Name: 경도 형광 현미경 검사 법을 통해 신경 생존 모니터링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: 배우세요 경도 형광 현미경 검사 법을 통해 신경 세포 생존을 모니터링하는 방법을 알아보세요. 이 프로토콜은 단일 세포 수준에서 세포 사망 예측 변수를 식별하여 신경 퇴행성 질환 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리 스티브 Finkbeiner 및 로봇 현미경 선구적인 Finkbeiner 연구소의 회원을 감사 합니다. 우리는 또한 초기 소프트웨어 이미지 처리에 필요한 및 생존 분석 자동화를 구축 하기 위한 댄 Peisach 감사 합니다. 이 작품은 신경 성 질환 및 치기 (NINDS) R01-NS097542, 미시간 대학 단백질 폴딩 질병 이니셔티브, 및 앤아버 활성에 대 한 ALS를 위한 국립 연구소에 의해 투자 되었다.

모든 척추 동물 작업 사용 및 미시간 대학 (프로토콜 # PRO00007096)에서 관리 동물에 위원회에 의해 승인 되었다. 실험 동물 희생의 수를 최소화 하기 위해 신중 하 게 계획 된다. 임신 여성 야생-타입 (WT), 유전자 변형 비 긴 에반스 쥐 (Rattus norvegicus)는 실 환경 풍부 및에 단위에 대 한 실험 동물 의학 (ULAM) 미시간 대학에 의해를 걱정에서 홀로 지 내게 따라 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 게 NIH 지원 가이드 모든 쥐 안락사, 안락사의 미국 수의 의학 협회 그리고 미시간 대학에 대 한 지침의 권고와 일치 하기 전에 가능한 짧은 시간에 의해 안락사의 방법 하우징 루틴에 보관 했다 종 지침입니다.
1. 재료 준비
<ol><li>19-20 쥐 새끼와 문화13,14, 이전에 설명 된 대로 x 106 셀 4 일에서 생체 외에서폴 리-D-리 코팅된 판에 밀리 리터 당 0.5에서 대뇌 피 질의 뉴런 쥐 배아 일에서 대뇌 피 질의 신경 해 부 15,,1617,,1819.</li>
	<li>내 무료 플라스 미드 DNA 분리 하 여 설명 하는 단계에 따라 관심의 DNA 플라스 미드 준비 키트 ( 재료의 표참조). 분 광 광도 계를 사용 하 여 결과 DNA 계량.</li>
	<li>생체 외에서 날 4 (DIV4), aliquot, 필터, 소독 하 고 37 ° c: 6 mL에 다음 미디어를 품 어 감소 (RSM; 예를 들어., OptiMEM), 혈 청 미디어 25 mL 신경 기저 미디어 (NBM) 40 mL NBKY (NBM + 1 mM kynurenic 산 + 10 m m MgCl2, 7의 pH를 조정 합니다. 4) 10 mL NBC (NBM + 1 x 신경 세포 문화 보충 + L-글루타민 보충 x 1 + 1 x 펜 Strep). 참고: 나열 된 볼륨은 transfecting 한 96 잘 접시에 대 한 충분 한. 특정 약에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.</li>
</ol>2입니다. 쥐 대뇌 피 질의 신경 세포의 transfection
<ol><li>제공 된 예제 transfection 시트 수정 ( 추가 파일 1참조) 판형, 플레이트 지도, DNAs, 수를 조정 하 여 DNA 농도 및 우물 (녹색 상자)의 수. 참고: 여부 한 총 DNA의 관계 없이 잘, 당 0.2 µ g을 요약 (예:., DNA A) 이상의 (예를 들어, DNA B와 C) DNA 구조 추가 됩니다 각 잘 하.</li>
	<li>스프레드시트에서 작업 한 튜브에 RSM 및 DNA의 적절 한 금액을 결합 합니다. RSM 및 transfection 시 약 (예, Lipofectamine)는 별도 관에서의 적절 한 금액을 결합 합니다.</li>
	<li>5 분 동안 실 온 (RT)에서 품 어.</li>
	<li>DNA와 transfection 시 RSM 혼합물을 결합 하 고 20 분 동안 RT에서 품 어.</li>
	<li>멀티 채널 피 펫 사용이 인큐베이션 단계 및 세척 살 균 플라스틱 골짜기 셀 NBM의 당 100 µ L 2 x. 바른된 미디어 (CM)를 예약 하 고 37 ° c.에 저장 이 다음 단계에 대 한 뉴런 공기에 노출 되는 시간을 최소화 하기 위해 주의.</li>
