Name: 고체 및 혈액암 세포를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 T 세포를 위한 실시간 힘 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-12T10:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 학습하세요 xCELLigence 실시간 세포 분석을 활용한 CAR T 세포의 고체 및 혈액암 세포 대비 세포독성 평가 방법을. 이 기술은 면역 세포의 암 세포 살상 효능을 정량적으로 모니터링하여 다양한 면역 요법의 효과를 신속하게 스크리닝할 수 있습니다.

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저자는 이 연구에서 이용된 시약 및 기기를 제공한 ProMab 생명공학 및 ACEA 바이오사이언스에 감사드립니다.

1. CAR 인코딩 렌티바이러스 의 생성
참고: 특정 CAR T 세포 플라스미드 시공이 완료되면(CD47 등), 렌티바이러스 CA는 293FT 세포, 렌티바이러스 패키징 믹스 및 형질전환제(재료표 참조)를 사용하여 표준 절차에 의해 생성된다(재료표참조). 이어서, 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR) 키트 및 열 사이클러(재료 표참조)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 렌티바이러스 RNA 양을 측정하여 바이러스 역가를 결정한다. 모든 렌티 바이러스 절차는 안전 요구 사항을 엄격히 따르는 것이 중요합니다.
<ol><li>종자 15 x 106 HEK293FT 세포를 덜베코의 변형된 이글 배지(DMEM)에서 가습된 5%CO2 인큐베이터 내부에 150 mm 접시에 37°C에서 밤새 배양한다.</li>
	<li>형질감염 복합체로 15 mL 튜브 2개를 준비합니다. 제1 튜브는 2.5 mL의 트랜스펙션 희석 액에서 렌티바이러스 벡터 플라스미드 DNA(5 μg) 및 렌티바이러스 패키징 믹스(22.5 μg)를 함유하고 있다. 두 번째 튜브는 2.5 mL의 형질감염 정제 액에 82.5 μL의 형질감염 시약을 함유하고 있습니다(재료 표참조).</li>
	<li>튜브 1의 내용물 인 튜브 2를 피펫하고, 15 분 동안 실온에서 혼합물을 배양한다.</li>
	<li>튜브의 내용물방울을 HEK293FT 세포의 접시에 전달하고 가습된 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 밤새 샘플을 배양하였다.</li>
	<li>다음날, 기존 배지를 신선한 DMEM 배양 배지의 19 mL로 대체하고 37°C에서 가습된 5%CO2 인큐베이터 내부에서 밤새 세포를 배양하는 것을 계속한다.</li>
	<li>접시에서 50 mL 원심 분리튜브로 매체를 옮김을 옮김. 냉장고에 바이러스가 함유 된 매체로 튜브를 보관하십시오.</li>
	<li>위의 절차를 반복하여 신선한 DMEM을 추가하고 1 일 후에 다시 수집하십시오.</li>
	<li>하나의 원심 분리튜브에 미디어의 두 컬렉션을 결합합니다. 4 °C에서 30 분 동안 2,000 x g에서 튜브를 원심 분리합니다.</li>
	<li>렌티바이러스함유 상층의 대부분을 초투명 원심분리관으로 옮니다. 세포 및/또는 파편을 포함할 수 있는 펠릿을 방해하지 않도록 상급물질의 최소 부피,약 1 mL를 남겨두십시오.</li>
	<li>상기 초음파 원심분리기는 4°C에서 100분 동안 110,000 x g에서 상급을 명확히 하였다.</li>
	<li>상급체를 조심스럽게 제거하고 튜브 바닥의 바이러스 펠릿에 DMEM 배지 100 μL을 부드럽게 추가합니다. 튜브를 얼음 위에 15분 동안 두십시오. 용액을 부드럽게 섞고 렌티바이러스 용액을 미리 냉장 멸균 튜브에 넣습니다. 이러한 바이러스 스톡 튜브를 -80°C 냉동실에 보관하십시오.</li>
	<li>렌티바이러스 RNA를 추출하고 측정하는 제조업체의 프로토콜에 따라 정량적 RT-PCR 키트를 사용하여 렌티바이러스의 적규자를 결정합니다.</li>
</ol>2. CAR T 세포의 생성 및 확장
<ol><li>이전에 냉동된 인간 PBMC(약 1 x 106 ~ 2 x 106 세포)를 동일한 수의 CD3/CD28 코팅 마이크로비드로 CAR T 세포 배지의 1mL에서 활성화하고 24시간 동안 가습된 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 세포를 배양합니다. </li>
	<li>얼음에 렌티 바이러스 주식의 알리쿼트해.</li>
	<li>1 μL의 트랜스덕션 강화제를 세포와 함께 우물에 넣고 섞는다.</li>
	<li>5:1의 감염(MOI)의 복합성에서 세포에 렌티바이러스를 추가하고 부드럽게 섞는다. 다음 날이 단계를 반복하십시오 (첫 번째 변환 후 24 시간).</li>
	<li>2-3일마다 T 세포 성장을 모니터링한다. 1 x 10 6 ~ 2x 106 셀 /mL의 밀도로 세포를 유지하기 위해 신선한 CAR T 세포 배지를 더 추가하십시오.</li>
	<li>동결 용액을 사용하여 표준 프로토콜로 CAR T 셀을 동결합니다(재료 표참조).</li>
	<li>표준 방법을 사용하여 CAR T 세포를 해동하고 분석법에 적용하기 전에 IL-2 (300 단위/mL)로 약 2-4 시간 동안 CAR T 세포 배지에서 이를 배양합니다.</li>
</ol>3. 유세포측정에 의한 CAR 발현 검출
<ol><li>3 x 105 CAR T 세포와 비트랜스듀싱 T 세포를 2개의 분리된 1.5 mL 마이크로원지 튜브로 옮김.</li>
	<li>튜브를 300 x g에서 2분 동안 원심분리하고 1% 인간 혈청을 함유하는 형광 활성화 세포 선별(FACS) 완충액의 200 μL에서 세포를 재중단한다.</li>
	<li>5 mL 폴리스티렌 FACS 튜브 2 개에 셀 용액의 파이펫 100 μL을 넣고 튜브를 얼음 위에 5 분 동안 유지하십시오.</li>
	<li>각 세포 유형의 1 개의 튜브에 1 μL의 생체 생물 염소 항 마우스 F (ab')를 추가합니다. 그런 다음, 각 세포 유형의 다른 튜브에 PE 표지 된 항 태그 항체 2 μL을 추가합니다 (재료 표참조). 잘 섞어서 30분 동안 얼음위에 배양합니다.</li>
