Name: 완전히 자치 특성화 및 생물학 고분자의 결정에서 데이터 수집 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: 학습하세요 단백질 결정학에서 동기가속기 빔라인을 활용한 완전 자동화 데이터 수집 방법을. ISPyB 시스템으로 생물학 고분자의 고품질 회절 데이터를 효율적으로 획득하고 분석하는 프로토콜입니다.

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저자 ESRF를 beamtime에 대 한 감사합니다.

참고: 생산, 정화, 및 GCSH의 결정 화 보조 파일 1에서 설명 합니다.
1. 간략 한 오프 라인 준비와 크리스탈 장착 설명
<ol><li>위치는 나일론 루프 또는 다른 크리스탈 장착 지원 이미 하나 이상의 결정 아래 척추 핀에 고정 하 고 강수량 솔루션 (단백질 해결책의 0.5 M 나트륨 편대 pH 4.0 + 25 µ L의 20 µ L)에서 그들을 리프트.<ol>
<li>모든 초과 액체를 빨 아 종이 심지와 함께 산으로는 crystal(s) 주위 대량 액체를 제거 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>강 수 솔루션 플러스 30% 글리세롤;를 포함 하는 cryoprotective 솔루션에는 crystal(s)를 담근 다 그런 다음, 크리스탈 지원 및 crystal(s)는 모두 제거 합니다.<ol>
<li>모든 초과 액체를 빨 아 종이 심지와 함께 산으로는 crystal(s) 주위 대량 액체를 제거 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>액체 질소로 채워진 척추 유리병에 마운트를 빠지게 하 고 유사 하 게, 유럽 분자 생물학 실험실 (EMBL)에 준비 하는 다른 결정 함께 저장 / ESRF 샘플 체인저 퍽9 액체 질소 온도에. 참고:는 crystal(s)는 beamtime 사용할 때까지이 조건에서 안정 되어 있습니다.</li>
</ol>2. 요청 대산괴-1 beamtime
<ol><li>ESRF 홈페이지 (http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying)에 가능한 한 빨리 beamtime를 요청 합니다. 참고: ESRF MX beamlines 액세스 가능한 모드의 수가 있다. 실험실의 블록 할당 그룹 (가방), 2 년 동안 할당 된 beamtime를 일부로 공동으로 적용할 수 있습니다. 그룹은 개별적으로 적용 하려면, 그들은 피어 검토 후 빠른 액세스는 beamlines 수 있는 액세스를 압 연에 대 한 적용할 수 있습니다. 그룹의 제안은 검토 하 고 추가 정보를 요청할 수 있습니다 ESRF 안전 그룹에 의해 허가 됩니다. 제안을 수락 하는 경우는 실험 번호와 비밀 번호를 전달 됩니다. Beamtime를 구입 하 여 독자적인 연구를 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>필요한 안전 교육 온라인 (http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/SafetyTraining)에 완료.</li>
	<li>Beamtime 대산괴-1 달력에 예약. 참고: 교대 당 분석할 샘플 홀더 50 최대 예약 가능 하다.</li>
	<li>샘플 측정을 위해 필요한 안전 정보 메일에 실험 (http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form) 선언 -양식 입력 합니다.</li>
</ol>3. ISPyB에서 회절 계획의 창조
참고: 회절 계획 ISPyB에서 샘플에 필요한 모든 정보를 보유 하 고 각 샘플에 대 한 수행 하는 실험에 맞게 추가 정보를 포함할 수 있습니다.
<ol><li>(Https://exi.esrf.fr/)에서 ISPyB를 엽니다.</li>
	<li>MX 실험를 선택 합니다.</li>
	<li>실험 번호와 비밀 번호는 로그인.</li>
	<li>선적 을 클릭 | 새로운 추가 하 고 필요한 정보를 제공. 저장을 클릭 합니다.</li>
	<li>추가 소포 를 클릭 하 고 요청 된 정보 채웁니다. 저장을 클릭 합니다.</li>
	<li>클릭 추가 컨테이너이름으로 퍽 바코드 주고 척추 퍽을 선택. 저장을 클릭 합니다.</li>
	<li>편집, 및 컨테이너 기호 클릭 하 고 입력 단백질 이름 처럼 필요한 정보 기본 워크플로, 퍽, 등, 크리스탈 위치는 샘플에 관한.</li>
	<li>ESRF 안전 그룹에 의해 승인 되었습니다 단백질 (예: GCSH 또는 lysozyme)을 선택 합니다.</li>
	<li>각 개별 샘플을 식별 하는 고유한 샘플 이름을 입력 합니다. 그것은 선택적으로 핀 바코드를 스캔 수 있습니다. 나머지 아래의 정보는 선택 사항입니다.</li>
	<li>선택적 정보를 입력 합니다.<ol>
<li>각 개별 샘플에 대 한 실험 유형을 입력 (즉, MXPressE_SAD, 점수, 또는 MXPressO, 등등, 기본 MXPressE) exp. 종류에서. 이 정의 자동 워크플로 각 결정을 처리 하는 데 사용 됩니다. GCSH 크리스탈 바늘은 주어진 MXPressP를 선택 합니다.</li>
		<li>알려진 공간 그룹 (예를 들어 P1, C2, 또는 p 212121)을 입력 합니다. 있는 경우이 데이터 수집 전략 계산 하 고 사용할 수 있는 자동 데이터 처리 파이프라인에 의해 사용 됩니다.</li>
		<li>원하는 해상도 입력 (기본: d분 = 2.0 Å). 이 초기 메쉬 검사, 특성화 및 기본 데이터 컬렉션에 대 한 크리스탈-검출기 거리를 정의합니다.</li>
		<li>이 제한에 diffract 하지 않는 결정에서 전체 데이터 집합의 컬렉션을 방지 하기 위해 원하는 임계값 해상도 (예: 1.5 Å 또는 2.3Å)을 설정 합니다. 이 데이터 저장 공간 및 분석 시간을 절약할 수 있습니다.</li>
		<li>필요한 완전성을 설정 (기본값: 0.99). 필요한 복합성을 설정 (기본값: 4). 하나 이상의 크리스탈 샘플 지원에 포함 되어, 결정 분석의 최대 수를 설정. 기본 값은 1 또는 MXPressP에 대 한 5.</li>
		<li>적절 한 빔 크기 선택 (기본: 50 µ m). 특정 값을 선택 하지 않은 경우 X 레이 중심 및 데이터 수집 전략 계산 50 µ m의 빔 크기와 함께 수행 됩니다. 참고: 완전 한 데이터 집합의 모든 후속 컬렉션, 동안 빔 크기 것입니다 적응 시킬 자동으로.</li>
		<li>공간 그룹에 넣어 강제로 공간 그룹 열에 알려진 경우. (1의 기본 값으로 낮은 높은 감도 위한 0.5-2.0) 결정의 방사선 민감도 설정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>원하는 경우, 전체 데이터 집합 컬렉션에 대 한 수집을 총 회전 각도 설정 (기본값: eEDNA에 의해 결정 하는 총 회전 각도).</li>
	<li>값을 저장 합니다. 선적에 반환클릭 하십시오. ESRF 선적 보내기를 누릅니다.</li>
	<li>배송 라벨을 인쇄 하 고 샘플을 보내. 사용자는 ESRF 계정 세부 사항을 사용 하 여, 택배와 함께 픽업을 정렬 해야 합니다. 참고: 샘플 (https://www.esrf.eu/MXDewarReimbursement 참조)의 원활한 복귀를 허용 하도록 포함 반환 레이블 선택 매우 중요 하다.</li>
</ol>4. 데이터 수집, 보기 및 검색
참고: 실험 당일, 샘플은 대산괴-1 높은 용량 Dewar (HCD)에 전송 됩니다. Beamline 과학자는 다음 사용자가 원격으로 지켜질 수 있다 데이터 수집을 시작 합니다. 각 다른 샘플 형식에 대 한 사용자 데이터 수집을 시작 했다 그들을 알리는 전자 메일을 받습니다. 이전 지적, 온라인 및 실시간으로 모든 워크플로에서 모든 단계의 실행을 따라 할 수 있는 사용자 를 통해 ISPyB에서 결과 수 있습니다 볼 수 및 다운로드 하 여.
<ol><li>분석 하는 각 샘플에 대 한 ISPyB (https://exi.esrf.fr/)에 자동 실험의 결과 검사 합니다.<ol>
<li>실험 번호 및 암호를 사용 하 여 로그인 하 고 ID30A-1에서 원하는 실험 세션 클릭 하십시오.</li>
