Name: 자동된 라이브 셀 이미징 사용 하 여 간단한 마이그레이션/침공 워크플로 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: 학습하세요 자동화된 라이브 셀 이미징을 활용한 암세포 이동 및 침입 분석 방법입니다. 이 프로토콜은 실시간 관찰을 통해 세포 이동성과 형태학을 효율적으로 연구할 수 있는 재현 가능한 통합 워크플로를 제공합니다.

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우리는 사냥꾼 의료 연구 연구소 (13-02 HMRI)를 통해 블 룸 필드 그룹 재단 자금 지원 하 고 싶습니다. X.Z는 뉴캐슬의 대학 통해 APA 장학금 및 HCRA Biomarkers 주력 박사 장학금에 의해 지원 됩니다.

참고: 두 셀 라인은 별도로 처리 합니다. 다음 절차에서는 해야 될 하나의 단일 셀 라인에 적용 경우 지정 하지 됩니다.
1. 부상 이전 셀 밀도 최적화
<ol><li>약 80% T75 cm2 조직 배양 플라스 크에 부착 세포 문화 합류에 페 놀 레드 무료 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 200 mM L-글루타민, 5% CO2 (37 ° C에서 2 µ g/mL 인슐린 보충 표준 보육 대부분 암 세포 선, 문화 정립에 대 한 조건은 세포 라인에 따라 다릅니다)입니다.</li>
	<li>폐기물 용기에 떨어져 pipetting 문화 미디어를 제거 합니다. 짧게 씻어 셀 단층 및 피펫으로를 미리 데워 0.1% 트립 신-EDTA의 2 개 mL를 피펫으로. 0.1% 트립 신-EDTA의 또 다른 2 개 mL를 추가 하 고 5 분 동안 37 ° C에서 표준 외피 조건 하에서 플라스 크를 놓습니다.</li>
	<li>부드럽게 셀의 분리를 보장 하기 위해 플라스 크를 누르고 분해 반응을 중지를 미리 데워 진된 문화 미디어의 10 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>세포 현 탁 액 15 mL 원심 분리기 튜브 및 실 온 (RT)에서 5 분 동안 200 x g 에 아래로 회전으로 전송 합니다. 조심 스럽게 셀 펠 릿을 교 반 하지 않고는 상쾌한을 제거 하 고 다른 10 mL 미리 데워 진 문화 미디어 resuspend.</li>
</ol>2. 자동된 셀 카운터 (또는 어떤 계산 방법)를 사용 하 여 셀 수를 계산
<ol><li>Dulbecco의 인산 염 x 1의 800 µ L와 resuspended 세포 현 탁 액의 희석 200 µ L 1.5 mL 원심 분리기 튜브에 염 분 (DPBS) 버퍼링.</li>
	<li>셀 카운터 60 µ m 셀 카운트 센서를 부착, 토글 누른 끝 셀 서 스 펜 션으로 병합 합니다. 셀 서 스 펜 션 센서에 그려진 성공적으로 때까지 천천히 토글 해제. 셀 농도 셀/mL에 표시 됩니다.</li>
	<li>10 mL 세포 현 탁 액에 휴대폰 번호를 계산 합니다.</li>
</ol>3. 셀 도금
<ol><li>96 잘 접시에 3 중에 셀 밀도 (40000-90000 셀/잘)의 범위에서 플레이트 세포.</li>
	<li>
라이브 셀 이미징에 접시를 놓고 모든 2 h 24 h에 대 한 검색을 예약 합니다.
	<ol>
<li>소프트웨어에서 작업 목록에서 검색 하는 일정을 클릭 합니다. 서랍 설정 창에서 접시의 위치를 확인 하 고 추가 선박 을 클릭 접시 종류를 선택 합니다. 검색 설정 창에서 또는 실험 접시 설정에 따라 스캔 패턴 편집 선택한 스캔 형식 을 표준으로 설정 합니다.</li>
		<li>시간 표시 막대 를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 설정 간격을 선택 합니다. 2 h 24 시간 일정에 추가할 검색 모든 설정 합니다. 적용을 클릭 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 마이그레이션 분석 결과 대 한 밀도 시드 최적의 셀 결정
<ol><li>세인트op 24 h 후 스캔 합류 처리 HD 단계 대비 이미지를 자동으로 수집, 분석 도구를 적용 하 고 시간에 대 한 세포 증식 곡선 생성.
	<ol>
<li>3-6 대표 이미지를 결정 하 고 새로운 이미지 컬렉션에 그들을 배치.</li>
		<li>처리 정의로 적절 한 마스크를 결정 합니다.</li>
		<li>분석 작업을 시작 합니다.</li>
		<li>시간에 대 한 합류에 따라 최적화 된 세포 밀도 결정 (6 내에서 약 100% 합류-18 h 마이그레이션 분석 결과 개시 하는 때에 따라). 참고: 합류 하는 세포를 성장 하는 데 걸리는 시간의 양을 시드 희석에 따라 다릅니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 일 1과 2: 마이그레이션 및 침입 분석 실험을 위한 준비
<ol><li>