	<li>각 튜브에 FACS 버퍼의 3 mL로 세포를 세척하고 5 분 동안 300 x g에서 튜브를 원심 분리; 초자연적 인 와류를 매우 짧게 버리거나 튜브를 잠시 흔들어 잔류 액체의 세포를 다시 중단시하십시오.</li>
	<li>각 튜브에 APC 항 CD3 2 μL과 7-AAD 항체 용액 2 μL을 추가합니다(재료 표참조). 안티 F (ab')2 Ab로 염색 된 세포의 튜브에 PE 표지 된 스트렙타비딘 1 μL을 추가합니다. 잠깐 섞어서 30분 더 얼음에 튜브를 배양합니다.</li>
	<li>FACS 버퍼를 사용하여 단계 3.5에 설명된 대로 세포를 다시 세척하고 각 튜브에 FACS 버퍼의 200 μL을 추가합니다.</li>
	<li>유세포 분석기를 사용하여 전방 산란 대 측면 산란 플롯에서 T 셀을 먼저 게이팅한 다음 CD3 대 7-AAD 플롯에서 라이브 셀(7-AAD-음성)을 게이팅하여 세포를 분석합니다. 마지막 단계는 안티 태그, 안티 ScFv 또는 안티 F (ab')2 대 CD3를 분석하는 것입니다.</li>
</ol>4. 실시간 세포용해 효능 분석
참고: 제조업체의 권장 조건에 따라 RTCA 분석 작업을 수행합니다. 간단히 말해서, 먼저 E-플레이트의 우물에서 표적 세포를 플레이트하고, 다음날 CAR T 세포를 첨가하였다. 표적 세포에 대한 CAR T 세포의 세포용해 활성은 실시간으로 모니터링된다. T 세포 및 모의 변환 T 세포 (모의 CAR T 세포)는 음성 이펙터 셀 컨트롤로 사용됩니다. 다음 프로토콜은 부착성 종양 세포전에 대한 시험관내 실시간 세포용해 효능 분석기를 기술한다.
<ol><li>xCELLigence E-Plate의 각 웰에 표적 세포 배양 배지 100 μL을 추가하고, xCELLigence 계측기 내부에 플레이트를 놓고, 배경 판독을 합니다. 이어서, E-플레이트를 세포 파종을 위한 조직 배양 후드로 옮김을 전달한다.</li>
	<li>표준 프로토콜을 사용하여 배양 장치에서 표적 암세포를 시도합니다. 그런 다음 세포를 15 mL 원심분리기로 옮기고 신선한 배양 배지를 최대 15 mL까지 추가합니다. 200 x g에서5 분 동안 원심 분리에 의해 세포를 펠렛. 상한자를 버리고 신선한 배지 5 mL를 추가하고 혈청 학적 파이펫을 사용하여 세포 펠렛을 부드럽게 다시 놓습니다. 혈세포계와 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 밀도를 계산합니다.</li>
	<li>세포 밀도를 적절히 조정한 다음 E-플레이트의 각 웰에 100 L의 셀 현탁액을 추가합니다. 표적 세포 수는 일반적으로 부착 세포주 (BxPC3, Hela-CD19 및 SKOV3)에 대한 약 10,000 개의 세포 / 웰 또는 Raji와 같은 현탁액 세포의 30,000 세포 / 웰 (액체 암 세포를 묶기 위해 항체가있는 사전 코팅 우물에 대한 자세한 내용은 아래 참조)입니다.</li>
	<li>실온에서 E-Plate를 30분 동안 평형화하여 세포가 우물 바닥에 고르게 정착할 수 있도록 합니다(이것은 매우 중요하며 이 단계를 건너뛰지 마십시오).</li>
	<li>E-플레이트를 세포 배양 인큐베이터 내부의 xCELLigence 계측기에 넣고 임피던스를 측정하기 시작하여 세포 지수 대 시간으로 표시되며, 자동으로 15분마다 표시됩니다.</li>
	<li>다음날, 이펙터 CAR T 세포를 준비한다. 모든 셀이 동시에 준비되었는지 확인하기 위해 적절한 컨트롤(예: Mock CAR T 셀, 비변환 제어 T 셀 및/또는 관련없는 CAR T 셀)을 미리 준비해야 합니다. 이펙터 셀과 대조군 셀을 적절한 밀도로 조정하고, 9단계에서 각각의 웰에 100 μL의 이펙터 셀 현탁액이 첨가될 때 원하는 E:T 비율이 달성될 수 있도록 직렬 희석을 준비한다.</li>
	<li>xCELLigence 데이터 수집을 일시 중지하고 인큐베이터로부터 세포 배양 후드로 E-플레이트를 가져온다.</li>
	<li>각 우물에서 배지 100 μL을 제거합니다. 각 웰의 잔류 배지의 양은 이제 100 μL입니다.</li>
	<li>100 μL의 직렬 희석 이펙터 CAR T 셀 또는 다른 제어 셀(즉, 모의 CAR T 셀)을 추가하여 원하는 E:T 비율을 달성합니다.</li>
	<li>이펙터 세포가 침전될 수 있도록 실온에서 E-플레이트를 30분 동안 평형화한 다음 E-Plate를 다시 xCELLigence 계측기에 넣습니다. 데이터 수집을 다시 시작합니다.</li>
	<li>이렇게 원하는 경우, 주요 시점에서 xCELLigence 데이터 수집은 직교 분석(즉, ELISA 또는 유세포측정에 의한 사이토카인 생산 측정)에 의해 분석되는 작은 샘플을 수집하기 위해 일시 중지되고 플레이트를 제거할 수 있다.</li>
	<li>EGFR-GITR-CD3 CAR T 세포 실험에서 ELISA 키트로 INFγ 수율을 측정합니다(제조업체의 지시에 따라; 재료 표참조). 액체 암의 사용에 관하여 참고: 비 부착혈액암 세포를 시험하기 위하여, 세포를 추가하기 전에 E-Plate의 우물은 암세포의 표면에 표현되는 항원에 특정한 항체로 먼저 코팅됩니다. 라지 B 세포주의 경우 항 CD40에 기초한 테더링 시약이 사용된다(재료표에서액체 종양 살해 분석 키트 참조). 다음은 플레이트 코팅 절차입니다.</li>
	<li>테더링 버퍼로 테더링 시약(안티-CD40)을 4 μg/mL의 농도로 희석합니다.</li>
	<li>조직 배양 후드 내부에서 작업하여, 희석된 테더링 시약의 50 μL을 E-플레이트의 각 웰에 첨가한다. E-플레이트를 실온 또는 37°C 인큐베이터에 3시간 동안 둡니다.</li>
	<li>테더링 시약을 제거하고 세척 버퍼로 E-Plate를 2x 이상 세척합니다. 이 시점에서, E-플레이트는 라지 표적 세포(30,000세포/웰)를 시드할 준비가 되어 있다.</li>
	<li>4.1 단계 (위)를 계속하여 절차의 나머지 부분을 수행하십시오.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 CAR T 세포 발달과 ProMab 생명 공학 및 ACEA 생명 과학의 사업 관심사인 관련 효능 검소에 있는 연구를 각각, 수행합니다. 그러나, 이것은 과학적 지식의 보급을 증가 조브의 사명에 저자의 준수를 변경하지 않습니다. 이 간행물의 조건은 연구 정책에 따라 ProMab 생명 공학 및 ACEA 바이오 사이언스에 의해 검토되고 승인되었습니다.

