Name: Kinesins 연결 된 조립 분자 셔틀 역에 의해 구동 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-26T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 배우세요 kinesin 모터 단백질을 이용한 분자 셔틀 구축 방법을. 미세소관과 TIRF 현미경을 활용한 나노스케일 동적 평형 시스템 연구 기법입니다.

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저자는 기꺼이 NSF 그랜트 NSF DMR 1807514에서 재정 지원을 인정 한다. 저자는 G. Bachand 그리고 V. Vandelinder GFP kinesin 단백질을 제공 하기 위한 감사 합니다. 이 작품, 부분적으로, 통합 나노 센터에서 수행 했다, 로스 알라모 스 국립 연구소에 의해 과학의 미국 부 에너지 (DOE) 사무소는 사무실의 과학 사용자 시설 운영 (계약 없음. DE-AC52-06NA25396)와 Sandia 국립 연구소 (콘-로 번호 97 드-AC04-94AL85000). 저자는 말뚝-점-말뚝 NTA와 공업화의 그들의 선물에 대 한 박사 제니퍼 네 프와 AllVivo 관을 감사 합니다.

1. 솔루션 준비
주의: 3이 프로토콜 (톨루엔, dimethyldichlorosilane, 및 dithiothreitol)에 사용 된 시 약은 매우 유독 하다. 사용 하기 전에 관련 물질 안전 데이터 시트 (MSDS)를 참조 하십시오. 또한,이 프로토콜의 부분 같이 안전 안경, 보호 장갑의 두 세트를 착용 하는 보호의 높은 수준에서 수행 해야 합니다. 그렇지 않으면 권고 하지 않는 한 실험 모든 적절 한 개인 보호 장비 (안전 안경, 장갑, 실험실 코트, 전장 바지 및 폐쇄 발가락 신발)를 사용 하는 동안 실험실 벤치에 수행할 수 있습니다.
참고: ATP, kinesin,이 프로토콜에 사용 되는 microtubules의 농도 수정할 수 있습니다 각 실험의 요구를 주어진. 그러나, 수정, 확인 하십시오 다른 시 약의 최종 농도 주어진 동일 하 게 유지는 아래. 모든 실험은 실 온 (25 ° C)에서 수행 했다.
<ol><li>재고 솔루션의 준비 참고: 준비 및 aliquot 미리 다음 솔루션. 모든 aliquots는 실 온 (25 ° C)에서 준비 될 수 있습니다.<ol>
<li>
BRB80 버퍼 참고:이 프로토콜에 사용 되는 솔루션의 대부분을 위한 버퍼는 BRB80. BRB80 대량으로 준비 하 고는-20 ° C 냉동 고에 저장 된 수 있습니다.<ol>
<li>24.2 g 분해 piperazine-N, n ′-bis(2-ethanesulfonic acid) (파이프) 및 이온된 물 800 mL에 수산화 칼륨 (KOH)의 3.1 g 100 m m 파이프의 800 mL를 만들려고. 수산화 칼륨 (KOH)와 8에 pH 파이프 및 EGTA의 해산에 수 1 L. 올리기의 최종 볼륨을 100 mL 10 m m 염화 마그네슘 (MgCl2)의 10 mM 에틸렌 글리콜 tetraacetic 산 (EGTA) 100 mL를 추가 합니다. 참고: BRB80 버퍼에 화학 물질의 최종 농도 80 m m 파이프, 1 mM MgCl2, 및 1 밀리미터 EGTA.</li>
			<li>6.9 코 및 염 산 (HCl)를 사용 하 여 버퍼의 pH를 조정 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
ATP
		<ol>
<li>100 mM 초순에 ATP의 1 mL 솔루션을 준비 합니다. 피펫으로 10 μ aliquots로. -80 ° C 냉동 고에는 aliquots를 저장 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
GTP
		<ol>
<li>25mm 초순에 GTP의 500 μ 솔루션을 준비 합니다. 피펫으로 5 μ aliquots로. -80 ° C 냉동 고에는 aliquots를 저장 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
MgCl2
		<ol>
<li>100 mM MgCl 초순에2 의 1 mL 솔루션을 준비 합니다. 피펫으로 10 μ aliquots로. -20 ° C 냉동 고에는 aliquots를 저장 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
카 세 인
		<ol>
<li>그리고 건조 카 제인의 1 g 무게 50 mL 원뿔 원심 관에 그것을 전송. 카 세 인 분말을 튜브에 BRB80 버퍼의 35 mL를 추가 합니다.</li>
			<li>밤새 해산 추운 방에 텀블러에 솔루션을 배치 합니다. 이 시점에서 솔루션 두껍고 점성을 찾을 것입니다.</li>
			<li>튜브 수직 어떤 큰 소화 덩어리 정착 수 있도록 4 ℃ 냉장고에 둡니다. 새로운 튜브에는 상쾌한을 전송.</li>
			<li>더 많은 침전 물 밖으로 펠 렛을 1000 x g 에서 원심 분리기에 튜브를 회전 합니다. 다시 한번, 새로운 튜브는 상쾌한 전송.</li>
			<li>반복적으로 0.2 μ m (최대 압력 바 7) 필터를 사용 하 여 솔루션을 필터링 합니다. 두께가 되 고 솔루션, 많은 필터 막힌 얻을 것 이다, 그래서 필터는 분명 때까지이 단계를 반복 하 고 unclogged.</li>
			<li>UV/Vis 분 광 광도 법, 280 nm20에서 19 m m-1∙cm-1 의 카 제인의 소멸 계수를 사용 하 여를 사용 하 여 결과 솔루션에서 카 세 인 농도 결정 합니다. 카 세 인에 대 한 23 kDa의 분자량을 가정할 경우, 솔루션에 BRB80 20 mg∙mL-1 의 농도를 희석.</li>
			<li>피펫으로 20 μ aliquots로-20 ° C 냉동 고에는 aliquots를 저장 하 고.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
D-포도 당
		<ol>
<li>초순에 2 M D-포도의 1 mL 솔루션을 준비 합니다. 피펫으로 10 μ aliquots로. -20 ° C 냉동 고에는 aliquots를 저장 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
포도 당 산화 효소
		<ol>
<li>20 mg∙mL-1 포도 당 산화 효소 BRB80에서의 1 mL 솔루션을 준비 합니다. 피펫으로 10 μ aliquots로. -20 ° C 냉동 고에는 aliquots를 저장 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
카 탈 라 제
		<ol>
<li>BRB80에서 0.8 mg∙mL-1 catalase의 1 mL 솔루션을 준비 합니다. 피펫으로 10 μ aliquots로. -20 ° C 냉동 고에는 aliquots를 저장 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Dithiothreitol (DTT) 참고: DTT 약간 휘발성과 독성 때문에, 연기 후드 다음 단계 수행 하시기 바랍니다.<ol>
<li>1 M 초순에 희석 DTT의 1 mL 솔루션을 준비 합니다. 피펫으로 10 μ aliquots로. -20 ° C 냉동 고에는 aliquots를 저장 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Paclitaxel
		<ol>
<li>1mm paclitaxel DMSO에 희석의 1 mL 솔루션을 준비 합니다. 피펫으로 10 μ aliquots로. -20 ° C 냉동 고에는 aliquots를 저장 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 참고: 이러한 실험에 사용 된 DMSO는 순수.<ol>
<li>피펫으로 10 μ aliquots에 순수한 DMSO의 1 mL. -20 ° C 냉동 고에는 aliquots를 저장 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Creatine 인산 염
		<ol>
<li>초순에 0.2 M creatine 인산 염의 1 mL 솔루션을 준비 합니다. 피펫으로 10 μ aliquots로. -20 ° C 냉동 고에는 aliquots를 저장 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Creatine phosphokinase
		<ol>
<li>200 units·의 1 mL 해결책 준비 초순에 L-1 creatine phosphokinase. 피펫으로 10 μ aliquots로. -20 ° C 냉동 고에는 aliquots를 저장 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
니켈 (II) 황산 염
		<ol>
<li>초순에 50 m m 니켈 (II) 황산 염의 해결책의 500 mL를 준비 합니다. 실 온 (25 ° C)에서 솔루션을 저장 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Poly(ethylene glycol)-블록-poly(propylene glycol)-블록-poly(ethylene glycol) (말뚝-점-PEG) 솔루션
		<ol>
<li>못-점-말뚝의 2 밀리 그램을 무게 (수 평균 분자량: 14,600 g∙mol-1)-종이 무게에 NTA 분말. 못-점-말뚝-NTA 기능성된 nitrilotriacetic 산 (NTA) 그룹 triblock 공중 합체 이다. 못-점-말뚝-주권에 대 한 자세한 내용은 테이블의 자료 를 참조 하십시오.</li>
			<li>Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 분말을 전송 합니다. 튜브를 재고 니켈 (II) 황산 염 해결책의 1 mL를 추가 합니다. 분말 해산 때까지 소용돌이 볼 수 없는 수 풀 남아 있다.</li>
			<li>실 온에서 1 달까지에 대 한 저장소입니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>실험을 시작 하기 전에
	<ol>
<li>얼음 양동이 채울.</li>
		<li>각 섹션 위의 1.1.13를 1.1.1에서에서 설명 하는 13 시 약의 한 약 수 고 양동이, 따라서 얼음에 그들을 유지에 그들을 추가. 사용 하기 전에 시 약의 각 동.</li>
	</ol></li>
	<li>Microtubule 준비 참고: Microtubules의 동결 건조 된 tubulin 염료 라는 20 μ g 약 수에서 생산 했다. 647의 염료의 여기 파장은 nm.<ol>
<li>
Microtubule 성장 버퍼의 준비
		<ol>