	<li>NBM 미디어를 제거 하 고 NBKY의 당 100 µ L를 바꿉니다.</li>
	<li>20 분 후에 각 잘 transfection 시 약/DNA 혼합물의 50 µ L dropwise 추가 합니다.</li>
	<li>Transfection 시 약/DNA 단지 37 ° c.에 20 분에 대 한 셀을 품 어</li>
	<li>NBKY 2 x 린스와 CM의 100 µ L와 잘 당 NBC의 100 µ L를 바꿉니다.</li>
	<li>성공적으로 transfected 세포 transfection의 16-24 h 안에 형광 현미경 검사 법에 의해 표시 되어야 합니다. 효율성을 측정 하기 위해를 사용 하 여 형광 현미경 transfection 37 ° c.에 하룻밤 부 화 후 참고: 이 기술은 5 ~ 10%의 전반적인 transfection 효율 발생합니다.</li>
</ol>3입니다. 영상
<ol><li>자동화 한 무대, 형광 현미경에 접시를 놓고 접시 몇 군데는 각 시간에 맞게 사용자 수 있도록 수 탁자 (예: 접시의 하단에 표시)을 설정 합니다. 이 참조에 대 한 수 탁자의 이미지를 저장 합니다.</li>
	<li>이동의 관심 분야 하 고는 탁자에 상대적인 x y 좌표를 참고.</li>
	<li>형광 라벨 표현 transfected 세포에 초점.</li>
	<li>수동으로 또는 자동화 된 방식으로 적절 한 채널 또는 채널 (예: 빨간색 형광 단백질 [RFP] 녹색 형광 단백질 [GFP], 4, 6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), 형광 이미지를 가져가 라. 정기적으로 간격으로 여러 개의 이미지를 복용 하 여 우물의 몽타주 이미지 처리 하는 동안 조립 될 수 있다 (4 단계 참조). 참고: 간격 확대, 광학 현미경, 및 감지기 크기 등 여러 가지 요인에 따라 달라 집니다. 일반적으로, 인접 한 이미지의 광학 간격 작은 정도의 이미지 중복 허용 및 정렬 기능을 각 개별 이미지의 크기의 90-95% 사이 여야 합니다.</li>
	<li>이 프로세스는 필요한, 원래 수 탁자에 정렬 자주 때마다 반복 합니다. 생존 분석, 이미징 일어난다 셀 종류와 실험의 목적에 따라 모든 6-24 h.</li>
</ol>4. 이미지 처리
참고: 이미지 수집, 다음 단계 처리의 시리즈는 이미지 분석 전 필요한. 이 포함 되지만, 바느질, 스택 및 배경 빼기 (그림 1)에 국한 되지 않습니다. 이 단계의 목표 이미지 스택, 또는 시계열, 셀 하 명확 하 게 그들의 배경에서 인지할 수 하 고 여러 시간 점에 따라 하기 쉬운입니다. 전용된 피지 매크로 (Image_Processing.ijm, 보충 파일 2참조), 기본 바느질, 스태킹, 수행 및 배경 빼기. 이미지 처리를 수행할 때 고려해 야 할 매개 변수 및 각 단계에 대 한 설명은 토론 섹션에서 제공 됩니다.
<ol><li>그림 2에 표시 된 형식에 맞게 입력된 디렉터리 또는 원시 데이터를 조정 합니다.</li>
	<li>시간 포인트는 연속 하는 경우 (즉, T1, T2, T3), 이름을이 폴더를. 이 단계는 Image_Processing 매크로 충돌 하지 않습니다 보장 하기 위해 중요 한 누적 하는 동안.</li>
	<li>프로그램을 열고 다음 클릭 하 고 피지 바 Image_Processing 매크로 끌어 피지 아이콘 두 번 누릅니다. 이 피지 내에서 매크로 열 것 이다.</li>
	<li>2-7 개의 이미지, 봉합 및 스택 이미지에 대 한 원하는 출력 디렉터리, 이미징 timepoints의 수, 형광 채널 및 플레이트 형식 수를 포함 하는 입력된 디렉터리를 지정 하려면 Image_Processing 매크로 조정 합니다.</li>
	<li>이미지 인수 했다 순서를 결정 합니다. 이 테스트 하려면 수동으로 플러그인 드롭다운 메뉴 | 를 기동 하 여 피지에 이미지의 몽타주를 스티치 바느질 | 그리드/컬렉션 바느질. 정확 하 게 맞춘된 이미지 생성 됩니다 때까지 드롭다운 메뉴 유형 및 순서 내에서 설정을 조정 합니다.</li>
	<li>8, 9이이 선택에 맞게 Image_Processing 매크로의 라인에서 GRID_TYPE 및 STITCH_ORDER 변수를 조정 합니다.</li>
