Name: 다양 한 생 화 확 적인 접근을 사용 하 여 소설 CK2 키 기판의 식별 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: 학습하세요 CK2 기질을 생화학적 방법으로 라벨링하고 정제하여 식별하는 기술입니다. 세포 또는 조직 용액에서 내인성 단백질 기질을 효과적으로 분석할 수 있습니다.

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이 작품은 펜실베니아 보건에서 T.I.S.의 연방 보편적인 연구 향상 그랜트에 의해 부분적으로 지원

참고: 필요한 자료 사용 가능 하 고 제대로 준비 되는지 확인 ( 재료의 표참조).
1입니다. 준비
<ol><li>기계적 조직 샘플 (조직 세포의 용 해 버퍼, 표 1의 100 µ L에 1-2 mg) lyse 세포 (세포의 용 해 버퍼의 350 µ L에서 80-90% 합칠 즉는 10 cm 접시) 실험에 대 한 샘플의 900 µ L의 총 수집 되 고 목표와 교양 또는. 이 볼륨의 아래에서 설명 하는 실험에 필요한 약간의 초과에서 note.</li>
	<li>4 ° c.에 3 분 동안 17500 x g 에서 원심 분리 하 여 샘플 다운 스핀 완료 되 면, 각각 3 개의 새로운 1.7 mL microcentrifuge 튜브는 상쾌한의 270 µ L을 전송. 약 90 µ L 남아 있을 것입니다. "입력된 컨트롤" 및 새로운 튜브에 장소 사용할 수 40 µ L을 제거 합니다. 얼음에 모든 샘플을 놓습니다.</li>
</ol>2. 키 분석 결과: thiophosphorylation 및 알
<ol><li>270 µ L를 포함 하는 것은 다음과 같이 3 개의 튜브 라벨: "니 rxn", "GTPγS만", 및 "PNBM (p nitrobezyl mesylate)만". 니 반응 준비.<ol>
<li>"니 rxn" 튜브를 CK2의 (1350 U에 해당) 2.7 µ L을 추가 다음 2.5 mM GTPγS의 2.7 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>"GTPγS만" 튜브 2.5 m m GTPγS, 2.7 µ L을 추가 하 고 세포의 용 해 버퍼의 2.7 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>"PNBM만" 튜브에 세포의 용 해 버퍼의 5.4 µ L를 추가 합니다. 모든 튜브 믹스 하 고 다음 즉시 얼음에 장소를 터치 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>30 ° C 물 욕조에 1 분에 대 한 모든 3 개의 튜브를 품 어. 부 화, 다음 모든 3 개의 튜브를 12 mg/mL PNBM의 13.5 µ L를 추가 합니다. 샘플 혼합 반전입니다. 1 시간에 대 한 실 온에서이 샘플을 품 어.</li>
	<li>시작 후는 인큐베이션 단계 2.2에서에서, 빨리 과정 약 45 분 소요 가능한 염 열을 준비 합니다.</li>
</ol>3입니다. 열 담의 준비
<ol><li>처음 반전 저장 버퍼에 다시 Sephadex G-25 중단 수 지를 여러 번 각 열에 의해 열 (이 예에서는 실험 3)를 준비 합니다. 수 지 클램프 스탠드에 각 열을 연결 하 고 약 5 분 동안 그대로 앉아 시키는 하 여 정착을 허용 합니다.</li>
	<li>맨 아래 하단 개방 폐기에 대 한 흐름을 통해 수집 하는 튜브를 중력에 의해 배수 저장 버퍼 수 있도록 열 아래쪽에서 뚜껑을 제거 Sephadex G-25 수 지의 정착에 따라.</li>