		<li>기본 설정된 (최고 점수) autoprocessing 파이프라인 (수류탄 또는 XDS_APP 등)을 선택 하 고 마지막 수집 결과 클릭 하 여 가장 높은 완성도 높은 해상도와 정확한 공간 그룹에 밖으로 기록 되는 데이터를 다운로드 하 고, 그런 다음, 다운로드. 참고: 모든 메쉬, 선 및 특성화 이미지 /MXPressE_01 라고 하는 각 샘플에 대 한 하위 디렉터리에 있습니다. ESRF는 자동으로 즉 EDNA_proc12, 수류탄12, XDS_APP14, autoPROC15및 XIA216, 5 별도 처리 패키지를 실행합니다. 데이터 통합 XDS, 다이얼에 근거 하는 XIA2 예외를 기반으로 합니다. 모든 패키지 또한 슬픈 단계적 프로토콜에에서 사용 되는 데이터에 있는 경우는 비정상적인 신호를 자동으로 감지를 허용 하는 변칙 및 nonanomalous 모드로 실행 됩니다. 각 패키지는 다른 매개 변수 및 의미를 일부 패키지 실행 특정 예제와 함께 더 나은 의사 결정 트리를 사용 합니다. 그러나,이 결과의 많은 수에 대 한 패키지 및 가능한 공간 그룹의 수가 차지 하는 경우 만들 수 있습니다. 결과, 따라서, 대략 해상도 최저 해상도 껍질, CC(1/2), 그리고 완전성에 R병합 같은 다른 품질 통계에 따라 평가 됩니다. 이것은 최고의 데이터 집합, 사용자 안내 겨냥 하지만 모든 가능한 공간 그룹 및 결과 신중 하 게 검사 해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>모든 로그 파일 및 병합 되지 않은 XDS_ASCII 포함 됩니다 다운로드 폴더를 압축을 풉니다. HKL 고 병합 하며, 크기.mtz 파일입니다. 참고: 경우 관심 또는 가까운 체의 단백질의 PDB 형식의 구조 실험의 시작에 ISPyB에 업로드 된, autoprocessing 파이프라인 ESRF에 자동으로 수행 합니다 분자 교체 (MR)으로이 구조를 사용 하 여 실행 합니다 검색 모델 솔루션을 득점 하는 최고에. 미스터 파이프라인의 결과 ISPyB에 표시 되 고 처리 된 데이터 폴더 (예를 들어 /data/visitor/mx2112/id30a1/20180711/PROCESSED_DATA/GCSH/GCSH-x5/autoprocessing_GCSH-x5_run1_1/grenades_fastproc/user_nohet.pdb_에서에서 찾을 수 있습니다. mrpipe_dir /). 여기, 최종 모델 coot1.pdb 및 반사 데이터 sidechains.mtz 라는 것입니다. Note는 파이프라인 해결책을 찾아내기의 가능성을 증가 하기 위하여 세포 (원시 세포 감소)의 대칭을 줄일 수 있습니다. 여기의 경우, 미스터 파이프라인 솔루션 orthorhombic 셀 (C2221) 보다는 오히려 단사 셀 (C2)에 썼다. 분자 대체를 수행 하는 방법에 수동으로 실행 (두 번째 최고 득점 autoprocessing 솔루션 exemplified) 보충 파일에 포함 되어 있습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Hui, R., Edwards, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput protein crystallization.</a> Journal of Structural Biology. 142 (1), 154-161 (2003).</li>
<li>Bowler, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MASSIF-1%3A+a+beamline+dedicated+to+the+fully+automatic+characterization+and+data+collection+from+crystals+of+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Synchrotron+Radiation%22%5BJournal%5D)">MASSIF-1: a beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).</li>
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<li>Cipriani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CrystalDirect%3A+a+new+method+for+automated+crystal+harvesting+based+on+laser-induced+photoablation+of+thin+films%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68, 1393-1399 (2012).</li>
<li>Nurizzo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RoboDiff%3A+combining+a+sample+changer+and+goniometer+for+highly+automated+macromolecular+crystallography+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">RoboDiff: combining a sample changer and goniometer for highly automated macromolecular crystallography experiments.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (8), 966-975 (2016).</li>
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<li>Brockhauser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+workflows+in+the+design+and+implementation+of+complex+experiments+in+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984 (2012).</li>
<li>Svensson, O., Gilski, M., Nurizzo, D., Bowler, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-position+data+collection+and+dynamic+beam+sizing%3A+recent+improvements+to+the+automatic+data-collection+algorithms+on+MASSIF-1%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Multi-position data collection and dynamic beam sizing: recent improvements to the automatic data-collection algorithms on MASSIF-1.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 74, 433-440 (2018).</li>
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<li>Higashiura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+X-ray+crystal+structure+of+bovine+H-protein+at+0.88+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">High-resolution X-ray crystal structure of bovine H-protein at 0.88 Å resolution.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (6), 698-708 (2010).</li>
<li>Sanishvili, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+7+%C2%B5m+mini-beam+improves+diffraction+data+from+small+or+imperfect+crystals+of+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">A 7 µm mini-beam improves diffraction data from small or imperfect crystals of macromolecules.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 64 (4), 425-435 (2008).</li>
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<li>Bowler, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation+and+Experience+of+Controlled+Crystal+Dehydration%3A+Results+from+the+European+Synchrotron+HC1+Collaboration%5BTitle%5D)+AND+%22Crystal+Growth+%26+Design%22%5BJournal%5D)">Automation and Experience of Controlled Crystal Dehydration: Results from the European Synchrotron HC1 Collaboration.</a> Crystal Growth & Design. 15 (3), 1043-1054 (2015).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