<li>피펫으로 21.8 작은 (0.6 mL) microcentrifuge로 BRB80 버퍼의 μ 튜브. MgCl2 재고 솔루션의 1 μ, GTP 재고 솔루션의 1 μ 그리고 DMSO 재고 솔루션의 1.2 μ를 추가 합니다. 참고: 따라서, BRB80 버퍼에 시 약의 최종 농도 4 mM MgCl2, 1 mM GTP, 및 5% (v/v) 디 메 틸 sulfoxide.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Microtubule 합
		<ol>
<li>레이블이 지정 된 동결 건조 된 tubulin의 약 20 μ g 수에 직접 microtubule 성장 버퍼의 6.25 μ를 추가 합니다. 와 5 대 약 수 동 30 rps에서 s.</li>
			<li>45 분 동안 37 ° C에서 배양 전에 5 분 동안 얼음에 약 수를 냉각 하 고 1.3.3 섹션을 진행 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Microtubule 안정화
		<ol>
<li>BRB80 버퍼의 490 μ를 aliquoted paclitaxel 솔루션의 5 μ를 추가 합니다. 소용돌이 10 솔루션 30 rps에서 s.</li>
			<li>일단는 microtubules에 대 한 보육의 45 분을, BRB80/paclitaxel 솔루션 생산 microtubule 솔루션의 5 μ를 추가 합니다. 참고:이 100 희석, 안정, microtubule 솔루션 것이 라고 하 MT100. 그것은 최대 5 일 동안 사용 될 수 있습니다 그리고 각 실험에 대 한 원하는 microtubule 밀도를 희석 수 있습니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>운동 성 솔루션
	<ol>
<li>
효소 antifade, ATP 시스템, 재생 및 ATP
		<ol>
<li>BRB80 버퍼의 291 μ를 aliquoted 카 세 인 솔루션의 9.0 μ를 추가 합니다.</li>
			<li>경우 원하는 ATP 농도 실험에 대 한 새로운 0.6 mL microcentrifuge 튜브에 BRB80/카 제인 솔루션의 피펫으로 83 μ m m 1 보다 낮습니다. 그렇지 않으면, 피펫으로 85 μ 새로운 0.6 mL microcentrifuge 관으로 그 솔루션의.</li>
			<li>그 튜브를 D-포도 당, 포도 당 산화 효소의 1 μ, 카 탈 라 제의 1 μ의 DTT의 1 μ 1 μ를 추가 합니다. 참고: 이러한 화학 물질 구성 된 효소를 제거 하 여 photobleaching를 감소 시킬 것 이다 antifade 칵테일21 녹은 산소와 냉각 반응 기. 이 photobleaching 및 microtubule 해체 형광 이미징22,23동안 여기 조명에 의해 발생을 줄일 수 있습니다.</li>
			<li>ATP 농도 1 m m 보다 크게 낮은 것을 선택 하는 실험에 대 한 다음과 같은 시 약을 솔루션에 추가 ATP 회생 시스템을 만들: aliquoted creatine 인산 염 솔루션 및 aliquoted creatine의 1 μ 1 μ phosphokinase 솔루션입니다.</li>
			<li>운동 성 솔루션 주식 ATP 솔루션의 1 μ를 추가 합니다. 영화 또는 소용돌이 homogenously 화학 제품을 배포 하는 약 수. 참고: 따라서, 솔루션에 화학 물질의 최종 농도 10 μ M paclitaxel 0.5 mg·mL− 1 카 세 인, 20 m m D-포도 당, 200 μg·mL− 1 포도 당 산화 효소, 8 μg·mL− 1 catalase, 10 m m dithiothreitol, 2 mM creatine 인산 염 (추가) 하는 경우, 2 units· L− 1 creatine phosphokinase (추가) 하는 경우, 그리고 1 mM ATP. 이 운동 성 솔루션으로이 솔루션을 지칭 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Kinesin 참고:이 실험에 사용 된 재고 kinesin 솔루션 통합 나노 Sandia 국립 연구소에 대 한 센터에서 G. Bachand에 의해 준비 되 고 사용자 계약 (https://cint.lanl.gov/becoming-user/call-for-proposals.php)에서 사용 가능. 여기에 사용 되는 버퍼 구성 되어 이미 40 mM, 300 mM NaCl, 0.76 g· L-1 EGTA, 37.2 mg· L-1 EDTA, 50 g· L-1 자당, 0.2 m m TCEP, 및 50 μ M Mg-ATP. 이 일련의 실험에 대 한 rkin430eGFP kinesin 구문 사용 되었다. Kinesin 쥐 kinesin 무거운 체인 eGFP 고 C 터미널 그 태그를 꼬리 도메인24에서 융합의 처음 430 아미노산의 구성입니다. 그것은 대장균에 표현 했다 고 정화 Ni−NTA 열을 사용 하 여. GFP kinesin 재고 용액의 농도 UV/Vis 분 광 광도 법, GFP 489 nm25, 55 m m-1·cm-1 의 대 한 소멸 계수를 사용 하 여 정한 1.8 ± 0.3 μ M 이며 그 kinesin 고려는 이합체.<ol>
<li>실험에 대 한 원하는 kinesin 농도 또는 표면 밀도 결정 합니다. 일반적인 분석 실험,이 농도 20 nM. Kinesin 농도 희석 하는 경우 보다 더 hundred-fold, 0.5 mg·mL-1 카 제인의를 포함 하는 BRB80의 솔루션에 희석.</li>
			<li>Approximatively 20의 최종 농도 얻기 위해 운동 성 솔루션 kinesin 솔루션의 1 µ L를 추가 nM.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Microtubules
		<ol>
<li>10 μ MT100 솔루션 섹션 1.3 운동 성 솔루션에 추가 합니다. 참고:이 운동 성 솔루션은 최대 3 시간 동안 사용할 수 있습니다. 그 시간 후에 antifade 시스템 솔루션에 포도 당 효소 반응에 의해 고갈 때문에 그 효과 잃는다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. 흐름 셀 조립
<ol><li>
coverslips 세척
	<ol>
<li>흐름 세포에 대 한 큰 coverslip 사용 (차원: 60 m m x 25 m m)와 작은 하나 (크기: 22 x 22 mm)19.</li>
		<li>모든 coverslips 초순 두 번 에탄올과 두 번 씻어. 5 분 50-75 ° c.의 온도에 오븐에서 그들을 건조 초순에 coverslips를 sonicate</li>
		<li>청소기 자외선/오존을 사용 하 여 ( 테이블의 재료 와 제조 업체의 지침을 참조), 실 온 (25 ° C)에서 및 일반 대기 상태에서 15 분 수행이이 단계 수에 대 한 각 coverslip의 한쪽을 치료 (압력 1의 atm).</li>
		<li>조심 스럽게 (핀셋을 사용 하 여) 그것의 다른 측에 각 coverslip 바뀌고 자외선/오존 치료 뿐만 아니라 그 쪽.</li>
		<li>50-75 ° c.의 온도에 오븐에서 그들을 다시 건조 하기 전에 5 분 동안 다시 초순에 coverslips를 sonicate</li>
	</ol>
</li>
	<li>
못-점-말뚝 코팅 수 있도록 coverslips 치료 참고:는 dimethyldichlorosilane와 매우 독성이 되 고 프로토콜의이 부분에 사용 되는 톨루엔 다음과 같은 예방 조치를 복용 하는 동안 증기 두건에서 다음 단계를 수행: 보호 장갑 및 긴 소매 셔츠 그들의 실험실에서의 두 세트를 착용 코트입니다. 팔 뚝에서 피부가 한 흘림의 경우 화학 물질에 직접 노출 되는 셔츠의 소매 안에 장갑의 가장자리를 감싸 다. 보호 안경 착용.<ol>
<li>475 ml 톨루엔의 순수한 dimethyldichlorosilane의 25 mL를 희석. 15 초 동안 각 coverslip dimethyldichlorosilane 및 톨루엔 용액에 담가.</li>
		<li>톨루엔에 두 번, 세 번 메탄올에는 coverslips를 씻어. 고압된 질소를 사용 하 여 coverslips를 건조.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
흐름 세포로 coverslips를 조립
	<ol>
<li>일단은 coverslips 건조, 세로로 두 1 cm x 2.5 cm 줄무늬에 양면 테이프 2 c m x 2.5 c m 조각 잘라.</li>
		<li>섬세 한 작업와이 퍼에 큰 coverslip 넣고 테이프의 조각 사이 1 c m x 2.5 c m 영역을 만들려면 coverslip의 가장자리를 따라 세로로 테이프 줄무늬를 스틱.</li>
		<li>흐름 셀 조립 마무리 테이프 줄무늬 위에 작은 coverslip 스틱.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 흐름 셀 솔루션 흐르는
<ol><li>조립된 흐름 셀으로 approximatively 20 μ 말뚝 점 못 솔루션의 흐름. 셀에 비행 볼륨 챔버를 채울 수 있다. 다음 단계에서는 솔루션을 교환할 때 동일한 볼륨을 사용 합니다.</li>
	<li>5 분 동안 표면에 흡수 못 PPG 못 솔루션에 대 한 허용. 버퍼를 흐르는 BRB80 버퍼 말뚝 점 못 솔루션 3 번을 교환 합니다. 흐름 세포에 운동 성을 솔루션 흐름.</li>
	<li>계획 된 실험 한 시간 보다 긴 경우 증발을 방지 하기 위해 그리스와 흐름 셀의 가장자리를 밀봉 하십시오. 참고: 흐름 셀은 이제 몇 군데 될 준비가.</li>
</ol>4. 이미징 플로우 셀
<ol><li>이미지는 microtubules와 kinesin 모터 ( 재료의 표참조)에 대 한 목표 형 총 내부 반사 형광 (TIRF) 설치를 사용 하 여 수행 합니다. 참고: 여기, 우리가 사용한 현미경 100 배 1.49 / 숫자 조리개 렌즈, 642의 파장을 가진 한 두 개의 레이저를 사용 하 여 및 140의 최대 전력 mW, 그리고 또 다른 파장 488 nm 및 150의 최대 전력 mW.</li>
	<li>목표에 집중 오일 한 방울을 놓습니다.</li>
	<li>현미경 플랫폼에 흐름 셀을 배치 하 고 목적에 기름과 흐름 세포 사이 접촉까지 목표를가지고.</li>
	<li>현미경의 연동 커버 시스템을 사용 하 여 탈출에서 모든 레이저 빛을 차단.</li>
	<li>레이저를 켜고 흐름 셀의 낮은 표면에 집중. microtubules 붙일 표시 및 647의 파장에 흥분 nm. 그들은 488 nm 레이저 GFP kinesin 모터 사용 된다 642 nm 레이저를 사용 하 여 몇 군데 있을 것입니다.</li>
	<li>이미지 또는 동영상의 기록 합니다. 일반적으로, 레이저 전원이 약 30 mW 및 둘 다에 대 한 50 ms의 노출 시간 레이저 채널. 만큼 거기 운동 흐름 셀에 대 한 이미지를 기록할 수 있습니다. 참고: 레이저 조명 발가 벗은 눈에 대 한 유해 하 고 회복 불능의 피해를 일으킬 수 있습니다. 조명된 영역을 불투명 뚜껑을 완전히 덮여 있는지 확인 하십시오.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