	<li>일단 저장소 버퍼 고갈 열 equilibrate 위해 세포의 용 해 버퍼의 약 2.7 mL를 추가 합니다. 흐름을 통해 수집 하 고 삭제. 3 회 반복 한다. 최종 평형에 따라 열 단계 4.1에 대 한 준비가.입니다.</li>
</ol>4입니다. PNBM의 제거
<ol><li>1 h 인큐베이션 (2.2 단계) 및 열 준비 (3 단계) 완료 되 면 샘플 열에 적용 됩니다. 각 열을 다음과 같이 레이블: "니 rxn", "GTPγS만", 및 "PNBM만". 각각의 열에 각 샘플의 모든 로드. 수집 하 고 흐름을 통해 삭제.</li>
	<li>각 열에 세포의 용 해 버퍼의 420 µ L을 추가 하 여 샘플을 씻으십시오. 세포의 용 해 버퍼 필터링 하는 열을 통해 고 폐기를 위해 흐름 통해 수집을 허용 합니다. 이 세척 단계 튜브 샘플의 컬렉션에 대 한 위치에 배치 합니다.</li>
	<li>각 열에 세포의 용 해 버퍼의 500 µ L을 추가 하 여 샘플을 elute. 지금 포함 alkylated CK2 기판 및 thiophosphorylated 흐름-통해 수집 합니다.</li>
</ol>5. Immunoprecipitation: 1 부
<ol><li>각각 elutions ("니 rxn", "GTPγS만", 및 "PNBM만")의 각 단계 4.3에서에서 수집에서 "차입 입력 제어" 샘플에 대 한 첫 번째 제거 80 µ L에 의해 immunoprecipitation에 대 한 샘플을 준비 합니다. 각 샘플에서 80 µ L의 제거, 다음 약 420 µ L 샘플 당 남아 있을 것입니다.<ol>
<li>200 µ L을 포함 하는 2 관으로 각 샘플을 분할. 각 각 튜브 라벨: "니 rxn 안티 thiophosphate 에스테 르", "니 rxn IgG", "GTPγS 안티 thiophosphate 에스테 르", "GTPγS IgG", "PNBM 안티 thiophosphate 에스테 르", 및 "PNBM IgG".</li>
	</ol>
</li>
	<li>안티 thiophosphate 에스테 르 항 체 안티 thiophosphate 에스테 르 레이블 튜브의 각의 2.8 µ g와 2.8 µ g isotype 제어 항 체 IgG 라는 튜브의 각의 추가 합니다. 2 h 4 ° C에서 회전자에 튜브를 놓습니다.</li>
	<li>5.2 단계에서 2 h 외피의 마지막 15 분 동안 단백질 A/G 구슬의 준비를 시작 합니다.</li>
</ol>6. 단백질 A/G agarose 구슬 준비
<ol><li>짧게 소용돌이 구슬 되도록 저장 튜브는 완전히 다시 일시 중단. p 200의 끝을 잘라 피 펫 팁을 증가 하기 위하여 깨끗 한 면도날을 사용 하 여 표시기 크기. 피펫으로 100 µ L 당 새로운 1.7 mL microcentrifuge 튜브에 immunoprecipitation 구슬 슬러리의. 이 예제에서는 6 튜브의 총 필요 합니다.</li>
	<li>17500 x g 4 ° c.에 1 분 동안에 관을 원심 상쾌한을 제거 하 고 삭제. 세포의 용 해 버퍼와 짧게 소용돌이의 200 µ L에 다시 구슬을 일시 중단 합니다. 스핀을 반복 하 고 단계 3 번 세척.</li>
	<li>5.2 단계에서 부 화 완료 될 때까지 최종 세척 후 얼음에 비즈를 놓습니다.</li>
</ol>7. Immunoprecipitation: 부 II