완전 자동 beamlines 요구 되는 beamline에 또는 원격으로 과학자의 존재 없이 고분자 결정의 큰 숫자에서 자동화 된 특성화 및 데이터 컬렉션을 제공 합니다. 완전히 자동화 된 beamlines를 사용 하 여 수동 작업에 비해 많은 이점이 있다. X 선 메시를 기반으로 하는 예를 중심으로, 자동된 샘플 및 라인 스캔, 수행으로 인간의 눈으로 보다 더 정확한 그것은 영향을 받지 열 또는 광학 효과. 실제로,이 메쉬 및 라인 스캔 제공 데이터 수집에 사용할 올바른 빔 크기를 결정 중요 한 추가 데이터 (즉, 크리스탈과 크리스탈의 지역 diffracting 최고의 자세한 치수)-작은 결정을 위해 특히 18-고 얻은 회절 데이터의 품질 향상된에 자주 발생. 또한, 활용 함으로써 사용자 정의 매개 변수 자동 실험의 설치에서 특정 워크플로 단계 가장 연구, 따라서 실험 성공률을 더 최적화 시스템에 맞게 맞출 수 있습니다.
함께 복용 beamline (사용자가 자체 일정, 캘린더 [위 참조]를 사용 하 여), 그리고 대산괴-1의 완전 자동화 된 접근에 대 한 간단한 액세스 제공 엄격한, 사용할 수 있는 워크플로의 신뢰성 높은 처리량 및 시간 절약 클래식 체험 MX 실험 및 가능성이 더 고급 절차 및 자동 워크플로로 응용 프로그램을 구현 하는 대안. 가까운 장래에, 3D19 지도 제작 크리스탈 x 선 중심, 크리스탈 탈수 실험20와 같은 더 복잡 한 프로토콜을 자동화할 것입니다 하는 동안의 정확도 개선 하기 위해 구현 됩니다. 그것은 완전 자율 데이터 수집 MX, 작은 분자 조각 스크린에 대 한 높은-품질 데이터를 제공 최적화 제대로 결정 diffracting 자동으로 단계를 제공 하 고 다 수의 심사에서에서 표준 방법 될 것 기대 크리스탈 구조 드 노 보를 해결 하기 위해 정보입니다. 함께 결정21의 자동된 수확에서 개발, 자동화 된 서비스로 단백질 결정 구조 솔루션의 가능성 잘 현실을 될 수 있습니다.

