Name: 인간 P53을 연구하기 위한 기능성 어세이 개발을 위한 섀시로 효모 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 57 s
Description: 학습하세요 효모 Saccharomyces cerevisiae를 이용한 인간 P53 전사 활성화 기능 분석 프로토콜. 암 관련 돌연변이 효과 평가 및 색상 리포터, 루시퍼라스 정량화 방법을 통해 유전자 발현 조절 메커니즘을 연구합니다.

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우리는 유럽 연합 (FEDER 기금 POCI/01/0145/FEDER/007728 Programa 오페라 팩터드 드 경쟁) 및 국가 기금 (FCT/MEC, Fundação para a Ciência e Tecnologia 및 Ministério da Educação e Ciência) 파트너십 계약 PT2020 UID/QUI/50006/2019 및 프로젝트(3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014 - POCI-01-0145-FEDER-016581. FCT 펠로우십: SFRH/BD/96189/2013 (S. 고메스). 이 작품은 Compagnia S. Paolo, 토리노, 이탈리아 (프로젝트 2017.0526)와 보건부 (프로젝트 5x1000, 2015 및 2016; 현재 연구 2016)에 의해 지원되었습니다. 테레사 로페즈-아리아스 몬테네그로 박사(트렌토 대학교, 실험 과학 교육 실험실)에게 비디오 녹화에 도움을 주신 것에 대해 깊이 감사드립니다.

