완전히 자치 특성화 및 생물학 고분자의 결정에서 데이터 수집
March 22nd, 2019
여기, 우리는 일부 싱크 로트 론 beamlines에 자동화 심사 및 사용할 수 있는 데이터 수집 옵션을 사용 하는 방법을 설명 합니다. 과학자는 싱크 로트 론 cryocooled 샘플 보내기 회절 속성은 상영, 데이터 세트는 수집 처리 그리고, 구조 솔루션은 실행 가능한-모든 인간의 개입 없이.
X선 결정학은 단백질로부터 3D 구조 정보를 결정하는 데 가장 큰 기술입니다. 싱크로트론 빔 라인은 단백질이 생성하는 작고 약하게 확산되는 결정으로부터 데이터를 얻기 위해 필요합니다. 거대한 빔은 생물학적 거대 분자로부터 데이터 수집 과정을 완전히 자동화하기 때문에 독특한 빔 라인입니다.
샘플 마운팅, 위치 및 최종 데이터 수집에서. 이러한 종류의 완전한 자동화는 연구원이 빔 라인에서 데이터를 수집하는 대신 실험실에서 시간을 보낼 수 있기 때문에 매우 중요합니다. 빔 라인은 또한 지능적이고 평균적으로 빔 라인이 인간에 의해 작동 할 때보다 더 나은 데이터를 수집 할 수 있습니다.
이 프로토콜을 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 수정 마운팅을 수행하고 대규모 에서 빔 시간을 요청합니다. 단백질 결정학 빔 라인 또는 ISPyB 웹 사이트에 대한 정보 시스템으로 이동합니다. MX 실험을 선택하고 실험 번호와 암호로 로그인합니다.
발송물을 클릭하고 새 정보를 추가하고 필요한 정보를 제공합니다. 그런 다음 저장을 클릭합니다. 소포를 추가하고 요청된 정보를 입력합니다.
저장을 클릭한 다음 컨테이너 추가를 클릭합니다. 퍽 바코드를 이름으로 주고 척추 퍽을 선택하고 다시 저장을 클릭합니다. 용기 심볼을 클릭하고 편집하고, 퍽에서 단백질 이름, 선호하는 작업 흐름 및 결정 위치와 같은 샘플에 관한 필요한 정보를 입력합니다.
ESRF 안전 그룹에 의해 승인된 단백질을 선택하십시오. 고유한 샘플 이름을 입력하여 각 개별 샘플을 식별합니다. 선택적으로 핀 바코드를 스캔합니다.
포함할 나머지 정보도 선택 사항입니다. 각 개별 샘플에 대해 실험 유형을 입력합니다. 이렇게 하면 각 수정을 처리하는 데 사용할 자동 워크플로우가 정의됩니다.
GCSH 결정이 바늘임을 감안할 때 MX 프레스 P.Next를 선택하고 우주 그룹을 입력합니다. 있는 경우 데이터 수집 전략 계산과 사용 가능한 자동 데이터 처리 파이프 라인에 사용됩니다. 원하는 해상도를 입력합니다.
이렇게 하면 초기 메시 스캔, 특성화 및 기본 데이터 수집에서 검출기 거리까지의 수정을 정의합니다. 이제 원하는 임계값 해상도를 설정하여 전체 데이터 집합이 이 제한으로 확산되지 않는 결정에서 전체 데이터 집합의 수집을 방지합니다. 이를 통해 데이터 저장 공간과 분석 시간을 절약할 수 있습니다.
필요한 완전성을 설정합니다. 그런 다음 필요한 복합성을 설정합니다. 샘플 지지대에 두 개 이상의 결정이 포함되어 있는 경우 분석할 최대 결정 수를 설정합니다.
기본 값은 MX 프레스 P.에 대해 하나 또는 5이며 적절한 빔 크기도 선택할 수 있습니다. 알려진 경우 힘 공간 그룹 열에 공간 그룹에 넣습니다. 그런 다음 결정의 방사선 감도를 설정합니다.
