Name: 펩타이드 농축 및 질량 분광법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: 배우세요 펩타이드 농축 및 질량 분광법을 이용한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출 방법입니다. 개선된 분획화와 조각화 설정으로 유비퀴틴모 분석의 커버리지를 크게 향상시킵니다.

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이 작품은 국가 로드맵 대규모 연구 시설 (프로젝트 번호 184.032.201)의 일환으로 네덜란드 과학 연구 기구 (NWO)에 의해 자금을 조달 네덜란드 Proteomics 센터의 프로그램 "직장에서 단백질"프로젝트의 일부입니다 ).

여기에 설명된 모든 방법은 에라스무스 MC의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(EDC)에 의해 승인되었습니다.
1. 견본 준비
<ol><li>배양 된 세포<ol>
<li>관심 있는 세포주(예: HeLa 또는 골육종 [U2OS] 세포)를 선택하고 10% 열 불활성화 태아 소 혈청(FBS)과 100 단위/mL 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 덜베코의 최소 독수리 배지(DMEM)에서 세포를 성장시다.</li>
		<li>정량적 프로테오믹스 실험의 경우, DMEM의 배양 세포는 아르기닌과 리신이 결여되어 있다. 배지는 10% 투석소 혈청(FBS), 100 단위/mL 페니실린/스트렙토마이신, 알라닌 글루타민으로 보충되어야 합니다. 기존의 리신과 아르기닌('Light' Medium) 또는 리신-8(13C136)을 추가하여 두 가지 유형의 미디어를 만드십시오. 15N2)및 아르기닌-10(13C6; 15N4)('헤비 미디엄') 각각.</li>
		<li>광배지(즉, 표지되지 않은) 및 중형배지(즉, 표지되지 않은 SILAC)에서 세포의 배양 배치를 확장 및 치료 전에 적어도 6배 이상 배배화하여 중형 배양내의 모든 단백질이 무거운 안정동위원소로 표지되도록 한다. 아미노산.</li>
		<li>프로테아좀 억제제 보르테조미브의 10 μM 또는 DMSO의 동등한 부피를 모의 처리로서 8시간 동안 치료한다. PBS로 세포를 세척, 그들을 사용하여 해리 1% 트립신 / EDTA, 세포를 펠릿.</li>
		<li>0.5% 나트륨 데옥시콜레이트(DOC)를 가진 얼음-차가운 50 mM Tris-HCl(pH=8.2)의 2 mL에서 시험된 조건당 150 cm2 배양판으로부터 세포 펠릿을 분해한다. 용해액을 95°C에서 5분간 끓이고 10분 동안 초음파 처리합니다(재료 표에열거된 초음파 처리기의 경우 "H"를 4°C에서 설정). 우리는 N-에틸 말레미드 (NEM)와 같은 듀비퀴티나제 억제제의 사용을 권장하지 않습니다, 이것은 펩티드 식별을 복잡하게 할 수있는 원치 않는 단백질 수정을 소개 할 수 있기 때문에.</li>
	</ol>
</li>
	<li>생체 내 마우스 뇌 조직<ol>
<li>생체내 조직을 사용하는 경우, 100 mM Tris-HCl(pH=8.5), 12 mM 나트륨 DOC 및 12 mM 나트륨 N-라우로일사르코시네이트17을함유하는 얼음-차가운 완충액으로 조직을 용해시낸다. 4 °C에서 10 분 동안 용해 (재료 의 테이블에나열된 초음파 에 대한 "H"설정)에 대한 용해를 4 °C에서 5 분 동안 끓인다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>대색 흡광도 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 총 단백질 량을 정량화합니다. 단백질의 총량은 성공적인 디글리 펩티드 면역 침전(IP)을 위해 적어도 몇 밀리그램이어야 한다. SILAC 실험의 경우 총 단백질 량에 따라 1:1 비율로 가볍고 무거운 표지된 단백질을 혼합합니다.</li>
	<li>5 mM1,4-dithiothreitol을 사용하여 50 °C에서 30 분 동안 모든 단백질을 줄이고 그 후 어둠 속에서 15 분 동안 10 mM 요오도 아세타미드로 알킬레이트하십시오. Lys-C(1:200 효소 대 기질 비율)로 단백질 소화를 수행한 다음 30°C 또는 실온(RT)에서 트립신(1:50 효소 대 기질 비율)으로 밤새 소화합니다.</li>