<ol><li>단계 5.2에서에서 2 h 부 화 후 4 ° c.에 3 분에 17500 x g 에서 샘플 다운 스핀 원심 분리 후 세척된 구슬 튜브를 사용 각 샘플에서 200 µ L을 추가 합니다. 1 시간에 4 ° C에서 회전자에 튜브를 놓습니다.</li>
	<li>1 h 부 화에 따라 원심 17500 x g 4 ° c.에 1 분 동안에 관 다음 각 예제에서 상쾌한의 40 µ L을 제거 하 고 "고갈 제어"로 저장 (총 6 관). 상쾌한 및 폐기의 나머지 부분을 제거 합니다. 알아서 하지 구슬을 방해.</li>
	<li>세포의 용 해 버퍼 및 vortexing의 200 µ L를 간단히 추가 하 여 샘플을 씻으십시오. 다음 4 ° c.에 1 분 동안 17500 x g 에서 원심 상쾌한을 제거 하 고 삭제. 세척을 반복 하 고 단계 3 번 회전. 알아서 하지 다음이 단계 동안 구슬을 방해.</li>
	<li>세척 단계를 완료 한 후 구슬을 포함 하는 각 샘플에 2 x 샘플 버퍼의 50 µ L를 추가 합니다. 다른 모든 샘플에 대 한 샘플 버퍼 x 6의 8 µ L를 추가: "입력된 컨트롤", "차입 입력된 컨트롤" 및 "고갈 컨트롤".</li>
	<li>일단 버퍼 튜브, 피펫으로 위쪽 및 아래쪽을 혼합, SDS 페이지를 진행 하기 전에 5 분 동안 95 ° C에서 모든 샘플을 열에 추가 됩니다.</li>
</ol>8입니다. 결과의 분석/검증
<ol><li>성공적인 CK2 종속 thiophosphorylation 알을 확인 합니다.<ol>
<li>2.2 단계에서 thiophosphorylation CK2 중재의 효능을 확인 하려면 SDS 페이지와 15-20 µ L "차입 입력 컨트롤" 12.5 %polyacrylamide 젤에 단계 5.1에서에서 수집을 실행 하 여 서 부 럽을 수행 합니다.</li>
		<li>다음 항 체와 세포 막 프로브: 안티-thiophosphate 에스테 르, 안티-CK2α, 및 안티-GAPDH (또는 다른 적절 한 로드 제어). 이 단계에 성공 하면 향상 된 안티-thiophosphate 에스테 르 신호 다른 두 레인 (그림 2)에 비해 "니 rxn" 차선에서 해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>시각화 CK2의 풍부한 putative 기판 고 단백질 정체성을 결정 합니다.<ol>
<li>Immunoprecipitation 단계 성공한 경우 평가, 별도 12.5 %polyacrylamide 젤에 7.4 단계에서 구슬에서 eluted 샘플의 25-30 µ L를 실행 합니다. 모든 장비는 깨끗 한 장갑을 착용 항상이 단계 동안 오염 최소화를 확인 합니다.</li>
		<li>실험 프로토콜 (그림 3)의 다양 한 단계에서 농축된 단백질을 시각화 하기 위해 블루 Coomassie와 젤 얼룩. 새로운 razorblades를 사용 하 여 신중 하 게 소비 세 독특한 밴드에에서 존재 "니 rxn 안티 thiophosphate 에스테 르 IP" 레인, 그들의 대략 분자 무게를 지적.</li>
		<li>액체 크로마토그래피/탠덤 질량 분석 (LC-MS/MS) (그림 4)에 의해 단백질 식별이 밴드를 제출 합니다. 확인 된 단백질에 대하여 지시 하는 항 체를 사용할 수 있는 경우 입력, 고갈, SDS 페이지 질량 분석의 결과의 immunoblotting 확인 하 고 IP 분수 수집 프로토콜 (그림 4)의 과정 동안.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