주 1 침입 분석 결과 대 한 플레이트 코트. 참고: ECM 젤 항상 처리 하룻밤 냉장고에 배치 된 팁과 얼음에.<ol>
<li>ECM 젤 얼음 문화 미디어 100 µ g/mL를 희석 하 고 지정 된 우물으로 희석된 ECM 젤/미디어의 50 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>장소 표준 외피 조건에서 접시 하룻밤.</li>
	</ol>
</li>
	<li>하루에 2, 부드럽게 초과 미디어 발음. (현재 프로토콜, 최적화 된 시드 밀도 대 한에 늦은 오후에 셀 (uncoated) 마이그레이션 분석 결과 대 한 지정 2 96 잘 접시와 triplicates 다음 1-3에서에서 (코팅) 침공 분석 결과에 최적화 된 셀 밀도와 접시 ZR75-1 MDA-MB-231 했다 90000/잘 및 50000/글쎄, 각각).</li>
	<li>표준 배양 조건에서 하룻밤 접시를 놓습니다.</li>
</ol>6. 주 3: 상처 스크래치
<ol><li>스프레이 닦아 스크래치 도구는 biosafety에 캐비닛을 배치 하기 전에 70% 에탄올으로 보트 세척 2. 정확히 45 mL의 멸 균 (압력가) 증 류 된 물과 70% 에탄올으로 세척 보트를 1과 2를 각각 채우십시오.</li>
	<li>살 균, 세척 5 분 동안 배 1과 2에 스크래치 도구 핀 블록 (위) 장소.</li>
	<li>
마이그레이션 분석 결과 접시와 함께 시작 합니다.
	<ol>
<li>인큐베이터에서 세포를 포함 하는 접시 이동한 더 잘 스크래치 도구의 손상을 방지 하려면 건조 되었는지 확인 합니다. 플레이트 커버를 제거 하 고 스크래치 도구의 베이스 플레이트 홀더에 삽입 하 고 신중 하 게 못을 유도 하 여 기본 부분에 상단 부분을 배치. 검은 레버를 누르면 누른 한편 핀 블록을 조심 스럽게 들어올립니다. 각 잘에서 간격 육안 및 현미경의 밑에 일반적으로 볼 수 있습니다.</li>
		<li>신속 하 게 물;에 핀을 담근 다 이것은 접시 설치 동일 경우 침공 분석 결과 접시를 긁 적 전에 스크래치 도구를 청소 충분 합니다. 그렇지 않으면, 5 분 동안 멸 균 증류수 그리고 70% 에탄올으로 살 균 단계를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세척 접시 1 또는 2 시간 분리 된 셀 또는 셀을 피하기 위해 미리 데워 진된 문화 미디어와 잘 연결 시트입니다.</li>
	<li>치료의 유무에 관계 없이 지정 된 우물에 신선한 따뜻한 미디어의 100 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>
침공 분석 결과 대 한 추가 단계.
	<ol>
<li>Equilibrate 신중 하 게 차가운 미디어 발음을 5 분 동안 4 ° C에서 침공 분석 결과 접시를 놓습니다.</li>
		<li>ECM 젤 얼음 문화 미디어 5 mg/mL를 희석, 지정 된 우물으로 희석된 ECM 젤의 50 µ L을 추가 하 고 30 분 동안 표준 외피 아래에 배치.</li>
		<li>따뜻하게 업 미디어 또는 화합물을 테스트 없이 100 µ L를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>라이브 셀 이미징에 접시를 놓고 5 분 imagelock 격판덮개로 선택 선박 종류 에 대 한 equilibrate 그것 합니다. 스크래치 상처로 검색 유형 을 설정, 선택 또는 실험 판 설치 (1 이미지/잘 고 넓은 모드)에 따라 검색 패턴 을 편집 하 고 24 h 반복 스캔 마다 1-2 h 72 h에 대 한 상처는 치유 될 때까지 일정.</li>
	<li>다음 솔루션 (45 mL 보트 세척에서)의 각 상위 핀 블록 5 분: 0.5% 세제 1 넣어 스크래치 도구를 청소 하려면 (참조 테이블의 자료), 1% 세제 2 ( 재료의 표참조), 불 임 증 류 물과 70% 에탄올. 먼지 없는 환경에서의 베이스 플레이트 및 저장소에 다시 스크래치 도구를 놓습니다.</li>
</ol>7. 데이터 분석
<ol><li>서랍 설정 에 실험 접시를 선택 하 고 제거 선박을 클릭 하 여 모든 상처 치유 했다 후 지정 된 접시를 검색을 중지 합니다.</li>
	<li>후 상처, 폐쇄 상처 10%, 50%로 이미지 오른쪽을 포함 하 여 사운드 백분율의 범위를 확장 하는 3-6 대표 이미지를 수집 합니다.</li>
	<li>적절 한 처리 정의 확인 하려면 적절 한 스크래치 상처 마스크 와 합류 마스크를 적용할 세분화 조정, 정리 및 필터 를 사용 합니다. 전류/모든 미리 보기 를 사용 하 여 마스크의 정확도 볼 수 있습니다.</li>
	<li>분석 작업을 시작 합니다.</li>
	<li>데이터 분석 소프트웨어 또는 추가 분석에 대 한 내보낼 수 있습니다. 3 통계 소프트웨어에서 제공 HD 단계 이미지를 평가 하는데 사용 될 수: 상처 폭 (µ m), 상처 합류 (%)와 상대 상처 밀도 (%). 비교는 다음 섹션에서 논의 될 것입니다.</li>
</ol>