1. 특정 RE를 포함하는 ADE2 또는 LUC1 기자 효모 균주의 건설 (yAFM-RE 또는 yLFM-RE)
<ol><li>줄무늬 yAFM-ICORE 또는 yLFM-ICORE 균주12,14 (ICORE = I, GAL1 프로모터하에서 의 ISce-I 엔도너렐리스; CO = 카운터 선택 우라3; RE = 카나마이신 저항을 수여하는 KanMX4 리포터; 표1) YPDA 한천 플레이트상에 -80°C에 보관된 15%글리세롤 스톡으로부터(표 2). 30 °C에서 2-3 일 동안 자랍니다.</li>
	<li>신선한 접시에서 효모 콜로니 1개를 꺼내 (3주 이상 된 것) YPDA 5 mL을 함유한 작은 플라스크에 놓습니다(표 2). 밤새 30°C에서 배양하고, 150-200 rpm에서 흔들어.</li>
	<li>다음 날, 덱스트로스의 모든 흔적을 제거하기 위해, 3,000 x g에서 2 분 동안 세포를 펠렛하고 튜브의 반전으로 상판을 버립니다. 참고: 실온(RT)에서 이 프로토콜의 모든 원심분리를 수행합니다.</li>
	<li>갈락토제(표 2)를 함유하는 30-50 mL의 미리 온난한 CM(complete media)에서 세포 펠릿을 재중단하고 30°C에서 4시간 동안 배양하고 150-200 rpm에서 흔들어 (I-SceI의 유도에 필요함).</li>
	<li>3,000 x g에서 2 분 동안 세포를 원심 분리하고 튜브의 반전으로 상판을 버립니다.</li>
	<li>30-50 mL의 멸균수에서 세포 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. 1.5단계를 반복합니다.</li>
	<li>멸균수 10 mL에서 세포 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. 1.5단계를 반복합니다.</li>
	<li>DNA 섭취를 선호하는 이온 용액인 멸균LiAcTE(표 3)의 5 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 1.5단계를 반복합니다.</li>
	<li>멸균 LiAcTE의 250 μL에 있는 세포 펠릿을 다시 중단하고 1.5 mL 관으로 세포를 전송합니다. 1.5단계를 반복하고 300-500 μL의 멸균 LiAcTE에서 세포 펠릿을 다시 중단한다.</li>
	<li>세차하는 동안, 100 °C에서 10 분 동안 연어 정자 DNA 캐리어의 10 mg / mL 용액을 변성시키고 얼음에 즉시 식혀 단일 가닥 DNA로 유지하십시오.</li>
	<li>별도의 1.5 mL 튜브에 원하는 올리고뉴클레오티드 500 피코몰을 첨가 (표3),삶은 연어 정자 DNA의 5 μL, 300 μL의 멸균 LiAcTE PEG (표3),및 효모 세포 현탁액의 50 μL (단계 1.9에서).</li>
	<li>10s의 튜브를 30°C에서 30분 동안 혼합하고 배양하고, 150-200 rpm에서 흔들어. 1.5 mL 튜브를 옆으로 놓아 흔들림을 선호합니다.</li>
	<li>가열 블록에서 42 °C에서 15 분 동안 효모 세포를 가열 한 다음 10,000 xg에서 20 s의 세포를 원심 분리합니다. 상급물을 제거하고 멸균수 1 mL에서 세포를 다시 일시 중단하십시오.</li>
	<li>YPDA 한천 플레이트에 세포 현탁액의 100 μL을 퍼뜨리고 30°C에서 1일 동안 배양(거꾸로)한다. 잘 분리 된 식민지를 얻으려면 1 :10 희석의 100 μL을 퍼뜨리는 것입니다.</li>
	<li>다음날, 덱스트로오스와 5-FOA를 함유한 CM 한천 플레이트에 멸균 벨벳을 사용한 복제판(표 2). 많은 세포가 옮겨지는 경우 새로운 플레이트상에 제2 복제판을 고려한다(즉, URA3 세포의 일부 성장).</li>
	<li>3일 후, G418(카나마이신과 유사한 아미노글리코시드 항생제)을 함유하는 비선택적 YPDA 및 YPDA 상에 복제판(표 2)을 표시하여, 그들의 후속 비교를 용이하게 하기 위해 각 플레이트를 표시하였다. 플레이트를 30°C에서 밤새 배양합니다.</li>
	<li>다음 날, G418 민감하지만 YPDA 플레이트(예: yLFM- 또는 yAFM-RE 콜로니)에서 성장하는 콜로니로부터 후보 리포터 균주를 식별한다. 확인된 콜로니(3-6 콜로니)를 새로운 YPDA 플레이트상에 연속하여 단일 콜로니 분리를 얻고 30°C에서 2일 동안 자랍니다.</li>
	<li>추가 분석을 위해 식민지를 격리하기 위해 YPDA 플레이트에 단일 효모 식민지를 패치하십시오. 30°C에서 24시간 후, 몸집이 작은 돌연변이(즉, 호흡기결핍 돌연변이)의 성장을 방지하는 YPGA 한천 플레이트(표 2)에 복제도금으로 시험한다. 동시에, 새로운 YPDA 한천 접시에 복제 판.</li>
	<li>콜로니 PCR에 의한 올바른 올리고뉴클레오티드 통합의 존재에 대해 1.18단계에서 올바른 패치(즉, YPDA 및 YPGA 한천 플레이트의 성장, 1-3콜로니)를 테스트합니다. 10x PCR 버퍼(1.5 mM MgCl2),2 μL 의 10 피코몰/μL 프라이머(표3),2.5 mM dNTP의 4 μL, 5 U/μL Taq 폴리머라제의 0.25μL, 50 μL의 최종 부피에 물을 추가하여 반응 혼합물을 조립한다. 각 PCR 튜브내로 50 μL의 양치질이 필요한 효모 콜로니의 수에 대한 반응 혼합을 곱한다. 파이펫을 사용하여, YPDA 한천 플레이트에서 아주 적은 양의 효모 세포를 단일 PCR 반응 혼합물에 첨가한다.</li>
	<li>다음 프로그램과 함께 PCR 반응을 수행: 94°C 8분 동안 94°C, 94°C에서 1분 동안 35사이클의 변성, 55°C에서 1분 동안 어닐링, 72°C에서 2분 동안 연장.</li>
	<li>반응이 완료된 후, 아가로즈 겔에 PCR 반응(부피의 약 1/10)을 적재하여 정확한 크기(~500 bp)를 확인합니다.</li>
	<li>PCR 생성물을 상용 키트로 정제한 후 동일한 단계 1.19를 사용하여 원하는 RE 서열의 통합을 확인한다.</li>
	<li>올바른 서열의 유효성 검사 후, yAFM-RE 또는 yLFM-RE 균주 배양(YPDA)의 15% 글리세롤 스톡을 만들어 -80°C에 저장한다.</li>
</ol>2. 질적 색계 ADE2 효모 분석기준을 이용한 P53 단백질 환활성화 능력 평가