이 작품에서는, 우리는 자기 조립 약하게 바인딩 빌딩 블록 자신의 트랙을 생성 하는 활성 나노 시스템 제시. 그림 1에서 보듯이, 활공 microtubules kinesin 모터 솔루션에서 축적 하 고 표면에 그들을 입금. Kinesin 모터 솔루션을 반환 하기 전에 짧은 기간 동안은 microtubule의 여파에 남아 있습니다. 따라서,이 실험에서 kinesin 모터 대체 상태:
(1) microtubule 단일 바인딩 상태:이 때에 kinesin 먼저는 microtubule에 바인딩합니다. 그것은 평형 상태 (2)에 존재합니다.
(2) 더블 바인딩 상태:이 경우에, microtubule 단일 바인딩 kinesin 또한 바인딩하는 표면 통해 그것의 그의 태그. 이 더블 바인딩된 상태 microtubule 추진에 대 한 수 있습니다.
(3) 단일 표면 바인딩된 상태:는 microtubule의 끝 떨어져 걸어가 고 아직 표면에서 desorbed 하지는 더블 바인딩 kinesin이이 상태입니다. 이 모터는 그림 1 (결합 및 녹색 채널)에서 관찰 될 수 있다: 그들은 몇 마이크로미터에 microtubule의 꼬리 뒤에 확장 하 고 감소 흔적을 형성.
이 프로토콜의 가장 중요 한 단계는 슬라이드에 소수 성 표면 형성 이다. 뿐만 아니라, 위험한 화학 물질 사용 합니까 하지만 또한 말뚝 점 못 kinesin 역 표면에 바인딩할 수 있습니다 표면 코트 NTA 그룹 공업화 있습니다. 또 다른 중요 한 단계는 그리스와 흐름 셀 바다 표범 어업. 이로써 흐름 셀 증발에서 액체 없이 장기간된 영상.
이 기술의 기본 수정 microtubule 농도, kinesin 농도, 및 ATP 농도 변경으로 구성 됩니다. Microtubule 농도 변경 하는 것은 표면에 활공 하는 microtubules의 수를 변경 됩니다. Kinesin 농도 변경 하는 것은 수가 kinesin 분자는 microtubule에 바인딩할 수 있는 변경 됩니다. 그러나,이 실험에 이미 정의 된 금액 위에 kinesin 농도 증가 배경 형광, 활공 하는 microtubules 남겨진 kinesin 산책로 보고 더 어렵게 증가할 수 있었다. 한편, 10 µ M 아래 ATP 농도 낮추는 microtubule 활공 속도 크게 줄일 것 이다. 이 효과 바란다면 creatine 인산 가수분해 효소 및 phosphokinase 구성 된 시스템을 다시 생성 하는 ATP를 활용할 필요가 있다.
이 기법은 가능한 제한이입니다, 시스템의 큰 활성 kinesin 콘텐츠로 인해 ATP를 빠르게 사용할 수 있습니다, 실험은 특정 조건에서 1 시간 이내를 지속 될 수 있습니다. 이 예를 것입니다 경우 이중 높은 kinesin 농도이 프로토콜에 표시 됩니다 무엇 보다 5 배 높은 microtubule 농도 사용 경우.
우리의 이전 작품18에 우리 공부는 microtubules에 따라서 kinesin 모터의 공간 배급의 길이 따라 모터의 밀도의 증가에 따른 활공 microtubules kinesin 모터 솔루션에서 축적 증명은 microtubule입니다. 우리는 또한 microtubules의 활공 안정성 솔루션 kinesin 집중력과 microtubule 속도에 비선형 의존을 설명 발견.
나노 설계 시스템에서 및 동적 평형에 있는 활성 nanosystems의 디자인에서 추가 조사를 위해 제시 프로토콜 단백질 모터의 보다 효율적 사용에 대 한 방법을 포장 한다. 또한,이 시스템의 동적 특성 분자 구성 요소, 설계 하 고 자연 구조 사이의 간격의 부분을 닫는 자가 치유와 동적 교체를 공부 하기 위한 모델 시스템으로 사용할 수 있습니다.

