바이러스 입력, 무결성 A549 세포 단층 및 분석 결과 일...

호흡 syncytial 바이러스 (RSV) 소아 인구 세계1에 더 낮은 호흡 기관 감염의 주요 원인입니다. 그것의 높은 부담에도 불구 하 고 아직 아무 백신 이나 치료 가능한 있다. 2013 년 이후 세계 보건 기구 (WHO)는 주요 연구 우선 순위, 연간 WHO 상담 회의2,3로 RSV 백신 개발을 선언 했다. WHO는 RSV 중화 항 체 (NAb) 측정 모니터를 사용 하 백신 immunogenicity로 보호4의 주요 혈 청 학적인 감 적으로 인식 되 고이에 동의 했다. NAbs 안티-RSV 단일 클론 항 체 palivizumab, 현재만 예방 전략 사용 가능한4의 임상 시험 연구의 숫자에 가혹한 RSV 감염 으로부터 보호 하기 위해 표시 되었습니다.
5,6,,78도전 표준화 노력 만든 세포 및 분자 기반 분석을 포함 한 전세계 실험실에 의해 사용 되는 여러 NAb 분석 결과 형식을 확인 하 고 있습니다. 그러나, RSV 특정 항 체의 존재에 의해 감소 된 플 라크 형성 단위 (PFU)의 수를 측정 하는 기존의 플 라크 감소 중화 (PRN) 분석 결과 금9아직도 남아 있다. 여기, 우리는 향상 된, 단순화, 및 높은 처리량 PRN 프로토콜 다른 RSV 긴장 증가 분석 결과 처리량과 수많은 셀 라인에 사용할 수 있는 보고 합니다. 이 프로토콜은 임상 샘플 다른 설정에서 뿐만 아니라 동물 모델 실험에서 샘플을 사용 하 여 테스트 되었습니다.

<table><tbody><tr><td>Cell line</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td></td><td>ATCC CCL-185</td> provided <td>by Dr Keith Chappell, University of Queensland</td></tr><tr><td>Viral srains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RSV A2</td><td>ATCC</td><td>VR-1540</td><td>로트 번호 60430286</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Merck</td><td>1000142511</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 당나귀 안티 염소 IgG (4 &deg; C)</td> <td>Life Technologies</td><td>A11055</td><td></td></tr><tr><td>CMC 나트륨 염 분말</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5678-500G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (혈청 없음, 3.7 g / L NaHC, P / S) (4 °C에서 저장; C)</td> <td>과학 서비스 &ndash; 조직 배양</td><td></td><td>MCRI in house 공급</td></tr><tr><td>태아 송아 혈청 (-20 &deg에서 50 mL 부분 표본에 보관; C)</td><td>Interpath</td><td>SFBS-F</td><td></td></tr><tr><td>Goat X RSV 항체</td><td>Merck</td><td>AB1128</td><td></td></tr><tr><td>호흡기 세포융합 바이러스(RSV)에 대한 인간 다클론 항혈청 (45 &micro에 저장; L 부분 표본 -20 &deg; C)</td><td>BEI Resources</td><td>NR-4022</td><td>등록 시 BEI Resources를 통해 무료 주문. 이 혈청은 RSV (NR-32832)</td></tr> <tr><td>M199 분말</td><td>Life Technologies</td><td>31100035</td><td></td></tr><tr><td>우유 희석제 차단 용액 (4 °C에 저장)에 대한 인간 항혈청 및 면역 글로불린 패널에 속합니다. C)</td> <td>Australian Biosearch</td><td>50-82-01</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 / 스트렙토 마이신 (-20 &deg에서 6mL 부분 표본에 저장됨; C)</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q 디스펜서의 s.d.H2O</td><td>Merck</td><td></td><td>사내 분배</td></tr><tr><td>배양용 멸균 1x PBS(4°C에서 보관; C)</td> <td>과학 서비스 &ndash; 조직 배양</td><td></td><td>MCRI in house supply</td></tr><tr><td>트윈 20 폴리소르베이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>General Consumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Conical Falcon tubes (50 mL)</td><td>Invitro Technologies</td><td>FAL352070</td><td></td></tr><tr><td>Filter unit 0.22 &mu; m (500 mL)</td><td>Thermo Fisher</td><td>NAL5660020</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Eppendorf tubes (1.5 mL)</td><td>Australia PL</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>Sterile flat-bottom plates (96-well with lid)</td><td>Interpath</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>sterile U-bottom plates (96-well with lid)</td><td>Interpath</td><td>650180</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 혈청 피펫</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS4487-200EA</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 혈청학 피펫</td><td>Interpath</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 혈청학 피펫</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS4251-200EA</td><td></td></tr><tr><td>팁 피펫 1-200 &micro; L Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960</td><td>Fisher Biotec</td><td>TF-200-L-R-S</td><td></td></tr><tr><td>팁 피펫 5-20 &micro; L Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960</td><td>Fisher Biotec</td><td>TF-20-L-R-S</td><td></td></tr><tr><td>팁 피펫 100-1,000 &micro; LClear Maxymum Recovery 랙 사전 멸균 10RACKS x 100TIPS PKG1000</td><td>Fisher Biotec</td><td>TF-1000-L-R-S</td><td></td></tr><tr><td>팁 피펫 1-10 &micro; L Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001</td><td>Fisher Biotec</td><td>TXLF-10-L-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Equipments and softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ELISpot reader system</td><td>AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AID ELISpot software version 5.0</td><td>AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로소프트 엑셀 2007</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