특정 단백질의 3 차원 구조를 결정 하는 것은 생물학에서 중요 합니다. 일에서 파생 된 정보 그래서 생물학 기능에서 및 모양 및 연구 분자에 포함 된 활성 및 바인딩 사이트의 특이성에 빛이 나. 많은 경우에, 이로써 결정 또는 적절 한 행동의 메커니즘 잠재적인 치료 분자 개발. MX 구조 정보를 얻기 위해 가장 일반적으로 사용 되는 기술 이지만 병목은 잘 diffracting 결정을 얻기 위해 최적 조건의 결정. 따라서, 결정 화 실험 수많은 다른 조건에서 실시 하 고 최고의 결정 회절 데이터 수집을 위해 사용할 수를 찾을 다음 상영. 결정 화 실험1 의 설정의 자동화 명확 하 게이 점에서 도움이. 그러나, (즉, 크리스탈 장착, 회절 심사 및 회절 데이터 수집) 이후 단계는 일반적으로 수행 수동으로, 시간, 노력, 및 리소스를 많이 차지. 회절 심사 및 데이터 수집의 자동화, 따라서 뜻 시간과 효율에 엄청난 이득입니다.
MX에서 회절 심사 및 데이터 수집 싱크 로트 론 MX beamlines를 자동화는 크게 용이 하 게이 과정에서 가장 자주 수행 됩니다. 그러나, 대부분의 경우, 그것은 실험 동안에 beamline에 있어야 또는 원격으로 작동 하는 과학자에 필요한. 최근, 완전히 자동화 된 MX beamlines의 새로운 세대의 개발된2되었습니다. 여기, 사용자 수, 육체적으로 또는 원격으로 실험 세션 동안 필요가 없습니다. 밤, 심사 결정 및 회절 데이터 수집 과학자 보다는 지출 전체 일, 그리고 종종 덜 일상적인 작업에 더 많은 시간을 보낼 수 있습니다. 세계 최초의 완전 자동화 된 beamline 대규모 자동화 샘플 선택 통합 시설 (대산괴-1, ID30A-1)2,3 유럽 싱크 로트 론 방사선 시설 (ESRF)에 이다. 그것은 높은-용량 샘플 포함 dewar beamline의 각도4,5역할도 로봇 샘플 교환기와 연동에서 운영 하 독특한 샘플 환경. 대산괴-1은 갖춘 단일 광자 계산 하이브리드 픽셀 검출기6, 0.969의 고정된 파장에서 작동 하는 undulator beamline Å (12.84 keV) 강렬한 엑스레이 광속 (2 x 1012 광자/s)와 함께. 100 µ m x 65 µ m (수직 빔 크기 가로) 최대 10 µ m (라운드 빔)의 최소 사이 샘플 위치에서 빔 크기를 조정할 수 있습니다. 평균,는 beamline 처리할 수 있는, 완전히 자동에 24 시간에 (아래 참조), 120 크리스탈 패션. beamline 작업 워크플로7, 각각의 연구 샘플에서 최고의 데이터 측정을 보장 하기 위해 지능형 결정 워크플로에 있는 이전 단계의 결과에 따라 소요의 시리즈를 기반으로 합니다. 특히, 개별 샘플의 회절 특성의 평가 계정 크리스탈 볼륨 및 유출에 걸리고, 크리스탈은 크리스탈만 최고의 지역 후속 데이터에 사용 되는 x 선 빔 보다 더 큰 보장 컬렉션입니다. 회절 데이터 세트, 따라서, 최소화 된 방사선 손상2,3최대 해상도 최적화 되어 있습니다. 모두 네이티브 및 단일 파장 변칙 회절 (슬픈) 데이터 컬렉션에 대 한 의사 헬리컬 (다중 위치) 데이터 수집 전략 등의 까다로운 데이터 수집 프로토콜 사용할 수8있습니다.
대산괴-1에서 완전히 자동 실험 cryocooling를 포함 하 고 척추9, 원하는 실험 매개 변수 입력 핀 결정 원하는 beamline 장비 표준에 대 한 적합 한 자석 샘플 마운트에 장착 된 ' 회절 계획 ' 단백질 결정학 beamlines (ISPyB)10, MX 실험에 대 한 웹 기반 정보 관리 시스템 통합 시스템에서 표 고는 beamline에 샘플을 보내는. ESRF 에서/는 beamline에서 샘플의 수송의 모든 비용 ESRF 사용자 사무소에 의해 지원 됩니다 (자세한 내용은 ESRF11 의 웹사이트를 참조 하십시오). 대산괴-1, 제한이 루프 크기에 배치 됩니다 또는 크리스탈 품질. 주어진된 크리스탈에 대 한 회절 계획을 선택할 때 사용자 수 중 기본 설정을 사용 하거나 각 샘플에 대 한 사용자 정의할 수 있는 특정 워크플로를 선택 하십시오. 여러 사전 프로그래밍된 워크플로 사용할 수 있습니다. MXPressE3 워크플로에서 포함 하는 샘플 루프 처음 광 중심을 사용 하 여 샘플 위치에 정렬 됩니다. 그런 다음, X 레이 기반을 중심으로 x 선 빔에 크리스탈의 최고의 지역 중심은 보장 합니다. 데이터 수집 전략 다음 eEDNA, 특히 계정 크리스탈 볼륨과 beamline에 실시간 유량으로 x-선 실험 분야에서 온라인 데이터 분석에 대 한 플러그인 기반 응용 프로그램을 개발 하기 위한 프레임 워크를 사용 하 여 계산 됩니다. 전체 회절 데이터 집합의 컬렉션, 다음이 다음 자동 데이터 처리 파이프라인12 의 시리즈를 사용 하 여 처리 하 고 결과 ISPyB에서 검사 및 다운로드에 사용할 수 있는 만들어집니다. MXPressE 슬픈3 워크플로 대상 단백질의 selenomethionine를 포함 하는 결정을 겨냥 하 고 대산괴-1의 작동 에너지 바로 Se K 가장자리 위에 사실 악용. 슬픈 데이터 수집을 위해 MXPressE eEDNA 데이터 수집 전략 최적화, (즉, 높은 중복, 및 Bijvoet 쌍 사이의 R병합 이 5% 미만의 설정 해상도). 후속 데이터 수집 없이 결정의 일련의 회절 속성 화면을 MXScore3 워크플로 결정 분석의 전체 품질 평가 생산 하기 위해 사용할 수 있습니다. MXPressI3 워크플로에서 180 ° 회전 데이터의 0.2 ° 진동 사용 하 고 시작 피 각도 해상도 eEDNA 전략에 의해 결정을 사용 하 여 수집 됩니다. MXPressO 3 포함 하는 워크플로로 preobserved 해상도 (기본값: d분 = 2 Å). 재판 결정에서 발생 하는 결정의 초기 평가 하려면, MXPressM3 워크플로 제공 합니다. 이 높은 복용량 메쉬 수행 없이 데이터 컬렉션 샘플 지원의 넓은 방향을 통해 스캔 또는 중심. 최근에, 2 개의 새로운 실험 워크플로, MXPressP 및 MXPressP_SAD, pseudohelical 데이터 컬렉션을 수행 하는 구현된8되었습니다. 온라인 및 실시간으로 모든 워크플로에서 모든 단계의 실행 지켜질 수 있다 ISPyB 통해 사용자.
여기 우리가 대산괴-1에서 완전 자동화 된 MX 실험을 준비 하는 방법과 검색 실험에서 결과 데이터를 분석 하는 방법을 보여줍니다. 예를 들어, 우리 인간의 미토 콘 드 리아 글리신 분열 체계 단백질 H (GCSH)를 사용합니다. 이 리 포 산이 포함 된 단백질 글리신 분열 체계 글리신의 저하에 대 한 책임의 일부입니다. 이 시스템 더 P 단백질, pyridoxal 인산 염 의존 글리신 decarboxylase, T 단백질, tetrahydrofolate 필요한 효소 및 L 단백질, lipoamide 효소 포함 됩니다. GCSH T 단백질 P 단백질에서 글리신의 methylamine 그룹을 전송합니다. H 단백질에 결함 인간13에 nonketotic hyperglycinemia (NKH)의 원인입니다.

