Name: 올레산의 Tripeptide 안정 Nanoemulsion (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: 배우세요 올레산-플래티넘(II) 나노에멀젼 합성법을 KYF 트리펩타이드로 안정화하여 항암제 전달 시스템을 개발하는 방법입니다. 생분해성 안정화제를 활용한 이 기술은 난소암 치료에 효과적인 약물 캡슐화를 가능하게 합니다.

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우리는 기꺼이 SC2CA206194 부여 국립 암 연구소에서 재정 지원을 인정 합니다. 아니 경쟁 금융 관심 선언 됩니다.

1입니다. 올레산 Acids–Platinum(II) 공액의 합성
<ol><li>Cisplatin의 활성화<ol>
<li>60 ° c.에 물 (예를들면, nanopure)의 4 ml cisplatin의 50 밀리 그램 (0.167 mmol)을 일시 중단</li>
		<li>Cisplatin의 솔루션을 물 0.5 ml에서 AgNO3 dropwise 55.2 mg (0.325 mmol)을 추가 하 고 60 ° c.에 적어도 2 시간에 대 한 반응을 저 어 AgCl의 흰색 침전 반응의 진행을 나타내는 형성할 것 이다.</li>
		<li>10%와 테스트를 수행 하는 경우 활성화 반응 완료를 확인 하려면 솔루션에서 무료+ Ag 이온의 존재에 대 한 HCl. 시험 부정 이어야 한다 (아무 추가 AgCl 침전을 형성 한다).</li>
		<li>10 분 동안 3,220 x g 에서 반응 혼합물을 원심 고 AgCl의 흰색 침전을 제거 합니다.</li>
		<li>상쾌한을 수집 하 고 0.2 m m 주사기 필터를 통해 필터링. 플래티넘의 존재에 대 한 상쾌한 SnCl2 결정을 파스퇴르 피 펫을 통해 솔루션의 2-3 방울을 적용 하 여 테스트 합니다. 테스트 경우 백 금 깡통의 좌표 복잡의 색상은 어두운 노란색/주황색 긍정적 이다.</li>
		<li>두 번째 단계에 대 한 활성화 된 Pt(II)는 상쾌한 사용.</li>
	</ol>
</li>
	<li>활성화 된 Pt(II)와 올레 산의 반응<ol>
<li>60 ° c.에 물 3 ml에서 올레산 (0.333 mmol)의 94.2 mg을 일시 중단</li>
		<li>물의 1 mL에서 NaOH의 13.3 mg (0.333 mmol)을 추가 하 고 단계의 1.1 활성화 된 Pt(II)의 솔루션 혼합</li>
		<li>저 어 2 h 반응 60 ° C에서 그리고 다음 실 온에서 하룻밤. 원유 제품은 기름 갈색/노란색 침전 이다.</li>
		<li>10 분 동안 3,220 x g 에서 반응 혼합물을 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다. 회전 증발 기를 사용 하 여 25 ° C에서 원유 제품 건조. 이기와 여러 세척 하 여 제품을 정화. 순수한 올레 acids–Pt(II) 공액의 마지막 색깔은 옅은 노란색 이다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. KYF-Pt-네브라스카의 합성과 FITC 표시 Nanoemulsion FITC-KYF-Pt-NE
<ol><li>붙일 레이블된 tripeptide FITC KYF KYF tripeptide의 합성<ol>
<li>KYF 표준 고체 펩 티 드 화학을 사용 하 여 음성 합성. 다음 표준 조건 커플링을 사용 하 여 각 아미노산 연결: 왕 수 지 (2.19 mmol), 보호 Fmoc 아미노산 (4.38 mmol), 2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium tetrafluoroborate (TBTU) (4.38 mmol)과 diisopropylethylamine (DIPEA) (8.76 mmol)입니다. Dimethylformamide (DMF)에 TBTU와 아미노산을 분해 및 DIPEA.</li>
		<li>사용 전에 h 1에 대 한 DMF의 25 mL Fmoc-L-페 4 alkoxybenzyl 알코올 수 지 (0.382 meq/g)의 5.7 g를 담근 다.</li>
		<li>5 분 동안 20 %piperidine / DMF 용액의 15 mL와 L-페닐알라닌 아미노산의 아민 그룹을 deprotect, 용 매를 삭제 하 고 20 분 주기 세척을 반복 합니다.</li>
		<li>다음 용 매와 1 분에 대 한 수 지를 세척: DMF, 이소프로필 알코올 (IPA), DMF, IPA, DMF, IPA, DMF, DMF. 각 세척 후 용 매를 버리십시오.</li>
		<li>수 지에서 무료 NH2 그룹의 존재를 확인 하기 위해 카이 저 테스트 수행 (하위 참조)와 긍정적인 (수 지 씨는 보라색), Fmoc-L-티로신 아미노산을 추가 하 고 결합을 수행 하는 경우 하룻밤.<ol>
<li>카이 저 별도 병에 테스트 솔루션을 준비 합니다.</li>
			<li>5 g에 에탄올 100 mL ninhydrin의 분해.</li>
			<li>80 g에 에탄올 20 mL에 페 놀의 분해.</li>
			<li>0.001 M와 칼륨 시안 화물의 용액 2 mL를 혼합 pyridine의 98 mL입니다.</li>
			<li>끓는 물에 5 분에서 샘플을 열 솔루션을 테스트 하는 각 카이 저 2-3 방울을 추가 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>카이 저 테스트를 수행 하는 두 번째 아미노산의 성공적인 결합, 시 및 부정적인 deprotection 프로토콜 (2.1.3 2.1.5 단계)와 함께 진행 하는 경우. Fmoc 페닐알라닌 아미노산 프로세스를 반복 합니다.<ol>
<li>각 세척 용 매를 삭제 후 모든 아미노산의 결합, 시의 DMF, IPA, DMF, 메탄올, dichloromethane diethyl 에테르 5 mL와 함께 1 분 동안 수 지를 씻어. 추가 처리를 위해 수 지를 저장 합니다.</li>
			<li>FITC와 펩 티 드를 수정 하려면 다음 단계 (2.1.7-2.1.9)에 대 한 수 지의 절반을 사용 합니다. 수정 되지 않은 KYF tripeptide를 얻으려면 2.1.10에서 시작 하는 절차를 따릅니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>6-azidohexanoic 산 KYF N3 KYF의 N 맨끝 아미노산을 수정 합니다. 이 위해, 믹스 1 g (0.382 mmol) KYF 왕 수 지와 120.1 mg (0.764 mmol)의 6-azidohexanoic 산의 245.2 mg (0.764 mmol) TBTU와 DMF의 30 mL에 DIPEA의 197.1 mg (1.528 mmol)의. 실 온에서 반응 밤새 저 어.</li>
		<li>클릭 반응을 통해 propargyl fluorescein와 KYF N3 의 합성에서 KYF FITC를 가져옵니다. 이 위해, CuI 고체의 3.78 mg (0.019 mmol), propargyl fluorescein, 71.9 mg (0.193 mmol)와 DIPEA의 2.24 mg (0.017 mmol) 253 mg (0.097 mmol) KYF N3 왕 수 지의 혼합. 반응 갈색 녹색에서 색상을 변경 해야 합니다.</li>
		<li>24 시간 후 1 분 또는 5 번, 메탄올과 물 몇 번이 고, DMF 및 물 몇 번이 고, DMF와 IPA의 5 mL와 함께 dichloromethane 및 diethyl 에테르에 대 한 수 지를 몇 번이 고 씻어. 각 세척 후 용 매를 버리십시오.</li>