	<li>Image_Processing 매크로에 선 10을 조정 하 여 잘 당 이미지 수를 지정 합니다. 참고: 이미지의 2 x 2 몽타주에 대 한이 줄 DIM 읽을 것 = 2.</li>
	<li>배경 빼기 필요한 경우 조정 BGSUB Image_Processing 매크로에 선 14 = true.</li>
	<li>Image_Processing 매크로에 선 15를 조정 하 여 롤링 볼 반지름을 설정 합니다. 참고: 최적의 결과 얻으려면, 적어도로 반지름 설정 이미지에서 가장 큰 전경 개체의 직경.</li>
	<li>Image_Processing 매크로 시작 하려면 실행 을 클릭 합니다. 일단 시작 하 고, Image_Processing 자동으로 바느질, 스택 및 배경 빼기를 통해 사전 것입니다.</li>
</ol>5. 점수 세포 죽음
참고: 득점 세포 죽음 및 검열 데이터에 대 한 자세한 토론 섹션 참조.
<ol><li>Image_Processing 스크립트에 의해 생성 하는 이미지 스택을 찾습니다. 피지에서 엽니다.</li>
	<li>개별적으로 각 셀 번호와 분류 하는 도구를 가리킨 피지 내를 사용 합니다. T 를 누르면 각 포인트 ROI (지역 관심) 관리자에 셀 식별자를 추가 합니다. 참고: 식별자는 ROI 관리자에서 레이블 및 모두 표시 확인란을 클릭 하 여 구상 될 수 있다.</li>
	<li>
각 이미지 스택과 기록 timepoint 각 세포 사망 또는 파일 Survival_spreadsheet.csv (보조 파일 3 참조)에서 검열을 요구 하는 경우에 timepoints 통해 진행.
	<ol>
<li>각 셀 스프레드시트, 잘 대응을 잘 내 투자 수익 번호 각 셀에 대 한 고유 식별자 (ID)로 구성 되어 단일 행을 차지 합니다. tp_death 셀 살아있을, time_death 시간에 죽음의 실제 시간을 나타냅니다 동안 관찰은 마지막 시간입니다. 각 셀에 대 한 이러한 데이터를 입력 합니다. 그것은 생존을 사용 하 여 후속 분석을 위해이 구조를 유지 하기 위해 중요 한입니다. R ( 보조 파일 4참조). 참고: 세포 죽음을 결정 하기 위한 기준을 중요 한와 셀 유형에 따라 다를 수 있습니다. 세 가지 주요 기준 죽은 신경11,20 (그림 3)의 식별에 사용 됩니다: 형광 강도 (예: 신경 1 69 h)의 손실의 셀 (예: 신경 2 188 h), 몸과 neurite의 손실 무결성 또는 blebbing (예: 신경 2 188 h).</li>
	</ol>
</li>
	<li>마지막 열에 있는 셀의 검열 상태를 기록 합니다. 참고: 여기에, 독특한 방법에의 한 검열은 처리 R에 의해 검열 된 셀에 의해 표시 된다 0, 무수정된 셀 1에 의해 표시 되는 동안. Note는 마지막 시간 포인트 사는 모든 셀 검열, 고 따라서 0로 표시.</li>
</ol>6. 수행 콕스 비례 위험 분석 및 시각화 결과
<ol><li>필요한 경우, https://cran.r-project.org/mirrors.html에서 R 스튜디오를 다운로드 합니다.</li>
	<li>연구 스튜디오를 열고 생존에 대 한 아이콘을 두 번 클릭 합니다. R 스크립트.</li>
	<li>생존의 2 줄에 커서를 놓습니다. R 생존 라이브러리를 로드 하려면 주요 R 스튜디오 창에서 실행 버튼을 클릭 합니다.</li>
	<li>생존의 5 줄을 변경 합니다. R 스크립트 파일의 위치를 일치 하도록 Survival_spreadsheet.csv. dataframe로 생존 데이터 로드를 실행 을 클릭 하십시오.</li>
	<li>8-9 라인을 강조 하 고 콕스 비례 위험 분석을 수행 하기 위해 R 스튜디오 콘솔 창에서 실행 버튼을 클릭 합니다. 결과 및 출력 통계 R 스튜디오의 콘솔 창에 나타납니다.</li>
	<li>12-16 생존의 라인을 강조 표시 합니다. R R 스튜디오에서 플롯 탭에 표시 됩니다 죽음 플롯의 누적 위험을 생성 하기 위해 실행 버튼을 누르십시오. 작 위에 있는 내보내기 단추를 클릭 하 여이 파일을 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>카 플 란-마이어 곡선으로 생존 데이터를 플롯 하는 것이 바람직합니다, 19-24 생존의 라인을 강조 표시 합니다. R 실행 버튼을 누르십시오.</li>
</ol>