<ol><li>yAFM-RE 스트레인을 사용하여 1.1 단계및 1.2단계를 반복합니다(표 1).</li>
	<li>다음날, 미리 온난한 YPDA의 30-50 mL에서 세포 배양물(1:10)을 희석하고 OD600nm가 0.8-1.0(~2시간)에 도달할 때까지 흔들어 30°C에서 계속 배양한다.</li>
	<li>1.5-1.10 단계를 반복합니다.</li>
	<li>별도의 1.5 mL 튜브에 효모 P53 (또는 제어) 발현 벡터 (표4), 삶은 연어 정자 DNA 담체의 5 μL, 멸균 LiAcTE PEG 300 μL, 효모 세포 현탁액 50 μL을 추가합니다.</li>
	<li>1.12 단계 와 1.13 단계를 반복하지만 멸균 수의 300 μL에서 세포 펠릿을 다시 중단하십시오.</li>
	<li>덱스트로를 함유하는 합성 선택적(P53 발현 또는 대조벡터용) 플레이트상에 100 μL의 세포 현탁액을 탄소 공급원및 고량의 아데닌(표 2)으로 확산한 다음, 2-3일 동안 30°C에서 배양(거꾸로)한다.</li>
	<li>새로운 선택적 플레이트에 단일 효모 형질전환 콜로니 (플레이트 당 2-6 줄무늬)를 연속하고 30 °C에서 하룻밤 자라게하십시오.</li>
	<li>그 다음 날, 멸균 벨벳 복제판을 사용하여 색 표현형(즉, 덱스트로오스를 탄소원으로 함유하지만 아데닌의 양을 제한하는 플레이트)의 평가를 허용하는 새로운 선택적 플레이트에; 표2). 플레이트를 30°C에서 3일 동안 거꾸로 배양합니다. 선택적으로, P53 단백질의 온도 민감도를 평가하기 위해, 3일 동안 3개의 상이한 온도에서 배양한다: 24°C, 30°C, 및 37°C. 참고: 동일한 줄무늬를 여러 번 복제할 수 있습니다.</li>
	<li>P53 단백질 과분활성화 능력을 평가하기 위해 효모 콜로니의 색상 기반 표현형을 확인하고 P53 야생형 및 빈 벡터 표현형에 대하여 P53 단백질 표현형을 비교한다.</li>
</ol>3. 정량발광기반 LUC1 효모 분석기를 이용한 P53 단백질 환동성 능력 평가
<ol><li>프로토콜 2에 기재된 LiAc 기반 방법을사용하여 P53(또는 대조군) 발현 벡터(표 4)로 효모 세포를 변형시킨다. yLFM-RE 스트레인을 사용하십시오(표1).</li>
	<li>탄소 공급원으로서 포도당을 함유하는 다량의 아데닌을 가진 새로운 선택적 플레이트상에 단일 형질전환제를 패치하고 밤새 30°C에서 성장하게 하였다. 각 변환 유형에 대해 5-7개의 다른 패치를 만듭니다.</li>
	<li>하룻밤 성장 후, 탄소 공급원으로서 덱스트로스 또는 라피노스를 함유하는 합성 선택적 배지에서 플레이트로부터 멸균 이쑤시개 또는 피펫 팁을 사용하여 소량의 효모 세포를 재중단(투명한 96웰 플레이트에 최종 부피, 원형으로 또는 평평한 바닥). 실험에 유도가능한 P53 발현이 필요한 경우, 라피노스 배지에 갈락토스를 추가하여 유도수준을 조절한다(표 2). 참고: 이러한 셀 현탁액은 약 0.4의 OD600nm를 가져야 하며 1보다 높지 않아야 합니다.</li>
	<li>멀티 라벨 플레이트 리더를 사용하여 유도 가능한 P53 발현 후 OD600nm에서 각 웰의 흡광도를 측정합니다(30°C에서 4-8시간 및 150-200 rpm 흔들림). 셀 현탁액이 각 웰을 멀티채널 파이펫과 혼합하여 균일한지 확인합니다.</li>
	<li>투명한 96 웰 플레이트로부터 10-20 μL의 세포 현탁액을 백색 384(또는 96) 웰 플레이트로 옮기고 용해 완충액의 동일한 부피(10-20 μL)와 혼합한다. RT에서 10-15 분 동안 인큐베이션을 셰이커 (150-200 rpm)에 하여 루시퍼라아제 기판에 세포의 투과율을 달성합니다.</li>
	<li>반딧불 루시퍼라아제 기판 10-20 μL을 추가하고 다중 라벨 플레이트 리더로 광 단위(LU)를 측정합니다.</li>
	<li>P53 단백질 환활성화 능력을 결정하기 위해, 각각의 LU를 상응하는 OD600nm(상대광 단위, RLU)로 정규화한다. 효모 변형 식민지의 3-4 패치에서 평균 RLU 및 표준 편차를 계산합니다.</li>
	<li>P53 야생형 및 빈 벡터에 대하여 P53 단백질 과역 데이터를 비교하거나, 빈 벡터로 얻어진 값을 빼거나 빈 벡터로 얻은 값으로 나누어(즉, 유도의 계산 폴드)로 나눈다. 참고: P53 환활성화 활성은 또한 P53-상호 작용 단백질(즉, MDM2 및 MDMX) 및/또는 약물 치료를 포함하는 동일한 실험 적 설정을 사용하여 평가될 수 있다.</li>
</ol>4. 효모 자형형 분석기준을 이용한 P53 단백질 성장 억제 평가
<ol><li>섹션 2에 기재된 LiAc 기반 방법을 사용하여 P53/MDM2/MDMX(또는 제어) 발현 벡터(표 4)로 효모 세포를 변형시킵니다. CG379 스트레인(표 1)을 사용하고 최소한의 선택플레이트에 효모 형질전환제를 퍼뜨리다(표2).</li>
	<li>최소 선택적 배지(표 2)에서 형질전환된 세포를 약 1OD600nm로성장시킨다.</li>
	<li>효모 세포를 선택적 유도 배지에서 0.05 OD600nm로 희석(표2)및 선택적으로, 선택된 소분자를 적절한 농도(또는 용매만)에 첨가하여 돌연변이 P53을 재활성화하거나 MDM2를 억제하는 데 그 효능을 시험한다. /MDMX-P53 상호 작용.</li>
	<li>30°C에서 연속 궤도 흔들림(200 rpm)에서 약 42시간 동안 배양세포(음극 대조 효모가 중간 로그 상에 도달하는 데 필요한 시간, 약 0.45 OD600nm).</li>
	<li>최소 선택플레이트 상에 효모 세포 배양물의 100μL aliquots를 발견한다(표 2).</li>
	<li>30 °C에서 2 일 동안 배양하십시오.</li>
	<li>100 μL 배양 방울(콜로니 형성 단위, CFU 카운트)에서 얻어진 콜로니의 수를 계수하여 효모 성장을 측정하였다. 예를 들어, 효모를 최대 가능한 효과로 표현하는 야생형 P53의 성장을 고려한 화합물의 돌연변이 재활성화 효과를 계산하는 한편, 돌연변이 P53을 발현하는 세포의 성장(그러나 용매 조절에 노출됨)을 나타낸다. 0 단계의 재활성화를 말합니다.</li>
</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