수명이 긴, 거의 돌이킬 수 없는 채권1,2,3,,45,6 활성 nanosystems의 행동을 경 세 하는 상호 작용 특징 되었습니다 항상 있다 ,,78. 이의 잘 공부 예는 microtubule kinesin 시스템 어디 활공 microtubules irreversibly 표면 바인딩된 kinesin 모터1,2,,34에 의해 추진 되, 5. 있는 구성 요소는 역에 연결 된 다른 시스템이9,10 을 이론적으로 공부 하 고 macroscale11,12, 달성 하지만 스케일링이 시스템에는 나노 도전 하고있다입니다. 이 대 한 주요 이유 중 하나는 그 침입 하며 종종 구성 요소 간의 채권 개혁 환경 조건에서 큰 변화. 지난13,,1415에 변경이 구현 되었습니다, 비록 그들은 그것의 환경에 적응 하는 것 보다 시스템 자체를 수정에 의존 것 이다. 다양 한 동적 동작의 탐험에 문을 열고 것입니다 있는 구성 요소 지속적으로 조립 하 고 전반적인 환경 실험 자리를 방해 하지 않고 구조로 재구성 분자 스케일 시스템을 설계 16 , 17.
여기, 우리가 설명 만드는 동적으로 조립 하 고 분해는 nanoscale에 작동 하는 시스템에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 하 고. 시스템의 일반적인 동작 되었습니다 도입된 이전18: microtubule 필 라 멘 트 표면 바인딩된 kinesin-1 모터 역 의 트랙에 의해 추진 됩니다. Kinesin 모터 단백질이 다시 곧 후 탈 착 되 전에 microtubules, 앞으로 추진 수 있도록 솔루션에서 모집 됩니다. 일단 솔루션에서 다시 그들은 새로운 microtubule 추진 하 다시 보충 될 수 있다. 지난13,14,에15, 속보 및 유대의 개혁 요구 환경 수정; kinesin 모터 표면 상호 작용 하는 동안 반면에, 우리의 흐름 셀의 환경 그대로 남아 있습니다.
이 프로토콜은 (1) 프로토콜의 모든 단계를 시각화 하 고 (2) 분석 결과 이러한 유형의 문제 해결 지원에 관심 있는 연구자를 도울 것 이다. 그것은 하 워드 외. 199319에 설명 된 절차에서 파생 되었습니다.