향상 된 높은 처리량 호흡 syncytial 바이러스 (rsv) 마이크로 중화 분석 결과

An Improved and High Throughput Respiratory Syncytial Virus (RSV) Micro-neutralization Assay

호흡 syncytial 바이러스는 특정 중화 항 체 (RSV NAbs)는 RSV에 대 한 보호의 중요 한 표식. 다른 분석 결과 형식의 번호에에서는 현재 전세계 사용 이므로 RSV NAbs 측정 하기 위한 정확 하 고 높은 처리 방법에 대 한 필요. 여기는 영상 기반 마이크로 중화 분석 결과 RSV 하위 그룹 A에서 테스트 되었습니다와 RSV 하위 그룹 B 및 서로 다른 샘플에 대 한 또한 적응 수 있습니다 설명 합니다. 이 방법은 매우 재현성, 참조 원으로 10% 미만 대 한 상호 분석 결과 유사 합니다. 우리는이 분석 결과 많은 실험실에서 상대적으로 저렴 한 비용으로 전세계에 쉽게 설치 될 수 있다 믿습니다. RSV NAbs 측정 개선, 높은 처리량 분석 결과의 개발 뿐만 아니라 소설 RSV 백신 후보자의 평가 미래에 대 한 중요 한 되 고 국제적으로이 방법의 표준화에 대 한 중요 한 단계를 앞으로 나타냅니다.

바이러스 주식의 적정 1:10 1시 10분에서 수행한 PRN 분석 결과 (대표 결과 그림5) 전에 바이러스 재고 농도 결정 하기 위해8 희석. 그림 5, PFU 계산 될 수 있는 안정적으로 1:10 희석에4 와 1시 10분5. PFU에서 같은 희석 triplicate 우물에서의 평균 수를 계산 했다. 1 105 희석은 14에 관광 명소의 평균 수, 이후이 바이러스의 바이러스 titer는 다음과 같이 결정 했다.:
14 (반점의 평균 수) / [10-5 (희석) x 0.1 mL (inoculum 볼륨)] = 1.4 x 107 PFU/mL...

높은 처리량,이 연구에 설명 합니다 호흡 syncytial 바이러스 (RSV)에 대 한 특정 중화 항 체 titer를 확인 하려면 이미징 기반 마이크로 중화 분석 결과. 이 분석 결과 형식은 다른 샘플 형식에 대해 테스트 되었습니다.

향상 된 높은 처리량 호흡 Syncytial 바이러스 (RSV) 마이크로 중화 분석 결과

Respiratory syncytial virus-specific neutralizing antibodies (RSV NAbs) are an important marker of protection against RSV. A number of different assay ...

