경도 형광 현미경 검사 법을 통해 신경 생존 모니터링

이 프로토콜은 연구원이 1 세포 기초에 생존을 감시하고 세포 죽음 또는 생존을 현저하게 예측하는 변수를 확인하는 것을 가능하게 합니다. 기존의 세포 독성 연구는 세포의 인구를 평가하고 개별 세포를 구별 할 수있는 능력이 부족합니다. 세로 현미경 검사는 인구에 있는 각 세포에 대한 죽음의 시간의 할당을 허용합니다.

이 기술은 신경 퇴행성 질환 및 기타 조건에 대한 새로운 치료법을 평가하는 데 적합합니다. 이 방법은 신경 퇴행성 조건에서 질병 메커니즘을 탐구하는 데 매우 귀중한 것으로 입증되었으며 세포 사망이 관심있는 다른 장애로 동일한 효능을 적용 할 수 있습니다. 연구원은 과도한 독성없이 적절한 형질 전환 효율성을 달성하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다.

멀티채널 파이프와 프로토콜에 대한 친숙함으로 연습하면 시간이 지남에 따라 이러한 어려움이 줄어듭니다. 현미경 검사는 본질적으로 시각적 방법론입니다. 따라서, 이 기술은 독서 이외에 시청함으로써 보다 쉽게 이해될 수 있다.

시작하려면, 한 튜브에 감소 된 혈청 매체 및 경질 시약의 적절한 양을 결합하고, 별도의 튜브에 혈청 매체와 DNA를 감소. 실온에서 5분간 배양하세요. 그런 다음, 두 튜브의 내용을 결합하고 20 분 동안 실온에서 배양.

멀티채널 파이프와 멸균 플라스틱 쓰루를 사용하여 웰당 100마이크로리터의 신경기질 매체로 피질 뉴런을 두 번 세척합니다. 그리고 조건부 미디어 및 기타 나머지 미디어를 섭씨 37도에 저장합니다. NBM을 이전에 준비된 NBKY 솔루션 의 100 마이크로리터로 잘 교체하십시오.

20 분 후, 파이프 50 마이크로 리터의 트랜스페션 시약 및 DNA 혼합물은 각 우물로 떨어집니다. 세포를 섭씨 37도에서 20분 동안 배양합니다. NBKY 용액으로 세포를 두 번 헹구는 다.

그런 다음 100 마이크로리터의 조건부 미디어와 100개의 NBC 솔루션 마이크로리터를 우물에 추가합니다. 세포를 화상 진찰을 시작하려면 형광 현미경에 96 개의 우물 판을 놓습니다. 각 플레이트고유의 신탁 마크를 향후 정렬에 대한 참조로 사용하고 향후 참조를 위한 이미지를 저장합니다.

그런 다음 관심 영역으로 이동하여 마크에 비해 x 및 y 좌표를 기록합니다. 각 플레이트고유의 신탁 마크를 향후 정렬에 대한 참조로 사용하고 향후 참조를 위한 이미지를 저장합니다. 마지막으로, 형광 라벨을 표현하는 전감염된 세포에 초점을 맞춥니다.

적절한 형광 채널에서 정기적으로 간격이 있는 간격으로 여러 이미지를 가져 가라. 이미지 처리로 시작하려면 피지 아이콘을 두 번 클릭합니다. 그런 다음 이미지를 클릭하고 피지 바에 처리 매크로를 드래그하여 피지 내에서 매크로를 엽니다.

텍스트 프로토콜에 따라 이미지의 2~7개의 선을 조정하여 매크로 처리를 강조합니다. 그런 다음 스티치를 클릭한 다음 그리드/컬렉션 스티치를 클릭합니다. 정확하게 스티치된 이미지가 생성될 때까지 드롭다운 메뉴, 유형 및 순서 내에서 설정을 조정합니다.

이러한 선택에 따라 그리드 유형 및 스티치 순서 변수를 8선과 9번 라인에서 조정합니다. 그런 다음 라인(10)을 조정하여 웰당 이미지 수를 지정하고 필요한 경우 14줄의 배경 빼기 옵션을 true로 설정합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 롤링 볼 반경을 설정하려면 선 15를 조정하고 실행을 클릭합니다.

마지막으로, 출력 이미지 스택을 열고 텍스트 프로토콜에 따라 죽은 뉴런을 수동으로 식별합니다. 스프레드시트 파일에 데이터를 기록합니다. 통계 분석을 수행하려면 생존아이콘을 두 번 클릭합니다.

R 스크립트. 두 줄을 강조 표시하고 실행 버튼을 클릭하여 생존 라이브러리를 로드합니다. 그런 다음 5줄의 경로를 변경하여 입력 스프레드시트를 호출하고 실행 단추를 클릭합니다.

8줄과 9선을 강조 표시하고 실행 버튼을 클릭하여 Cox 비례 위험 분석을 수행합니다. 12~16번 선과 19~24번선을 강조 표시합니다. 실행 버튼을 클릭하여 누적 사망 위험과 생존 데이터를 카플란 마이어 곡선으로 플롯합니다.

이 연구에서는, 쥐 피질 뉴런은 형광 단백질 M 사과를 인코딩하는 도금으로 4 일 후에 도금에 감염되었다. 24 시간 후 형질 전환 후, 뉴런은 10 일 연속 24 시간마다 형광 현미경 검사법에 의해 이미지되었다. 이미지 수집 후, 이미지가 처리되고 세포 사망을 표시하기 위해 순차적으로 검사되었다.

각 세포에 대한 죽음의 시간은 세포 체의 형광, 형태 및 단편화의 변화에 의해 결정되었다. 돌연변이 뉴런의 생존 데이터에 대해 수행된 Cox 비례 위험 분석은 2.2의 위험 비율을 초래하였다. 이 결과는 야생 모형 인구에 비해 돌연변이 뉴런에 있는 죽음의 더 빠른 비율을 표시했습니다.

이 절차를 시도 할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 신중하게 파이프하는 것입니다. 공기 노출을 최소화하고 거품을 피하는 것은 성공적인 트랜스페트에 매우 중요합니다. 경외형 의 다음, 종방향 형광 현미경 검사는 세포 생존 외에도 단백질 국소화, 회전율 및 발현 수준을 포함하여 세포 사멸에 기여할 수 있는 다양한 요인을 추적하는 데 사용될 수 있다.

신경 변성의 분야 내에서, 경도 현미경 검사법의 동적 본질은 질병 관련 단백질의 집합이 독성 또는 보호 사건을 나타내는지에 빛을 비추고 있습니다. 이러한 시약이나 계측기는 위험하지 않습니다.