<table><tbody><tr><td>488 nm 레이저</td><td>Omicron Laserage</td><td>LuxX 488-150</td><td></td></tr><tr><td>642 nm 레이저</td><td>Omicron Laserage</td><td>LuxX&nbsp; 642</td><td></td></tr><tr><td>카제인</td><td>시그마</td><td>C7078-500G</td><td></td></tr><tr><td>소 간에서 추출한 카탈라아제</td><td>시그마</td><td>C40-500MG</td><td></td></tr><tr><td>크레아틴 인산염</td><td>시그마</td><td>P-7936</td><td></td></tr><tr><td>크레아틴 포스포키나제</td><td>시그마</td><td>C3755-500UN</td><td></td></tr><tr><td>D-글루코스</td><td>시그마</td><td>G2133-50KU</td><td></td></tr><tr><td>디클로로디메틸실란 용액</td><td>시그마</td><td>40140-25ML</td><td>독성</td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드</td><td>시그마</td><td>34869-100ML</td><td></td></tr><tr><td>디티오트레이톨</td><td>시그마</td><td>D0632-5G</td><td>독성</td></tr><tr><td>이클립스 TI</td><td>니콘 기기</td><td></td><td></td></tr><tr><td>eGFP rkin430</td><td>George Bachand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>제공 EGTA</td><td>시그마</td><td>e4378-25G</td><td></td></tr><tr><td>팔콘 50mL 원추형 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>포도당 산화효소</td><td>시그마</td><td>G0543-10KU</td><td></td></tr><tr><td>구아노신 삼인산</td><td></td><td>G8877-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes 섬세한 작업 와이퍼</td><td>Sigma Pharmaceuticals</td><td>8089</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>시그마</td><td>M1028-100ML</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>피셔 화학</td><td>A412</td><td>유독</td></tr><tr><td>Milli-Q 정수 시스템</td><td>Millipore Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>니켈 황산</td>염 <td>Sigma</td><td>656895-50G</td><td></td></tr><tr><td>Paclitaxel</td><td>Sigma</td><td>T1912-5MG</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma</td><td>P-6757</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F108-NTA</td><td>제공 Jennifer Neff 및 AllVivo Vascular</td><td></td><td>PEG-PPG-PEG-NTA</td></tr><tr><td>Pluronic&nbsp; F-108</td><td>Sigma</td><td>542342-250G</td><td>PEG-PPG-PEG</td></tr><tr><td>Thermo Scientific 스냅 캡 저잔류 미세 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-403-190</td><td></td></tr><tr><td>톨루엔</td><td>Fisher Chemical</td><td>T324</td><td>독성</td></tr><tr><td>세뇨관, HiLyte647 표지</td><td>세포골격, Inc.</td><td>TL670M</td><td></td></tr><tr><td>UV 오존 프로클리너</td><td>바이오포스 나노사이언</td>스 <td>PC440</td><td></td></tr><tr><td>왓츠맨&nbsp; Puradisc 주사기 필터</td><td>Sigma</td><td>WHA67840402</td><td></td></tr><tr><td>Zyla 4.2 sCMOS 카메라</td><td>Andor Technology</td><td>sCMOS 4.2</td><td></td></tr></tbody></table>