		<li>Trifluoroacetic 산 (TFA) 솔루션 수 지에서 KYF FITC 또는 KYF 펩 티 드를 쪼개 다/triisopropylsilane (팁) /H2O 95/2.5/2.5의 비율에서 3 시간 이상.</li>
		<li>감기 diethyl 에테르, 차가운 에테르로 세 번 세척 및 진공에서 다음 건조에 원유 펩 티 드를 침전.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pt(II) (FITC-KYF-Pt-네브라스카)와 KYF-Pt-NE FITC KYF 안정화 nanoemulsion의 합성<ol>
<li>소 프로 파 놀의 1.5 ml에서 올레 acids–Pt(II) 공액 및 장소 5 mL 주사기에 10 mg (0.0126 mmol)을 분해.</li>
		<li>주사기 펌프에 올레 acids–Pt(II) 공액으로 주사기를 놓고 0.1 mL/min로 흐름을 설정 합니다.</li>
		<li>FITC KYF Pt 네브라스카를 합성 하기 위해 FITC KYF KYF의 1 밀리 그램 (0.00219 mmol)의 1mg (0.00105 mmol)을 녹 (FITC의 몰 비율을 1:2-KYF:KYF) 물 20 mL에 37 ° c.에 해결책의 온도 조정 FITC fluorophore의 photobleaching을 피하기 위해 알루미늄 호 일 컨테이너의 벽을 커버. 합성 KYF-Pt-NE, 물 20 mL에 KYF tripeptide의 2mg (0.0044 mmol)을 녹이 고 37 ° c.에 해결책의 온도 조정</li>
		<li>FITC-KYF/KYF 또는 KYF tripeptide의 솔루션에 dropwise 올레 acids–Pt(II) 켤레를 추가 합니다. 후드 아래이 단계를 수행 합니다.</li>
		<li>유기 용 매를 증발 하 고 실 온에서 하룻밤 솔루션을 저 어는 FITC-KYF-Pt-NE 또는 KYF-Pt-니의 자기 조립</li>
		<li>FITC-KYF-Pt-NE 또는 KYF-Pt-NE 원심 집중 장치에 집중 (10 k MWCO), 및 nanopure 물 4 mL로 세 번 세척.</li>
		<li>4 ° c.에 KYF-Pt-NE와 FITC-KYF-Pt-NE 수성 솔루션 저장</li>
		<li>원자 흡수 분 광 법 (AAS), 다음 제조 업체의 가이드48을 사용 하 여 백 금 콘텐츠에 대 한 분석.<ol>
<li>10 %HCl 솔루션에서 플래티넘 표준 보정 곡선에 대 한 준비 (AAS에 대 한 효과적인 범위는 100 1200 ppb (부품 당 십억) 사이).</li>
			<li>아쿠아 레 지아 (3:1 집중된 염 산 및 질소 산의 혼합물)의 단계 2.2에서 100 µ L에서 KYF-Pt-NE 솔루션의 50 µ L를 녹이 고 실 온에서 하룻밤 둡니다. 물 1 mL의 최종 샘플 볼륨에 도달 850 µ L를 추가 합니다. AAS를 사용 하 여 샘플을 분석 합니다. 마지막 산 농도 모든 분석된 샘플에서 10% 이어야 한다.</li>
			<li>Ppb에 태평양 표준시 농도의 독서를 기록 하 고 계산 샘플 (샘플 희석 및 nanoemulsion의 초기 볼륨에 대 한 계정)에 최종 플래티넘 콘텐츠.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. FITC-KYF-Pt-NE의 세포질 통풍 관의 confocal 영상
<ol><li>6 난소 암 세포 선 (A2780, CP70, SKOV3, OV90, TOV21G, 및 ES2), 챔버, 당 104 셀 x 4.7의 밀도에 4 잘 챔버 confocal 요리에 씨 하 고 37 ° c.에 하룻밤 문화 사전</li>
	<li>24 시간 후 셀 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)을 세 번 세척 하 고 세포 배양 매체에서 FITC-KYF-Pt-NE와 품 어 (구체적인 내용을 라인 셀 단계 6.1 참조) 37 ° c.에서 15 분</li>
	<li>부 화, 이후 미디어를 제거 하 고 3 회 PBS로 세포 세척.</li>
	<li>-20 ° C에서 5 분에 대 한 차가운 메탄올을 가진 세포를 해결 하 고 1 mL의 PBS로 3 회 세척.</li>
	<li>0.1의 1 mL로 세포를 permeabilize 트리톤 X 세척 실 온에서 10 분 동안 세 번와 %1 mL PBS의.</li>
	<li>1 시 50 분에서 알 렉 사 Fluor 647 (1 mL)으로 활용 하는 LAMP1 항 체와 90 분에 대 한 셀을 품 어 실 온에서 PBS에 희석. 다음으로, 3 회 PBS로 세포 세척.</li>
	<li>DAPI 재고 솔루션 (1 mg/mL) 1 mg/mL PBS에 희석. 그런 다음, 각 약 실에 희석된 솔루션의 1 mL을 추가 하 고 실 온에서 15 분 동안 품 어. 3 회 PBS로 세포 세척.</li>
	<li>설치 매체를 사용 하 여 슬라이드에 coverslips를 탑재 합니다.</li>
	<li>405의 여기 파장에서 라이브 셀 confocal 현미경을 사용 하 여 셀을 이미지 nm, 488 nm 및 633 nm. 다음과 같이 검색 매개 변수를 설정: 0.2%를 더 이상 1%, 피 놀 리 1 공기 단위, 레이저 전력 이득 마스터 650-750, 디지털 오프셋 0.</li>
	<li>이미징 소프트웨어에 오픈 이미지입니다. 표시 된 이미지에서 그래픽 을 선택 하 고 삽입 눈금 막대, 이미지에 눈금 막대를 삽입 하려면 선택.</li>
</ol>4. 약물 방출 연구
<ol><li>PBS에서 약물 방출 연구를 실시 합니다. 각각 7.4, 6.8 및 5.0 3 PBS 버퍼의 pH 값을 조정 합니다.</li>
	<li>적절 한 pH PBS 버퍼의 180 μ에 KYF-Pt-NE의 5 μ를 희석, 3.5 kDa MWCO 미니 투 컵 전송 및 PBS에서 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>2, 4, 6, 24, 48, 및 140 h에서 각 3 미니 투 석 튜브에서 버퍼를 제거 하 고 AAS에 의해 백 금 농도 측정. 2.2.8 단계에 따라 모든 샘플을 준비 하지만 500 µ L 샘플의 최종 볼륨을 조정할.</li>
</ol>5. 세포 배양 방법
<ol><li>문화 셀 A2780, CP70, SKOV-3, OV-90, 비 네-21 G, ES-2 세포 배양 매체 (DMEM) 10% (A2780, CP70 SKOV-3, ES-2) 또는 (비 네-21 G, OV-90) 15% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 보충에 L-글루타민과 페니실린/스 라인. 모든 셀 5% CO2, 37 ° c.에 물 포화 분위기 성장</li>
	<li>시드 3 x 10 각 96 잘 접시와 체 외 배양 실험에 대 한 사전 문화 하룻밤에5 셀. 준비 물에 KYF-Pt-NE, cisplatin, 및 carboplatin 솔루션. KYF-Pt-네브라스카 carboplatin와 각 셀 라인 cisplatin의 농도 맞게 Pt(II)의 농도 조정 합니다. 37 ° c.에 72 시간 동안 품 어</li>
	<li>부 화, 후 색도계 분석 결과 (MTT 세포 증식 분석 결과)를 사용 하 여 세포 생존 능력을 평가 합니다. 짧게, 매체를 제거 하 고 각 매체에 MTT 고 2 h 37 ° c.에 대 한 품 어 10%의 110 μ를 추가 그럼 각 음을 100 μ 세제를 추가 하 고 37 ° c.에 5 h에 대 한 품 어</li>
	<li>570에서 흡 광도 확인 nm 플레이트 리더를 사용 하 여. 부터 Z-테스트 및 P-테스트와 통계 분석을 사용 하 여 결과 분석 합니다.</li>
</ol>