키메라 항원 수용체는 세포외 단일 사슬 가변 단편(scFv region), 힌지 영역, 막막 영역 및 CD28 및 OX4011,40과같은 수용체로부터의 TCR 신호 도메인 및 추가의 코스매 도메인으로 구성된 세포질 도메인으로 구성된 다중 도메인 단백질이다. 안전하고 선택적이며 효과적인 CA를 설계하려면 CA의 설계에서 다양한 순열을 시험관 내 효능 검사와 결국 동물 모델을 사용하여 철저히 테스트해야 합니다. 본 연구에서, 우리는 생체외 내 힘 분석이 효과적인 CAR의 설계를 어떻게 알릴 수 있는지에 대한 프로토콜 및 워크플로우를 제공했습니다.
모든 유형의 효능 분석, 특히 제조 목적을 위해, 분석이 민감하고, 견고하고, 일관되고, 가능한 한 작용 메커니즘에 가깝게 하는 것이 필수적이다16,17,41. 여기서 기재된 실시간 효능 분석은 사이토카인 방출과 같은 대리 마커를 사용하는 대신 CAR T 세포의 세포용해 활성을 직접 측정하도록 설계된다. 중요한 것은, 분석법은 세포 유지를 위한 권장 매체 및 분석판(E-Plate) 이외의 염료 또는 시약과 같은 임의의 추가 성분을 필요로 하지 않는다. 또한, 이 분석법은 정교하게 민감하며 다른 라벨 기반 분석제42,43,44에비해 매우 재현성이 높은 데이터를 제공한다. 더욱이, xCELLigence 분석은 특정 세포용해의 평가에 이상적인 매우 낮은 이펙터 대 표적 비율을 사용할 수 있다.
xCELLigence 시스템의 유연성과 유용성을 입증하기 위해, 우리는 혈액 학적 기원과 고형 종양의 두 가지 종양 유형, 즉 종양에 초점을 맞추지 않았습니다. CD22-지시 CAR T 세포의 효능을 평가하기 위해, 라지 세포(즉, B 세포 림프종 세포주)는 항 CD40 항체를 사용하여 E-플레이트에 테더를 체재하였다. E-플레이트의 바닥에 Raji 세포의 테더링은 우물에서 라지 세포의 생존력과 수를 반영하는 임피던스 신호를 초래합니다. CD22-CAR T 세포의 첨가에 따라, 라지 세포는 시간-및 이펙터 의존적 방식으로 선택적으로 살해되고, 임피던스 신호의 시간 의존적 감소로 절정에 이르렀다. 임피던스의 하락은 라지 세포의 세포용해 또는 생존력의 상실을 의미합니다17. 항체를 이용한 이러한 선택적 테더링 접근법은 다른 액체 종양 세포주까지 확장될 수 있다. 혈액학적 기원의 종양 세포주를 사용하는 대안전략은 HeLa 세포에서 발현되는 CD19와 같은 종양 항원을 안정적으로 발현하도록 설계된 부착암세포를 사용하는 것이다. 이 접근법의 장점은 부모 HeLa 세포를 쉽게 사용할 수 있으며 특이성에 대한 부정적인 대조군으로 사용할 수 있다는 것입니다. 이러한 접근법은 이미 CHO-CD22 대 CHO 세포 및 CHO-BCMas 대 CHO 세포29로검증되었습니다. 이러한 다양한 접근법을 사용하여 CAR T 세포 설계 및 효능을 쉽게 테스트할 수 있습니다. xCELLigence 분석은 본질적으로 유연하며, 분석 조건은 생리적 조건을 최대한 근사화하기 위해 조정할 수 있습니다.
우리가 여기에서 기술한 힘 분석의 1개의 중요한 이점은 간단한 기능적인 분석이고 높은 처리량 방식으로 최적이고 효과적인 CA를 디자인하기 위하여 유전 공학 기술과 함께 사용될 수 있다는 것입니다. EGFR 양성 암세포를 표적으로 하도록 설계된 CAR T 세포에 대해 여기에서 도시된 바와 같이, 분석은 상이한 CAR 구체/돌연변이체의 상대적 활성을 평가하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, GITR 도메인이 CD3 도메인의 상류에 위치할 때 CD3 도메인의 다운스트림에 위치할 때보다 훨씬 더 강력한 세포 용해 활성을 나타낸다는 것을 보여 주었다.
생체 내 CAR T 세포 활성과 완벽하게 상관관계가 없지만, 시험관내 사이토카인 방출은 역사적으로 CAR T 세포 효능의 척도로 사용되어 왔다. 여기에 기술된 xCELLigence 기반 효능 분석실험은 제조 중 또는 임상 적용을 위해 출시되기 전에 세포 기반 요법을 평가하는 데 사용될 수 있지만, 이러한 결과가 생체 내 효능과 얼마나 잘 연관되어 있는지는 아직 확인되지 않았습니다. 설립. 생체 내 효능은 시험관 내 분석기 내에서 재capitulated 수 있습니다 요인 및 변수의 호스트에 따라 달라 집니다. 이러한 변수는 종양부위에 CAR T 세포의 호밍, CAR T 세포의 자극 및 활성화 및 환자 내에서 지속되는 능력, 및 종양 미세환경 등을 포함한다. 추가 정제와 함께 xCELLigence 분석시험은 시험관내에서 이러한 복잡한 프로세스중 일부를 모델링할 수 있을 수 있다.
여기에 제공된 프로토콜은 대부분의 부착암 세포주 및 일부 액체 종양 세포주에도 적용됩니다. 1 차적인 암세포와 같은 임상 견본은, 그러나, 종양 모형 및 단계의 복잡성 때문에 추가 시험되고 최적화될 필요가 있습니다. 여기에 기술된 시험관내 효능 분석 시스템은 CAR T 세포의 잠재적 인 활성을 반영하기 위해암 세포주를 사용한다는 점은 확실히 주목할 가치가 있다. 인체 내부의 실제 종양 상황은 동적 종양 환경 및 발달로 인해 고형 종양이 표적으로 삼을 때 특히 훨씬 더 복잡합니다. 따라서, 효능 평가 결과는 시험된 CAR T 세포의 임상적 효능으로 매우 잘 번역되지 않을 수 있다.
요약하면, 제시된 임피던스 기반 xCELLigence 플랫폼은 장기간, 즉 최대 10일 동안 세포 살멸을 라벨이 없는 모니터링을 가능하게 합니다. 데이터 수집을 위한 이러한 긴 시간적 규모의 이 용량은 현재 사용 중이며 시간 포인트 수집 및 까다로운 샘플 조작을 위해 여러 실험 복제를 설정해야 하는 다른 분석실험과 기술을 차별화합니다. 또한, 이펙터 면역 세포의 최소한의 신호 기여도는 데이터 분석을 단순화합니다. 이 소프트웨어는 자동으로 데이터를 처리하고 세포 분석, KT50 등의 비율과 같은 유용한 매개 변수를 생성 할 수 있습니다. 이 기술은 이미 높은 감도(E:T 비율이 1:20이하)와 다른 분석에서는 쉽게 달성할 수 없는 높은 다이나믹 레인지(E:T 비율이 20:1~1:20)를 입증했습니다. 전반적으로, 이 기술의 구현은 CAR T 세포 시약의 개발을 향상시키고 훨씬 더 높은 속도로 분야를 발전시킬 더 높은 처리량 척도에 대한 보다 정확한 데이터 분석을 허용해야 합니다.