kinesins 연결 된 조립 분자 셔틀 역에 의해 구동

Assembling Molecular Shuttles Powered by Reversibly Attached Kinesins

이 프로토콜에는 kinesin 전원 분자 셔틀 표면에는 kinesins의 약한 그리고 뒤집을 수 있는 첨부 파일을 만드는 방법을 설명 합니다. 이 시스템에 이전 프로토콜 달리 microtubules 솔루션에서 kinesin 모터 단백질을 보충 하 고 표면에 그들을 배치. kinesins에 따라서 다시 채용 될 수 되 고 대량 솔루션으로 다시 탈 착 되는 전에 표면 따라 microtubules의 활공을 촉진 한다. 이 연속 조립과 해체 동적 동작 microtubules 활공 하 여 임시 kinesin 산책로의 형성 등 시스템에서 눈에 띄는 이끌어 낸다.
여러 가지 실험 방법이이 실험을 통해 설명 될 것입니다: 대 일 분 광 광도 법 시 약의 재고 솔루션의 농도 결정 하는 데 사용할 것입니다, 오존 및 자외선 (UV) 치료 그리고 silanized coverslips 것 먼저 흐름 세포, 및 총 내부 반사 형광에 탑재 되 고 전에 (TIRF) 현미경 kinesin 모터 및 microtubule 필 라 멘 트를 동시에 이미지에 사용 됩니다.

이 실험에서 우리는 1000을 사용 희석 섹션 1.3.2에서에서 준비 하는 microtubules의 시간. Kinesin 농도 20 nM, 그리고 ATP 농도 1 m m. 이미징은 TIRF 현미경을 사용 하 여 수행 되었다. 활공 microtubules kinesin 모터에서 별도로 촬영 했다: microtubules 647 nm 레이저 (그림 1, 레드), 여기에 보이는 그리고 GFP kinesin 488 nm 레이저 (그림 1, 녹색)로 표시 했다. 여기 빨간색과 녹색 빛 사이의 시간 했다 미만 1 s. 프레임 사이 시간 10 s. Microtubules 안정적인 움직임을 표시 했다. 활공 속도 평균 microtubule approximatively 800 nm/s 이었다. Microtubule 표면 밀도 400 m m-2이었다. Kinesin (녹색) 트랙 몇 마이크로미터에 대 한 (빨간) microtubules의 뒤 끝을 넘어 연장 것으로 보인다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59068/59068fig1.jpg"> 그림 1: 약하게 표면 바인딩된 kinesin 모터에 의해 추진 하는 microtubules 활공. Microtubules 앞으로 이동, 그들은 솔루션에서 kinesin 모터 축적. 이러한 모터 두 상태를 번갈아:는 microtubule에 바인딩된 단일 및 이중 바인딩된은 microtubule을 표면. 두 번 바운드 모터는 microtubule의 끝에 도달 하면 모터 뒤에 남아 하 고 천천히 약 0.1 s-1의 오프 속도 표면에서 desorbs. 그 결과, kinesin 모터의 산책로 microtubules 뒤에 남아 있다. 맨 윗줄: 레드 (microtubule) 채널. 가운데 행: 그린 (kinesin) 채널. 아래쪽 행: 레드 (microtubule) 및 녹색 (GFP kinesin) 채널을 결합 하 여. 눈금 막대: 20 µ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59068/59068fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

선물이 분자 셔틀 만들려고 프로토콜 표면 준수 kinesin 모터 단백질 염색 이라는 microtubules을 추진. 표면으로 kinesins의 약한 상호 작용 그것에 그들의 뒤집을 수 있는 첨부 파일을 수 있습니다. 이 전시 하는 동적 어셈블리 및 그것의 기능을 유지 하면서 부품의 분해는 나노 시스템을 만듭니다.

Kinesins 연결 된 조립 분자 셔틀 역에 의해 구동

This protocol describes how to create kinesin-powered molecular shuttles with a weak and reversible attachment of the kinesins to the surface. In contrast ...