여기, 우리는 복잡 한 생물학 견본에서 단백질 키 니 아 제 CK2의 기질을 식별 하는 데 상대적으로 간단한 생 화 확 적인 방법 설명. 이 프로토콜의 중요 한 단계 CK2의 특이 한 효소 속성에 기반 하 고 GTPγS 및 후속 immunoprecipitation 식별을 사용 하 여 특정 기질 단백질의 CK2 종속 thiophosphorylation를 포함 합니다. 이러한 결과 함께 우리 시연 유틸리티와이 접근의 다양성으로 우리가 지금 인간의 세포종 세포에 초파리 난소18이 전략을 적용.
양적 phosphoproteomics 접근을 사용 하 여 이전에 게시 연구의 수 실제로 소설 CK2 기판19,20,,21<sup cla...

단백질 kinases는 신호 변환 폭포의 핵심 요소입니다. 이 효소에 의해 기질 단백질의 인 산화는 세포 분열, 물질 대사, 및 다른 사람의 사이에서 분화 하는 중요 한 이벤트를 규제 하는 생물학 응답 elicits. CK2 편 표현, acidophilic 떠들고/트레오닌 키 니 아 하이 인 간에 게 효 모에서 보존 하 고는 transcriptional 규칙에서 apoptosis1 세포 주기 진행에 이르기까지 많은 세포질 과정에 중요 한 역할은 2,3. 효소는 2 개의 촉매 α의 구성 하는 heterotetramer (또는 α') 소 단위 및 2 개의 규제 β 소 단위4. 매우 다 면 발현 성 덧붙여 CK2 두 다른 특이 한 특성의 분석을 복잡 하 게 하는 즉 제정 활동5 와 듀얼 공동 기질 특이성6전시 한다. 이 후자의 속성 기질 단백질의 인 산화에 대 한 ATP로 서 GTP를 사용 하는 기능 CK2 endows.
쥐에서 CK2의 촉매 또는 규제 subunits의 유전 삭제 결과 그것은 개발 및 organogenesis7,8동안 중요 한 역할을 재생을 나타내는 배아 치 사 율. CK2 또한 여러 가지 유형의 암 overexpressed 고 따라서 유망 치료 대상9,,1011를 나타냅니다. 실제로, 특정 억제제 대상 CK2 키 니 아 제 활동은 현재이 목적12,,1314에 대 한 조사를 받고. 동안 억제 CK2의 가능한 옵션을 주어진 다 면 발현 성 자연, 대안 이며 아마도 더 합리적인 접근의 특정 암 진행의 기반이 되는 중요 한 CK2 기판 대상 하는 것. 따라서, 포괄적인 신분증과 CK2 기질 단백질의 특정 조직이 나 종양 유형 내에서이 키의 특정 함수를 elucidating 상당한 이점 될 것 이다.
여기, 우리는 셀 또는 조직 lysate 복잡 한 생물학 견본에서 CK2 기판 식별에 대 한 다양 한 생 화 확 적인 방법 설명. 이 프로토콜은 GTP 아날로그 (guanosine 5'-[γ-thio]triphosphate) 다른 생 kinases 사용할 수 없습니다 GTPγS의 사용에 의해 CK2의 듀얼 공동 기질 특이성을 이용. 효과적으로 "레이블" 후속 격리 및 식별에 대 한이 예제 내에서 기판 하 니 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>12 mg/mL PNBM</td><td>Abcam</td><td>ab138910</td><td>40.5 &마이크로; L</td></tr><tr><td>2.5 mM GTP&감마; S</td><td>시그마-알드리치</td><td>G8634-1MG</td><td>5.4 &마이크로; L</td></tr><tr><td>안티 CK2&알파; (E-7) 마우스 단클론 항체</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-373894</td><td>1:1000 for Western blotting</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH (6C5) 마우스 단클론 항체</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-32233</td><td>1:1000 for Western blotting</td></tr><tr><td>Anti-nucleolin rabbit polyclonal anti</td><td>Abcam</td><td>ab22758</td><td>1:1000 for western blotting</td></tr><tr><td>Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody</td><td>Abcam</td><td>ab92570</td><td>다양 (최종 농도 2.8 &micro; g, 각 샘플에 대해)</td></tr> <tr><td>4&ordm으로 사전 설정된 원심분리기; C</td><td>ThermoScientific</td><td>Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini EDTA-Free 프로테아제 억제제</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Lysis Buffer</td><td>아래 레시피를 참조하십시오</td>. 아래 <td>레시피를 참조하십시오</td>. <td>30 mL</td></tr><tr><td>일반 토끼 IgG 항체 (isotype control)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2729S&nbsp;</td><td>다양 함 (최종 농도 2.8 &micro; g 각 샘플)</td></tr><tr><td>PD MiniTrap 컬럼</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9180-10</td><td>3 컬럼</td></tr><tr><td>단백질 A/G 플러스 아가로스 비즈</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2003</td><td>600 &micro; L</td></tr><tr><td>재조합형 인간 CK2 홀로엔자임</td><td>뉴잉글랜드 Biolabs</td><td>P6010S</td><td>2.7 &마이크로; L</td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Labnet: Mini</td><td>Labroller Mini Labroller SKU# H5500</td><td></td></tr><tr><td>T98G 인간 교모세포종 세포</td><td>ATCC</td><td>CRL-1690</td><td></td></tr><tr><td>수조는 30&ordm으로 사전 설정; C</td><td>Shel Lab</td><td>H20 목욕 시리즈 모델 # SWB15</td><td></td></tr></tbody></table>