호흡기 싱크로바이러스에 대한 보호의 중요한 마커로서 RSV 중화 항체를 측정하기 위한 정확하고 높은 처리량 방법이 필요합니다. 이 방법은 10% 미만인 기준 항세럼에 대한 분석 간 변형으로 매우 재현가능한 이 분석법이 상대적으로 저렴한 비용으로 전 세계 많은 실험실에서 쉽게 확립될 수 있다고 믿습니다. 여기에서 RSV 하위 그룹 A에서 테스트되었으며 RSV 하위 그룹 B 및 다른 샘플 유형에 맞게 조정할 수 있는 이미징 기반 미세 중화 분석이 여기에 설명되어 있습니다.절차를 시연하는 것은 MCRI의 연구 팀의 일원인 르우벤 Tse입니다. 첫날 에 시드 플레이트, 먼저 DMEM 매체에서 A549 세포를 다시 중단, 와 10%FCS와 1, 000 단위 페니실린-연쇄상 구균 혼합물 의 농도400, 밀리 리터 당 000 세포. 그런 다음 잘 당 100 마이크로 리터의 밀도에 40, 000 A459 세포와 96 잘 평평한 바닥 멸균 플레이트를 시드.하룻밤 사이에 5%의 이산화탄소 환경에서 37도의 플레이트를 배양합니다. 둘째 날에 혈청 희석을 준비하기 위해 먼저 실온에서 인간 RSV 기준 혈청 및 혈청 검사 샘플을 해동하십시오. 그런 다음 56°C의 수조에 넣고 30분 동안 가열하여 활성화합니다.다음으로, 150 마이크로리터의 최종 부피에 페니실린-스트렙토마이신 혼합물과 FCS 프리 DMEM 미디어와 참조 혈청의 1.5 마이크로리터를 혼합하여 기준 세럼의 1~100희석의 110마이크로리터 이상을 준비한다. 96웰 U-바닥 멸균 플레이트의 잘 A12로 이 희석의 파이펫 110 마이크로리터. 플레이트 아래로 1~2개의 희석제를 연속하여 먼저 페니실린-스트렙토마이신 혼합물을 사용하여 FcS가 없는 DMEM 미디어 55마이크로리터를 H12에서 H12에 웰즈B12에 추가합니다.그런 다음 새로운 팁 전송 55 마이크로 리터 잘 A12에서 잘 B12. 파이펫을 5회 위아래로 사용하여 용액을 혼합하고 H12에 도달할 때까지 계속합니다. 잘 H12에서 용액의 초과 55 마이크로 리터떨어져 파이펫.다음으로, 혈청 시험 시료의 1~100희석을 준비하고, 96웰멸균 플레이트의 A9 및 E1에 대응하는 웰 A1에 각 희석제 110마이크로리터를 첨가한다. 그런 다음 페니실린-연쇄상 구균 혼합물을 갖춘 FCS 가 없는 DMEM 미디어 55마이크로리터를 1~9개의 기둥의 우물에 추가합니다. 이전에 설명한 대로 행 A에서 행 D행 및 행 E에서 행 H로 연속 1~2회 희석을 만듭니다.페니실린-스트렙토마이신 혼합물을 10과 11의 우물에 첨가하여 FCS 가 없는 DMEM 미디어 55마이크로리터를 첨가합니다. 바이러스 육수를 준비하기 위해 먼저 RSV의 냉동 유리병을 37도 의 수조에 넣고 빠르게 해동한 다음 유리병을 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, 페니실린-스트렙토마이신 혼합물을 함유한 DMEM 미디어에 바이러스를 추가하여 100개의 우물에 대해 총 55밀리리터를 만들기 위해 우물당 약 200PFU를 함유하고 있다.바이러스 혈청 혼합물을 준비하기 위해 먼저 10 및 11의 H를 통해 1~9개의 열과 우물을 통해 모든 컬럼에 희석된 바이러스의 55마이크로리터를 첨가한다. 그런 다음 페니실린-스트렙토마이신 혼합물로 FCS가 없는 DMEM 미디어 55마이크로리터를 열 10과 11의 D를 통과하는 모든 우물에 추가하고, 1시간 동안 5%의 이산화탄소 환경에서 37°C의 플레이트를 배양합니다. RSV를 가진 A549 세포의 접종에 앞서, A549 세포 단층이 80%의 컨실루인지 확인하기 위하여 광 현미경의 밑에 세포 판을 검사합니다.그런 다음 접시를 부드럽게 뒤집어 미디어를 버리고, 가볍게 멸균 흡수성 종이 타월에 접시를 블롯. 각 후 여과 된 멸균 PBS로 씻어 주세요. 