<ol><li>Graham, C. H., Lala, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+placental+invasion+of+the+uterus+and+their+control%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of placental invasion of the uterus and their control.</a> Biochemistry and Cell Biology. 70, 867-874 (1992).</li>
<li>Affolter, M., Zeller, R., Caussinus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+remodelling+through+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue remodelling through branching morphogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 831-842 (2009).</li>
<li>Brugues, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forces+driving+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">Forces driving epithelial wound healing.</a> Nature Physics. 10, 683-690 (2014).</li>
<li>Weigelt, B., Peterse, J. L., van't Veer, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+metastasis%3A+markers+and+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Breast cancer metastasis: markers and models.</a> Nature Reviews Cancer. 5, 591-602 (2005).</li>
<li>Breast Cancer: Estimated Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide in 2012. GLOBOCAN. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_cancer.aspx">http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_cancer.aspx</a> (2012).</li>
<li>Kalluri, R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basics+of+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The basics of epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Clinical Investigation. 119, 1420-1428 (2009).</li>
<li>Scully, O. J., Bay, B. H., Yip, G., Yu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genomics+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Breast cancer metastasis.</a> Cancer Genomics Proteomics. 9, 311-320 (2012).</li>
<li>Kramer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FReviews+in+Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro cell migration and invasion assays.</a> Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752, 10-24 (2013).</li>
<li>Holliday, D. L., Speirs, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+the+right+cell+line+for+breast+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Choosing the right cell line for breast cancer research.</a> Breast Cancer Research. 13, 215(2011).</li>
<li>Clark, A. G., Vignjevic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modes+of+cancer+cell+invasion+and+the+role+of+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Modes of cancer cell invasion and the role of the microenvironment.</a> Current Opinion in Cell Biology. 36, 13-22 (2015).</li>
</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

마이그레이션 및 침략 암 세포의 이동성을 평가 하기 위해 중요 한 매개 변수가 있습니다. 96 핀 스크래치 도구를 사용 하 여 2D 및 3D에서 분석 실험을 동시에 치유 하는 상처를 수행 가능 하다. 자동 스캐닝을 촉진, 떨어져 최소 중단, 안정적인 셀 문화 환경을 제공 96 핀 스크래치 도구를 사용 하 여 실시 하는 스크래치 분석 결과 제공 일관 된 스크래치 상처, 더 강력한 실험을 사용 하 고 재현 가능. 96 잘 접시 형식은 세포 선 또는 다른 약물 치료의 수를 증가의 추가 옵션을 제공 합니다. 또한, 추가 분석을 위해 셀 형태 변화와 동적 움직임을 기록할 수 있습니다.
마이그레이션/침입 분석 결과 몇 가지 필수 구성 요소와 쉽게 적용할 수 있도록 설계 되었습니다. Confluent 셀 단층 간격으로 감독된 셀 이동 되도록 부상 전에 중요 하다. 그것은 따라서 매우 권장 셀 밀도, 시드를 최적화 하 고 6-18 h 사이 기간 일반적으로 이상적 이다. 표면 및 확산 속도에 연...