효모 계 분석에 따르면 P53 단백질 기능의 다양한 측면을 조사하는 데 유용하다는 것이 입증되었습니다. 이러한 해학은 기능적 다형성의 평가를 포함하여 RE 표적 부위의 변이체로 P53 환활성화 잠재력을 평가하는 데 특히 민감하다. 색상 리포터의 사용뿐만 아니라 루시퍼라아제 분석의 소형화는 비용 효율적이고 상대적으로 확장 가능한 분석결과를 낳습니다. 또한, 성장 억제 시험은 잠재적으로 흡수의 측정을 통해 효모 세포 생존의 정량화를 자동화, 화학 라이브러리 스크리닝에 사용되는 것이 가능하다. ABC 수송기의 세포벽 및 작용으로 인한 투과성이 제한적이지만 약물 스크리닝을 위한 효모 사용에 한계가있는 것으로 여겨지고 있지만, 유전자 변형은 22,65에성공적으로 개발되었다.
포유류 세포 기반 분석과 비교하여 효모 기반 P53 분석사는 P53이 더 높은 진핵생물에서 기능을 조절하는 보조...

전사는 특정 자극에 응하여 염색질 지구에 RNA 중합효소의 모집 그리고 변조를 위한 전사 인자 (TFs) 및 공동 인자의 동적, 공간 및 시간적 조직을 관련시키는 매우 복잡한 프로세스입니다1 . 인간 P53 종양 억제제를 포함하는 대부분의 TFs는, 단일 (또는 다중) 독특한 모티브로 구성된 응답 요소 (REs)에게 불린 DNA 서열의 형태로 특정 시스 작용 요소를 인식합니다 ~6-10 뉴클레오티드 긴. 이러한 모티브 내에서, 개별 위치는 다양한정도의 가변성 2를 나타낼 수 있으며, 일반적으로 위치 중량 행렬(PWM) 또는 로고3,4로요약된다.
상기 효모 S. 세레비시아는 정형고효모 유전자가 존재하지 않는 경우에도 보완 성 검사, 자궁외 발현 및 기능성 관찰을 통해 인간 단백질의 다양한 측면을 연구하는 데 적합한 모델 시스템입니다5. 6개 , 7.전사 계통 8의 기저 성분의진화적 보존으로 인해 많은 인간 FFs(효모 세포에서 ectopically 발현시)는 프로모터를 통해 작용하여 리포터 유전자의 발현을 조절할 수 있습니다. 적절한 REs를 포함합니다. 인간 P53에 대해 여기에 제시된 전사 모델 시스템은 그 효과를 변조할 수 있는 세 가지 주요 변수를 특징으로 한다: 1) P53의 발현 및 유형의 양상, 2) P53 의존적 전사를 제어하는 RE 서열, 및 3) 리포터 유전자(그림1A).
P53 발현의 양상에 관하여, S. cerevisiae는 유도성, 억압적, 또는 구성적인프로모터의 선택을 허용한다 9,10,11. 특히, 유도성 GAL1 프로모터는 효모에서 TF의 기저(라피노스를 탄소원으로 사용) 또는 가변(매체 내의 갈락토의 양을 변화시킴으로써) 발현을 허용한다. 실제로, 미세조정가능한 발현은 P53 자체뿐만 아니라 다른 P53 패밀리 단백질12,13을연구하기 위한 중요한 발전을 나타낸다.
P53 의존식을 제어하는 R의 유형에 관해서는, S. cerevisiae그렇지 않으면 등소성 배경에 관심의 RE에 독특한 차이를 소유하는 다른 기자 균주의 건설을 할 수 있습니다. 이러한 목표는 델리토 페르페토12, 14, 15,16에서개발된 특히 다재다능한 게놈 편집 접근법의 적응을 이용하여 도달한다.
더욱이, 상이한 리포터 유전자(즉, URA3, HIS3 및 ADE2)는 S. cerevisiae에서인간 FF의 전사 활동을 질적 및 정량적으로 평가하는 데 사용될 수 있으며, 각각 특정 기능을 가지고 있을 수 있습니다. 실험적 필요에맞게 17,18,19,20,21. 이 리포터 유전자의 발현은 각각 우라실, 히스티딘 및 아데닌 프로토위트로피를 부여합니다. URA3 리포터는 5-FOA가 있는 세포의 성장을 허용하지 않으므로 역선택될 수 있습니다. ADE2 리포터 시스템은 영양 선택 외에도 야생형(즉, ADE2 발현에서 기능적) 또는 돌연변이(즉,ADE2에서 기능적이지 않음)를 발현하는 효모 세포를 식별할 수 있다는 장점이 있습니다. ) 식민지 색상에서 P53.
예를 들어, ADE2 유전자를 발현하는 효모 세포는 아데닌(2.5-5.0 mg/L)을 제한하는 플레이트에 보통 크기의 백색 식민지를 생성하는 반면, 제대로 또는 전사하지 않는 세포는 더 작은 빨간색(또는 분홍색)과 같은 플레이트에 나타납니다. 식민지. 이것은 아데닌 생합성 통로에 있는 중간의 축적 때문입니다 (즉, P-ribosylamino-imidazole, 이전에 는 아미노-이미다졸 리보티드 또는 AIR라고 불렸습니다), 이는 적색 안료를 형성하기 위하여 변환됩니다. 질적 색계 ADE2 리포터 유전자는 이후 양적 반딧불 Photinus pyralis (LUC1)12,22로대체되었다. 최근에는 ADE2 리포터가 lacZ 리포터와 결합하여 점수가 매편, 반정적, 이중 리포터 분석으로 P53 돌연변이체의 잔류 수준에 따라 하위 분류에 악용될 수 있습니다. 23.
EGFP (향상된 녹색 형광 단백질) 또는 DsRed (디스코소마 sp. 적색 형광 단백질)와 같은 형광 기자는 또한 가능한 모든 오센스 돌연변이와 관련된 트랜스 활성화 활성의 정량적 평가에 사용되어 왔다. TP53 코딩 시퀀스24. 마지막으로, RE 및/또는 리포터 유전자에 대해 다른 이소제닉 효모 균주와 P53 알레일 발현을 위한 튜닝 가능한 프로모터를 결합할 수 있는 기회는 암 관련 및 생식선의 정제된 분류를 생성하는 데이터 매트릭스의 발달로 이끌어 냈습니다. 돌연변이 P53 대두25,26,27.
전술한 접근법은 P53 단백질의 전사 활성을 측정하기 위해 사용된다. 그러나, 효모 S. 세레비시아28 및 척수사카로마이스폼베(29)에서 야생형 P53의 발현은 세포주기 검거28,30 또는 세포주기와 연관된 성장 지연을 유발할 수 있다. 세포 죽음31. 두 경우 모두, 효모 성장 억제는 높은 P53 발현에 의해 유발되고 세포 성장에 관여하는 내인성 효모 유전자의 잠재적인 전사 변조와 상관관계가 있다. 이러한 가설을 뒷받침하는, 기능 상실 돌연변이P53 R273H는 야생형 P5332와유사한 수준으로 발현될 때 효모 세포 성장을 방해하지 않았다. 반대로, 독성 돌연변이P53 V122A(야생형 P53에 비해 전사 활성이 높은 것으로 공지)의 효모에서발현은 야생형 P5332보다더 강한 성장 억제 효과를 일으켰다.
부가적으로, 인간 MDM2는 효모에서 인간 P53 전사 활성을 억제할 수 있었고, 그 유비퀴틴화 및 후속 분해를 촉진할 수 있었다는 것을 입증하였다33. 이에 따라, 인간 MDM2 및 MDMX가 P53-유도 효모 성장억제를 억제하는 능력을 32,34로입증하였다. 추가 연구에서는, 효모32에있는 ACT1 유전자에 putative P53 RE 상류의 확인과 함께 P53 전사 활성 및 액틴 발현 수준 사이 상관관계가 확립되었다. 일관되게, 액틴 발현은 P53 V122A에 의해 야생형 P53 및 더욱 강화되었지만, 돌연변이 P53 R273H에 의해서는 아니었다. 반대로, P53에 의한 액틴 발현은 효모 성장 분석법에 기초한 결과와 일치하는 P53 억제제 MDM2, MDMX, 또는 피피테린 α(P53 전사 활성의 소분자 억제제)의 공존존재에서 감소하였다. 중요한 것은, 이러한 결과는 P53 유도 성장 억제와 효모에서의 활성 정도 사이의 상관 관계를 확립했으며, 이는 또한 P53 기능을 변조하는 소분자를 식별하고 연구하기 위해 악용되어 왔다28,34 , 35.