다양 한 생 화 확 적인 접근을 사용 하 여 소설 ck2 키 기판의 식별

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

키 기판 관계의 연구는 이러한 효소와 생리 및 병 적인 상태에서 그들의 다운스트림 목표의 기능에 대 한 완전 한 이해를 얻기 위해 필수적 이다. CK2 여러 세포질 과정에서 포함 된 기판의 수백의 성장 목록을 진화론 보존된 떠들고/트레오닌 키 니 아 제 이다. 다 면 발현 성 속성으로 인해 식별 및 CK2 기판의 종합 세트 특히 도전 하고있다 고이 중요 한 효소의 연구에서 장애물을 남아 있다. 이 문제를 해결 하려면 우리 대상된 농축 및 상 상속 CK2 기판의 식별을 가능 하 게 하는 다양 한 실험적인 전략을 고안 했다. 이 프로토콜은 lysate 셀 또는 조직에는 기판의 특정 thiophosphorylation에 대 한 허용 CK2의 독특한 듀얼 공동 기질 특이성을 활용 합니다. 이러한 기판 단백질은 이후에 alkylated, immunoprecipitated, 및 액체 크로마토그래피/탠덤 질량 분석 (LC-MS/MS)에 의해 식별. 우리는 이전 CK2 기판 초파리 난소에서 성공적으로 식별 하이 접근을 사용 하 고 여기 우리가 조사를이 방법의 적응성을 보여주는 인간 세포종 세포에이 프로토콜의 응용 프로그램을 확장 합니다 다양 한 모형 유기 체 및 실험적인 시스템에이 키의 생물학 역할.

실험 절차의 회로도 그림 1에 제공 됩니다. 기술의 기본으로 phosphoryl 그룹 전송을 위한 GTP를 사용 하 여 CK2의 특이 한 능력 이다. 에 세포 lysate thiophosphorylation 생 CK2 기판의 GTP 아날로그, GTPγS, 함께 exogenous CK2 holoenzyme의 추가. 안티 thiophosphate 에스테 르 항 체를 사용 하 여 immunoprecipitated 수 다음이 특정 기질 단백질에 thiophosphate 에스테 르 moiety를 생성 하는 alkylating 시 약 p-nitrobenzyl mesylate (PNBM)와 lysate의 후속 처리 그리고 궁극적으로 질량 분석에 의해 확인 된. T98G CK2와 GTPγS 그리고 PNBM의 추가 다음과 같은 긍정적인 결과 묘사 하는 그림 2 (세...