저자는 공개 관심의 충돌이 있지 않습니다.

Nanoemulsion 합성에 중요 한 단계는 기판의 어 금 니 비율 조정, 등 올레 acids–Pt(II) 추가 중 온도 흐름 속도 제어를 유지, 자기 조립, 충분 한 시간을 제공 하는 제품을 사용 하 여 정화를 원심 농축 기 열입니다. 이러한 매개 변수는 크기 KYF-Pt-NE;의 형태에 영향 따라서, 특히 적절 한 어 금 니 비율을 유지 하 고 합성 상태를 올바르게 조정 하는 것이 중요 하다.
Nanoemulsion 합성 (3 단계) 동안 기판의 비율 자기 집합 프로세스에 대 한 중요 하 고 제품의 최종 크기를 결정 합니다. KYF 올레 acid-Pt(II) 어 금 니 비율을 1:3 이며 물에 KYF tripepide의 최적 농도 0.2 m m. 또한, 단계 3.1에서에서 올레 acid-Pt(II) 공액을 분해 하는 데 사용 하는 유기 용 매 혼합할 수 있는 물, 여과 시스템 호환 되며 실 온에서 쉽게 증발 하는.
중요 한 ...

최근 몇 년 동안, 나노 약물 전달 및 bioimaging1,2,,34이러한 생물 의학 응용 프로그램에 대 한의 공학에 관심을 증가 되었습니다. 나노 기반 시스템의 많은 자주 통합 한 배합 내의 여러 구성 요소를 필요로 합니다. 종종 지질 또는 고분자에 기반한 빌딩 블록 다 그들의 물리 화학적 특성으로 그들의 생체 적합성 및 biodegradability, 궁극적으로 nanostructure1, 의 기능에 영향을 미칠 수 있습니다 5,6. 단백질 및 펩 티 드, 등 생물학 파생된 자료 오래 그들의 시퀀스 유연성7,8인 다기능 nanostructures의 유망 부품으로 인정 되었습니다. 높은 순서 supramolecular 아키텍처 헬리컬 형성으로 자기 조립 하는 펩 티 드 리본9,10, 섬유 건설 기계11,12, 그리고 더 많은, 따라서 건물에 방법을 포장 하단-최대를 사용 하 여 biomolecule 기반 하이브리드 nanostructures13접근.
의학 및 생명 공학, 특히 항 암 제 치료14 와 심혈 관 질환15 뿐만 서 항생제 개발16,17, 대사에 대 한 응용 프로그램에 대 한 펩 티 드 탐험 되어 장애18, 그리고 감염19. 작은 펩 티 드 치료제 임상 시험20받고 백 이상 있다. 펩 티 드 들 수정 하 고 저렴 한 비용에 합성 빠른 있습니다. 또한, 그들은 생 분해성는 크게 그들의 생물 학적 및 제약 응용 프로그램21,22를 용이 하 게. 구조 부품으로 펩 티 드를 사용 하 여 포함 반응, 펩타이드 기반 나노 입자의 제어 릴리스23,,2425,26 히드로 플랫폼 공학 , 27, 펩타이드 기반 바이오 센서28,,2930,31또는 바이오 전자 장치32,,3334. 중요 한 것은, 페닐알라닌을 포함 하는 2 개 또는 3 개의 아미노 산 성 잔류물을 가진 조차 짧은 펩 티 드 가이드 발견 됐다는 자기 조립35,,3637 를 처리 하 고 안정 된 유화38 만들 .
혼자와 함께 다른 에이전트39,40백 금 기반의 약물, 그들의 높은 효 험 때문 많은 암 치료 regimens에 사용 됩니다. 백 금 화합물 monoadducts 및 intrastrand 또는 interstrand 크로스 링크를 형성 하 여 DNA 손상 유도. Pt-DNA 병 변 세포 기계 장치에 의해 인식 되 고, 복구 하지 세포 apoptosis. Pt(II) 암 세포 죽음에 기여 하는 가장 중요 한 메커니즘은 DNA 전사41,42의 억제. 그러나, 백 금 치료의 혜택은 심각한 부작용을 유발 하는 Pt(II)의 조직의 독성에 의해 점감 된다. Pt(II)43, DNA에 도달 플래티넘의 하위 치료 농도 수시로 귀착되는의 낮은 임상 투약을이 끈다. 결과적으로 DNA 수리 Pt(II) 저항을 취득 하 고 암 세포 생존에 기여 한다. 플래티넘 항 암 치료 저항 항 암 제 치료와 치료 실패44,45의 주요 원인에 중요 한 문제입니다.
우리 조직의 순환에 차폐 효과 제공 하 고 Pt II 유발 부작용을 줄이기 위해 Pt(II) 에이전트를 캡슐화 하는 안정적인 nanosystem를 개발 했습니다. 시스템은 KYF tripeptide nanoemulsion (KYF-Pt-네브라스카)46를 가진 안정 된 올레 acids-Pt(II) 코어를 기반으로 합니다. KYF-Pt-네브라스카, 올레산는 tripeptide의 아미노산의 구성 요소는 식품 및 의약품 안전 청 (FDA) 일반적으로 인정으로 안전 (그 라) 상태. KYF-Pt-NE47nanoprecipitation 메서드 사용 하 여 준비가 되어 있습니다. 즉, 올레 acids-Pt(II) 공액 유기 용 매에 녹아 있는 고 dropwise KYF 용액 (그림 1) 37 ° c.에 추가 솔루션은 KYF-Pt-니의 자기 조립을 허용 몇 시간 동안 흔들 nanoemulsion 10 kDa 원심 집중 장치에 집중 하 고 물으로 세 번 세척. fluorophore와 KYF의 화학 수정 형광 FITC-KYF-Pt-NE의 합성을 바이오 메디컬 이미징에 대 한 적합 한 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>2- (1H- 벤조 트리아 졸 -1- 일) -1,1,3,3- 테트라 메틸 우로늄 테트라 플루오로 보레이트 (TBTU)</td> <td>ANASPEC INC. :</td> <td>AS-20376</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>4 웰 챔버 컨 포칼 접시</td><td>Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific</td><td>154526</td><td>이미징</td></tr><tr><td>용 6- 브로 모헥산</td><td>Chem-Impex INT ' 엘 주식회사</td><td>24477</td><td>펩타이드</td></tr><tr><td>A2780</td>용 클릭 수정, <td>마운트 시나이 병원의 John Martignetti 교수가 아낌없이 제공,</td><td>난소암 세포주</td>Barnstead Nanopure Thermo Fisher D11901 정수 시스템, BUCHI 회전 증발 R-3, Buchi Z568090 용매 제거 및 시료 건조용 원심분리기 5810 R eppendorf <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>5811F</td><td>백금 복합체 분리용</td></tr><tr><td>Cis-dichlorodiamineplatinum (II) 99%</td><td>Acros Organics</td><td>19376-0050</td><td>시험관 내 