셀 이동 및 침략 상처 폐쇄, 자 궁과 유선 morphogenesis1,2,3태의 침공 등 인체의 정상적인 기능을 사용할 수 있는 중요 한 생물 학적 과정이 있습니다. 인간의 몸은 이러한 생물 학적 이벤트;의 정확 하 고 엄격한 통제 그러나, 몇 가지 예외가 있다. 악성 종양, 예를 들어이 보호를 탈출, 비정상적인 증식을 전시 전 이라고 인접 조직으로 침범을 수 있습니다. 전이 암 관련 사망률4의 주요 원인입니다.
유방암은 가장 일반적으로 여성, 암 진단 이며 여성 암 관련 된 죽음의 두 번째로 높은 원인이 선진국 전세계5. 유 방 암 덕트 또는 lobules 상피 세포의 하나 이상의 계층으로 구성 된에서 유래 했다. 정상적인 유 방 상피 세포 서로 전자 cadherin 및 integrins6같은 막 단백질을 통해 지하실 막에 준수합니다. 그러나, 침 습 유방암 세포 그들의 극성 및 세포 세포 접착, 잃 었 고전적인 상피 엽 전환 (응급)를 받아야 하 고 이동 하는 기능을 얻을. 넘쳐 흐름, 후이 세포는 세포 외 기질 (ECM)에 걸쳐 이동 하 고 혈관 또는 임 파 액 체계, intravasation 및 전이성 성장7다음 다음을 입력 합니다. 큰 의미는이 발생 하는 메커니즘을 이해, 때문에 전이 암 관련 mortalities의 가장 흔한 원인은 암 밀접 하 게 관련 된 세포 마이그레이션/침공. 암 세포의 움직임을 시각화, 마이그레이션 및 침입 분석 실험 이상적인 모델을 각각 2D 및 3D 셀 운동, 공부는. 마이그레이션 침공은 microenvironment와 생물 학적 장벽을 저하 능력 상호 작용을 포함 하는 반면 세포의 움직임을 직접 평가 합니다. 마이그레이션 침공의 요구 사항으로 두 개의 프로세스가 서로 완전히 독립적 되지 않습니다.
여러 가지 방법은 마이그레이션 침공을 공부 하 고 개발 되었습니다. 울타리와 마이크로 캐리어 분석 영역;의 변화 평가를, 셀 수 있도록 셀 무료 영역 생성 Kramer 연구진이, 상처 치유, 같은 마이그레이션 분석 검토 반면, transwell 및 모 세관 분석 유인8쪽으로 이동 하는 셀의 수를 기반으로 합니다. 침공 분석 실험, 대 한 ECM 환경 예를 들어, ECM 젤 또는 콜라겐 설정할 수 있으며 3D 이동 침공 지역, 거리 및 셀 수 (예: transwell 분석 결과, 오리너구리 분석 결과)를 모니터링 하 여 평가 될 수 있다8. 비-침략 적 세포로 침입 셀을 결합 하 고 침입 세포의 행동을 평가 하는 것입니다 침공 분석 결과의 다른 유형 (예: 회전 타원 체 분석 실험). 위의 방법은 그들의 프로 죄수, 그리고 쉽게 접근, 쉽게, 반복 하 고 마이그레이션 분석 결과 결합 하는 방식으로 있고 비슷한 워크플로 분석 결과 침공은 실험적인 디자인에 우선.
이 프로토콜 셀 마이그레이션 및 라이브 셀 이미징 사용 하 여 침입의 측정을 설명 합니다. 그것은 표준 셀 문화 인큐베이터에 설치 하는 시스템을 모니터링 하는 실시간 셀입니다. 그것은 높은 정의 이미지 검색과 간격 측정 셀 또는 형광 목표에 적절 한 마스크를 적용 하 여 설정에 따라 걸립니다. 분석 결과 마이그레이션/침략의 모듈 96 잘 접시에 셀 단층에 균질 스크래치 상처를 만들기에 적합은 96 핀 스크래치 도구 사용 하 여 포함 되어 있습니다. 메커니즘은 생체 외에서 상처 치유 분석 실험, 플라스틱 또는 코팅된 표면에 2D 셀 이동 모니터링을 기반으로 합니다. 침공 또는 스크래치 상처 내 추가 ECM에 걸쳐 3D 이동 평가 수 있습니다. 간단한 워크플로 그림 1에 나와 있습니다.