이 프로토콜은 동적 평형에있는 나노 스케일 생물학적 시스템의 설계에 대한 추가 조사의 문을 열기 때문에 중요합니다. 이 기술은 우리가 부를 수 있는 무슨의 연구, 자기 치유'또는 분자 분대의 동적 교체를 가능하게 하기 때문에 설계되고 자연적인 구조물 사이 간격의 일부를 채웁니다. 이 기술을 처음으로 시도하는 가장 중요한 조언은 실험자가 모든 안전 프로토콜을 따르는지 확인하는 것입니다.먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 스톡 솔루션을 준비합니다. BRB80 버퍼의 파이펫 21.8 마이크로리터는 작은 미세 원심분리기 튜브로 들어갑니다. 염화 마그네슘 스톡 솔루션 1마이크로리터, GTP 스톡 용액의 마이크로리터 1개, DMSO 스톡 솔루션 1.2마이크로리터를 추가하여 마이크로튜버 성장 버퍼 를 준비합니다.마이크로투블러 중합을 시작하려면 6.25 마이크로튜블러 성장 버퍼를 lyophilized tubulin의 20 마이크로그램 알리쿼트에 직접 추가하십시오. 5 초 동안 40 RPS에서 소용돌이. 얼음에 알리쿼트를 5분간 식힙니다.그런 다음 섭씨 37도에서 45분 동안 배양합니다. 마이크로튜버 안정화를 시작하려면 BRB80 버퍼의 490 마이크로리터에 알리인용 파클리탁셀 용액 5마이크로리터를 추가합니다. 10초 동안 30 RPS로 용액을 소용돌이시다.마이크로투블러에 대한 45분 의 인큐베이션이 완료되면 BRB80 및 파클리탁셀 혼합물에 5마이크로리터를 추가하여 MT100 용액을 만듭니다. 먼저, BRB80 버퍼의 291 마이크로리터에 알리인용 카제인 용액의 9.0 마이크로리터를 추가한다. 새로운 6 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 BRB80 카제인 용액의 Pipette 83 마이크로리터.D-포도당, 포도당 산화제, 카탈라제, DTT, 크레아틴 인산염 및 인포키나아제 1 마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음, 운동성 용액에 재고 ATP 용액의 마이크로리터 1을 추가합니다. 플릭, 또는 균질적으로 화학 물질을 배포하기 위해 알리쿼트 소용돌이.다음으로, 최종 농도가 20 나노몰러인 운동성 용액에 준비된 키네신 용액 1마이크로리터를 첨가한다. MOTILity 솔루션에 MT100 솔루션의 마이크로리터 10개추가합니다. 유동 셀의 경우 큰 커버슬립과 작은 커버슬립을 모두 사용하십시오.에탄올로 두 번, 초순수물로 두 번 커버립을 헹구는 다. 세척된 커버립을 초순수 물로 5분간 초음파 처리합니다. 그런 다음 섭씨 50도에서 75도 사이의 온도에서 오븐에서 커버립을 건조시십시오.UV 오존 클리너를 사용하여 실온및 정상적인 대기 조건에서 각 커버슬립의 한쪽을 15분 동안 치료하십시오. 핀셋을 사용하여 각 커버슬립을 뒤집고 UV 오존을 사용하여 처리되지 않은 측면을 치료합니다. 처리된 커버립을 초순수물로 5분간 초음파 처리합니다.그런 다음 섭씨 50도에서 75도 사이의 온도에서 오븐에서 건조하십시오. 다음으로 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 보호 장비를 착용하십시오. 각 커버슬립을 식염수 용액에 15초 동안 담급다.커버립을 톨루엔으로 두 번, 메탄올에 세 번 씻으시다. 가압 질소를 사용하여 커버립을 건조시다. 커버립이 건조하면 2센티미터의 양면 테이프를 2.5cm로 자른다.이 조각을 수직으로 반으로 2.5센티미터 스트립으로 2센티미터로 잘라냅니다. 큰 커버슬립을 섬세한 작업 와이퍼에 넣고 테이프 스트립을 가장자리에 따라 길이 방향으로 붙이면 테이프 조각 사이에 1센티미터 에서 2.5센티미터 면적을 만듭니다. 테이프 스트립 위에 작은 커버슬립을 붙이면 유동 셀 어셈블리를 완료합니다.첫째, PEG-PPG-PEG 용액의 약 20마이크로리터를 조립된 유량 셀로 플로우한다. 용액이 5분 동안 표면에서 흡수한 다음 이 솔루션을 BRB80 버퍼 20마이크로리터로 버퍼를 3회 흐르게 한다. 운동성 용액의 20 마이크로리터를 유량 셀로 플로우합니다.그 후, 계획된 실험이 1시간 이상 인 경우 증발을 방지하기 위해 유동 셀의 가장자리를 그리스로 밀봉한다. 객관적인 유형총 내부 꽃집 현미경 검사를 사용하여 이미징을 수행합니다. 목표에 침수 오일 한 방울을 놓습니다.다음으로, 현미경 플랫폼에 유동 셀을 놓습니다. 그리고 목표와 유량 전지의 오일 접촉이 있을 때까지 목표를 달성하십시오. 현미경의 연동 커버 시스템을 사용하여 모든 레이저 빛이 탈출하는 것을 차단합니다.이어서, 레이저를 켜고 642나노미터 레이저를 사용하여 유동셀의 하부 표면에 초점을 맞추어 마이크로투블러를 이미지화하고, 488 나노미터 레이저를 사용하여 GFP 키네신 모터를 이미지화한다. 관심 있는 이미지 나 동영상을 기록합니다. 이미지는 유동 셀에 운동성이 있는 한 기록될 수 있습니다.이 연구에서는 자체 트랙을 구성하기 위해 약하게 결합하는 빌딩 블록을 자체 조립하는 활성 나노 스케일 시스템이 제시됩니다. 티프 현미경 검사를 사용하여 글라이딩 마이크로투볼은 키네신 모터와 별도로 이미지화됩니다. 마이크로튜브는 647 나노미터 레이저로 여기를 볼 수 있습니다.그리고 GFP 키네신은 488 나노미터 레이저로 흥분할 때 볼 수 있습니다. 여기와 빨간색과 녹색 빛의 시간은 1 초 미만이었다. 볼 수 있듯이, 글라이딩 마이크로투볼은 용액에서 키네신 모터를 축적하고 표면에 보관합니다.키네신 모터는 솔루션으로 돌아가기 전에 짧은 시간 동안 마이크로튜브의 여파로 남아 있습니다. 운동성 용액의 항페이드에서 시약의 정확한 농도를 갖는 것이 매우 중요하며, 그렇지 않으면 사진 표백으로 인해 실험이 실패할 수 있습니다. 이 기술은 나노 스케일 엔지니어 시스템에서 단백질 모터를 보다 효율적으로 사용할 수 있는 길을 열어줍니다.따라서, 보다 복잡한 나노 구조의 설계 및 연구를 가능하게 한다.