<table><tbody><tr><td>L-아스파르트산</td><td>SIGMA</td><td>11189</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 정제 키트</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>L-페닐알라닌</td><td>SIGMA</td><td>78019</td><td></td></tr><tr><td>펩톤</td><td>BD 박토</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>효모 ex+A2:C26tract</td><td>BD Bacto</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Difco 효모 질소 염기(아미노산 및 황산암모늄</td><td>제외) BDTM</td><td>233520</td><td></td></tr><tr><td>리튬 아세테이트 이수화물</td><td>SIGMA</td><td>517992</td><td></td></tr><tr><td>세균 한천 A형</td><td>Biokar Diagnostics</td><td>A1010 HA</td><td></td></tr><tr><td>G418 이황산염</td><td>SIGMA</td><td>A1720</td><td></td></tr><tr><td>황산암모늄</td><td>SIGMA</td><td>A2939</td><td></td></tr><tr><td>L-아르기닌 모노하이드로 클로라이드</td><td>SIGMA</td><td>A5131</td><td></td></tr><tr><td>아데닌 헤미설페이트 염</td><td>SIGMA</td><td>A9126</td><td></td></tr><tr><td>수동 용해 버퍼 5x</td><td>PROMEGA</td><td>E1941</td><td></td></tr><tr><td>Bright-Glo Luciferase 분석 시스템&nbsp;</td><td>PROMEGA</td><td>E2620</td><td></td></tr><tr><td>5-FOA</td><td>Zymo Research</td><td>F9001</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Galactose</td><td>SIGMA</td><td>G0750</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamic acid</td><td>SIGMA</td><td>G1251</td><td></td></tr><tr><td>덱스트로스&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>L-히스티딘</td><td>SIGMA</td><td>H8125</td><td></td></tr><tr><td>L-이소류신</td><td>SIGMA</td><td>I2752</td><td></td></tr><tr><td>L-라이신</td><td>SIGMA</td><td>L1262</td><td></td></tr><tr><td>L-류신</td><td>SIGMA</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>L-메티오닌</td><td>SIGMA</td><td>M2893</td><td></td></tr><tr><td>PEG</td><td>SIGMA</td><td>P3640</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-라피노스 펜타하이드레이트</td><td>SIGMA</td><td>R0250</td><td></td></tr><tr><td>L-세린</td><td>SIGMA</td><td>S4500</td><td></td></tr><tr><td>L-트립토판</td><td>SIGMA</td><td>T0271</td><td></td></tr><tr><td>L-트레오닌</td><td>SIGMA</td><td>T8625</td><td></td></tr><tr><td>우라실</td><td>SIGMA</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>L-발린</td><td>SIGMA</td><td>V0500</td><td></td></tr></tbody></table>