<table><tbody><tr><td>0.5% 트립신-EDTA 용액 (10x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>30028-02</td> DPBS <td></td></tr><tr><td>Countess II FL 자동 세포 계수기</td>에서 2배로 희석 <td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td>자동 세포 계수</td></tr>기 <tr><td>세제 1 (Alconox)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242985</td><td>0.5% 작동 농도</td></tr><tr><td>세제 2 (Virkon S)</td><td>VetProduct DIRECT</td><td></td><td>1% 작동 집중</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium, 페놀-레드</td><td>없음 ThermoFisher Scientific</td><td>21063-045</td><td>10% FBS, 200 mM L-글루타민, 2 &mu 공급; g/ml 인슐린</td></tr><tr><td>ECM 젤(마트리겔)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6909</td><td>성장 인자 감소, 페놀 레드 무료</td></tr><tr><td>Essen ImageLock 96-웰 플레이트, 평평한 바닥</td><td>Essen</td><td>4379</td><td></td></tr><tr><td>EVE 카운팅 슬라이드</td><td>BioTools</td><td>EVS-50</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>Bovogen Biologicals</td><td>SFBS-F-500ml</td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte 96-웰 스크래치 상처 세포 침입 액세서리</td><td>Essen</td><td>4444</td><td>CoolBox, 2x CoolSink</td></tr><tr><td>IncuCyte 세포 마이그레이션 키트</td><td>포함 Essen</td><td>4493</td><td>96웰 핀 블록, 2x 세척 보트 및</td></tr><tr><td>IncuCyte ZOOM</td><td>소프트웨어 포함 Essen</td><td></td><td>라이브 세포 분석 시스템</td></tr><tr><td>인슐린 용액 인간</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민 용액(100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030-091</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 플라스크, 75cm2 성장 면적</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658175</td><td></td></tr></tbody></table>

자동된 라이브 셀 이미징 사용 하 여 간단한 마이그레이션/침공 워크플로

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

암 세포 이동성은 전이의 개시에 대 한 중요 합니다. 따라서, 셀 이동 및 침략 적 능력의 큰 의미입니다. 마이그레이션 분석 침공 분석 실험은 더 순수 관련, 원래 사이트에서 vivo에서 암 세포 dislodgment를 흉내 낸 고 세포 외 매트릭스를 통해 침입 하는 반면 2D 수준에서 셀 이동의 기본적인 통찰력을 제공 합니다. 현재 프로토콜 마이그레이션 및 침입 분석 실험에 대 한 단일 워크플로우를 제공합니다. 실시간 HD 이미지와 내장 된 분석 모듈에 대 한 통합된 자동화 된 미세한 카메라를 함께 연구 한 시간 효율, 간단 하 고 재현성 실험 옵션을 제공합니다. 이 프로토콜은 사용자가 선택할 다른 분석 방법과 소모품에 대 한 대체도 포함 됩니다.

이 마이그레이션/침입 분석 결과 상처 치유 분석 결과, 96 핀 스크래치 도구에 의해 만들어진 셀 자유로운 지역으로 이동 하는 셀의 속도 계산 하는 기반으로 합니다. 마이그레이션 및 침입 분석 실험의 차이 마이그레이션 분석 측정 셀 조직 문화 취급 플라스틱 표면 및 침략 측정값 셀에 ECM 젤 이동 이동 실험.
스크래치 도구는 지정 된 격판덮개에 일관 된 스크래치 상처를 만들기 위해 설계 되었습니다 그리고 라이브 셀 영상 중간에 스크래치 상처와 실시간 고해상도 이미지를가지고 하도록 설계 되었습니다. 두 유 방 암 세포 라인 현재 프로토콜에 사용 되는 ZR75-1 및 MDA-MB-231, luminal B로 분류 하 고 트리플 부정적인 하위 각각9. 96 핀 스크래치 도구에 의해 생성 된 스크래치 상처 700-900 µ m...

현재 프로토콜 암 세포 마이그레이션 및 실시간으로 단일 플랫폼에서 침입을 조사 하 고, 세포 이동성 및 형태학 연구를 쉽게 재현할 수 및 시간 효율적인 옵션을 제공 하는 통합된 방법을 설명 합니다.