<table><tbody><tr><td>Beamline MASSIF-1</td><td>ESRF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BL21DE3</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527I</td><td></td></tr><tr><td>chloramphenicol</td><td>Roth</td><td>3886.1</td><td></td></tr><tr><td>농축기: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC803024</td><td></td></tr><tr><td>투석막</td><td>Spectrumlabs</td><td>132655</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Dnase</td><td>Roche</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Euromedex</td><td>EU0006-B</td><td></td></tr><tr><td>EDTA- 무료 프로테아제 억제제</td><td>Roche</td><td>4,693,159,001</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>VWR 화학 물질 Prolabo</td><td>14388.29T</td><td></td></tr><tr><td>His-trap HP</td><td>GE 헬스케어</td><td>17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>이미다졸</td><td>시그마-알드리치</td><td>56750-500G</td><td></td></tr><tr><td>IPTG,</td><td>Euromedex</td><td>EU0008-B</td><td></td></tr><tr><td>LB 매체</td>, <td>시그마-알드리치</td><td>L3022</td><td></td></tr>, <tr><td>리포산</td><td>, 시그마-알드리치</td><td>T5625</td><td></td></tr><tr><td>루프</td><td>, 햄튼 리서치</td>, <td>HR8-124</td><td></td></tr>, <tr><td>라이소자임</td>, <td>로슈</td><td>10, 837, 059, 001</td><td></td></tr>, <tr><td>MonoQ, 5/50, GL</td>, <td>GE, 헬스케어</td>, <td>17-5166-01</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S/3160/60</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator vibra cell 75/15</td><td>SONICS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPINE pucks</td><td>MiTeGen</td><td>SKU: M-CSM003-0001A</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Euromedex</td><td>26-128-3094-B</td><td></td></tr><tr><td>포름산나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1064430500</td><td></td></tr><tr><td>GCSH 정제 버퍼</td><td>20 mM TRIS pH 8, 200 mM NaCl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GCSH 극저온 보호 버퍼</td><td>0.25 M 포름산나트륨 pH 4, 30% 글리세롤</td><td></td><td></td></tr><tr><td><강>프로그램:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MxCube</td><td></td><td>Gabadinho, J. et al. MxCuBE : 고분자 결정학 실험을 위해 맞춤화된 싱크로트론 빔라인 제어 환경. 싱크로트론 방사선 저널(Journal of Synchrotron Radiation). 17 (5), 700-707, DOI: 10.1107/S0909049510020005 (2010)</td><td>로컬 개발</td></tr><tr><td>ISPyB</td><td>ESRF</td><td>Solange Delageni&egrave; re, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, St&eacute; 파니 베이리어, 조스&이큐트; 가바디뉴, 엘스페스 J. 고든, 사무엘 D. 존스, 칼 에릭 레빅, 세아큐트; n M. 맥스위니, St&eacute; 파니 모나코, 맥스 나나오, 대런 스프루스, 올로프 스벤손, 마틴 A. 월시, 고든 A. 레너드; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 2011년 11월 15일, Pages 3186-3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535</td><td>local development</td></tr><tr><td>MXCube2</td><td>ESRF</td><td>Gabadinho, J. et al. MxCuBE : 고분자 결정학 실험을 위해 맞춤화된 싱크로트론 빔라인 제어 환경. Journal of Synchrotron(싱크로트론 저널) 방사선 . 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone, Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24-226 (2014).</td><td>지역 개발</td></tr><tr><td>BES 워크플로우 서버</td><td></td><td>Brockhauser, S. et al. 고분자 결정학에서 복잡한 실험의 설계 및 구현에 워크플로우 사용. Acta Crystallographica 섹션 D 생물학적 결정학. 68 (8), 975-984, DOI: 10.1107/S090744491201863X (2012).</td><td></td></tr><tr><td>DOZOR</td><td>ESRF</td><td>Bourenkov 및 Popov, 미공개</td><td>로컬 개발</td></tr><tr><td>BLISS 빔라인 제어</td><td></td><td>Guijarro, M. et al. BLISS - ESRF EBS 빔라인에 대한 실험 제어. Proceedings of the 16th Int. Conf. on Accelerator and Large Experimental Control Systems, ICALEPCS2017, 바르셀로나, 스페인. 도이: 10.18429/jacow-icalepcs2017-webpl05 (2018).</td><td>지역 개발</td></tr><tr><td>이미지의</td><td></td> AUTO 처리 <td>Monaco, S. et al. ESRF에서 고분자 결정학 X 선 회절 데이터의 자동 처리. 응용 결정학 저널(Journal of Applied Crystallography). 46 (3), 804-810, doi: 10.1107/S0021889813006195 (2013)</td><td>local development</td></tr><tr><td>BEST and EDNA</td><td></td><td>Incardona, M.-F., Bourenkov, G.P., Levik, K., Pieritz, R.A., Popov, A.N., Svensson, O. EDNA : X-ray 실험 온라인 데이터 분석에 적용되는 플러그인 기반 애플리케이션용 프레임워크. 싱크로트론 방사선 저널(Journal of Synchrotron Radiation). 16 (6), 872-879, doi: 10.1107/S0909049509036681 (2009).</td><td>지역 개발</td></tr><tr><td>CCP4</td><td></td><td>Winn, M.D. et al. CCP 4 제품군 개요 및 현재 개발. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 235-242, doi: 10.1107/S0907444910045749 (2011).</td><td></td></tr><tr><td>Phaser MR</td><td></td><td>McCoy, A.J., Grosse-Kunstleve, R.W., Adams, P.D., Winn, M.D., Storoni, L.C., Read, R.J. Phaser 결정학 소프트웨어.Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674, doi: 10.1107/S0021889807021206 (2007).</td><td></td></tr><tr><td>Coot</td><td></td><td>Emsley, P., Cowtan, K. Coot: 분자 그래픽을 위한 모델 구축 도구.Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60, 2126-32 (2004).</td><td></td></tr><tr><td>refmac5</td><td></td><td>Murshudov, G.N., Vagin, A.A., Dodson, E.J. 최대 가능성 방법에 의한 고분자 구조의 정제.Acta Crystallographica 섹션 D. 53, 240--255 (1997).</td><td></td></tr><tr><td>Matthews</td><td></td><td>Matthews, B.W. 단백질 결정의 용매 함량. 분자 생물학 저널. 33 (2), 491-497 (1968).</td><td></td></tr></tbody></table>