다음으로 원고에 제공된 플레이트 템플릿에 따라 A549 세포판에 해당하는 우물에 바이러스 혈청 혼합물 100마이크로리터를 추가하고, 1시간 동안 5%의 이산화탄소로 37도에서 플레이트를 배양한다.인큐베이션의 끝에서, 파이펫을 사용하여 우물당 90 마이크로리터를 제거하고 페니실린-스트렙토마이신 혼합물에 1XM199, 1.5%CMC 및 2%FCS를 함유한 미디어의 마이크로리터 100을 추가한다. 3일 동안 이산화탄소 5%에서 37도의 플레이트를 배양합니다. 분석판을 고치고 개발하기 위해 먼저 RSV에 감염된 A549 세포판을 부드럽게 반전시켜 M199, CMC, 2%FCS 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합물을 포함하는 매체를 폐기한다.그런 다음 고정 버퍼 200 마이크로리터를 각 웰에 천천히 추가합니다. 20 분 동안 영하 20도에서 접시를 배양하십시오. 그런 다음 고정 버퍼를 버리고 흡수성 종이 타월에 부드럽게 얼룩이 있습니다.접시를 아래로 내려 놓고 10 분 동안 건조시십시오. 그런 다음 05 폴리소르바트 20을 포함하는 필터링 된 PBS 버퍼를 사용하면 5 %의 우유 차단 용액을 만듭니다. 블로킹 용액 200마이크로리터를 각 웰에 추가하고 실온에서 30분 동안 플레이트를 배양합니다.인큐베이션이 끝나면 접시를 부드럽게 반전하여 용액을 버리고 흡수성 종이 타월에 얼룩을 놓습니다. 1차 항체를 만들기 위해 블로킹 용액에서 염소 XRSV 항체를 1~500개 희석한다. 각 우물에 50 마이크로리터를 추가하고 1 시간 동안 섭씨 37도에서 접시를 배양합니다.여과 된 PBS-폴리소르베이트로 접시를 세 번 씻으시다. 다음으로, 블로킹 용액에서 알렉사 플루오르 당나귀 당나귀 면역 글로불린 G를 희석하여 이차 항체를 만든다. 각 우물에 50 마이크로리터를 추가하고 1시간 동안 섭씨 37도에서 배양합니다.여과 된 PBS-폴리소르베이트로 접시를 5번 세척합니다. 자동 스팟 판독기가 있는 플라크를 계산하려면 먼저 사용하지 않은 96웰 컬쳐 플레이트를 사용하여 FITC 채널의 카운트 설정을 입력하여 계측기를 공동 작업합니다. 그런 다음 셀 플레이트를 읽고 호일로 감싸고 섭씨 4도에 보관하십시오.다음으로, 우물의 이미지를 확인하여 실제 플라크 또는 세포 단층이 중단된 경우, 세포 단층이 중단된 우물을 제외합니다. 무혈제 대조유의 평균 플라크 수는 계산되어 바이러스 활성의 50% 억제를 초래할 50%의 중화 컷오프를 결정하는 데 사용되었다. 상호 혈청 희석은 x 축과 두 점 사이에 그려진 선에서 세미 로그 그래프의 y 축에 있는 플라크 수를 플롯했습니다.시험 혈청 샘플의 50% 중화 titres는 무혈청 대조공 우물의 50% 값 의 위 또는 그 이하의 카운트를 가진 빨간색 및 혈청 희석제가 확인되었다. 감비아에서 두 개의 다른 성인 코호트와 멜버른에서 건강 한 자원 봉사자에 RSVAPRN assays 멜버른 성인에 비해 낮은 평균 NAB titre를 가진 감비아 성인 결과. 표시된 인간 RSV-참조 혈청은 6.82%의 변이계와 매우 낮은 가변성을 보여 주며, 이러한 개선된 높은 처리량 RSV 플라크 감소 중화 분석은 많은 실험실에서 용이하게 구현될 수 있으며, RSV 중화 항체 분석에 대한 WHO의 국제 조화 노력을 지원할 것이다.이것은 미래에 새로운 RSV 백신 후보의 평가에 중요 할 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 프로토콜은 사스에 대한 재조합 수용체 결합 도메인 (RBD) 기반 subunit 백신을 연구를위한 일반적인 절차를 설명합니다. 그것은 293T 세포에 RBD 단백질, RBD와 설립 사스 pseudovirus의 중화 분석을 사용하여 마우스 세라의 중화 활동의 검출과 생쥐의 예방 접종의 transfection과 표현을위한 방법을 포함하고 있습니다.