원하는 경우 전체 데이터 집합 컬렉션에 대해 수집할 총 회전 각도를 설정합니다. 모든 정보가 시스템에 입력되면 값을 저장합니다. 클릭하고, 발송물으로 돌아가고, ESRF로 발송물을 누릅니다.
배송 라벨을 인쇄하고 샘플을 보냅니다. 사용자는 ESRF 계정 세부 정보를 사용하여 택배로 픽업을 준비해야 합니다. 실험 당일, 샘플은 대규모 1대용량 이슬어로 전달됩니다.
그런 다음 빔 라인 과학자들은 원격으로 사용자가 다음에 데이터 수집을 시작합니다. 서로 다른 샘플 유형에 대해 사용자는 데이터 수집이 시작되었다는 이메일을 받습니다. 모든 워크플로우의 모든 단계 실행을 온라인과 실시간으로 따를 수 있습니다.
ISPyB에 로그인하여 사용자가 액세스할 수 있습니다. 결과를 보고 다운로드할 수도 있습니다. 분석된 각 샘플에 대해 ISPyB에서 자동 실험 결과를 검사합니다.
ID30A1에서 원하는 실험 세션을 클릭합니다. 기본 자동 처리 파이프라인을 선택합니다. 가장 높은 완전성과 가장 높은 해상도로 올바른 공간 그룹에 기록된 데이터를 다운로드합니다.
마지막 수집 결과를 클릭하 여 다음 다운로드합니다. MX 프레스 P 워크플로우는 ESRF 빔 라인 Massive One에서 X선 빔의 중앙에 완전히 장착하고, x선 빔의 중심을 지정하고, 인간 GCSH의 일련의 결정에서 전체 회절 데이터 세트를 수집하는 데 사용되었습니다. 샘플을 장착하고 루프가 스캔할 영역에 대해 분석되었습니다.
회절 분석 후, 데이터 수집을 위해 결정 내에서 4개의 점을 선택했습니다. 분자 대체에 의한 수동 구조 결정은 단일 자동화 된 정제 주기 후에 고품질 전자 밀도 지도를 산출했습니다. 이 데이터 집합의 경우 자동화된 파이프라인은 1포인트 3개의 두 angstrom 해상도로 데이터를 잘라냅니다.
그러나 사용자는 낮은 해상도로 데이터를 잘라내기로 결정할 수 있습니다. 연속 전자 밀도는 이단 히스티딘 태그와 는 별개로 전체 아미노산 사슬에 대해 볼 수 있습니다. 인간과 소 GCSH를 구별하는 4개의 대체체 중, 3개는 전자 밀도에서 쉽게 식별할 수 있습니다.
이것은 125 치환에 아산산에 대한 덜 분명하다. 측면 체인의 전자 밀도는 유연성으로 인해 부분적으로만 해결됩니다. 현재 획득한 모델은 R 작업 가치가 20포인트 4%, R자유값은 23포인트 8%이며, 자동화 및 수동 모델 구축 및 개선의 추가 주기로 더욱 최적화할 수 있습니다.
시스템에 대한 요구 사항을 조정하는 것이 중요합니다. 예를 들어 이미 관찰된 해상도를 알려진 값으로 설정하면 시간을 절약하고 더 나은 데이터 수집을 보장할 수 있습니다. 완전 자동 데이터 수집은 결정학을 민주화했으며 이제 는 작은 실험실조차도 거대한 인력으로만 이전에 가능했을 때 유명한 프로젝트에 착수 할 수 있습니다.
개요
이 기사는 단백질 결정학을 위한 동기 회절 빔라인의 자동화된 선별 및 데이터 수집 과정을 설명합니다. 완전 자동화된 시스템을 통해 연구자들은 인간의 개입 없이 극저온 샘플로부터 데이터를 효율적으로 수집하고 처리할 수 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 단백질 결정학
- X-ray 회절
- 데이터 수집 자동화
배경
- X-ray 결정학은 단백질 구조를 결정하는 데 필수적입니다.