이 프로토콜의 목적은 레이블, 풍부, 및 단백질 키 니 아 CK2 세포 lysate 또는 조직 homogenate 같은 복잡 한 생물학 견본에서의 기판 확인 하는 것 이다. 이 메서드는이 목적을 위해 CK2 생물학의 독특한 측면을 활용합니다.

다양 한 생 화 확 적인 접근을 사용 하 여 소설 CK2 키 기판의 식별

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

이 프로토콜은 세포 또는 조직 용해와 같은 복잡한 생물학적 샘플에서 내인성 CK2 기판의 특정 라벨링 및 후속 농축 및 식별을 허용한다. 이 방법은 모든 세포 유형 또는 조직에 적용될 수 있다. 따라서 다양한 생물학적 맥락에서 CK2의 연구를 촉진한다.절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원생 인 존 Chojnowski가 될 것입니다. 시작하려면, 총 900 마이크로리터의 시료를 수집하기 위해 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 조직 샘플 또는 배양 세포를 기계적으로 분해한다. 원심분리기는 중력의 500배, 섭씨 4도에서 3분간.그런 다음, 3개의 새로운 1.7 밀리리터 미세원심분리기 튜브의 각각에 상피의 270 마이크로리터를 전송합니다. 입력 제어로 사용할 나머지 상체의 40 마이크로리터를 제거하고 새로운 튜브로 전송합니다. 모든 샘플을 얼음 위에 놓습니다.먼저, 여기에 표시된 대로 3개의 샘플 튜브각각에 라벨을 붙입니다. 키나제 반응 튜브에 CK2의 2.7 마이크로리터와 2.7 마이크로리터를 2.5 밀리머 GTPgammaS를 추가합니다. 튜브를 플릭하여 섞어 즉시 얼음 위에 놓습니다.GTPgammaS 전용 튜브에 2.7 마이크로리터 2.5 밀리머 GTPgammaS, 그리고 2.7 리시스 버퍼의 마이크로리터를 추가합니다. 혼합이 튜브를 플릭하고 즉시 얼음에 배치합니다. PNBM 전용 튜브에 5.4 마이크로리터의 리시스 버퍼를 추가합니다.튜브를 플릭하여 섞어 즉시 얼음 위에 놓습니다. 30°C에서 1분간 3개의 튜브를 모두 수조에 담는다. 그 후 각 튜브에 밀리리터당 12밀리그램에 13.5 마이크로리터의 PNBM을 추가합니다.튜브를 반전하여 샘플을 혼합하고 실온에서 1시간 동안 샘플을 배양합니다. 샘플이 인큐베이팅되는 동안 여기에 표시된 대로 샘플이 로드될 각 열에 레이블을 지정합니다. 각 열을 여러 번 반전하여 저장소 버퍼의 Sephadex G-25 수지를 다시 일시 중지하여 열을 준비합니다.각 컬럼을 클램프 스탠드에 부착하고 약 5분간 방해받지 않고 앉아 수지정착을 허용합니다. 다음으로 각 컬럼의 아래쪽 개구부 아래에 튜브를 놓습니다. 각 컬럼의 상단과 하단모두에서 캡을 제거하여 저장 버퍼가 중력에 의해 튜브로 배출되도록 합니다.저장소 버퍼가 고갈되면 각 열에 약 2.7 밀리리터의 Lysis Buffer를 추가하여 이를 상화하여 흐름을 수집하고 폐기합니다. Lysis 버퍼를 추가하고 흐름을 세 번 삭제하는 이 프로세스를 반복합니다. 시작하려면 각 샘플을 해당 열에 로드합니다.흐름을 수집하고 폐기합니다. 각 컬럼에 420마이크로리터의 리시스 버퍼를 추가하여 샘플을 세척합니다. Lysis 버퍼가 열을 통해 필터링하고 흐름을 수집하고 폐기하도록 합니다.