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

암 세포 이동성은 전이의 개시에 매우 중요합니다. 따라서, 세포 이동및 종양 세포의 침습적 용량의 조사는 큰 관심사입니다. 암 세포 이동 및 침입을 실시간으로 단일 플랫폼에서 조사하기위한이 통합 방법은 세포 이동성 및 병리학을 연구하기위한 쉽게 재현 가능하고 시간 효율적인 옵션을 제공합니다.이 방법은 세포 외 매트릭스를 통해 암 세포 침입에 대한 통찰력을 제공 할 수 있으며 다른 세포 유형에 적용 될 수 있습니다. 최적의 스크래치 시간을 달성하기 위해 세포 단층이 100% 합류에 도달하면 시드 밀도가 최적화되었는지 확인하고 잠복기 기간을 연장하지 마십시오. 마이그레이션 분석에 대한 시드 셀의 최적 수를 결정하려면 96벽 판에 삼중구에 있는 밀도의 범위에 세포를 배치합니다.플레이트를 라이브 셀 이미저에 넣고 이미저 소프트웨어의 작업 목록에서 일정 검사를 선택합니다. 서랍 설정 창에서 플레이트의 위치를 결정하고 용기 추가를 클릭하여 플레이트 유형을 선택합니다. 스캔 설정 창에서 실험판 설정에 따라 스캔 패턴을 선택 또는 편집하고 스캔 유형을 표준으로 설정합니다.타임라인을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 설정된 간격을 선택합니다. 그런 다음 24시간 동안 2시간마다 스캔을 추가하고 적용을 클릭합니다. 24시간 후, 서랍 설정을 열어 실험판을 선택하고, 제거 용기를 클릭합니다.3~6개의 대표 이미지를 선택하고 새 이미지 컬렉션에 배치합니다. 적절한 처리 정의를 확인하려면 세분화 조정, 정리 및 필터를 사용하여 적절한 인플루언서 마스크를 적용하고 미리 보기 전류를 사용하여 마스크의 정확도를 확인합니다. 분석 작업을 시작하고 마이그레이션 분석이 시작되는 시기에 따라 6~18시간 이내에 시간에 대해 대략 100% 합류에 따라 최적화된 세포 밀도를 결정합니다.그런 다음, 응력 처리 분석 도구를 자동으로 수집된 고화질 상 대비 이미지에 적용하여 시간에 대한 세포 증식 곡선을 생성한다. 분석을 시작하기 전에, 얼음 차가운 세포 배양 배지에서 희석된 세포외 매트릭스 젤의 50 마이크로리터로 침략 분석용 플레이트를 밀리리터 농도당 100 마이크로그램으로 코팅한다. 그런 다음, 하룻밤 동안 세포 배양 인큐베이터에 접시를 놓는다.다음 날 오후, 여분의 배지를 부드럽게 흡인시키고, 셀룰러 매트릭스 코팅 플레이트의 적절한 우물로, 최적화된 밀도로 세포를 플레이트, 코팅되지 않은 96웰 플레이트로 플레이트한다. 그런 다음, 하룻밤 동안 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 놓는다. 다음 날에는 코팅되지 않은 이온 분석판을 스크래치 도구의 베이스 플레이트 홀더에 넣고 안내 다웰을 사용하여 홀더의 상단을 조심스럽게 베이스에 배치합니다.조심스럽게 스크래치를 만들기 위해 핀 블록을 들어 올리는 동안 검은 레버를 누르고 잡아. 각 우물의 긁힘은 육안으로뿐만 아니라 현미경으로 볼 수 있어야합니다. 이어서, 플레이트를 미리 따뜻하게 한 배양 배지로 1~2회 세척하여 분리된 세포 나 세포 시트를 제거한다.침략 분석의 경우, 방금 입증 된 바와 같이 코팅 된 접시를 긁습니다. 분리된 세포와 시트를 제거한 후, 차가운 배지를 조심스럽게 채도하기 전에 5분간 섭씨 4도에서 접시를 평형화하기 위해 미리 차가운 냉각 상자를 사용하십시오. 