완전히 자치 특성화 및 생물학 고분자의 결정에서 데이터 수집

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

높은 광택 x 선 광선 자동화와 결합 구조 생물학에서 가장 어려운 프로젝트도 싱크 로트 론 기반 고분자 엑스레이 결정학 (MX) beamlines 사용 하 여 끌고있다. 그러나, 대부분의 시설이 아직도 실험을 수행 하기 위해 사이트에 과학자의 존재를 요구 한다. 완전 자동 특성, 및 데이터 수집, 자동화 된 beamlines의 새로운 세대 생물 고분자의 결정은 최근 개발 되었다. 이러한 beamlines 사용자는 beamline 스스로 제어 하는 것 없이 초기 결정 화 실험 회절 데이터 세트의 큰 숫자의 컬렉션의 결과 화면에 구조상 생물학을 위한 새로운 도구를 나타냅니다. 여기 우리가 자동 심사 및 데이터 수집에 대 한 실험을 설정 하는 방법을 보여줍니다는 beamline에 실험을 수행 하는 방법 결과 데이터 집합 처리 방법, 그리고 어떻게, 가능한 경우, 생물 고분자의 결정 구조는 해결 된다.

MXPressP 워크플로 완전히 자동으로 마운트, x-선 빔에서 센터, 특성, 및 인간 GCSH의 결정의 시리즈에서 전체 회절 데이터 집합을 수집 ESRF beamline 대산괴-1에서 사용 되었다. 샘플 장착 했다 고 루프 (그림 1, 왼쪽)를 검색 하는 영역에 대 한 분석. 회절 분석 후 4 포인트 데이터 수집 (그림 1, 오른쪽) 크리스탈 내에서 선정 됐다. 이후 미스터 솔루션을 발견에 대 한 높은-품질 데이터 집합 (표 1)를 나왔고 미스터 파이프라인을 포함 하 여 자동화 된 데이터 분석 파이프라인에 의해 처리. 후자는 빠르게 획득된 데이터 집합 및 사용된 검색 모델 분자 교체에 의해 단계적으로 적합 한지 여부를 평가 하는 사용자 수 있습니다. 또한, ligands의 존재 수 판단, 따라서 추가 분석에 대 한 가장 유망한 데이터 집합에만 초점을 사용자 허용. 씨에 의해 수동 구조 결정 후 단일 자동 수정 주기 (그림 2a) 높은-품질 전자 밀도 지도를 얻지 못했다. 이 데이터 집합에 대 한 자동화 된 파이프라인 가공 데이터는 1.32 Å 해결책; 그러나, 사용자가 여전히 높은 해상도 셸에서 다른 품질 통계 (CC1/2, &lt; I/σ(I) &gt; Rmeas)에 도착 하는 더 낮은 해상도에서 데이터를 잘라 결정할 수 있습니다. 인간 GCSH 구조체의 결정 구조는 소 단백질 (3KlR)16의 비슷합니다.
지속적인 전자 밀도 N 맨끝 히스티딘 태그를 제외 하 고 전체 아미노산 체인에 대 한 표시 됩니다. 인간과 소 GCSH를 구별 하는 4 개의 대체의 3 개는 쉽게 식별 전자 밀도 (일/Val66, Asp/Glu98, 그리고 레이/Phe149; 그림 2b -d)입니다. 이것은 Asp/Lys125 대체는 사이드 체인의 전자 밀도 유연성 (그림 1e)으로 인해 부분적 으로만 해결 한다 보다 적게 명확 하다. 현재 획득된 모델 R작업 및 R무료 값 20.4%와 23.8%, 각각, 있으며 더 사이클의 자동 및 수동 모델 구축 및 수정 하 여 더 최적화할 수 있습니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>수류탄 파이프라인</td>
			<td>XDS_APP 파이프라인</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">데이터 수집 및 처리</td>
		</tr>
<tr>
<td>소스를 x-선 빔 라인 /</td>
			<td colspan="2">ESRF / 대산괴-1</td>
		</tr>
<tr>
<td>파장 (Å)</td>
			<td colspan="2">0.966</td>
		</tr>
<tr>
<td>해상도 (Å)</td>
			<td>41.88-1.48 (1.53-1.48)</td>
			<td>41.86-1.32 (1.39-1.32)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">총/고유 반사</td>
			<td>127670 / 28644</td>
			<td>177332 40134 /</td>
		</tr>
<tr>
<td>(12178 / 2775)</td>
			<td>(23772 / 5714)</td>
		</tr>
<tr>
<td>인덱싱, 스케일링 및 병합을 위해 공간 그룹</td>
			<td>C222</td>
			<td>C2221
</td>
		</tr>
<tr>
<td>셀 크기</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>a, b의 c (Å)</td>
			<td>42.20, 83.75 95.85</td>
			<td>42.19 83.72, 95,82</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mosaicity</td>
			<td>0.05</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rmeas (%)</td>
			<td>10.0 (110.7)</td>
			<td>11.1 (198.2)</td>
		</tr>
<tr>
<td>&lt; I/σ(I) &gt;</td>
			<td>9.6 (1.3)</td>
			<td>7.6 (0.7)</td>
		</tr>
<tr>
<td>참조1/2 (%)</td>
			<td>99.7 (53.9)</td>
			<td>99.7 (19.1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>완성도 (%)</td>
			<td>99.6 (99.6)</td>
			<td>99.5 (98.6)</td>
		</tr>
<tr>
<td>다중성</td>
			<td>4.5 (4.4)</td>
			<td>4.4 (4.2)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">분자 교체 및 예비 모델 구체화</td>
		</tr>
<tr>
<td>단계적으로 조정 공간 그룹</td>
			<td>C2</td>
			<td>C2221
</td>
		</tr>
<tr>
<td>셀 크기</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>a, b의 c (Å)</td>
			<td>83.74, 42.18 95.82</td>
			<td>42.19 83.72, 95,82</td>
		</tr>
<tr>
<td>Α, Β, Γ (°)</td>
			<td>90, 90.03, 90</td>
			<td>90, 90, 90</td>
		</tr>
<tr>
<td>검색 모델 씨 (PDB)에 대 한</td>
			<td>3KLR</td>
			<td>3KLR</td>
		</tr>
<tr>
<td>단백질 분자 / 애리조나 주립대</td>
			<td>2</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>단백질 잔류물</td>
			<td>250</td>
			<td>125</td>
		</tr>
<tr>
<td>R작업/R무료 (%) 1 수정 후</td>
			<td>24.3 26.5 /</td>
			<td>20.4 / 23.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 수정 후 RMSD 본드 길이 (Å)</td>
			<td>0.01</td>
			<td>0.01</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 수정 후 RMSD 본드 각도 (°)</td>
			<td>1.2</td>
			<td>1.83</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rotamer 국외 자 (%) 1 수정 후</td>
			<td>1.07</td>
			<td>4.29</td>
		</tr>
<tr>
<td>야 Ramachandran 선호/허용/허용 되지 않습니다 (%) 1 수정 후</td>
			<td>95.93 4.07 / / 0</td>
			<td>95.12 4.88 / / 0</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: x 선 회절 데이터 수집, 수정, 및 유효성 검사 통계. 높은 해상도 쉘에 대 한 값은 괄호에 부여 됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59032/59032fig1.jpg"> 그림 1: 샘플 분석 데이터 수집 전에. (A) 빨간 상자에 의해 표시 됩니다 검색을 위해 선택한 지역. (B) 회절 이미지의 분석 지도 열으로 표시 됩니다. 위치 결정 내에서 4 개의 위치는 데이터 수집을 위해 선정 됐다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59032/59032fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59032/59032fig2.jpg"> 그림 2: 수정 후 얻은 전자 밀도 지도의 시각적 확인. 전자 밀도 지도 (인간의 GCSH에 Asp) r.m.s. 수준 (는) Trp143, (b) Val66 주위에 인간 GCSH (일), 및 (c) Glu98 x 2 및 지도에 contoured contoured r.m.s 수준 (d) Phe149의 주위 (에 인간 GCSH 레 우) 및 (e) x 1 Lys125 (인간 GCSH에 Asp). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59032/59032fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