인간 p53을 연구하기 위한 기능성 어세이 개발을 위한 섀시로 효모

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

잘 알려진 포유류 P53 단백질이 효모 S. 세레비시아에서 전사 인자(TF)로서 작용할 수 있다는 사실은 1) 결합 부위의 영향을 연구하기 위해 상이한 기능성 검사의 개발을 허용하였다[즉, 반응 요소(RE)] P53 환동성 특이성 또는 2) TP53 돌연변이, 공동 발현 보조 인자, 또는 P53 환활성화 활성에 대한 소분자에 대한 서열 변이체. 다른 기본 및 번역 연구 응용 프로그램이 개발되었습니다. 실험적으로, 이러한 접근법은 효모 모델의 두 가지 주요 장점을 이용한다. 한편으로는, 게놈 편집의 용이성은 P53 의존의 서열 특이성을 조사하기 위하여 특정 P53-RE의 수준에서만 다른 이소제닉 긴장을 이용해서 정성적 또는 정량적인 리포터 시스템의 빠른 건설을 가능하게 합니다 트랜스 활성화. 한편, 이소성 P53 발현에 대한 조절 시스템의 가용성은 광범위한 단백질 발현에서 의 역활성화의 평가를 허용한다. 이 보고서에서 검토된 것은 컬러 리포터 유전자, luciferase 및 효모의 성장을 기반으로 하는 시스템을 광범위하게 사용하여 주요 방법론 단계를 설명하고 예측 능력을 비판적으로 평가합니다. 더욱이, 이러한 접근법의 극단적인 다양성은 TP53 유전자 가족의 다른 구성원인 P63 및 P73을 포함하여 다른 F를 연구하기 위하여 쉽게 이용될 수 있습니다.

의 건설 ADE2 또는 LUC1 리포터 효모 균주
델리토 퍼페토접근법12,14,15,16은 P53 리포터 효모 균주의 시공을 가능하게 하도록 적응되었다(도1B). 이 방법은 양단에, 적어도 30개의 뉴클레오티드를 포함하는 단일 또는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 선택된 통합 궤적에 동봉한...

여기에 제시된 효모 Saccharomyces 세레비시아에 종족을 건설하고 악용하는 네 가지 프로토콜은 인간 P53 의 일시 활성화 잠재력, 다양한 암 관련 돌연변이의 영향, 공동 발현 된 상호 작용 단백질, 및 특정 작은 분자의 효과.