다음으로, 희석된 세포외 매트릭스 젤 50마이크로리터를 적절한 우물에 넣고 30분 동안 세포 배양 배양 배양소에 판을 넣습니다.거품은 세포외 매트릭스 젤로 작업 할 때 일반적이지만 70 %의 에탄올을 흡입하여 제거 할 수 있습니다. 그런 다음 100 마이크로리터의 신선하고 따뜻한 매체를 시험 화합물의 유무에 관계없이 마이그레이션 또는 침입 분석 플레이트의 적절한 우물에 추가하고 플레이트를 라이브 세포 이미징 플랫폼에 배치합니다. 스크래치 도구를 청소하려면 상단 핀 블록을 개별 45 밀리리터 워시 보트에 배치하여 5% 세제 1개, 세제 2개, 멸균 증류수 또는 70% 에탄올을 세척당 5분 동안 넣은 후 스크래치 도구를 베이스 플레이트에 다시 배치하여 먼지가 없는 환경에서 보관하십시오.상처 스캔을 이미징하기 위해 플레이트가 5분 동안 평형화할 수 있도록 허용한 후, 이미지 로그 평면으로 용기 유형을 선택하고 스캔 유형을 스크래치 상처로 설정합니다. 실험판 설정에 따라 스캔 패턴을 선택하거나 편집하고, 72시간 동안 1~2시간마다 24시간 반복 스캐닝을 예약하거나, 상처가 입증된 대로 치유될 때까지 는 24시간 씩 반복스캔을 예약한다. 모든 상처가 치유되면 스캔을 중단하고 3~6개의 대표적인 이미지를 선택하여 상처가 만들어진 직후의 이미지를 포함하여 다양한 사운드 백분율을 선택하고 상처가 10~50% 증가합니다.적절한 처리 정의를 확인하려면 적절한 스크래치 상처 마스크와 인플루언스 마스크를 시연한 대로 적용하고 미리 보기 전류를 사용하여 마스크의 정확도를 확인합니다. 그런 다음 분석 작업을 시작합니다. 마이그레이션 분석에서 상처 폭은 상처 옆의 세포 시트 사이의 평균 거리입니다.상처 합류는 상처 부위 내의 합류입니다. 이상적인 초기 상처 합류는 0%에 가깝습니다. 상대적인 상처 밀도와 상처 합류는 상처 부위를 차지하는 세포의 속도를 시사합니다.이러한 데이터는 이러한 대표적인 세포주 모두에서 거의 겹칩니다. 다른 세포주는 세포주 사이의 차동 철새 능력을 나타내는 매우 다른 상처 치유 능력을 보여줍니다. 예를 들어, 라멜리포디아는 이이동의 시작 부분에서 이선전방에서 이 유방 아데노암 세포주에서 관찰되는 반면, 이 뮤신 1-생산 유방암 세포주는 동시에 세포 이동의 흔적을 나타내지 않았다.또한, 유방 아데노암 라인의 상대적 상처 밀도는 50시간 후에 포화되었지만, 뮤신 1-생산 유방암 세포선의 상대적 상처 밀도는 시간이 지남에 따라 변하지 않았고, 아데노암 세포의 고침적인 표현형과 무신 1-유방암 세포의 비침습성을 강조했다. 아데노암 세포는 또한 세포외 매트릭스 젤을 통해 침입하는 동안 다르게 행동하고, 주요 돌출부를 가진 길쭉한 형태를 보여주고, 이주 삽에서, 이주 전면에 있는 출혈이 시각화되었습니다. 도금 할 때, 너무 적은 세포가 시드되는 경우, 스크래치가 제대로 형성되지 않습니다 기억, 너무 많은 세포가 시드되는 경우, 과밀이있을 것입니다.이 절차에 따라 트랙 트리트먼트를 추가하여이 방법을 높은 처리량 트랙 스크리닝에 적용 할 수 있습니다. 이 방법을 통해 연구자들은 높은 처리량인 단일 플랫폼에서 이러한 검사를 수행할 수 있으며, 연구자가 실험적인 엔드포인트가 아닌 실시간으로 세포를 모니터링할 수 있도록 합니다. 스크래치 도구를 살균하는 데 사용되는 소독제는 위험할 수 있습니다.관련 MSDS 및 시설의 정기적인 트리거 라인에 따라 솔루션을 수집하고 폐기해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