<ol><li>Lockshin, R. A., Zakeri, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell death in health and disease.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11, 1214-1224 (2007).</li>
<li>Kepp, O., Galluzzi, L., Lipinski, M., Yuan, J., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+assays+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Cell death assays for drug discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10, 221-237 (2011).</li>
<li>Lemasters, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+permeability+transition+in+cell+death%3A+a+common+mechanism+in+necrosis%2C+apoptosis+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial permeability transition in cell death: a common mechanism in necrosis, apoptosis and autophagy.</a> Biochimica et Biophysica Acta Bioenergetics. , 177-196 (1998).</li>
<li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labelled+Annexin+V%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V.</a> Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).</li>
<li>Chien, K. R., Abrams, J., Serroni, A., Martin, J. T., Farber, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+phospholipid+degradation+and+associated+membrane+dysfunction+in+irreversible%2C+ischemic+liver+cell+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Accelerated phospholipid degradation and associated membrane dysfunction in irreversible, ischemic liver cell injury.</a> Journal of Biological Chemistry. 253, 4809-4817 (1978).</li>
<li>Zwaal, R. F. A., Comfurius, P., Bevers, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+exposure+of+phosphatidylserine+in+pathological+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Surface exposure of phosphatidylserine in pathological cells.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 62, 971-988 (2005).</li>
<li>Mitchell, D. B., Santone, K. S., Acosta, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+cytotoxicity+in+cultured+cells+by+enzyme+leakage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Culture+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of cytotoxicity in cultured cells by enzyme leakage.</a> Journal of Tissue Culture Methods. 6, 113-116 (1980).</li>
<li>Moran, J. H., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+beta-NADH-linked+fluorescence+assay+for+lactate+dehydrogenase+in+cellular+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">A rapid beta-NADH-linked fluorescence assay for lactate dehydrogenase in cellular death.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 36, 41-44 (1996).</li>
<li>Mossman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+colorimetric+assay+for+cellular+growth+and+survival%3A+Application+to+proliferation+and+cytotoxicity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays.</a> Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).</li>
<li>Guerzoni, L. P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Modulation+of+TrkB+Receptor+Signaling+upon+Sequential+Delivery+of+Curcumin-DHA+Loaded+Carriers+Towards+Promoting+Neuronal+Survival%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">In Vitro Modulation of TrkB Receptor Signaling upon Sequential Delivery of Curcumin-DHA Loaded Carriers Towards Promoting Neuronal Survival.</a> Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).</li>
<li>Arrasate, M., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+microscope+system+for+determining+factors+that+predict+neuronal+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Automated microscope system for determining factors that predict neuronal fate.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102, 3840-3845 (2005).</li>
<li>Christensen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivariate+survival+analysis+using+Cox%E2%80%99s+regression+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Multivariate survival analysis using Cox’s regression model.</a> Hepatology. 7, 1346-1358 (1987).</li>
<li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+induction+enhances+TDP43+turnover+and+survival+in+neuronal+ALS+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models.</a> Nature Chemical Biology. 10, 677-685 (2014).</li>
<li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelioration+of+toxicity+in+neuronal+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+by+hUPF1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112, 7821-7826 (2015).</li>
<li>Malik, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrin+3-dependent+neurotoxicity+is+modified+by+nucleic+acid+binding+and+nucleocytoplasmic+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Matrin 3-dependent neurotoxicity is modified by nucleic acid binding and nucleocytoplasmic localization.</a> Elife. 7, (2018).</li>
<li>Archbold, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP43+nuclear+export+and+neurodegeneration+in+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+frontotemporal+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">TDP43 nuclear export and neurodegeneration in models of amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia.</a> Scientific Reports. 8, 4606(2018).</li>
<li>Green, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAN+translation+at+C9orf72-associated+repeat+expansions+is+selectively+enhanced+by+the+integrated+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">RAN translation at C9orf72-associated repeat expansions is selectively enhanced by the integrated stress response.</a> Nature Communications. 8, 2005(2017).</li>
<li>Park, S. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+essential+Sis1+chaperone+reduces+TDP-43+effects+on+toxicity+and+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the essential Sis1 chaperone reduces TDP-43 effects on toxicity and proteolysis.</a> PLOS Genetics. 13, e1006805(2017).</li>
<li>Gupta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Proline%2FArginine+Dipeptide+from+Hexanucleotide+Repeat+Expanded+C9ORF72+Inhibits+the+Proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">The Proline/Arginine Dipeptide from Hexanucleotide Repeat Expanded C9ORF72 Inhibits the Proteasome.</a> eNeuro. 4, (2017).</li>
<li>Angelov, B., Angelova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+clustering+of+the+neurotrophin+receptor+TrkB+revealed+by+super-resolution+STED+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Nanoscale clustering of the neurotrophin receptor TrkB revealed by super-resolution STED microscopy.</a> Nanoscale. 9 (28), 9797-9804 (2017).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