테스트</td></tr><tr><td>CP70</td> Mount Sinai Hospital <td></td><td>난소암 세포주의</td><td>John Martignetti 교수가 관대하게 지원</td></tr><tr><td>디지털 수조</td><td>VWR</td><td>97025-134</td><td>세포 배양을 위한 배지 예열용</td></tr><tr><td>동적 광 산란(DLS)</td><td>Brookhaven Instrument Corporation</td><td></td><td>나노 입자 크기 측정</td></tr><tr><td>ES-2</td><td>ATCC</td><td>CRL-1978</td><td>난소암 세포주</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99.79%</td><td>Chem-Impex INT' 엘 주식회사</td><td>00493</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl 알코올 수지 (0.382 meq / g),</td> <td>Chem-Impex INT ' 엘 주식회사</td><td>01914</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98%</td><td>Alfa Aesar</td><td>H59730</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>HERACELL 150i CO2 인큐베이터</td><td>Thermo Scientific Fisher</td><td></td><td>인큐베이터</td></tr><tr><td>고압 주사기 펌프</td><td>New Era</td><td>1010-US</td><td>나노 입자 합성에 백금 복합체 첨가용</td></tr><tr><td>핫플레이트/교반기</td><td>VWR</td><td>12365-382</td><td>시료 교반 및 가열용</td></tr><tr><td>LAMP-1 항체(cojugated with Alexa Fluor 647)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-18821 AF647</td><td>For imaging</td></tr><tr><td>N,N-diisopropylethylamine (DIPEA)</td><td>Oakwood Chemical</td><td>005027</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Ninhydrin 99%</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10409</td><td>Kaiser test</td></tr><tr><td>Oleic acid</td><td>Chem-Impex INT' 엘 주식회사</td><td>01421</td><td>백금 복합체 합성</td></tr><tr><td>OV90</td><td>ATCC</td><td>CRL-11732</td><td>난소암 세포주</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td>세포 세척 용</td></tr><tr><td>Permount 장착 매체</td><td>Fisher Chemical</td><td>SP15-100</td><td>이미징</td></tr><tr><td>용 페놀</td><td>Fisher Chemical</td><td>A92500</td><td>Kaiser 테스트</td></tr><tr><td>포스 포 텅스텐 산</td><td>Fisher Chemical</td><td>TEM</td>Piperidine 99%BTC 219260-2.5L SPPS Platinum AAS 표준 소울션에 대한 <td>A248-25</td> negative stain</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>for calibration curve</td></tr><tr><td>Propargyl bromide 97%</td><td>Alfa Aesar</td><td>L10595</td><td>플루오레세인의 알킨 변형용</td></tr><tr><td>Scientific biological cabinet</td><td>Thermo Scientific Fisher</td><td>1385</td><td>Bio-hood 세포 배양용</td></tr><tr><td>자동 세척 진공 시스템</td><td>Welch</td><td>2028</td><td>회전 증발 용 진공 펌프</td></tr><tr><td>질산은</td><td>Acros Organics</td><td>19768-0250</td><td>시스플라틴 활성화</td></tr><tr><td>SKOV3</td><td>ATCC</td><td>HTB-77</td><td>난소 암 세포주</td></tr><tr><td>수산화 나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>S313-1</td><td>백금 복합체 합성</td></tr><tr><td>용 주석 (II) 염화물</td><td>시그마 알드리치</td><td>208256</td><td>백금 존재 테스트</td></tr><tr><td>TOV21G</td><td>ATCC</td><td>CRL-11730</td><td>난소암 세포주</td></tr><tr><td>트리플루오로아세트산 99% (TFA)</td><td>알파 에자르</td><td>L06374</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>트리이소프로필실란(TIPS)</td><td>Chem-Impex INT' 엘 주식회사</td><td>01966</td><td></td></tr><tr><td>SPPS Triton-X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787-100ML</td><td>이미징</td></tr><tr><td>용 우라닌 분말 40 %</td> <td>Fisher Scientific</td><td>S25328A</td><td>플루오레세인</td></tr><tr><td>Vivaspin 20 (10000 MWCO)</td>의 알킨 변형 용 <td>Sartorious</td><td>VS2001</td><td>나노 입자 세척 및 응축</td></tr><tr><td>용 VWR 도립 현미경</td><td>VWR</td><td>89404-462</td><td>세포 배양 모니터링 용</td></tr></tbody></table>