	<li>소화된 시료에 트리플루오로아세트산(TFA)을 0.5%의 최종 농도로 추가하고 모든 세제를 침전시키고 제거하기 위해 10,000 x g에서 10분 동안 샘플을 원심분리합니다. 후속 분획을 위해 펩티드를 함유하는 상상급체를 수집한다.</li>
</ol>2. 오프라인 펩타이드 분획
<ol><li>고판기 역상(RP) C18 크로마토그래피를 중합체 고정상 재료(300 Å, 50 μM; 재료 표참조)를 빈 컬럼 카트리지에 적재하여 트립틱 펩타이드를 분별합니다. 고정상 침대 크기는 분별될 단백질 소화량으로 조정되어야 합니다. 0.5 g의 고정상 재료로 채워진 빈 6 mL 컬럼 카트리지(재료 표참조)를 준비하여 ~ 10 mg의 단백질 다이제스트를 준비합니다. 고정상 비율에 단백질 소화는 대략 1:50 (w/w)이어야 합니다.</li>
	<li>준비된 컬럼에 펩티드를 로드하고 0.1% TFA의 약 10개의 컬럼 부피로 컬럼을 세척하고, 그 다음에H2O의 약 10개의 컬럼 부피를 갖는다.</li>
	<li>펩티드를 각각 7%, 13.5%, 50% 아세토니트릴(AcN)으로 10 mMM 암모늄 포메이트 용액(pH= 10)의 10개의 컬럼 부피를 가진 3개의 분획으로 용해시. 모든 분수를 완전하게 사용자 지정합니다.</li>
	<li>유비퀴틴 잔여 모티프(K-θ-GG) 항체를 사용하여 단백질A아가로즈 비드를 diGly 펩티드의 면역농축에 공액화한다. 구슬의 배치 당 항체의 정확한 양은 독점 정보이며 제조업체에 의해 공개되지 않기 때문에, 혼동을 피하기 위해 제조 업체와 같은 비드 배치에 대해 동일한 정의를 사용하는 것이 좋습니다. 이 비드 의 한 배치를 PBS로 2x로 씻고 비드 슬러리를 6 개의 동일한 분획으로 나눕습니다. 자세한 실험 계획은 그림 1을 참조하십시오.</li>
	<li>50 mM MOPS, 10 mM 나트륨 인산염 및 50 mM NaCl (pH = 7.2)으로 구성된 완충액의 2.3 단계에서 수집 된 3 개의 펩티드 분획을 용해시키고 파편을 스핀 다운합니다.</li>
	<li>분획물의 상피제를 diGly 항체 비드에 첨가하고 회전기 유닛상에서 4°C에서 2시간 동안 배양한다. 구슬을 스핀 다운하고 상급체를 항체 비드의 신선한 배치로 옮기고 4 °C에서 2 시간 동안 다시 배양합니다.</li>
	<li>후속 글로벌 프로테오메(GP) 분석을 위해 상급자를 저장합니다.</li>
	<li>구슬을 유지하기 위해 GF/F 필터 플러그가 장착된 200 μL 파이펫 팁으로 모든 분획에서 구슬을 옮김을 전달합니다. 비드와 함께 파이펫 팁을 원심 분리팁 어댑터가 장착된 1.5mL 마이크로원심지 튜브에 넣습니다. 얼음 차가운 IAP 완충액 200 μL로 구슬을 3x 세척하고 그 후 200 μL의 얼음 차가운 밀리Q H2O. 모든 세척 단계 전에 2 분 동안 200 x g에서 열을 아래로 회전시키지 만 열이 건조하지 않도록주의하십시오. 0.15% TFA의 50 μL의 2 사이클을 사용하여 펩티드를 용해.</li>
	<li>C18 단계 팁 (본질적으로 2 개의 C18 디스크가있는 200 μL 파이펫 팁)을 사용하여 펩티드를 탈염시키고 진공 원심 분리를 사용하여 완전성을 위해 건조시십시오.</li>
</ol>3. 나노 플로우 LC-MS / MS
<ol><li>나노 흐름 LC 시스템에 결합된 민감한 질량 분석기에서 LC-MS/MS 실험을 수행합니다.</li>
	<li>CSH130 수지(3.5 μm, 130 Å)로 포장된 75 μm 내경을 가진 50cm 반상 열이 있는 사내 포장된 반상 컬럼을 사용하고, 300 nL/min에서 120분 이상 2-28%(AcN, 0.1% FA)의 그라데이션으로 펩티드를 용출할 수 있습니다. 예를 들어 컬럼 오븐을 사용하여 컬럼을 50°C로 유지합니다(재료 표참조).</li>
	<li>질량 분석 분석을 수행합니다.<ol>
<li>질량 분석기는 데이터 종속 수집(DDA) 모드에서 작동해야 합니다. MS1 질량 분석기는 Orbitrap 질량 분석기의 경우 자동 게인 제어(AGC) 목표 설정이 4E5이고 최대 주입 시간이 50ms인 고해상도(예: 120,000)로 수집되어야 합니다.</li>
		<li>먼저 "최고 강도 우선" 모드에서 질량 분석 분석을 수행합니다. 이렇게, 가장 강렬한 이온은 조각화를 위해 먼저 선택되고, 그 다음에 두 번째로 높은, 등등, 총 사이클 시간 3초를 가진 최고 속도 방법을 사용한다. 그런 다음 "가장 낮은 강도 첫 번째" 모드에서 두 번째 DDA MS 분석을 수행하여 가장 적은 강도의 이온을 먼저 선택한 다음 두 번째로 낮은 이온을 선택합니다. 이 전략은 매우 낮은 분하 펩티드의 최적의 검출을 보장합니다.</li>