여기, 직접 단일 셀 기준 신경 생존을 모니터링 하는 방법론을 제시 합니다. 이 방법은 다양 한 세포 형태학, 단백질 표정, 지역화 등 요인의 지속적인 평가 대 한 수 있는 전통적인 분석 실험 세포 죽음에 대 한 개별 시간 포인트 및 셀의 전체 인구는, 달리 고 어떻게 각 요소 잠재 방식으로 세포 생존에 영향을 확인할 수 있습니다.
이 방법론은 다양 한 실험적인 요구에 맞게 수정할 수 있습니다. 주파수 및 이미징의 기간 쉽게 조정 될 수 있다, 그리고 관심의 모든 단백질 단백질 기능13,,1415, 조사 하거나 질병 상태를 형광 표시와 함께 공동 transfected 수 16,17...

비정상적인 세포 죽음은 암, 뇌졸중1, neurodegeneration, 등 많은 질병에 영향을 미치는. 세포 죽음에 대 한 강력 하 고 중요 한 분석 확장 하거나 세포 생존을 감소 시키기 위한 치료 전략의 개발으로 서 이러한 장애의 특성에 필수적입니다. 현재 직접 또는 대리 마커2세포 죽음을 측정 하기 위한 기법의 수십 있습니다. 예를 들어 세포 죽음 평가 될 수 있다 시각적으로 또는 특정 인지질 원형질 막4,5,6의 모습을 모니터링 하 여 중요 한 염료를 선택적으로 죽 었 거 나 살아있는 세포3, 얼룩의 도움으로 . 측정 세포내 구성 요소 또는 셀룰러 산시 미디어로 출시 세포 대사 산물의 세포 죽음7,8에 대 한 프록시 사용할 수 있습니다. 또는, 세포 생존 수 수 직선 근사 줄 대사 활동9,10를 평가 하 여. 비록 이러한 방법을 세포 생존 평가의 빠른 수단을 제공, 그들은 경고 없이 되지 않습니다. 각 기술은 단일 인구, 개별 셀 및 생존의 그들의 독특한 속도 사이의 구별을 불가능 렌더링으로 문화를 관찰 합니다. 또한, 이러한 인구 기반 분석 실험 세포 형태학, 단백질 표정, 또는 지역화를 포함 하 여 세포의 죽음에 대 한 중요 한 될 수 있는 요소를 측정할 수 없습니다. 대부분의 경우에서 이러한 분석 개별 시간 포인트 제한 되며 시간이 지남에 셀의 연속 관측에 대 한 허용 하지 않습니다.
대조적으로, 경도 형광 현미경 검사 법은 직접 그리고 지속적으로 단일 셀 기준11에 죽음의 위험을 모니터링 하는 매우 유연한 방법입니다. 간단히, 경도 형광 현미경 세포 죽음 및 강화 하거나 세포 죽음 억제 하는 요인의 정확한 결심을 허용 하는 시간의 연장된 기간에 대 한 정기적 추적을 개별 셀의 수천 수 있습니다. 그것의 기초에는 방법은 형광 단백질을 인코딩 벡터와 과도 transfection 또는 셀의 변환 포함 한다. 고유한 신탁 설립 다음 하며이 랜드마크에 관하여 각 transfected 세포의 위치 이미지를 시간, 일, 또는 주에 걸쳐 개별 셀을 추적 하는 사용자 보면 이러한 이미지는 순차적으로, 형광, 형태학, 및 각 셀에 대 한 죽음의 시간 할당을 사용 하면 세포 체의 분열에서 세포 죽음 특성 변화에 의해 표시 됩니다. 죽음, 위험 함수에 의해 결정의 계산된 속도 수 있습니다 다음 양적 조건 사이의 비교 또는 일변량 또는 복수 콕스 비례 위험 분석12를 사용 하 여 셀룰러 특징 선택 관련. 함께, 이러한 접근 세포 인구 가운데 세포 죽음의 비율 그리고 크게 세포 죽음 및 생존 (그림 1)를 예측 하는 변수 식별의 정확 하 고 객관적인 차별 가능
이 메서드는 형식 도금의 다양 한 모든 포스트 mitotic 세포 종류에 생존을 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다, 하지만이 프로토콜 transfecting 및 쥐 대뇌 피 질의 뉴런 96 잘 접시에 배양 이미징에 대 한 조건을 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>Neurobasal 매체</td><td>GIBCO</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>GIBCO</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>CompactPrep 플라스미드 맥시 키트</td><td>Qiagen</td><td>12863</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘 육수화물</td><td>시그마</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Kynurenic Acid Hydrate</td><td>TCI</td><td>H0303</td><td></td></tr><tr><td>폴리 D-Lysine</td><td>Millipore</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>GIBCO</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>52887</td><td></td></tr><tr><td>B27 보충제</td><td>Thermo Fisher</td><td>A3582801</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>GIBCO</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>96 웰 플레이트</td><td>TPP</td><td>0876</td><td></td></tr></tbody></table>