여기, 우리는 일부 싱크 로트 론 beamlines에 자동화 심사 및 사용할 수 있는 데이터 수집 옵션을 사용 하는 방법을 설명 합니다. 과학자는 싱크 로트 론 cryocooled 샘플 보내기 회절 속성은 상영, 데이터 세트는 수집 처리 그리고, 구조 솔루션은 실행 가능한-모든 인간의 개입 없이.

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

X선 결정학은 단백질로부터 3D 구조 정보를 결정하는 데 가장 큰 기술입니다. 싱크로트론 빔 라인은 단백질이 생성하는 작고 약하게 확산되는 결정으로부터 데이터를 얻기 위해 필요합니다. 거대한 빔은 생물학적 거대 분자로부터 데이터 수집 과정을 완전히 자동화하기 때문에 독특한 빔 라인입니다.샘플 마운팅, 위치 및 최종 데이터 수집에서. 이러한 종류의 완전한 자동화는 연구원이 빔 라인에서 데이터를 수집하는 대신 실험실에서 시간을 보낼 수 있기 때문에 매우 중요합니다. 빔 라인은 또한 지능적이고 평균적으로 빔 라인이 인간에 의해 작동 할 때보다 더 나은 데이터를 수집 할 수 있습니다.이 프로토콜을 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 수정 마운팅을 수행하고 대규모 에서 빔 시간을 요청합니다. 단백질 결정학 빔 라인 또는 ISPyB 웹 사이트에 대한 정보 시스템으로 이동합니다. MX 실험을 선택하고 실험 번호와 암호로 로그인합니다.발송물을 클릭하고 새 정보를 추가하고 필요한 정보를 제공합니다. 그런 다음 저장을 클릭합니다. 소포를 추가하고 요청된 정보를 입력합니다.저장을 클릭한 다음 컨테이너 추가를 클릭합니다. 퍽 바코드를 이름으로 주고 척추 퍽을 선택하고 다시 저장을 클릭합니다. 용기 심볼을 클릭하고 편집하고, 퍽에서 단백질 이름, 선호하는 작업 흐름 및 결정 위치와 같은 샘플에 관한 필요한 정보를 입력합니다.ESRF 안전 그룹에 의해 승인된 단백질을 선택하십시오. 고유한 샘플 이름을 입력하여 각 개별 샘플을 식별합니다. 선택적으로 핀 바코드를 스캔합니다.포함할 나머지 정보도 선택 사항입니다. 각 개별 샘플에 대해 실험 유형을 입력합니다. 이렇게 하면 각 수정을 처리하는 데 사용할 자동 워크플로우가 정의됩니다.GCSH 결정이 바늘임을 감안할 때 MX 프레스 P.Next를 선택하고 우주 그룹을 입력합니다. 있는 경우 데이터 수집 전략 계산과 사용 가능한 자동 데이터 처리 파이프 라인에 사용됩니다. 원하는 해상도를 입력합니다.이렇게 하면 초기 메시 스캔, 특성화 및 기본 데이터 수집에서 검출기 거리까지의 수정을 정의합니다. 이제 원하는 임계값 해상도를 설정하여 전체 데이터 집합이 이 제한으로 확산되지 않는 결정에서 전체 데이터 집합의 수집을 방지합니다. 이를 통해 데이터 저장 공간과 분석 시간을 절약할 수 있습니다.필요한 완전성을 설정합니다. 그런 다음 필요한 복합성을 설정합니다. 샘플 지지대에 두 개 이상의 결정이 포함되어 있는 경우 분석할 최대 결정 수를 설정합니다.기본 값은 MX 프레스 P.에 대해 하나 또는 5이며 적절한 빔 크기도 선택할 수 있습니다. 알려진 경우 힘 공간 그룹 열에 공간 그룹에 넣습니다. 그런 다음 결정의 방사선 감도를 설정합니다.원하는 경우 전체 데이터 집합 컬렉션에 대해 수집할 총 회전 각도를 설정합니다. 모든 정보가 시스템에 입력되면 값을 저장합니다. 클릭하고, 발송물으로 돌아가고, ESRF로 발송물을 누릅니다.배송 라벨을 인쇄하고 샘플을 보냅니다. 사용자는 ESRF 계정 세부 정보를 사용하여 택배로 픽업을 준비해야 합니다. 실험 당일, 샘플은 대규모 1대용량 이슬어로 전달됩니다.그런 다음 빔 라인 과학자들은 원격으로 사용자가 다음에 데이터 수집을 시작합니다. 서로 다른 샘플 유형에 대해 사용자는 데이터 수집이 시작되었다는 이메일을 받습니다. 모든 워크플로우의 모든 단계 실행을 온라인과 실시간으로 따를 수 있습니다.ISPyB에 로그인하여 사용자가 액세스할 수 있습니다. 결과를 보고 다운로드할 수도 있습니다. 