올레산의 tripeptide 안정 nanoemulsion

A Tripeptide-Stabilized Nanoemulsion of Oleic Acid

Nanoemulsion 올레 acids-Pt(II) 코어와 리-티로신-페닐알라닌 (KYF) 코팅 (KYF-Pt-네브라스카)를 생산 하는 방법을 설명 합니다. KYF-Pt-NE Pt(II) 10 wt. %에 캡슐화, 107 ± 27 및 부정적인 표면 충전의 직경. KYF-Pt-NE 안정적인 물과 혈 청, 이며 생물학적으로 활성. KYF에 fluorophore의 활용 생물 학적 영상에 적합 한 형광 nanoemulsion의 합성을 허용 한다. nanoemulsion의 합성 수성 환경, 그리고 짧은 KYF 펩타이드와 올레 acids-platinum(II) 공액의 자기 조립을 통해 KYF-Pt-NE 형태에서 수행 됩니다. 자기 집합 프로세스 솔루션의 온도, 기판의 어 금 니 비율 및 기판 추가의 흐름 속도에 따라 다릅니다. 중요 한 단계 등 합성 중 최적의 교 반 속도 유지, 자기 조립, 충분 한 시간을 허용 미리 원심 집중 장치에는 nanoemulsion 점차적으로 집중.