- 동기 회절 빔라인은 약하게 회절하는 결정으로부터 데이터를 얻는 데 중요합니다.
- 자동화는 데이터 수집의 효율성과 품질을 향상시킵니다.
- Massive one 빔라인은 생물학적 거대분자에 대한 완전 자동화된 워크플로우를 제공합니다.
연구 목적
- 동기 회절 빔라인에서 자동화된 데이터 수집 과정을 시연합니다.
- 단백질 결정학에서 자동화의 이점을 강조합니다.
- 연구자들이 따를 수 있는 자세한 프로토콜을 제공합니다.
사용된 방법
- 샘플 장착 및 동기 회절 장치로의 배송.
- 실험 관리를 위한 ISPyB 정보 시스템의 활용.
- 자동화된 데이터 수집 및 처리 워크플로우.
- 데이터 수집 및 결과 분석의 실시간 모니터링.
주요 결과
- 인간 GCSH 결정으로부터 고품질 회절 데이터를 성공적으로 수집했습니다.
- 자동화된 처리는 고해상도 전자 밀도 맵을 생성했습니다.
- 인간과 소 GCSH 간의 구조적 차이를 식별했습니다.
- 결정학에서 자동화된 워크플로우의 효과를 입증했습니다.
결론
- 데이터 수집의 자동화는 결정학에 대한 접근을 민주화합니다.
- 소규모 연구실도 이전에는 대규모 시설에만 국한되었던 복잡한 프로젝트를 시작할 수 있습니다.
- 실험 파라미터를 조정하면 데이터 수집 효율성을 향상시킬 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Fully automated synchrotron beamlines reduce manual intervention in macromolecular crystallography, enabling high-throughput screening and data collection from weakly diffracting crystals. This automation enhances data quality and throughput, allowing biopharma R&D teams to allocate scientific effort toward target validation and lead optimization rather than beamline operations. The technology democratizes access to structural biology, supporting early-stage de-risking of therapeutic targets through reliable 3D structural insights.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by providing high-resolution structural data on biological macromolecules.
- Operational Value: Supports functional target validation through automated characterization and data collection from crystallization trials.
- Predictive Value: Increases confidence in target models by delivering consistent, high-quality electron density maps for structure-guided design.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated crystal systems for downstream workflows by automating mounting, centering, and diffraction analysis.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via predefined workflows and real-time monitoring through ISPyB.
- Scalability: Enables screening of large numbers of crystals and reuse of automated pipelines across projects.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage structural data to preclinical validation by providing reliable models for mechanistic studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by identifying structural differences between species variants, such as human and bovine GCSH.
- Mechanistic De-risking: Clarifies binding sites and flexibility, aiding in the interpretation of structure-activity relationships.
Pipeline & Workflow Integration
The automated beamline integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification, supporting data generation for downstream analytics and modeling.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by solving crystal structures of proteins and complexes.
- Screening: Delivers assay-ready systems with quantitative outputs such as resolution, completeness, and multiplicity for reliable compound evaluation.
- Analytics: Provides measurable readouts including R-work and R-free values, resolution cutoffs, and electron density maps to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects structural insights to preclinical continuity by enabling species-specific model refinement, as demonstrated with GCSH.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for structural screening across multiple targets, reducing dependency on site-specific expertise.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target models, reduction of mechanistic ambiguity, and support for structure-based drug design.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of data collection across samples and projects.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency through reduced beamline staffing, and lowered biological risk in lead selection.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on structural confidence and data quality metrics.
Implementation Considerations
- Expertise in protein crystallography and sample preparation is required for successful crystal mounting and characterization.
- Access to synchrotron facilities and instrumentation such as the Massive one beamline is essential for automated data collection.
- Standardization across teams requires consistent use of ISPyB for experiment tracking, workflow selection, and result retrieval.
- Adaptation across model systems involves adjusting parameters such as resolution thresholds, space group, and radiation sensitivity based on crystal properties.
- Practical limitations include the need for cryocooled samples and dependency on crystal quality, which affects automated workflow success rates.