최근 몇 년 동안, CAR T 세포 치료는 재발 및 난치성 조혈 악성 종양에 대한 암 면역 요법에서 가장 눈에 띄는 돌파구 중 하나되었습니다. 최근 미국 식품의약국(FDA)이 급성 림프구성 백혈병에 대한 CD19 지향 CAR T 세포의 승인을 받아, 비-호지킨 림프종, 확산 큰 B 세포 림프종, 및 B 세포 성숙 항원 (BCMA)에 대한 획기적인 치료의 지정은 다발성 골수종에 대한 연구 CAR T 세포를 지시, 이 기술은 과학 계에서 큰 흥분을 생성하고 수많은 기초, 적용, 전 세계적으로 임상 연구1,2,3, 4,5. 2019년 1월, 700개 이상의 임상시험이 임상시험 데이터베이스에 등록되었다(clinicaltrials.gov); 이 예심의 대략 450는 시작하거나 적극적으로 환자를 모집하고 있었습니다. 대부분의 임상시험은 혈액학적 악성종양에 초점을 맞추고 있으며, CD20, CD22 및 BCMA를 표적으로 하는 CAR T 세포를 이용한 임상 시험은 CD19 이외에진행중이며,6,7. 대부분의 임상시험이 자가 CAR T 세포 요법을 사용하고 있지만, 이들 중 상당수는 또한 알로겐성 CAR T 세포8,9,10의유용성을 탐구하고 있다. 혈액학적 악성종양으로 유망한 결과에도 불구하고, 고형 종양을 표적으로 하는 CAR T 세포의 사용은 종양에서 독점적으로 발현되는 좋은 표적의 부족, 고형 종양 및 종양의 이질성 "탈출", 및 CAR T 세포가 종양 미세환경에접근하는 데 있어 어려움을 포함하되 이에 한정되지 않는 다양한 이유로 클리닉에서 훨씬 더 어렵다는 것이 입증되었습니다11, 11, 10, 10 15.효능에 대한 이러한 장벽을 극복할 수 있는 고형 종양 특이적 CAR T 세포의 개발과 "표적-오프 종양" 독성의 문제점에 대한 중요한 필요성이 있다. CAR T 세포의 설계 및 시험에서 다수의 생체외 및 생체내 접근법이 보증되는 반면, 강력하고 예측적인 시험관 내 효능 분석법은16,17의주요 중요성이다.
CAR T 세포의 효능을 평가하기 위해, 다양한 시험관 내 방법이 개발되었다. 일반적으로, 이들 효능 분석제는 표적 종양 세포에 대해 CART 세포의 세포용해 활성을 직접 측정하는지 여부에 따라 2개의 광범위한 범주로 나눌 수 있거나, 또는(ii)표적 세포를 죽이면서 CAR T 세포에 의해 방출되는 사이토카인과 같은 대리 마커를 측정한다. 세포용해 활성을 직접 측정하는 기술은 크롬-51 방출 분석법(CRA)18,형광 프로브19,20및 세포사멸 세포세포를 검출하는 유세포분석법을 이용하여 표적 세포의 세포사멸을 측정하는 영상기반 분석법(21)을 포함한다. 이 측정결과에서, CAR T 세포는 전형적으로 방사성 또는 형광 탐사선으로 미리 표지된 표적 세포와 공동 배양되고, 적절한 측정이 뒤따랐다. 민감성 으로 인해 오랫동안 이 분야의 금 본위제로 간주되었지만 CRA에는 몇 가지 단점이 있습니다. 첫째, 종점 분석이며 운동 정보를 제공하지 않습니다. 둘째, 표적 세포는 혈전에서 침출되는 경향이 있고 배경잡음(22)을현저하게 증가시킬 수 있는 크롬-51로 표지될 필요가 있다. 마지막으로, 방사성 폐기물의 적절한 예방 조치와 폐기가 필요합니다. 힘의 표시로 표적 세포와 CAR T 세포 상호 작용의 부산물을 측정하는 대체 분석실험은, 유동 세포 분석 기지를 둔 방법 또는 효소 연결된 면역 흡착 분석약을 사용하여 CAR T 세포에 의해 풀어 놓인 각종 사이토카인의 양을 포함합니다. 다시 한번, 이들은 주어진 시점에서 사이토카인의 누적 방출을 측정하는 종점 분석이며, 따라서, 반드시 CAR T 세포의 실제 세포 분석 활성을 반영하지 않을 수 있다.
특히 CAR T 세포와 같은 세포 기반 치료에 대한 방출 기준을 정의하는 효능 분석법, 특히 모든 상호 작용이 고려되어야 할 또 다른 변수이기 때문에 분석이 최소한의 조작과 실습 시간을 수반하는 것이 중요하며 분석의 전반적인 견고성과 일관성을 감소시킬 수 있습니다. 더욱이, CAR T 세포와 종양 세포의 상호작용은 역동적인 과정이며, 세포용해의 속도와 같은 이러한 동적 상호작용에 대한 정보를 제공하는 것은 효능 평가를 위한 일차적으로 중요하다. 이러한 기준을 염두에 두고 xCELLigence 실시간 세포 분석(RTCA) 플랫폼을 활용하는 CAR T 세포에 대한 무표지 운동 효능 분석을 개발했습니다. xCELLigence는 각 우물의 바닥에 내장 된 금 바이오 센서를 포함하는 특수 마이크로 티터 플레이트 (E-플레이트)를 사용합니다. 특정 항체를 사용하여 테더된 고형 종양 세포 또는 액체 암 세포중 하나를 사용하여 작업하는 이러한 바이오센서는 표적 세포 수, 세포 크기, 세포 기질 부착 강도 및 세포 세포 상호작용(즉, 장벽 기능)의 실시간 CAR T 세포 유발 변화를 모니터링합니다17,23,24,25,26,27, 28. 워크플로우가 간단하고 단순히 대상 세포를 E-플레이트의 웰에 시드한 다음, 다른 이펙터 대 표적 비율로 CAR T 셀을 추가합니다(그림1). 그 후, 바이오센서가 표적 세포의 생존 가능성을 지속적으로 모니터링함에 따라 데이터는 실시간으로 자동으로 표시됩니다.
지난 15년 동안 xCELLigence 분석은 자연킬러(NK) 세포, T 세포, CAR T 세포, 체크포인트 억제제, 이중 특이적 항체, 온용해 바이러스 및 일부 조합 요법17,29,30,31,32,33,34의효능을 평가하기 위해 검증되었다. 최근, xCELLigence 효능 분석제는 T 세포 수용체(TCR)를 제조하기 위해T 세포(35)를 설계한 것으로 평가되었다. 여기에서 우리는 임상 치료에서 고형 종양 및 액체 종양을 표적으로 하기 위하여 디자인된 CAR T 세포의 시험관 내 힘을 평가하기 위한 RTCA 시스템을 채택하는 것을 보고합니다.