재조합 RBD 기반 SARS 백신에 대한 프로토콜 : 단백질 준비, 동물 예방 접종 및 중화 감지

이 비디오는 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)에 대한 중화 항체를 측정하기 위한 분석을 보여줍니다. RSV 중화 항체가 포함된 혈청을 사용한 사전 배양은 바이러스 입자를 중화하여 세포 감염 및 플라크 형성을 줄입니다. 그런 다음 바이러스에 감염된 세포는 플라크 시각화를 위해 고정, 차단 및 형광단 접합 항체 표지를 받습니다. 이 과정을 통해 RSV의 50%를 중화하는 가장 높은 혈청 희석액을 식별할 수 있으며, 이는 중화 역가를 나타냅니다.

호흡기 세포융합 바이러스에 특이적인 중화항체 역가를 측정하기 위한 분석

인간 호흡기 세포융합 바이러스(HRSV)는 어린 유아에게 심각한 세기관지염을 유발할 수 있습니다. 중증 HRSV 질환의 발병 기전 중 일부는 숙주 면역 반응에 의해 발생합니다. HRSV를 이용한 일차 인간 면역 세포의 자극은 염증 경로 및 감염의 활성화를 연구하기 위한 빠르고 재현 가능한 모델 시스템을 제공합니다.

인간 호흡기 세포융합 바이러스 감염에 대한 인간 말초 혈액 단핵 세포의 면역 반응을 연구하기 위한 체외 모델

이 연구는 설명   영상 기반의 마이크로 중화 분석은 바이러스의 항원 성 관계를 분석합니다. 이 프로토콜은 평판 스캐너를 사용하고 적정, 적정 정량, 중화, 중화 정량 등 4 단계가있다. 분석은 현재 순환 인플루엔자 A (H1N1) pdm09, A (H3N2)와 B 바이러스와 함께 잘 작동합니다.

정량적 마이크로 중화 분석의 최적화

우리를 생성 하는 방법을 설명 하 고 RSVs에 대 한 호흡 syncytial 바이러스 (RSVs)와 최적화 된 패 분석 결과 수정 유전자 증폭. 우리는 두 재조합 바이러스는 각각 RSV 복제의 정량화를 허용 하 고 라이브 RSV 포함 몸과 포함 시체 관련 된과 립 역동성의 분석을 생성 하 여이 프로토콜을 설명 합니다.

생성, 증폭 및 재조합 호흡 Syncytial 바이러스의 적정

호흡기 싱크량 바이러스(RSV) RNA 합성의 심층 기계분석의 경우, 바이러스 특이적 뉴클레오캡시드(NC)의 후속 체외 조립을 위해 RNA-프리 뉴클레오프로틴(N0)의 공동발현을 위해 샤페론 인포단(P)을 활용하는 프로토콜을 보고한다.

호흡기 싱크량 바이러스의 바이러스 특이적 뉴클레오캡시드의 생성 및 조립

여기서 설명된 프로토콜은 스파이크 당단백질로 의사형인 향상된 녹색 형광 단백질 표지 된 정맥낭염 바이러스에 의해 감염을 억제하는 병류 혈청 샘플의 능력을 평가함으로써 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 대한 중화 항체를 측정하는 빠르고 효과적인 방법을 설명합니다.

의사 바이러스 감염의 높은 처리량 형광 화상 진찰을 사용하여 SARS-CoV-2 중화 항체의 검출

2리포터 판독값을 제공하는 비드계 멀티플렉스 분석분석을 위한 유량 분석 시스템은 SARS-CoV-2에 대한 중화 IgG 및 IgM 항체를 동시에 측정할 수 있는 멀티플렉스 세론및 항체 중화 분석분석의 개발에 사용되었다.

멀티플렉스 비드 기반 유량 분석 시스템을 위한 신속한 멀티플렉스 듀얼 리포터 IgG 및 IgM SARS-CoV-2 중화 분석

포괄적인 실험실 프로토콜 및 분석 워크플로우는 AAV6에 대한 중화 요소를 감지하기 위해 신속하고 비용 효율적이며 간단한 색채 세포 기반 분석법을 위해 설명됩니다.

색색세포 기반 분석법을 사용하여 AAV에 대한 항체 중화를 검출하는 단계별 방법

유사형 바이러스(PV)는 실제 바이러스를 취급하는 것보다 더 안전한 조건에서 숙주-바이러스 상호 작용을 연구하는 데 사용되는 복제 결함 바이러스입니다. 여기에 제시된 자세한 프로토콜은 SARS-CoV-2 PV를 사용하여 COVID-19 백신 접종 후 환자 혈청의 중화 능력을 테스트하는 방법을 보여줍니다.

중화 분석을 통해 SARS-CoV-2에 대한 체액성 면역 반응을 모니터링하기 위한 분자 도구로서의 유사형 바이러스

배우세요 RSV 중화항체 정량을 위한 고처리량 이미징 기반 마이크로 중화 분석법을. A549 세포를 사용하여 10% 이하의 변동성으로 재현성 높은 결과를 얻는 이 방법은 다양한 RSV 계통에 적용 가능합니다.

향상 된 높은 처리량 호흡 Syncytial 바이러스 (RSV) 마이크로 중화 분석 결과

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