그런 다음 샘플 수집을 위해 각 컬럼 아래에 튜브를 배치합니다. 샘플을 elute하기 위해 각 열에 500 마이크로리터의 Lysis 버퍼를 추가합니다. 지금 키나아제 반응에 있는 티오포스포리및 alkylated CK2 기판의 농축된 인구를 포함하는 통해 흐름을 수집합니다.GTPgammaS 만 반응은 어떤 내생 CK2 존재에 의해 기질 티오포스포리및 알킬것을 포함합니다. PNMB 만 반응은 배경 알키드 단백질을 포함합니다. 용출 입력 제어 샘플로 각 용출에서 80 마이크로리터를 제거합니다.다음으로 각 샘플을 각각 200마이크로리터가 포함된 두 개의 튜브로 분할합니다. 여기에 도시된 바와 같이 각 튜브를 안티 티오포스페이트 에스테르 또는 면역글로불린 G로 라벨을 붙인다. 각 티오포스페이트 에스테르 튜브에 2.8 마이크로그램의 항티오포스페이트 에스테르 항체를 첨가합니다.각 IGG 튜브에 2.8 마이크로그램의 이소타입 제어 항체를 추가합니다. 그런 다음 튜브를 섭씨 4도에서 2시간 동안 회전에 놓습니다. 샘플 인큐베이션의 마지막 15 분 동안 깨끗한 면도날을 사용하여 P200 파이펫 팁의 끝을 잘라 게이지 크기를 증가시면 됩니다.사용하기 직전에 아가로즈 구슬이 들어 있는 저장 튜브를 잠시 소용돌이시다. 절단 파이펫 팁을 사용하여 면역 침전물당 비드 슬러리 100 마이크로리터를 새로운 1.7 밀리리터 미세센심분리기 튜브로 이송합니다. 구슬이 침전되는 것을 방지하기 위해 각 전송 전에 구슬을 소용돌이치게하는 것이 중요합니다.17, 500 배 중력과 1 분 동안 섭씨 4도에서 튜브를 원심 분리합니다. 상체를 제거하고 폐기합니다. Lysis 버퍼의 200 마이크로 리터를 추가하고 잠시 혼합 소용돌이를 추가하여 구슬을 다시 중단합니다.구슬을 원심분리하고 세게 씻는 과정을 세 번 반복하십시오. 마지막 세척 후, 진행 할 준비가 될 때까지 얼음에 구슬을 놓습니다. 시료가 인큐베이팅을 마쳤을 때 원심분리기는 중력17, 500배, 섭씨 4도에서 3분간 분리합니다.그런 다음 각 샘플의 200 마이크로리터를 세척된 구슬을 포함하는 튜브로 옮겨냅니다. 튜브를 회전에 섭씨 4도에 1시간 동안 놓습니다. 다음으로, 17, 500배, 섭씨 4도에서 1분간 튜브를 원심분리합니다.각 미세입자에서 40마이크로리터를 제거하여 고갈 제어로 저장합니다. 구슬을 방해하지 않도록 주의하면서 나머지 상체를 제거하고 버리십시오. 각각에 200 마이크로리터의 리시스 버퍼를 추가하고 간략하게 소용돌이를 만들어 샘플을 씻어내라.원심분리기는 중력의 500배, 섭씨 4도에서 1분간 1분간 상주포를 폐기한다. 이 세척 및 원심 분리 과정을 세 번 반복하여 구슬을 방해하지 않도록 주의하십시오. 그 후 구슬을 포함하는 각 샘플에 2X 샘플 버퍼50마이크로리터를 추가합니다.입력 제어, 용출 입력 제어 및 고갈 컨트롤을 포함하는 다른 모든 샘플의 경우 6X 샘플 버퍼의 8 마이크로리터를 추가합니다. 파이펫각 튜브는 구슬이 들어 있는 튜브를 제외한 모든 샘플을 섭씨 95도에서 5분간 가열한 후 SDS-PAGE를 진행합니다. 면역 침전이 성공했는지 평가하기 위해 별도의 12.5 %의 폴리 아크릴 아미드 젤에서 구슬에서 벗어난 각 샘플의 25 ~ 30 마이크로 리터를 실행합니다.