<table><tbody><tr><td>7-AAD</td><td>Biolegend</td><td>420404</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD40, 액체 종양 사멸 분석 키트</td><td>ACEA Biosciences</td><td>8100005</td><td></td></tr><tr><td>anti-human F(ab')2</td><td>Jackson Immunoresearch laboratories.</td><td>109-116-088</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-CD3</td><td>Biolegend</td><td>317318</td><td></td></tr><tr><td>분석 매체 RPMI1640</td><td>생명 기술. Corp</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>CAR-T 세포 동결 용액 CryostorCS10</td><td>Stemcell Technologies</td><td>#07930</td><td></td></tr><tr><td>CAR-T 세포 배지 ProMab의</td><td>AIM-V+300IFU/ml IL-2</td><td>12055-091</td><td></td></tr><tr><td>CD3/CD28 코팅 마이크로비드, Dynabeads</td><td>Thermofisher</td><td>11131D</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GElifesciences.com</td><td>SH30243.02</td><td></td></tr><tr><td>FACS 버퍼</td><td>Promab made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td></td><td>Lonza.com 14-503F</td><td></td></tr><tr><td>HEK293FT</td><td>Thermo Fisher</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>INFg ELISA 키트</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>렌티바이러스 패키징 믹스</td><td>시스템 Biosciences</td><td>VP100</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-X 정량 RT-PCR 적정 키트(클론텍)</td><td>Takara</td><td>631235</td><td></td></tr><tr><td>Promab 세포주</td><td></td><td></td><td>에 따라 다양한 배지</td></tr><tr><td>Real time Cellular Analyer</td><td>ACEA Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermal cycler</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transduction enhance agent, Virus Transduction Enhancer (Alstem)</td><td>Transplus, Alstem</td><td>V020</td><td></td></tr><tr><td>Transfection dilution solution, Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>트랜스펙션 시약, NanoFect 시약</td><td>Alstem</td><td>NF100</td><td></td></tr></tbody></table>

고체 및 혈액암 세포를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 t 세포를 위한 실시간 힘 분석

A Real-time Potency Assay for Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Solid and Hematological Cancer Cells

키메라 항원 수용체 (CAR) 암을 위한 T 세포 치료는 유년기 급성 림프구성 백혈병과 같은 저항성 및 불응성 혈액학적 악성종양에 대한 중요한 임상 적 이점을 달성했습니다. 노력은 현재 다른 혈액 암 이외에 고형 종양에 이 유망한 치료를 확장하기 위하여 진행되고 있습니다. 여기에서, 우리는 고체 및 액체 종양 세포에 고유하거나 우선적인 발현을 가진 항원을 표적으로 하는 강력한 CAR T 세포의 발달 그리고 생산을 기술합니다. 이들 CAR T 세포의 시험관내 효능은 고과열임제 기반 xCELLigence 분석기를 사용하여 실시간으로 평가된다. 구체적으로, 글루코코르티코이드 유도 종양 괴사 인자 수용체(TNFR)-관련 단백질(GITR)과 같은 상이한 코스티뮬레이션 신호 도메인의 영향을 CAR T 세포의 시험관 내 효능에 대한 검사를 받는다. 이 보고는 lentiviral 유전자 전혈을 사용하여 전임상 연구를 위한 CAR T 세포를 생성하고, CAR T 세포를 확장하고, CAR 발현을 유효하게 하고, xCELLigence 힘 분석실험을 실행하고 분석하는 프로토콜을 포함합니다.