경도 형광 현미경 검사 법을 통해 신경 생존 모니터링

Monitoring Neuronal Survival via Longitudinal Fluorescence Microscopy

표준 세포 독성 분석 실험, 여러 시간 점에서 고정된 세포 lysates의 필요, 감도 및 신경 운명에 영향을 주는 요소를 평가 하는 능력을 제한 했다. 이 분석 실험 개별 시간 포인트에서 세포의 별도 인구의 관찰을 해야합니다. 그 결과, 개별 셀 지켜질 수 없다 prospectively subcellular 이벤트, puncta 형성 등 단백질 mislocalization, 질병, 병원 성 드라이버 homeostatic 응답 인지를 구별할 수 있는 능력을 가혹 하 게 제한 하는 시간이 지남에 또는 단순히 우연 현상입니다. 단일 셀 경도 현미경 연구원 인구 사이 생존에 차이 확인 하 여 향상 된 감도와 인과 관계를 그릴 수 있도록 이러한 한계를 극복 한다. 이 비디오 가이드는 형광 단백질 마커를 표현 하는 쥐 주 대뇌 피 질의 뉴런의 단일 세포 생존을 측정 하는 실험에 대 한 대표적인 워크플로 개요 것입니다. 뷰어는 transfections 높은 효율을 달성, 수집 및 개별 셀의 예비 추적을 사용 하면 이미지를 처리 하는 방법을 배울 것 이다 고 신경 인구 콕스 비례 위험 분석을 사용 하 여의 상대 생존 됩니다.

여기 설명 된 transfection 절차를 사용 하 여, DIV4 쥐 대뇌 피 질의 뉴런 형광 단백질 mApple 인코딩 플라스 미드와 페 했다. 시작 24 시간 후 transfection, 세포 했다 몇 군데 형광 현미경 검사 법 모든 24 h에 의해 10 일 연속. 결과 이미지 다음 그림 2에 표시 된 대로 구성 했다 물 렸 다, 스택, 및 세포 죽음 (그림 1)에 대 한 득점. 그림 3 은 시간 코스 3 대표 뉴런에 대 한 세 번째 동안 실험 (신경 1과 2)의 과정을 다이의 두 통과 (신경 3).
생존 데이터 (생존 제공 하는 R 스크립트를 사용 하 여 분석 했다. R), 그리고 ...

여기, 선물이 단일 셀 기준 생존을 모니터링 하 고 크게 세포 죽음을 예측 하는 변수를 식별 하는 프로토콜.

Standard cytotoxicity assays, which require the collection of lysates or fixed cells at multiple time points, have limited sensitivity and capacity to ...