여기, 우리는 마우스 노상 강도의 백혈구가 추적 연구 비침습 두 개의 광자 (2P) 현미경의 접근 방식을 설명합니다. 우리는 조직 이미징 준비의 기술적 측면을 논의하고 실행 및 데이터를 수집하도록 설정 초기의 전형적인 실험을 통해 독자를 걸어보세요.

백혈구 호밍 및 마이 그 레이션의 비침습 영상 생체내에</em

암 줄기 세포 이주를 조사하기위한 compartmentalizing 마이크로 유체 장치가 설명되어 있습니다. 이 소설 플랫폼은 가능한 세포 microenvironment를 생성 및 라이브 세포 운동의 미세 시각화 할 수 있습니다. 높은 운동성 암 세포는 잠재적으로보다 효과적인 미래의 치료로 이어지는 공격적인 침투 분자 메커니즘을 공부 절연되어 있습니다.

Compartmentalizing 마이크로 유체 장치와 라이브 세포 이미징을 사용하여 암 줄기 세포 마이그레이션 평가

이 방법은 실제 시간과 같은 속도, 변위와 속도 등 다양한 세포 이주 매개 변수의 양적 측정에 세포의 모니터링이 가능합니다. 전통적인 방법과는 달리,이 실시간 접근법 끝점 양적 마이 그 레이션 측정에 기초하지 않고 대신 그것은 모니터링하고 지속적으로 서로 다른 매개 변수를 계산할 수 있습니다.

시간 경과 비디오 현미경을 이용한 세포의 무작위 마이 그 레이션의 정량 분석

이러한 세포 마이 그 레이션으로 세포 프로세스 전통적으로 2 차원, 딱딱한 플라스틱 표면에 연구하고 있습니다. 이 보고서는 직접 단백질 지방화를 시각화하고보다 생리학 관련, 3 차원 매트릭스에서 마이 그 레이션 세포의 단백질 역학을 분석하는 기술을 설명합니다.

3 차원 매트릭스에서 찬란 태그가 추가된 단백질을 표현 마이 그 레이션 전지의 라이브 세포 이미징

우리는 T 세포 활성화 과정 중에 단백질 역학에 대한 통찰력을 제공하는 라이브 세포 이미징 방법을 설명합니다. 우리는 정량적 인 결과는 T 세포 활성화에 걸쳐 복잡한 형성 신호를 따라 열매를 산출하는 T 세포의 확산 분석, 공 촛점 현미경 및 이미징 분석의 결합 사용을 보여줍니다.

T 세포의 실시간 라이브 영상은 복잡한 형성을 신호

라이브 셀 마이그레이션 연구에 대한 현미경 챔버의 접착제 및 가용성 그라디언트의 조립 방법이 설명되어 있습니다. 엔지니어링 환경 솔루션 기울기와 antifouling 표면과 접착제 트랙을 결합하기 때문에 하나가지도 단서의 상대적 중요성을 확인할 수 있습니다.

형광 현미경과 영상 셀 마이그레이션을위한 접착제 및 가용성식이 그라디언트를 만들기

이 프로토콜은 또한 중합체 매트릭스로부터 약물의 확산 속도를 결정하기 위해 사용될 수있다 화학 유인 물질에 응답하여 세포 이동을 측정하는 방법을 자세히 맞춤형.

측정 셀 마이그레이션에 대한 사용자 정의 상공 회의소

여기는 자동된 광학 카메라 현미경으로는 셀 마이그레이션에서 생체 외에서 테스트 하는 절차에 설명 합니다. 스크래치 분석 결과 널리 사용 되었습니다 어디 스크래치의 폐쇄는 세트 기간에 대 한 다음. 광학 현미경 세포 이동의 신뢰할만 하 고 저렴 한 감지 수 있습니다.

체 외에서 세포 마이그레이션 자동화 된 광학 카메라의 테스트에 대 한 스크래치 분석 결과 최적화

가장자리 지역 B 세포 (MZBs) 다시 흐름을 그들의 마이그레이션 경로 향하는 여 전단 흐름의 힘에 응답할. 이 프로토콜에는 기록 하 고 분석 응용 장치, 펌프, 현미경 이미징 시스템, 그리고 무료 소프트웨어를 사용 하 여 마이그레이션 방법을 보여 줍니다.

분석 Murine 가장자리 지역 B 세포 생체 외에서의 전단 흐름 유도 마이그레이션

이 연구는 소아 미만성 정중선 신경아교종 세포주에 적용되는 생3D 세포 면역세포화학 프로토콜을 제시하며, 3D 세포 침습 및 이동과 같은 동적 과정에서 원형질막에서 단백질의 발현을 실시간으로 연구하는 데 유용합니다.

소아 미만성 정중선 신경아교종의 Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays

이 프로토콜은 정량 분석을 통해 특정 환경 조건에서 T 세포 이동의 일차 쥐 T 세포 분리 및 타임 랩스 현미경 검사 방법을 제공합니다.

일차 쥐 CD8+ T 세포에 대한 Real-Time In Vitro Migration Assay

학습하세요 자동화된 라이브 셀 이미징을 활용한 암세포 이동 및 침입 분석 방법입니다. 이 프로토콜은 실시간 관찰을 통해 세포 이동성과 형태학을 효율적으로 연구할 수 있는 재현 가능한 통합 워크플로를 제공합니다.

자동된 라이브 셀 이미징 사용 하 여 간단한 마이그레이션/침공 워크플로

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