CAR 렌티바이러스 제제 및 CAR T 세포 생성 및 효능 평가 CAR 렌티바이러스 제제의 적시하는 적시하는 제조사의 프로토콜에 따라 정량적 RT-PCR 키트(재료 표참조)를 사용하여 결정하였다. 적정 프로토콜은 바이러스 RNA를 먼저 추출한 다음 렌티바이러스 RNA 카피 수를 측정하여 감염성 바이러스 입자의 양을 나타냈다. 위의 프로토콜을 사용하여 하나의 150mm 접시에서 생성 된 바이러스의 기종은 일반적으로 109-10바이러스 사본 / mL 사이의 범위. 도 2A는 대표적인 정량적 PCR 결과로부터의 RT-PCR 사이클 수 와 신호 강도를 나타낸다. 일단 바이러스 품질이 만족되면, 역가가 1 x 108 pfu/mL보다 클 때, 후속 T 세포 전염을 위해 동결되었다. CAR T 세포를 렌티바이러스로 환전한 후, T 세포를 추가로 12-14일 동안 배양하고, 그들의 밀도를 1 x 106 대 2 x 106 세포/mL 로 유지하였다. CAR T 세포는 다운스트림 적용 전에 유동 세포계를 사용하여 항 ScFv 특이적 항체로 검사하거나 아래로 동결하였다. 양호한 일괄 처리 결과는 그림 2B에나와 있습니다. 항-ScFv 항체를 사용하여, CAR T 세포의 약 50%가 양성(Q2 50.6% 대 T 세포 1%)을 염색하여 T 세포의 약 50%에서 CAR의 발현을 나타낸다. 이어서, RTCA 효능 분석기는 CAR T 세포의 각 배치가 동결되고 향후 적용을 위해 준비되기 전에 세포 분해 측정을 위해 수행되었다. CAR T 세포 설계, 생성 및 평가 절차의 1주기는 약 1 달이 걸렸습니다.
CD22-CAR T 세포에 의한 라지 림프종 B 세포 살해 항-CD40 액체 종양 테더링 키트(재료 표참조)를 37°C에서 3시간 동안 E 플레이트를 코팅하기 위해 4 μg/mL의 농도로 사용하였다. 테더링 버퍼로 웰을 세척한 후, B 세포 림프종 세포를 30,000 개의 세포 /well의 밀도로 E-Plate에 첨가하였다. 세포가 30분 동안 정착하도록 허용한 후 E-플레이트를 xCELLigence 계측기 내부에 다시 배치하고, 임피던스 판독을 즉시 개시하여 세포 부착 및 증식을 포착하였다. 다음 날, CD22-CAR T 세포, 모의 CAR T 세포 또는 비트랜스듀스 T 세포를 첨가하였다. 도 3에서,E:T 비율은 모든 세포 유형에 10:1로 사용되었다. CD22-양성 라지 세포는, CD22-CAR T 세포로 처리된 음성 대조군(비트랜스듀싱 T 세포 및 모크 CAR T 세포)에 비해 유의한 사살(녹색 흔적)을 나타냈다.
CD47-CAR T 세포에 의한 췌장암 세포의 효과적인 살해 CD47은 면역글로불린 슈퍼패밀리의 막 횡단 표면 당단백질이다. 인테그린 관련 단백질로서, 혈액학적 암(백혈병, 림프종 및 다발성 골수종) 및 고형암(난소, 소세포 폐암, 췌장, 아교모세포종 등) 및 기타 유형의 암36,37에서고도로 발현된다. CD47은 대식세포에 대한 먹지 않는 신호로도 알려져 있으며, 이는 일부 암에서 잠재적인 치료 대상이 되었습니다. CD47-CAR T 세포는 CD4738,39의높은 수준을 발현하는 BxPC3 췌장암 세포에 대해 생산 및 시험하였다. BxPC3 세포는 1일째에 E-Plate에서 10,000개의 세포/웰의 밀도로 시드하였다. 실시간 모니터링은 이들 세포가 16시간 후에 합의에 도달한 것으로 나타났다. 이 시점에서, CAR T 세포는 10:1의 E:T 비율로 첨가되었다(도4A). 비트랜스듀덕트 세포 및 모의 CAR T 세포와 같은 제어 이펙터 세포도 첨가하였다. 결과는 CD47-CAR T 세포가 표적 BxPC3세포(29)를선택적으로 죽인다는 것을 명확하게 보여준다. 또한, 도 4B는 CD47-CAR T 세포가 빈 웰에 첨가될 때 임피던스 신호가 표적 BxPC3 셀에 의해 생성된 임피던스 신호보다 실질적으로 낮다는 것을 보여준다. CD47-CAR T 셀만 있는 웰의 셀 인덱스 값은 최대 0.14에 도달했으며, 이는 중간 신호(0.02)보다 약간 높습니다. 이것은 이종 적인 살인 분석에서, 임피던스 신호가 표적 암세포로부터 거의 독점적으로 유도된다는 것을 나타낸다.
GITR 도메인에 의한 CAR T 세포의 비용 합산 EGFR-GITR-CD3 CAR에서 발현될 때, GITR 코스티멀링 도메인은 EGFR 양성 SKOV3 암세포의 살해를 향상시키기 위해 이전에 보고되었으나 EGFR 음성 MCF-7암세포(30)는그렇지 않다. GITR 도메인의 역할을 더 명확히 하기 위해, 전체 길이 GITR 도메인을 포함하는 CAR 구문, 또는 도메인의 삭제 또는 재배열된 버전을 포함하는 CAR 구문은 CAR T 세포를 재활성화하는 능력에 대해 생성및 테스트하였다(도5A). 도 5B,C의 xCELLigence 데이터는 GITR 코스티뮬레이션 도메인이 GITR 도메인이 결여된 원래 CAR 구문으로 관찰되는 것 이상의 EGFR 양성 표적 세포의 CAR T 세포 살멸을 향상시킨다는 것을 보여준다. 또한, 삭제 10 GITR 도메인에서 아미노산 (아미노산 184-193) 이 자극 활동을 폐지. 대조적으로, CAR 구문 내에서 GITR 도메인의 상대적 위치를 재배열하는 것은 자극 능력에 덜 해로운 것으로 판명되었습니다. 종점 데이터를 사용하여, IFNγ 생산은 T 세포 활성화의 대리로서 또한 GITR 도메인의 자극 활성을 입증하였다(도5B). 단순한 "스냅 샷"인 종점 데이터와 는 달리 xCELLigence 계측기의 연속 임피던스 프로파일은 다른 치료법의 킬링 역학의 미묘한 차이를 명확하게 비춥니다(그림5C). 여기서 얻은 결과는 생체내 연구30의결과와 일치한다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig1.jpg"> 도 1: xCELLigence 실시간 세포 분석(RTCA) 시스템은 이펙터 셀에 의한 표적 세포의 살해를 검출한다. 표적 암세포에 대하여 CAR T 이펙터 세포의 살해 활동을 측정하는 3개의 주요 개념적인 단계가 있습니다. 1 단계: 표적 세포 (즉, 종양 세포)를 E-플레이트의 우물 내로 시드합니다. 셀은 금 바이오 센서 마이크로 전극에 부착되며 이는 전극 사이의 전류 흐름을 방해합니다. 이 임피던스 값은 측정되고 셀 인덱스라는 단위 없는 매개변수로 플롯됩니다. 세포가 합류에 접근할 때 세포가 증가하고 고원에 도달할 때 세포 지수 값이 증가합니다. 2 단계: 이펙터 세포-비부착 면역 세포-이어서 첨가된다. 이러한 세포는 금 미세 전극에 부착되지 않기 때문에 임피던스 변화를 직접적으로 일으키지 않습니다. 3 단계 : 이펙터 세포가 표적 암 세포를 공격하는 경우, 종양 세포의 파괴는 시간이 지남에 따라 세포 지수의 감소에 의해 반영된다. 이펙터 세포의 이러한 세포용해 활성, 또는 이펙터 세포의 효능은 민감하고 정밀하게 모니터링될 수 있다. xCELLigence 시스템에서 임피던스 데이터를 지속적으로 수집하면 여러 조건에 대한 실시간 킬링 역학 분석을 동시에 수행할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig2.jpg"> 도 2: CAR T 세포의 렌티바이러스 및 유세포분석의 역가 측정. (A)렌티바이러스 적규자 결정. 상이한 색상 선은 주기 수 대 델타 Rn. 낮은 주기 수에 대한 대표적인 샘플은 샘플에 존재하는 비교적 높은 양의 바이러스 RNA 템플릿을 나타낸다. (b)전이 후, CAR T 세포를 2 x 106 세포/mL 미만의 밀도로 배양하고 유지한 다음 유동 분석을 실시하였다. y축은 T 셀의 염색을 반영하며 양수 값은 Q1 및 Q2 영역에 반영됩니다. 두 샘플 모두 T 세포에 대해 100% 양성이다. CAR scFV의 발현은 scFv 특이적Ab(x-축)를 사용하여 결정된다. 결과는 T 세포의 50% 이상이 CD22-CAR T 세포에서 scFv 양성임을 보여준다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig3.jpg"> 그림 3: 라지 버킷 림프종 세포에 대한 CD22-CAR T 세포의 역학을 죽이는. 적색 곡선은 라지 세포 단독이지만, 녹색 곡선은 CD22-CAR T 세포로 처리된 라지 세포이다. 분홍색과 파란색 곡선은 각각 Mock CAR T 세포 치료 및 비트랜스듀스 T 세포 치료입니다. E:T 비율은 10:1입니다. 오류 막대는 표준 편차입니다. 더 많은 데이터 포인트를 사용할 수 있지만 쉽게 표시할 수 있는 시간 척도가 2시간 간격으로 설정됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig4.jpg"> 그림 4: 췌장 고형 종양 세포에 대한 CD47-CAR T 세포의 효능. (A)분홍색은 표적 BxPC3 세포단독이며, 적색은 CD47-CAR T 세포가 첨가된 BxPC3이다. 녹색은 비트랜스듀싱 T 셀을 첨가한 BxPC3이고, 파란색은 모의 CAR T 셀을 갖는다. E:T 비율은 10:1입니다. (B)동일한 설정에서, 빨간색은 CD47-CAR T 셀만으로 웰을 제어하고 녹색은 배지만 비어 있습니다. 오류 막대는 표준 편차입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig5.jpg"> 도 5: GITR 도메인은 EGFR 양성 종양 세포전에 대한 CAR T 세포 독성 활성을 증가시킨다. (A)다른 자동차 구문. (B)4 시간 (왼쪽) 및 24 시간 (중간)에서 다른 CAR 구조에 대한 % 세포 용해의 막대 플롯. 24 시간에서 IFNγ 생산은 오른쪽에 도시된다. (C)모든 구문에 대한 지속적인 살인 평가. 검은 곡선은 BxPC3 난소암 세포의 성장 곡선입니다. 상기 녹색 곡선은 T 세포로만 처리된 표적 세포이고, 청색 곡선은 모의 CAR T 세포로 처리되고, 적색 곡선은 EGFR-GITR-CD3-CAR T 세포로 처리된 표적 세포이며, 분홍색 곡선은 EGFR-ΔGITR-CD3-CAR T 세포로 처리된 표적 세포이며, 갈색 곡선은 EGFR-CD3-GITR-CAR-CAR 로 처리된 표적 세포이다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

우리는 액체 및 고체 종양 세포를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 T 세포의 효능을 평가하기 위해 시험관내 세포분석 시스템을 정량적으로 실시간으로 기술한다. 이 프로토콜은 다른 면역 이펙터 세포뿐만 아니라 조합 치료를 평가하기 위해 확장 될 수있다.