인간 P53을 연구하기 위한 기능성 어세이 개발을 위한 섀시로 효모

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

안녕하세요, 내 이름은 바르톨로메오 보스코이며, 나는 이탈리아 트렌토 대학의 통합 생물학 센터에서 전사 네트워크 연구소에서 박사 과정 학생입니다. 아시다시피, 전사는 전사 인자와 공동 요소의 공간 및 측두조직과 관련된 매우 복잡한 과정입니다. 인간 P53을 포함한 이들 대부분은 반응 요소라고 불리는 특정 시스 작용 요소를 인식하고, 이 DNA 시퀀싱에 대한 결합은 표적 유전자의 전사의 변조에 필요하다.이 작품에서, 우리는 당신에게 색상 리포터 유전자 또는 루시파라제 또는 세포 성장의 정량화에 단백질로 효모를 사용하여 변환 기능에서 특정 P53 서열을 연구하는 프로토콜을 보여주고 싶습니다 이러한 접근 방식의 주요 실험 단계와 다재다능함을 강조하고자합니다. 프로토콜 1, 아데닌-2 또는 반딧불 루시파라제 유전자의 상류에 특정 P53 반응 요소를 포함하는 리포터 효모 균주의 시공. 기자 균주를 구성하기 위해 먼저 1.1~1.15단계를 수행하여 원하는 프로모터 영역을 대상으로 올리고뉴클레오티드로 효모 세포를 변형시킨다.변환은 표준 리튬 아세테이트 기반 프로토콜을 기반으로 합니다. 변압제가 5-FOA 플레이트에 나타나면, 보통 3일 동안 30도에서 배양한 후, 복제판은 선택적이지 않은 YPDA 플레이트와 G418을 포함하는 YPDA 플레이트에 플레이트를 플레이트에 표시하여 후속 비교를 용이하게 합니다. 접시를 30도에서 하룻밤 동안 배양하십시오.다음 날, G418 에 민감한 하지만 YPDA 플레이트에 성장 하는 식민지에서 후보 기자 균주를 확인 합니다. 새로운 YPDA 플레이트에 확인된 식민지를 줄이면 단일 식민지 분리를 얻고 30도에서 이틀 동안 자랄 수 있습니다. 원하는 P53 응답 요소의 올바른 통합을 확인하여 1.20 단계에서 언급된 조건과 PCR 반응을 수행합니다.sanger 시퀀싱 전에 올바른 앰플리코 길이를 확인하기 위해 아가로즈 젤에 PCR 제품의 알리쿼트를 로드합니다. 프로토콜 2, 우리는 질적 색상 기반 adenine-2 효모 분석법을 사용하여 P53 단백질 변환 능력을 평가하는 방법의 예를 제시한다. 섹션 1에 설명된 동일한 리튬 아세테이트 계 프로토콜에 따라 P53 발현 벡터를 갖는 효모 세포를 변환한다.새로운 선택적 접시에 접시 당 최대 6 까지 단일 효모 변환제 식민지를 줄이며, 30도에서 하룻밤 성장하자. 다음날, 멸균 벨벳을 사용하여, 복제판은 색 표현형, 즉 아데닌의 제한량을 포함하는 선택적 플레이트의 평가를 허용하는 새로운 선택적 플레이트에 줄무늬를 플레이트한다.3 일 동안 30도에서 배양하십시오. 동일한 줄무늬는 복제본을 여러 번 도금할 수 있습니다. 프로토콜 3, 우리는 지금 정량 발광 계 LUC1 효모 분석기를 사용하여 P53 단백질 환화 능력의 평가의 예를 제시한다.먼저, P53 발현 벡터를 갖는 효모 세포를 변환하고, 다시, 제2항에 기재된 리튬 아세테이트 계 프로토콜. 탄소원으로 포도당을 포함하는 새로운 선택적 플레이트에 단일 변압제를 패치하고 하룻밤 사이에 30도에서 성장하게하십시오. 각 변환 유형에 대해 5~7개의 패치를 만듭니다.하룻밤 성장 후, 탄소 원으로 라피노스를 포함하는 합성 선택적 매체에서 멸균 이쑤시개 또는 파이펫 팁을 사용하여 소량의 세포를 재연한다. 이러한 세포 현탁액은 약 0.4의 600 나노미터에서 광학 밀도를 가져야하며, 다른 온도, 치료 또는 P53 발현을 활성화하기 위해 다양한 양의 갈락토에 세포를 노출하기 위해 여러 96 웰 플레이트로 분할 될 수 있습니다. 반딧불이 리포터 활성을 측정하기 위해 투명 96웰 플레이트에서 10~20마이크로리터의 셀 서스펜션을 백색 384웰 플레이트로 옮기고, 셀을 동일한 양의 용해 완충제로 혼합하여 셰이커의 실온에서 10분, 15분 동안 배양한다.반딧불 루시파라기 기판 10, 20 마이크로리터를 추가합니다. 그리고 멀티 라벨 플레이트 리더기를 사용하여 라이트 유닛을 측정합니다. 또한 96웰 플레이트에서 배양물의 광학 밀도를 측정합니다.프로토콜 4, 우리는 지금 P53에 의해 유도된 효모의 성장의 억제를 이용하는 방법의 예를 제시한다. P53 발현 벡터를 사용하여 효모 세포를 변환하거나, P53 및 MDM2와 같은 공동 인자 중 하나인 코익스프레스에 발현 벡터를 결합하여 제1항에 기재된 리튬 아세테이트 계 프로토콜을 다시 한 번 변환한다. 선택적 매체에서 약 1개의 광학 밀도로 변압제 세포를 성장시키도록 한다.그리고 그들을 0.05로 희석하고, 선택한 분자를 적절한 농도에 첨가한다. 42 시간 동안 셰이커에 30도에서 세포를 배양. 이어서, 최소한의 선택적 중간 플레이트에서 효모 세포 배양의 100 마이크로리터를 종자.30도에서 이틀 동안 배양하십시오. ICORE 카세트 대신에 올바른 RE 통합은 콜로니 PCR에 의해 확인할 수 있으며, 후보 효모 클론으로부터 의 외량의 세포로부터 시작하여 표 3에 기재된 프라이머를 사용하여 표적 궤적을 증폭시킬 수 있다. PCR 제품, 약 500뉴클레오티드의 대역은, 정확한 P53 반응 요소 서열의 존재를 위해 편집된 게놈 위치의 서열을 확인하기 위해 Sanger 시퀀싱에 의해 검사될 수 있다.리포터 변형은 기능적 에세이에 사용될 준비가 되어 있습니다. P53 단백질 변환 능력을 평가하려면 효모 콜로니의 색상을 확인하십시오. 예를 들어, 우리는 두 개의 서로 다른 기자, P21-5-프라임 및 PUMA, 두 개의 서로 다른 온도, 30도 및 37도를 사용하여 야생 형 P53및 돌연변이 R175H 및 R282W 사이의 비교를 제시한다.흥미롭게도 R175H는 기능 상실 P53 알렐레, 모든 조건에서 붉은 식민지인 반면, R282W는 잔류 환원 활성을 30도에서 나타내며, 백색 식민지의 결과로 온도 민감도를 나타내지만 37도에서 활동이 손실되어 빨간색 또는 분홍색 콜로니가 생성됩니다. 확장된 데이터 세트는 4개의 돌연변이 진상선에 있는 2개의 B.Wild 형 P53을 10개의 다른 P53 반응 요소 리포터 균주, 3개의 온도 및 구성식 수준을 사용하여 변환활성화를 위해 시험되었다. 결과는 효모 식민지 색상 표현형을 생각 나게하는 색상 코드로 요약됩니다.P53 K139E 돌연변이 진상제는 부분 활성을 유지하고 냉소 민감성입니다. 예를 들어, 식민지는 24도와 30도에서 GADD45 기자 변형에 빨간색이지만, 37도에서 흰색입니다. 여기서, 우리는 인간과 C.elegans P53 효모의 트랜스활성화 특이성을 비교하는 이 방법으로 얻은 결과의 예를 제시합니다.막대 그래프의 결과는 4개의 복제의 표준 오차가 있는 평균 상대 광 단위로 표현됩니다. 5개의 다른 P53 응답 요소를 비교했습니다. P53 단백질 발현의 세 가지 상이한 수준은 배지내의 갈라토제 농도를 변화시킴으로써 시험하였다.두 P53 교정기는 현저하게 다른 상호 활성화 특이성을 보여줍니다. 이는 28-뉴클레오티드 스페이서의 존재 또는 부재를 제외하고 동일한 서열을 공유하는 ced13 및 V1 반응 원소의 결과에 의해 예시된다. 인간 P53은 V1 바인딩 사이트와 훨씬 더 높은 변환을 나타내며 C.elegans P53은 그 반대를 보여줍니다.결과는 갈라토세 유도 할 수없는 프로모터에서 P53 발현의 수준에서 독립적이다. 100 마이크로리터 배양물에서 얻은 콜로니수를 계산하여 효모 성장을 측정합니다. 돌연변이 P53을 발현하는 세포의 성장이 0 레벨의 재활성화를 나타내는 동안 효모를 최대한 의약으로 표현하는 야생형 P53의 성장을 고려한 화합물의 돌연변이 반응 효과를 계산한다.이 예에서, Nutlin-3a는 MDM2의 공동 발현에 의한 야생형 P53의 억제를 완화하고, PhiKan083은 Y220C P53 돌연변이를 부분적으로 재활성화한다. 두 경우 모두, 이것은 효 모 성장의 P53 의존 적인 감소 결과. 효모 기저 세포는 P53 단백질 기능의 가치, 측면을 조사하는 데 유용하다는 것이 입증되었습니다.이 작품에 설명된 프로토콜은 야생형 또는 암 관련 돌연변이 P53의 전환 가능성을 표적 사이트의 이체로 평가하기 위해 특히 민감하다. 추가, 접근은 P53 기능에 영향을 미치는 작은 분자를 확인하고 공동 인자와 P53 상호 작용을 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다. 색상 기자의 사용, 루시파라제의 소형화뿐만 아니라 성장 억제 테스트는 비용 효율적이고 확장 가능한 분석을 초래화학 라이브러리 스크리닝에 잠재적으로 적합.마지막으로, 이 작업에 기재된 시스템은 다른 서열 특이적 전사 인자의 연구와 함께 쉽게 채택될 수 있다.