이 프로토콜은 연구원이 1 세포 기초에 생존을 감시하고 세포 죽음 또는 생존을 현저하게 예측하는 변수를 확인하는 것을 가능하게 합니다. 기존의 세포 독성 연구는 세포의 인구를 평가하고 개별 세포를 구별 할 수있는 능력이 부족합니다. 세로 현미경 검사는 인구에 있는 각 세포에 대한 죽음의 시간의 할당을 허용합니다.이 기술은 신경 퇴행성 질환 및 기타 조건에 대한 새로운 치료법을 평가하는 데 적합합니다. 이 방법은 신경 퇴행성 조건에서 질병 메커니즘을 탐구하는 데 매우 귀중한 것으로 입증되었으며 세포 사망이 관심있는 다른 장애로 동일한 효능을 적용 할 수 있습니다. 연구원은 과도한 독성없이 적절한 형질 전환 효율성을 달성하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다.멀티채널 파이프와 프로토콜에 대한 친숙함으로 연습하면 시간이 지남에 따라 이러한 어려움이 줄어듭니다. 현미경 검사는 본질적으로 시각적 방법론입니다. 따라서, 이 기술은 독서 이외에 시청함으로써 보다 쉽게 이해될 수 있다.시작하려면, 한 튜브에 감소 된 혈청 매체 및 경질 시약의 적절한 양을 결합하고, 별도의 튜브에 혈청 매체와 DNA를 감소. 실온에서 5분간 배양하세요. 그런 다음, 두 튜브의 내용을 결합하고 20 분 동안 실온에서 배양.멀티채널 파이프와 멸균 플라스틱 쓰루를 사용하여 웰당 100마이크로리터의 신경기질 매체로 피질 뉴런을 두 번 세척합니다. 그리고 조건부 미디어 및 기타 나머지 미디어를 섭씨 37도에 저장합니다. NBM을 이전에 준비된 NBKY 솔루션 의 100 마이크로리터로 잘 교체하십시오.20 분 후, 파이프 50 마이크로 리터의 트랜스페션 시약 및 DNA 혼합물은 각 우물로 떨어집니다. 세포를 섭씨 37도에서 20분 동안 배양합니다. NBKY 용액으로 세포를 두 번 헹구는 다.그런 다음 100 마이크로리터의 조건부 미디어와 100개의 NBC 솔루션 마이크로리터를 우물에 추가합니다. 세포를 화상 진찰을 시작하려면 형광 현미경에 96 개의 우물 판을 놓습니다. 각 플레이트고유의 신탁 마크를 향후 정렬에 대한 참조로 사용하고 향후 참조를 위한 이미지를 저장합니다.그런 다음 관심 영역으로 이동하여 마크에 비해 x 및 y 좌표를 기록합니다. 각 플레이트고유의 신탁 마크를 향후 정렬에 대한 참조로 사용하고 향후 참조를 위한 이미지를 저장합니다. 마지막으로, 형광 라벨을 표현하는 전감염된 세포에 초점을 맞춥니다.적절한 형광 채널에서 정기적으로 간격이 있는 간격으로 여러 이미지를 가져 가라. 이미지 처리로 시작하려면 피지 아이콘을 두 번 클릭합니다. 그런 다음 이미지를 클릭하고 피지 바에 처리 매크로를 드래그하여 피지 내에서 매크로를 엽니다.텍스트 프로토콜에 따라 이미지의 2~7개의 선을 조정하여 매크로 처리를 강조합니다. 그런 다음 스티치를 클릭한 다음 그리드/컬렉션 스티치를 클릭합니다. 정확하게 스티치된 이미지가 생성될 때까지 드롭다운 메뉴, 유형 및 순서 내에서 설정을 조정합니다.이러한 선택에 따라 그리드 유형 및 스티치 순서 변수를 8선과 9번 라인에서 조정합니다. 그런 다음 라인(10)을 조정하여 웰당 이미지 수를 지정하고 필요한 경우 14줄의 배경 빼기 옵션을 true로 설정합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 롤링 볼 반경을 설정하려면 선 15를 조정하고 실행을 클릭합니다.마지막으로, 출력 이미지 스택을 열고 텍스트 프로토콜에 따라 죽은 뉴런을 수동으로 식별합니다. 스프레드시트 파일에 데이터를 기록합니다. 통계 분석을 수행하려면 생존아이콘을 두 번 클릭합니다.R 스크립트. 두 줄을 강조 표시하고 실행 버튼을 클릭하여 생존 라이브러리를 로드합니다. 그런 다음 5줄의 경로를 변경하여 입력 스프레드시트를 호출하고 실행 단추를 클릭합니다.8줄과 9선을 강조 표시하고 실행 버튼을 클릭하여 Cox 비례 위험 분석을 수행합니다. 12~16번 선과 19~24번선을 강조 표시합니다. 실행 버튼을 클릭하여 누적 사망 위험과 생존 데이터를 카플란 마이어 곡선으로 플롯합니다.이 연구에서는, 쥐 피질 뉴런은 형광 단백질 M 사과를 인코딩하는 도금으로 4 일 후에 도금에 감염되었다. 24 시간 후 형질 전환 후, 뉴런은 10 일 연속 24 시간마다 형광 현미경 검사법에 의해 이미지되었다. 이미지 수집 후, 이미지가 처리되고 세포 사망을 표시하기 위해 순차적으로 검사되었다.각 세포에 대한 죽음의 시간은 세포 체의 형광, 형태 및 단편화의 변화에 의해 결정되었다. 돌연변이 뉴런의 생존 데이터에 대해 수행된 Cox 비례 위험 분석은 2.2의 위험 비율을 초래하였다. 이 결과는 야생 모형 인구에 비해 돌연변이 뉴런에 있는 죽음의 더 빠른 비율을 표시했습니다.이 절차를 시도 할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 신중하게 파이프하는 것입니다. 공기 노출을 최소화하고 거품을 피하는 것은 성공적인 트랜스페트에 매우 중요합니다. 경외형 의 다음, 종방향 형광 현미경 검사는 세포 생존 외에도 단백질 국소화, 회전율 및 발현 수준을 포함하여 세포 사멸에 기여할 수 있는 다양한 요인을 추적하는 데 사용될 수 있다.신경 변성의 분야 내에서, 경도 현미경 검사법의 동적 본질은 질병 관련 단백질의 집합이 독성 또는 보호 사건을 나타내는지에 빛을 비추고 있습니다. 이러한 시약이나 계측기는 위험하지 않습니다.

monitoring-neuronal-survival-via-longitudinal-fluorescence-microscopy

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

종방향 형광 현미경(Longitudinal Fluorescence Microscopy)을 통한 신경 세포 생존 모니터링

우리는 오랜 기간이 이상의 형광 현미경을 통해 뉴런을 생활에서 mitochondria의 이미징 수있는 프로토콜을 설명합니다. 연장 기간 동안 이미지가 mitochondrially 대상으로 형광 단백질과 설계 및 우리 연구실에 지어진 저렴한 무대 위로 보육의 이용 lentivirus - 중재 표현을 통해 수행됩니다.

Neuromodulation 및 Mitochondrial 교통 : 긴 기간이 이상 Hippocampal 뉴런의 라이브 영상

불후의 N19 - oligodendrocyte 세포 문화에 caspase - 3의 중재 apoptosis의 라이브 세포 이미징의를...