고체 및 혈액암 세포를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 T 세포를 위한 실시간 힘 분석

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy for cancer has achieved significant clinical benefit for resistant and refractory hematological ...

xCELLigence 실시간 세포 분석을 통해 라벨이 없는 조건하에서 여러 일 동안 면역 세포에 의한 암세포의 학살을 정량적으로 모니터링할 수 있습니다. 이 시스템은 표적 암 세포 살해의 완전한 시간 과정을 제공하여 많은 수의 구조, 이펙터 세포 유형 또는 조합 요법을 낮은 이펙터에서 표적 비율에 동시 선별할 수 있도록 합니다. DMEM 배양 배지에 있는 7개의 HEK293FT 세포에 1.5배 10번 을 파종하여 150밀리리터 세포 배양 접시에 150밀리리터 세포 배양 접시에 37°C, 습도가 있는 이산화탄소 5%를 밤새 배양한다.다음 아침, 렌티바이러스 벡터 플라스미드 DNA 5마이크로그램과 22.5 마이크로그램의 렌티바이러스 포장 믹스와 2.5 마이크로리터의 트랜스페션 용액 2.5 밀리리터를 혼합하여 2.5 밀리리터의 트랜스페션 희석용 액수를 혼합합니다. 실온에서 15분 동안 배양한 후, HEK293FT 세포의 접시에 현명하게 반응 드롭을 전달하고 세포를 인큐베이터로 돌려 보내 두 번째 하룻밤 배양을 한다. 다음 날 아침, 상체를 신선한 DMEM 배양 배지의 19 밀리리터로 대체하고 세포를 하룻밤 동안 인큐베이터로 되돌려 보입니다.용액에서 세포 나 이물질을 제거하기 위해 두 번째 아침에 원심 분리에 의해 렌즈 바이러스를 퇴적하기 전에 다음 이틀 동안 섭씨 4도 저장에 대한 단일 50 밀리리터 원모 튜브로 상체를 수집합니다. 초원심분리를 위한 초투명 원심분리기 튜브에 상피물질을 함유하는 렌티바이러스의 약 1밀리리터를 제외한 모든 것을 전송한다. 초원심분리 후, 수퍼나탄을 함유한 잔류 바이러스를 조심스럽게 흡인시키고, 100마이크로리터의 DMEM을 펠릿에 부드럽게 넣고, 튜브를 얼음 위에 15분간 놓습니다.인큐베이션이 끝나면 용액을 부드럽게 섞고 렌티바이러스 용액을 영하 80도의 저장을 위해 미리 냉장된 멸균 튜브에 알리쿼트합니다. 그런 다음 제조업체의 지침에 따라 정량적인 RT-PCR에 의해 렌즈바이러스의 티터를 결정합니다. CAR-T 세포 발생 및 확장을 위해, 24시간 동안 세포 배양배기에서 24웰 플레이트의 1웰에 동일한 수의 CD3/CD28 코팅 마이크로비드를 가진 CAR-T 세포 배지의 1밀리리터에서 6개의 말초 혈액 단핵 세포에 1-2배 10을 활성화한다.다음 2 일 아침, 세포와 트랜스 듀스 증강 제의 하나의 마이크로 리터를 혼합 한 다음 5 대 1의 감염의 복합성에 렌티 바이러스의 추가. T 세포 성장을 모니터링하는 것은 밀리리터 농도당 6세포에 1~2회 10회 10회에서 세포를 유지하기 위해 필요에 따라 신선한 CAR-T 세포 배지를 추가하는 새로운 CAR-T 세포 배지를 추가한다. 유동 세포측정에 의한 T 세포 CAR 발현을 검출하기 위해, 개별 1.5 밀리리터 미세원심분리기 튜브로 3회 10회 및 비변환T 세포를 전송한다.원심분리에 의해 세포를 수집하고 1%인간 혈청으로 보충된 FACS 버퍼의 200 마이크로리터에서 펠릿을 재보페수한다. 각 세포 샘플을 얼음 위에 있는 개별 5밀리리터 폴리스티렌 FACS 튜브에 있는 100 마이크로리터 알리코크로 분할합니다. 5분 후, 염소 항마우스 FAB2의 생체분해된 FAB2 단편 1개와 각 세포 유형의 1개 튜브에 추가, PE 라벨이 부착된 안티태그 항체 2개를 각 세포 유형의 다른 튜브에 철저한 혼합을 한다.얼음에 30 분 후, 신선한 FACS 버퍼의 세 밀리리터와 원심 분리 후 슈퍼 나티츠를 씻어. 나머지 상체에서 펠릿을 다시 중단하고 각 튜브에 APC 안티 CD3의 2 개의 마이크로 리터와 7-AAD의 2 개의 마이크로 리터를 추가합니다. PE 라벨이 부착된 스트렙타비딘 의 마이크로리터 1개를 안티 FAB2 항체로 염색한 튜브에 간략하게 혼합하고 얼음에 있는 모든 튜브를 30분 동안 배양합니다.인큐베이션의 끝에서, T 세포를 전진 분산및 CD3 대 7-AAD 발현에 의해 T 세포를 게이팅하는 표준 프로토콜에 따라 세포측정을 유동하여 세포를 분석한다. 실시간 세포분석 효능 분석의 경우, 50~100마이크로리터의 표적 세포 배양 배지를 전자플레이트의 각 웰에 추가하고 세포 분석기 기기에서 배경 임피던스를 측정한다. 트립신을 사용하여 배양 플레이트에서 표적 암세포를 검출한다.신선한 배양 배지와 원심분리기의 15 밀리리터에서 세포를 씻으시다. 계산을 위한 신선한 배지의 5밀리리터에서 암세포 펠릿을 재중단하고 적절한 표적 세포 농도로 세포 밀도를 조절한다. 적절한 수의 우물에 세포를 추가하고 실온에서 30 분 동안 전자 플레이트를 두어 세포가 우물 바닥에 균등하게 정착 할 수 있습니다.평형 기간이 끝나면 플레이트를 실시간 셀 분석기에 배치하고 밤새 15분마다 자동으로 임피던스 측정을 시작합니다. 표적 세포의 접착 및 증식은 실시간으로 추적될 수 있다. 다음 날 아침, 이펙터 CAR를 희석하고 T 세포를 개별 튜브의 적절한 농도로 희석하고 각 웰의 최종 부피가 100 마이크로리터되도록 전자 플레이트의 각 우물에서 50~100 마이크로리터를 제거합니다.다음으로, 이펙터 및 제어 T 세포를 적절한 이펙터에서 적절한 이펙터에서 100 마이크로리터당 중간 크기의 마이크로리터에서 표적 비율로 조절한다. 그런 다음 전자 플레이트를 실온에서 30분 동안 상위화한 후 플레이트를 셀 분석기 시스템으로 되돌린다. 표적 암세포의 T 세포 중재 살인의 효능을 측정하기 위해 CAR-T 중재된 살인을 96시간 동안 모니터링한다.CAR-T 세포의 약 50%는 T 세포의 약 50%에서 CAR의 발현을 나타내는 항단 사슬 가변 단편 항체에 대해 양성으로 염색하였다. 본 대표적인 실험에서는 모든 그룹에 대해 10 대 1의 대상 비가 사용되었다. 라지 세포만 및 CD22-CAR T 세포 처리 라지 세포는 대조군 T 세포 와 모의 CAR-T 세포 그룹에 비해 상당한 살인을 나타냈다.이 실험에서는 CD47-CAR-T 세포만이 췌장암세포를 죽이는 데 효과적이었다. 또한, CD47-CAR-T 세포로부터의 임피던스 신호만으로도 CAR-T 세포와 같은 현탁세포로부터 발생하는 임피던스 신호가 최소화되고 CAR-T 세포가 표적 암세포에 첨가될 때 전체 임피던스 신호에 기여하지 않는다는 것을 나타내는 배지 단독으로 측정된 세포 지수 신호보다 약간 높았습니다. 특히, GITR 공동 자극 도메인은 GITR 도메인이 없는 원래 CAR 구조에 비해 상피 성장 인자 수용체 양성 표적 세포에 비해 CAR-T 세포 를 죽이는 향상시키는 데 더 효과적인 것으로 관찰되었다.전자 플레이트 우물로부터의 배지는 실험의 요구에 따라 분석 중 또는 이후에 시토카인 프로파일을 시간 지점에서 분석하기 위해 수집될 수 있다. 전반적으로 xCELLigence는 이중 특이적 T 세포 종사자 및 온연성 바이러스에서 부터 조합 요법의 면역 체크 포인트 억제제에 이르기까지 다양한 면역 요법의 효능을 평가하는 효율성을 향상시켰습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 실시간 전기 임피던스 측정을 통해 암세포에 대한 CAR T 세포 활성을 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 임피던스의 변화를 추적하면 암세포 세포 용해를 유도하는 CAR T 세포의 효과를 평가하여 세포 독성 능력에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