분석된 각 샘플에 대해 ISPyB에서 자동 실험 결과를 검사합니다.ID30A1에서 원하는 실험 세션을 클릭합니다. 기본 자동 처리 파이프라인을 선택합니다. 가장 높은 완전성과 가장 높은 해상도로 올바른 공간 그룹에 기록된 데이터를 다운로드합니다.마지막 수집 결과를 클릭하 여 다음 다운로드합니다. MX 프레스 P 워크플로우는 ESRF 빔 라인 Massive One에서 X선 빔의 중앙에 완전히 장착하고, x선 빔의 중심을 지정하고, 인간 GCSH의 일련의 결정에서 전체 회절 데이터 세트를 수집하는 데 사용되었습니다. 샘플을 장착하고 루프가 스캔할 영역에 대해 분석되었습니다.회절 분석 후, 데이터 수집을 위해 결정 내에서 4개의 점을 선택했습니다. 분자 대체에 의한 수동 구조 결정은 단일 자동화 된 정제 주기 후에 고품질 전자 밀도 지도를 산출했습니다. 이 데이터 집합의 경우 자동화된 파이프라인은 1포인트 3개의 두 angstrom 해상도로 데이터를 잘라냅니다.그러나 사용자는 낮은 해상도로 데이터를 잘라내기로 결정할 수 있습니다. 연속 전자 밀도는 이단 히스티딘 태그와 는 별개로 전체 아미노산 사슬에 대해 볼 수 있습니다. 인간과 소 GCSH를 구별하는 4개의 대체체 중, 3개는 전자 밀도에서 쉽게 식별할 수 있습니다.이것은 125 치환에 아산산에 대한 덜 분명하다. 측면 체인의 전자 밀도는 유연성으로 인해 부분적으로만 해결됩니다. 현재 획득한 모델은 R 작업 가치가 20포인트 4%, R자유값은 23포인트 8%이며, 자동화 및 수동 모델 구축 및 개선의 추가 주기로 더욱 최적화할 수 있습니다.시스템에 대한 요구 사항을 조정하는 것이 중요합니다. 예를 들어 이미 관찰된 해상도를 알려진 값으로 설정하면 시간을 절약하고 더 나은 데이터 수집을 보장할 수 있습니다. 완전 자동 데이터 수집은 결정학을 민주화했으며 이제 는 작은 실험실조차도 거대한 인력으로만 이전에 가능했을 때 유명한 프로젝트에 착수 할 수 있습니다.

fully-autonomous-characterization-data-collection-from-crystals

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

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최소한의 배경 산란을 갖춘 거대 분자 X선 결정학을 위한 올인원 샘플 홀더

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시투 X선 회절 연구를 위한 미세 투약에 의한 칩에 단백질의 결정화

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헬름홀츠 젠트럼 베를린에서 결정화 조각 검사를 위한 워크플로우 및 도구

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그르노블의 EMBL HTX 시설의 자동 결정화 파이프라인

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온칩 결정화 및 실온에서의 대규모 연속 회절

당사는 Harwell의 Research Complex에 있는 결정화 시설을 사용하여 단백질의 결정화를 위한 프로토콜을 제시하고 Diamond의 Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) 빔라인에서 플레이트 내의 결정으로부터 후속 in situ X선 결정학 데이터 수집을 제시합니다. 시료 요구 사항, 결정화 프로토콜 및 데이터 수집 지침에 대해 설명합니다.

Harwell 및 Beamline VMXi의 결정화 시설을 사용한 결정화 및 현장 실온 데이터 수집, Diamond Light Source

학습하세요 단백질 결정학에서 동기가속기 빔라인을 활용한 완전 자동화 데이터 수집 방법을. ISPyB 시스템으로 생물학 고분자의 고품질 회절 데이터를 효율적으로 획득하고 분석하는 프로토콜입니다.

완전히 자치 특성화 및 생물학 고분자의 결정에서 데이터 수집

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