KYF-Pt-NE이이 프로토콜을 사용 하 여 준비의 가장 대표 이미지는 그림 2A에 표시 됩니다. KYF-Pt-NEs 형태학, 잘 분산에 구형 하 고 균일 한 크기에 있습니다. KYF-Pt-NEs, 200 측정, 최소 3 편 이미지에서 직접 측정의 핵심 직경 107 ± 27 nm 이다. KYF-Pt-네브라스카, 동적 빛 분광학 (DL)을 사용 하 여 분석의 유체역학 직경 240 발견 되었다 0.156의 증가할수록 인덱스 nm. 제타 잠재력 KYF-Pt-북동 물에서의-60.1의 평균 값과 3 개의 독립적인 종합에 대 한 결정 했다 뮤직 비디오. 잠재력의 높은 크기의 정립, 좋은 콜 로이드 안정성을 나타냅니다 그리고 부정적인 표면 충전은 올레 산의 이온 COO- 표면 그룹. 전자 포인트 KYF 8.59, 이며 따라서 그것은 긍정적으로 중립 pH에 위탁.
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이 프로토콜 lysine-티로신-페닐알라닌 (KYF) tripeptide로 안정 된 올레 acids-platinum(II) 공액 nanoemulsion 합성 하는 효율적인 방법을 설명 합니다. 된 KYF는 공액의 자기 조립을 통해 가벼운 합성 조건에서 nanoemulsion 양식.

올레산의 Tripeptide 안정 Nanoemulsion

We describe a method to produce a nanoemulsion composed of an oleic acids-Pt(II) core and a lysine-tyrosine-phenylalanine (KYF) coating (KYF-Pt-NE). The ...