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인간의 DNA 수리 단백질의 유전자 연구는 모델 시스템으로 효모를 사용하여

본 원고는 효모에 polyglutamine의 독성 (polyQ) - 확장 단백질을 평가 삼 보완적인 프로토콜을...

성장 Assays은 효모에서 Polyglutamine 독성을 평가하기 위해

이 문서에서는 호스트와 두 개의 직교 방법의 조합을 사용 병원균의 단백질 사이의 높은 자신감 상호 작용 집합의 식별에 초점을 맞추고 효모 두 하이브리드 HT-GPCA이라는 포유 동물 세포에서 높은 처리량의 상호 작용 분석에 의해 따랐다.

호스트 병원체 단백질 - 단백질 상호 작용의 풍경의 특성을 비교 접근

효모 단백병증 모델은 질병과 관련된 단백질의 독성 및 응집을 평가하는 데 유용한 도구입니다. 여기에서는 Hsp104 변이체 라이브러리에서 독성 억제제를 스크리닝하는 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 효모에서 독성이 있는 단백질의 독성 억제자에 대해 모든 단백질 라이브러리를 스크리닝하는 데 적용할 수 있습니다.

효력을 더 Hsp104 변종 사용 효모 Proteinopathy 모델을 분리

단백질은 서로 상호 작용하며 이러한 상호 작용은 단백질의 기능을 대부분 결정합니다. 단백질 상호 작용 파트너는 디하이드로폴레이트 환원효소 단백질-단편 보완 분석법(DHFR-PCA)을 기반으로 하는 효모 적합성 분석을 사용하여 생체 내에서 고처리량으로 식별할 수 있습니다.

살아있는 세포의 단백질 조각 보완 분석 (PCA)에 의해 게놈 전체 단백질 - 단백질 상호 작용 상영

개발 변환 관리 및 생균제 효모 사카 boulardii에의 외래 단백질 발현을 테스트 할 수있는 기술의 통일 된 설명은 여기에 제시 하였다.

마우스의 구강 투여에 따라 생균제 효모의 변환 및 위장 면역 조직에서 그들의 복구

이 프로토콜 기능 S. cerevisiae에 단백질 기반 상속에 대 한 화면을 높은 처리량 방법을 설명 합니다.

S. cerevisiae 에 단백질 기반 상속에 대 한 높은 처리량 검열

이 문서는 기준점과 플라스 미드 라이브러리를 사용 하 여 신진 효 모에 overexpression 심사를 용이 하 게 하 짝짓기 기반 메서드를 제공 합니다.

효 모에 짝짓기 기반 Overexpression 라이브러리 심사

이 프로토콜의 히스톤 포스트 번역 상 수정 (PTM) ALS와 파 킨 슨 병에 관련 된 단백질의 overexpression 관련 하 여 발생 하는 수준에서 게놈 넓은 변화 하는 실험 절차 설명 Saccharomyces cerevisiae 모델입니다. SDS 페이지 분리 후 개별 히스톤 PTM 수준은 통해 서 부 럽 수정-특정 항 체와 검색 됩니다.

효 모 신경 Proteinopathy 모델에서 특성화 히스톤 포스트 번역 상 수정 변경

α-시누클레인의 생체 내 생리학적 모델은 파킨슨병의 발병기전을 연구하고 이해하는 데 필요합니다. 인간화 효모 모델을 사용하여 α-synuclein의 세포 독성 및 응집체 형성을 모니터링하는 방법을 설명합니다.

인간화 효모 모델을 이용한 α-시뉴클레인 독성 및 응집을 연구하는 방법

학습하세요 효모 Saccharomyces cerevisiae를 이용한 인간 P53 전사 활성화 기능 분석 프로토콜. 암 관련 돌연변이 효과 평가 및 색상 리포터, 루시퍼라스 정량화 방법을 통해 유전자 발현 조절 메커니즘을 연구합니다.

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