모니터링 죽습 Caspase - 3 활동 및 칼륨 - 유도 막 탈분극 다음 라이브 세포 이미징 및 Cleaveable 형광 염색 기판을 사용하여 불후의 Oligodendroglial 세포의 Apoptosis

이 보고서 표면 표현, 운송 경로 및 exogenously 표현, 산도에 민감한 GFP-태그를 뉴런의 플라즈마 막에 단백질의 인신 매매 속도론을 결정하는 라이브 세포 이미징 및 photobleach 기법의 사용을 설명합니다.

교양 뉴런의 막 단백질의 측면 보급과 Exocytosis은 형광 복구 및 형광 손실 Photobleaching를 사용하여 평가

출처: Krishnamurthy, K. et al. Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (2021)이 비디오는 유전적으로 암호화된 칼슘 바이오센서를 발현하는 ALS 돌연변이 뉴런의 시냅스 활동을 모니터링하기 위한 실시간 칼슘 이미징을 보여줍니다. 뉴런 시냅스 활동을 반영하는 세포 내 칼슘 수치의 실시간 변화를 측정하기 위해 이미징, 칼슘 역학 자극 및 형광 기록을 위해 뉴런을 준비하는 단계를 간략하게 설명합니다.

Fluorescence Imaging of Synaptic Calcium Dynamics in an In Vitro Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis(근위축성 측삭 경화증의 시험관 내 모델에서의 시냅스 칼슘 역학의 형광 이미징)

노화 시 세포 내 Ca2+ 리모델링은 흥분 독성 및 뉴런 손상에 기여할 수 있으며, 이는 Ca2+ 과부하에 의해 매개되는 과정입니다. 우리는 신경 노화 모델인 쥐 해마 뉴런의 장기 배양에서 세포질 및 미토콘드리아 Ca2+의 형광 및 생물 발광 이미징을 사용하여 노화 뇌의 Ca2+ 리모델링을 조사하는 것을 목표로 했습니다.

하는 세포 칼슘의 형광 및 생물 발광 영상<sup&gt; 2 +</sup&gt; 노인 해마 신경 세포에서

뒤에 소프트웨어 기반 후 처리 시간 경과 비디오 현미경에 의해 신경 인구를 모니터링 하는 강력한 프로토콜 설명 되어 있습니다. 이 메서드는 선택 된 인구 라이브 이미징 실험 동안에 생물 학적 이벤트를 식별 하는 강력한 도구를 나타냅니다.

영상 모니터 세포 생물학과 여러 신경 인구의 계보 진행을 추적 하는 단일 셀 다음 라이브

제시 여기 경작 하는 수정 된 롤러 튜브 방법 이며 photoetched coverslips에 정확한 위치와 많은 주 동안 설치류 두뇌의 간헐적인 고해상도 이미징 조각. 신경 생존 및 슬라이스 형태로 잘 유지 됩니다. 셀 형 특정 식에 대 한 바이러스를 사용 하 여이 완전히 동봉 된 시스템의 응용 프로그램에 제공 됩니다.

정확 하 게 지역화 하 고 반복적인 뇌 조각 동봉 된 시스템에서의 장기적인 문화 중 간헐적인 이미징 수정된 롤러 튜브 메서드

라이브 셀 이미징 고정된 셀 이미징 혼자 여 달성 하지 않은 단일 셀 이나 전체 인구에 풍부한을 정보를 제공 합니다. 여기, 라이브 세포 이미징 프로토콜 안티 mitotic 마약 paclitaxel와 치료 다음과 세포 운명 결정을 평가 하는 설명 합니다.

장기 라이브 셀 이미징 셀 운명 Paclitaxel에 대 한 응답에서을 평가 하

신경 줄기/전구 세포는 세포 이벤트의 다른 결과로 이끌어 내는 노치 신호 분대의 각종 표현 역학을 전시합니다. 이러한 동적 발현은 유전자 발현의 급격한 변화를 시각화할 수 있는 매우 민감한 생물 발광 이미징 시스템을 사용하여 정적 분석이 아닌 실시간 모니터링을 통해 밝혀질 수 있습니다.

뮤린 신경 발생 시 노치 신호 역학의 실시간 생물 발광 이미징

시냅스 전달에 필요한 세포하 이벤트를 시각화하기 위해 두 가지 관련 방법이 설명된다. 이들 프로토콜은 시험관내 배양된 뉴런의 라이브 세포 이미징을 사용하여 시냅스 전 칼슘 유입 및 시냅스 소포막 융합의 역학의 실시간 모니터링을 가능하게 한다.

근위축성 측삭 경화증 모델에서 시냅스 기능의 실시간 형광 측정

배우세요 경도 형광 현미경 검사 법을 통해 신경 세포 생존을 모니터링하는 방법을 알아보세요. 이 프로토콜은 단일 세포 수준에서 세포 사망 예측 변수를 식별하여 신경 퇴행성 질환 연구에 활용됩니다.

경도 형광 현미경 검사 법을 통해 신경 생존 모니터링

더 많은 동영상 탐색