짧은 펩티드 서열의 넓은 범위를 감안할 때,이 방법은 다른 많은 나노 입자 설계로 확장 될 수있다. 펩티드 변형은 진단을 목적으로 시스템을 적합하게 만들 수 있습니다. 항암 백금을 생분해성, 독성 안정화제로 약물에 캡슐화하는 것은 제약 응용 분야에서 매우 관련이 있습니다.난소암을 가진 예비 생체 내 연구 결과는 유망하고 추가 조사될 것입니다. 우선, 섭씨 60도에서 초순수 수분 4밀리리터에 50밀리그램의 시스플라틴을 중단하십시오. 시스플라틴 용액에 낙하 하는 실버 질산염 용액을 넣고 어둠 속에서 섭씨 60도에서 2 시간 동안 300 ~ 400 RPM에서 혼합물을 저어줍니다.그 후, 10%의 중량염산을 사용하여 용액에 이온이 없음을 확인합니다. 염산을 첨가하면 추가 은염화물이 형성되지 않으면 혼합물을 10분 동안 3, 220배 의 중력으로 원심분리합니다. 상체를 데수화하고 0.2 마이크로 미터 주사기 필터를 통해 필터링합니다.이어서, 10개의 염화물 결정으로 2~3방울을 적용하여 백금용 여과물을 테스트한다. 서스펜션이 짙은 갈색 또는 주황색으로 변하면 플래티넘이 존재합니다. 다음으로, 1밀리리터의 물에 13.3밀리그램의 수산화나트륨을 섭씨 60도에서 3밀리리터의 물에 올레산 의 94.2 밀리그램 현탁액에 넣습니다.혼합물을 섭씨 60도에서 2시간 동안 저어줍니다. 이어서, 열을 끄고 16~24시간 동안 실온에서 계속 저어주면서 원유를 유성, 황갈색 침전제로 얻는다. 반응 혼합물을 3, 220배 의 중력에서 10분 동안 원심분리하고 상체를 제거합니다.섭씨 25도에서 회전 증발기에서 제품을 건조하십시오. 원심분리에 의한 제품을 소용돌이게 하고 회수하여 아세토나이트 5밀리리터로 원유 제품을 중단합니다. 이 세척 과정을 적어도 3회 이상 반복하여 순한 올레산 백금 II 컨쥬게이트를 옅은 노란색 고체로 획득한다.먼저 5.7그램의 Fmoc 보호 L-페닐알라닌 기능을 있는 왕 수지(Wang 수지)를 1시간 동안 25밀리리터의 디메틸포르마미드에 담급니다. 그런 다음, 80 RPM에서 흔들면서 아민을 보호하기 위해 5 분 동안 DMF에서 20 % piperidine의 15 밀리리터에 수지. 수지물을 빼내고 20분 동안 보호 해제를 반복합니다.수지는 DMF와 이소프로필 알코올로 씻어내십시오. 보호 가 확인되면, Fmoc 보호 L-티로신 TBTU 및 DIPEA를 추가하고 결합을 수행하기 위해 16 ~ 24 시간 동안 혼합물을 교반. DMF와 이소프로필 알코올로 수지세척.카이저 테스트를 수행하고 이전에 설명한 대로 보호 해제 및 세척을 계속합니다. 커플과 보호 해제 Fmoc 같은 방법으로 리신을 보호. 그 후 DMF, IPA, 메탄올, 디클로로메탄 및 디틸 에테르로 수지세척을 세척합니다.FITC 수정을 위해 KYF 베어링 수지 1그램을 따로 두십시오. 나머지 수지는 95%의 트리플루오로아세산에 담급니다. 2.5%트리이소프로필란과 2.5%의 물은 3시간 동안 수지에서 트리펩티드를 갈라둡니다.다이틸 에테르로 원유 펩티드를 섭씨 20도까지 식힙니다. 침전액을 30~40밀리리터 의 차가운 다이틸 에테르로 3배 씻어 진공 상태에서 건조시. 다음으로, KYF 수지의 나머지 그램과 6-아세토헥사노산 30 밀리리터에 TBTU 및 DIPEA를 혼합합니다.아지드 변형 트리펩티드를 얻기 위해 실온에서 16~ 24시간 동안 혼합물을 교반한다. 그런 다음 이 수지 253밀리그램과 3.78 밀리그램의 고체 구리(I)요오디드 71.9 밀리그램의 propargyl florisean 및 DIPEA 2.24 밀리그램을 결합하십시오. 24 시간 동안 흔들면서 혼합물이 반응하게하십시오.그런 다음 FITC 변형 된 KYF 베어링 수지를 철저히 세척하십시오. FITC는 수지에서 KYF를 수정하고 수정되지 않은 트리펩티드와 동일한 방식으로 정화합니다. 나노에몰리젼을 준비하기 시작하려면, IPA의 1.5 밀리리터에 올레산 백금 II 컨쥬게이트의 10 밀리그램을 용해하십시오.이 용액을 5 밀리리터 주사기에 넣고 20 게이지 바늘을 부착하고 주사기를 반응 부위 에 주사기 펌프에 장착합니다. 주사기 펌프를 분당 0.1 밀리리터로 설정합니다. FITC 변형 KYF를 가진 나노에멀젼의 경우 FITC 변형 된 KYF 1 밀리그램과 20 밀리리터의 물에 수정되지 않은 KYF 1 밀리그램을 녹입니다.수정되지 않은 KYF를 가진 나노에멀젼의 경우, 대신 20 밀리리터의 물에 KYF 2 밀리그램을 녹입니다. FITC 수정 또는 수정되지 않은 KYF 용액을 섭씨 37도로 가열합니다. KYF 솔루션이 약 400RPM에서 교반되고 주사기가 용액과 정렬되었는지 확인합니다.이어서, 주사기 펌프를 시작하여 올레산 백금 2개의 컨쥬게이트 드롭을 현명하게 첨가하기 시작한다. 컨쥬게이트가 추가되면 교반 속도를 150RPM으로 줄이고 용액을 실온으로 냉각시킵니다. 계속 16~24시간 동안 저어줍니다.이어서, 나노멀티온을 10, 000 달톤 원심 필터 단위로 농축한다. 초순수의 4밀리리터 부분으로 원심 필터 단위로 나노에멀젼을 세 번 씻으시면 됩니다. 그리고 섭씨 4도에 수성 용액으로 보관하십시오.최종 제품은 FITC 변형 나노 입자에 대한 KYF 나노 입자 및 형광에 대한 오팔레산입니다. 수정되지 않은 KYF로 제조된 나노에멀젼의 액적물은 구형, 잘 분산되어 있으며 크기가 상대적으로 균일했다. 전송 전자 현미경 심상을 기반으로, 코어는 직경 약 107 나노미터이었다.FITC 수정 된 나노 에멀젼은 녹색으로 여기에서 나타나며 다양한 난소 암 세포주에서 세포를 입력 할 수 있습니다. 두 제제의 유체 역학 직경은 4개월 동안 물에 저장되는 동안 증가했지만 전체 치수는 보존되었습니다. 또한, 20%의 태아 소 혈청에서 배양의 하루 후에 에멀젼의 공화가 관찰되지 않았다.에멀젼에서 플래티넘의 출시는 pH 7.4에서 가장 낮았으며 4시간 후에 출시된 플래티넘의 20.8%에 불과했습니다. 플래티넘 릴리스는 pH가 감소함에 따라 가속화되었습니다. 백금 함유 KYF 코팅 된 나노 에멀젼은 이러한 난소암 세포주의 생존가능성을 임상적으로 관련된 카보플라틴에 의해 달성된 것보다 훨씬 더 큰 수준으로 감소시켰다.나노에멀젼은 또한 6개의 세포주 중 5에서 cisplatin 보다는 생존가능성에 있는 비교하거나 더 중대한 감소를 보여주었습니다. KYF 코팅 된 나노 에멀젼은 지속적으로 단독으로 올레산 백금 II 컨쥬게이트보다 생존가능성이 크거나 더 큰 감소를 유도했다. 이것은 트리펩타이드 염기 나노입자 스캐폴드 내에서 소수성 치료제를 캡슐화하는 간단하고 효율적인 방법입니다.짧은 펩타이드는 생분해성이 있으며 독성이 낮으며 의학 및 생명 공학에 중요합니다. 유기 용매에 노출되지 않도록 연기 후드에서이 절차를 수행합니다. 백금 올레산과 KYF 백금 나노에멀젼은 항암 성질을 가지고 있으므로 특별한 주의를 기울여 처리해야 합니다.이 방법은 낮은 filabilator 활동 및 장비의 관점에서 간단합니다, 그러나 그것은 합성 전략의 적당한 적용에 의존하고, 근본적인 화학 개념. 우리의 방법은 다른 작은 약물 분자를 제공하기 위해 확장 될 수있다. 나노 입자 코어는 올레산으로 구성되어 있으므로 소수성 제제의 캡슐화에 적합합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

위상 시프트 nanoemulsions (PSNE)는 지역화 된 난방을 개선하고 종양의 열 절제를 개선하기 위해 높은 강도 집중 초음파를 사용하여 기화 할 수 있습니다. 이 보고서에서는 좁은 크기 분포와 안정 PSNE의 준비가 설명되어 있습니다. 또한, 초음파로 인한 박리에 기화의 PSNE의 영향은 조직 - 모방의 유령에서 증명된다.