CAR T 세포의 효능을 평가하기 위한 실시간 체외 세포분해 분석

우리는 종양 대상 세포와 incubated 때 T 세포의 세포 독성을 측정 할 수있는 단일 셀 높은 처리량 분석을 설명합니다. 이 방법은 spatially 정의 비율에서 T 세포와 대상 세포를 한정하는 하위 nanoliter 우물 (~ 100,000 우물 / 배열)의 조밀 한, 탄성 배열을 사용하고 이펙터 - 대상 활용 및 후속 apoptosis를 모니터링하는 형광 현미경에 연결된다.

T 세포 양적 높은 처리량 단일 세포 세포 독성 분석

이 프로토콜에 대 한 3 차원 구조적된 암 세포 (spheroids)에서 실시간으로 immunotherapeutic 리디렉션된 T-셀 (자동차 T-세포) 세포 독성을 평가 하기 위해 설계 되었습니다.

자동차 T 세포에 의해 회전 타원 체 살인 분석 결과

여기, 생체 외에서 공동 문화 메서드를 재귀적으로 도전 종양 표적으로 T 세포, antitumor T 세포 활동의 phenotypic 및 기능 분석에 대 한 수 있습니다 설명 합니다.

체 외 종양 세포 Rechallenge 공상 항 원 수용 체 T 세포 Antitumor 기능 예측 평가

단일 종양 항원을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 Jurkat 세포에 의한 정량적 종양 세포 사멸을 평가하기 위한 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 말초 혈액 유래 T 세포에서 확인하기 전에 CAR hinge 구조를 신속하게 최적화하기 위한 스크리닝 플랫폼으로 사용할 수 있습니다.

형광 이미징을 사용한 Jurkat 발현 키메라 항원 수용체의 신속한 체외 세포 독성 평가

이 프로토콜은 암 면역 요법을 위한 비통합 mRNA를 사용하여 일시적 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포를 생성하는 자세한 절차를 설명하고 CAR-T 세포 및 세포 독성 기능을 평가하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.

암 면역 요법을 위해 mRNA를 사용하여 일시적인 키메라 항원 수용체 T 세포를 생성하는 비바이러스 접근법

여기에서는 단일 세포 수준에서 세포 사멸을 조사하기 위해 하나의 T 세포와 암 표적 세포를 캡슐화하는 이중 에멀젼 방울을 만드는 방법을 설명합니다. 이 방법은 많은 T 세포 집단 내에서 세포독성 분자와 표적 세포 사멸을 모두 이중 정량화할 수 있습니다.

단일 세포 수준에서 키메라 항원 수용체 T 세포를 평가하기 위한 액적 기반 세포 독성 분석

CD19 별 키메라 항원 수용체 (자동차)를 표현하는 T 세포는 우리의 첫번째 인 인간 유전자 치료 시험에서 B-세포 malignancies의 investigational 치료로 주입됩니다. 우리는을 사용하여 T 세포의 유전자 변형을...

임상 신청<em&gt; 잠자는 숲속의 미녀</em유전자 주변과 배꼽 탯줄 혈액에서 T 세포를 수정하는 셀을 제시&gt;과 인공 항원

종양 면역 요법에 사용하기 위해자가 수지상 세포의 큰 숫자 (DCS)를 생성하기위한 가장 일반적으로 사용되는 방법을 설명합니다. 방법은 단핵 세포에서 수지상 세포를 분화하는 IL-4, GM-CSF를 사용합니다. 그들은 환자에게 다시 주입하기 전에 미성숙 수지상 세포는 성숙하고 항원과 함께로드를 자극한다.

면역 요법에 대한 종양 항원로드 성숙 수지상 세포의 준비

지침을 제시 세포 킬러 인공 항원의 생성을 위해 제시되고, KaAPC 인간 항원 특이적인 T 세포의 생체 외 고갈과 항원에 T 세포 - 매개자가 면역 질환의 치료를위한 세포 면역 요법에 대한 대안을위한 효율적인 도구 나머지 면역 체계를 손상시키지 않고 특정 패션.

효율적인위한 킬러 인공 항원 제시 세포 (KaAPC) 체외 인간의 항원 특이 T 세포의 고갈

학습하세요 xCELLigence 실시간 세포 분석을 활용한 CAR T 세포의 고체 및 혈액암 세포 대비 세포독성 평가 방법을. 이 기술은 면역 세포의 암 세포 살상 효능을 정량적으로 모니터링하여 다양한 면역 요법의 효과를 신속하게 스크리닝할 수 있습니다.

고체 및 혈액암 세포를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 T 세포를 위한 실시간 힘 분석

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