각 젤을 쿠마시 블루와 함께 염색하여 실험 프로토콜의 다양한 단계에서 농축된 단백질을 시각화합니다. 새롭고 깨끗한 면도날을 사용하여 키나아제 반응 항티오포스페이트 에스테르 IP 레인에 존재하는 독특한 밴드를 신중하게 절제하고 대략적인 분자량을 기록합니다. 각 고유 밴드에 새 면도날을 사용해야 합니다.이 기술의 기본 기초는이 기술은 인스포릴 그룹 전송에 대 한 GTP를 사용 하는 CK2의 특이 한 능력. GTP 아날로그와 함께 외인성 CK2 홀로효소를 첨가한 GTPgammaS는 세포 용액에, 내인성 CK2 기판의 티오포스포틸화를 초래한다. 알킬라팅 시약 p-니트로벤질 메실레이트와 함께 용액의 후속 치료는 이러한 특정 기판 단백질에 티오포스페이트 에스테르 모에티를 생성하며, 이는 항 티오포스페이트 에스테르 항체를 사용하여 면역침전될 수 있으며 궁극적으로 질량 분광법에 의해 식별될 수 있다.여기에 나타난 대표적인 긍정적인 결과에서 CK2 의존성, 티오포스포릴화 및 후속 알킬레이션이 성공했습니다. 예상대로, 서양 블로팅에 의한 향상된 안티 티오포스페이트 에스테르 신호는 GTPgammaS만이 아닌 완전한 키나아제 반응을 포함하는 차선에서만 관찰되며, PNMB는 처리된 샘플만으로 관찰된다. 면역 절전 및 암시 된 단백질의 Coomassie Blue 스테인드 젤은 긍정적 인 결과를 보여줍니다.여러 독특한 밴드는 항 티오포스페이트 에스테르 IP 레인에서만 분명하기 때문에, lysate는 외인성 CK2와 GTPgammaS로 배양되었습니다. 표시된 밴드는 젤에서 절제되고 질량 분석법에 의한 단백질 식별을 위해 제출됩니다. 이 절차에 따라, 질량 분광법에 의해 확인된 PUTative CK2 기판은 체외 키나아제 분석법에서 CK2 의존형 인산화와 같은 추가 접근법을 사용하여 검증되어야 한다.

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우리는 강력한 생화확적인 접근을 사용하여 새로운 키나아제 단백질을 특징으로 했습니다: 다른 세포주 및 조직에 있는 전용적인 항체를 가진 서쪽 얼룩 분석, coimmunocipation 실험에 의하여 상호 작용, 서쪽에 의해 검출된 키나아제 활동 인광 특이적 항체를 사용하여 블롯[32 P] ATP 라벨링에 의해.

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여기에서는 효소 변형 분석을 위해 효모 표면 표시 기질을 사용하기 위한 프로토콜을 소개합니다. 이 플랫폼은 대표적인 효소 변형 분석법으로 기질 중 하나에 대한 티로신 인산가수분해효소 SHP-2의 탈인산화 활성 분석을 사용하여 시연되었습니다.

효모 표면에 표시된 단백질의 Enzymatic modification and flow cytometry assessment (효소 변형 및 유세포 분석 평가)

학습하세요 CK2 기질을 생화학적 방법으로 라벨링하고 정제하여 식별하는 기술입니다. 세포 또는 조직 용액에서 내인성 단백질 기질을 효과적으로 분석할 수 있습니다.

다양 한 생 화 확 적인 접근을 사용 하 여 소설 CK2 키 기판의 식별

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