음향 액적 기화 및 버블이 강화 된 초음파로 인한 박리에 대한 좁은 크기 분포와 위상 - 교대 Nanoemulsions의 합성

우리는 비타민 E-TPGS를 유화제로 사용하여 폴리(락틱-코-글리콜산)로 구성된 나노 입자 및 마이크로 입자의 생산 및 특성화를 설명합니다. 유화제의 농도와 같은 다양한 제형 매개 변수를 통해 평균 직경이 220 nm에서 1.98 μm 인 나노 입자를 생성 할 수 있습니다.

비타민 E-TPGS와 단일 또는 이중 에멀젼으로 형성된 PLGA 나노 입자

우리는 코어에 자체 조립 나노 구조를 포함하는 지질 입자의 운동 안정화를 위한 탄소 나노튜브의 스마트 응용에 대해 보고합니다. 지질 입자의 준비에는 약물 전달과 같은 생물 의학 응용 분야에 사용할 수 있는 다소 낮은 농도의 탄소 나노튜브가 필요합니다.

탄소 나노 튜브에 의해 안정화 내부 자기 조립 된 지질 입자의 용이 한 제조

메 톡시 폴리에틸렌 글리콜 (B 형을 mPEG -PPheGE)의 페닐 글리시 딜 에테르 (PheGE)의 리빙 음이온 중합의 주요 단계를 설명한다. 그 결과 블록 공중 합체 마이셀 (BCM 일)은 생리 학적으로 관련 조건 얻었다에서 사일 동안 독소루비신 14 % (중량 %) 및 약물의 서방로드되었다.

π-π 스태킹 상호 작용에 의해 안정화 된 블록 공중 합체 미셀 준비하는 양친 매성 공중 합체의 음이온 중합

특이성이 높고 부작용이 적은 암 약물을 종양 부위에 전달하려면 나노 입자를 기반으로 하는 새로운 방법이 필요합니다. 여기에서는 과산화수소 매개 산화에 의해 쉽게 준비될 수 있고 종양이 감소하는 환경에서 효율적으로 해리되어 페이로드를 방출할 수 있는 이황화 가교 미셀에 대해 설명합니다.

가역 디설파이드 가교 미셀 제조를위한 손쉬운 효율적인 접근법

포함 하는 단일 체인 amphiphiles 리, 특히 지방산, 단일 체인 amphiphiles의 독특한 화학적 특성으로 인해 그 포함 diacylphospholipids에 비해 뚜렷한 속성을 전시 한다. 여기 우리는 준비, 정화, 그리고 이러한 amphiphiles의 전체 또는 일부 구성 리의 사용에 대 한 기술을 설명 합니다.

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본 연구는 나노리포솜 제제에 대한 얇은 지질 막 방법을 이용한 고전적인 수분 공급에 대해 설명하고 나노입자 특성화에 이어. 47 kDa-친수성 및 구형 단백질인 타린(tarin)은 안정성을 개선하고, 빠른 클리어런스를 피하며, 통제된 방출을 촉진하는 전략으로 성공적으로 캡슐화되었습니다. 이 방법은 소수성 분자 캡슐화에 적응될 수 있다.

생리 활성 친수성 구형 단백질의 함정에 대한 나노 리포좀의 준비 및 특성화

약물 전달 응용 분야에 사용되는 오일은 환자의 지질 프로필을 방해할 수 있으며, 이는 심혈관 질환에서 바람직하지 않습니다. 오메가-3 지방산이 풍부한 오일은 기존 오일의 건강한 대안이며 자가 유화 약물 전달 시스템에 대한 엄청난 잠재력을 가지고 있습니다.

친유성 약물의 용해도를 향상시키기 위한 건강한 오일의 자체 나노 유화

효율적인 보조제를 합리적으로 설계하기 위해 우리는 폴리 락틱 공동 글리콜 산 나노 입자 안정화 피커링 에멀젼 (PNPE)을 개발했습니다. PNPE는 강력한 세포 접촉을 위한 독특한 부드러움과 소수성 인터페이스를 가지고 있으며 고함량 항원 로딩을 제공하여 항원 제시 세포에 대한 전달 시스템의 세포 친화도를 개선하고 항원의 효율적인 내재화를 유도했습니다.

항원 내재화를 촉진하기 위한 입자 안정화 에멀젼의 세포 친화도

본 프로토콜은 생체적합성 리포솜을 생성하기 위한 미세유체 기술인 옥탄올 보조 리포솜 어셈블리(OLA)를 설명합니다. OLA는 효율적인 캡슐화를 통해 단분산 미크론 크기의 리포솜을 생산하여 즉각적인 온칩 실험이 가능합니다. 이 프로토콜은 합성 생물학 및 합성 세포 연구에 특히 적합할 것으로 예상됩니다.

생명공학을 위한 온칩 옥탄올 보조 리포솜 어셈블리

이 프로토콜에서는 항원 특이적 전신 및 점막 반응을 촉진하기 위한 보조제로 사용할 수 있는 양이온성 나노에멀젼 캡슐화 레티노산(RA)을 개발했습니다. FDA 승인 RA를 나노에멀젼에 첨가함으로써, 나노에멀젼의 근육 주사 후 질과 소장에서 항원 특이적 sIgA를 촉진시켰다.

OVA 특이적 전신 및 점막 반응을 촉진하기 위한 보조제로서의 양이온성 나노에멀젼 캡슐화 레티노산

배우세요 올레산-플래티넘(II) 나노에멀젼 합성법을 KYF 트리펩타이드로 안정화하여 항암제 전달 시스템을 개발하는 방법입니다. 생분해성 안정화제를 활용한 이 기술은 난소암 치료에 효과적인 약물 캡슐화를 가능하게 합니다.

올레산의 Tripeptide 안정 Nanoemulsion

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