assembling-molecular-shuttles-powered-by-reversibly-attached-kinesins

Research

연구

JoVE Journal

Engineering

공학

표면 준수 kinesin 모터 단백질이 nanoscale 교통 시스템으로 제공할 수에 글라이딩 기능화 microtubules로 구성된 분자 셔틀. 여기 전형적인 셔틀 시스템의 조립이 설명되어 있습니다.

Kinesin 전원 분자 셔틀로화물 로딩

소포 또는 세포 소기관과 같은 화물의 세포 내 수송은 편광된 미세소관을 추적하는 분자 운동 단백질에 의해 수행됩니다. 이 프로토콜은 뉴런 내부로 이동하는 개별 화물 입자의 수송 방향성과 관련 운동 단백질의 상대적 양 및 유형의 상관관계를 설명합니다.

사용 축삭화물을 이동하는 분자 모터의 구성을 특성화 &quot;화물 매핑&quot;분석

여기에서, 프로토콜은 키네신 -1-화물을 식별하기 위해 제시된다. 키네신-1 중쇄 (KIF5B)의 모터리스 돌연변이는 세포질에 집계 및화물의 응집을 유도한다. 모두 집계는 형광 현미경에서 검출된다. 유사한 전략이 다른 모터 단백질화물을 식별하기 위해 사용될 수있다.

형광 현미경을 사용 키네신 -1-화물 식별

유사분열 방추체의 조립 및 위치는 미세소관 역학, 운동 단백질 및 가교제에 의해 생성된 결합된 힘에 따라 달라집니다. 여기에서 우리는 구형 에멀젼 방울의 기하학적 구속이 기본 유사 분열 방추체의 상향식 재구성에 사용되는 최근에 개발 된 방법을 제시합니다.

구형 에멀젼 방울의 기본 유사 분열 스핀들의 재구성

이 프로토콜의 목표는 DNA 종이 접기 나노 구조에 분자 모터의 앙상블을 형성하고 총 내부 반사 형광 현미경을 사용하여 앙상블 운동성을 관찰하는 것입니다.

단일 분자 관찰을 위한 DNA 종이 접기 나노 구조에 다인 및 키네신 모터 앙상블 생산

양방향 유사분열 키네신-5 Cin8은 운동성 동안 분열되고 병합되는 클러스터에 축적됩니다. 클러스터에 축적되면 Cin8의 속도와 방향성도 변경됩니다. 여기에서, 정제된 Cin8-GFP를 사용한 운동성 분석 및 Cin8의 단일 분자 및 클러스터의 모타일 특성의 분석을 위한 프로토콜이 기재되어 있다.

S. cerevisiae 세포로부터 정제된 양방향 Kinesin-5 Cin8의 단일 분자 및 클러스터의 이동성

여기에서는 시험관 내에서 미세소관 다발을 재구성하고 동시 광학 트래핑 및 전반사 형광 현미경을 사용하여 그 안에 가해지는 힘을 직접 정량화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 분석은 활성 미세소관 네트워크 내에서 단백질 앙상블에 의해 생성된 힘과 변위의 나노스케일 수준 측정을 허용합니다.

재구성된 활성 미세소관 다발 내의 힘을 직접 측정

이 연구는 Sf9-바쿨로바이러스 발현 시스템을 사용하여 키네신-3 계열의 구성원인 KIF1A(1-393LZ)의 정제에 대해 자세히 설명합니다. 이들 정제된 모터의 시험관내 단일분자 및 다중-모터 글라이딩 분석은 포유동물 세포 용해물로부터의 모터에 필적하는 강력한 운동성 특성을 나타냈다. 따라서, Sf9-바쿨로바이러스 시스템은 관심있는 운동 단백질을 발현하고 정제하는 것이 가능하다.

Sf9 정제 초공정 키네신-3 제품군 모터의 단일 분자 분석

이 기사는 MAP65, 식물 기반 미세 소관 가교제 및 PEG를 크라우밍 제로 사용하여 촉각제 모양의 미세 소관 어셈블리를 형성하기위한 프로토콜을 제시합니다.

미세 소관 선인장체의 자체 조립

이 논문은 공동 얽힌 액틴 필라멘트와 미세 소관의 조정 가능한 3차원 복합 네트워크를 엔지니어링하고 특성화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 복합 재료는 미오신 II 및 키네신 모터에 의해 구동되는 능동적 구조 조정 및 탄도 운동을 거치며 액틴, 미세 소관, 운동 단백질 및 수동 가교제의 상대적 농도에 의해 조정됩니다.

조정 가능한 모터 구동 역학 및 역학을 사용한 Actin-Microtubule 복합재 재구성 및 특성화

배우세요 kinesin 모터 단백질을 이용한 분자 셔틀 구축 방법을. 미세소관과 TIRF 현미경을 활용한 나노스케일 동적 평형 시스템 연구 기법입니다.

Kinesins 연결 된 조립 분자 셔틀 역에 의해 구동

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