		<li>전하 상태(2-7회 충전) 및 단일 동위원소 피크 할당에 따라 전구체 이온을 필터링합니다. 60s. 4중 대질량 필터로 1.6Th의 폭으로 설정된 펩티드 전구체를 동적으로 심문한 전구체를 제외합니다.</li>
		<li>최대 사출 시간 50ms및 HCD 충돌 에너지 30%로 7E3의 AGC에서 이온 트랩에서 MS2 스펙트럼을 수집합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 데이터 분석
<ol><li>안드로메다 검색 엔진18,,19에기초하여 자유롭게 사용할 수 있는 MaxQuant 소프트웨어 제품군과 같은 적절한 검색 엔진을 사용하여 질량 분석 원시 파일을 분석한다. MaxQuant에서 아래에 표시된 몇 가지 적응이 있는 기본 설정을 선택합니다. 누락 된 절단의 최대 수를 3으로 제기하여 트립신에 효소 특이성을 설정합니다. diGly 잔재 (+114.04 Da), 메티오닌 및 N 말단 아세틸화의 산화를 가변 변형으로 설정하고, 시스테인의 카르바미도메틸화를 고정 된 수정으로 설정합니다.</li>
	<li>예를 들어, Uniprot 저장소(https://www.uniprot.org/downloads)와 결합된 Uniprot<a href="https://www.uniprot.org/downloads" target="_blank">저장소(https://www.uniprot.org/downloads)에서</a>다운로드한 단백질 서열을 포함하는 FASTA 파일에 대한 데이터베이스 검색을 MaxQuant에서 자동으로 제공하는 표준 공통 오염 데이터베이스와 결합합니다. 거짓 발견 률(FDR)을 1%로 설정하고 수정된(diGly) 펩티드에 대한 최소 점수를 40(기본값)으로 설정합니다. 추가 분석으로부터 C-말단 diGly 변형 된 라이신 잔기로 확인된 펩티드를 배제한다.</li>
	<li>SILAC 실험 파일의 정량적 분석을 위해 복합성을 "2"로 설정하고 4.2단계를 반복합니다.</li>
	<li>MaxQuant 소프트웨어 제품군의 Perseus 모듈20을 사용하여 모든 다운스트림 분석(예: 통계, 유전자 온톨로지 분석)을 수행합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Clague, M. J., Urbé, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin%3A+Same+molecule%2C+different+degradation+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways.</a> Cell. 143, 682-685 (2010).</li>
<li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin-proteasome+proteolytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway.</a> Cell. 79 (1), 13-21 (1995).</li>
<li>Ohtake, F., Tsuchiya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JB+special+review+-+Recent+topics+in+ubiquitin-proteasome+system+and+autophagy%3A+The+emerging+complexity+of+ubiquitin+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">JB special review - Recent topics in ubiquitin-proteasome system and autophagy: The emerging complexity of ubiquitin architecture.</a> Journal of Biochemistry. 161 (2), 125-133 (2017).</li>
<li>Bergink, S., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+ubiquitin+and+SUMO+modifications+in+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Principles of ubiquitin and SUMO modifications in DNA repair.</a> Nature. 458 (7237), 461-467 (2009).</li>
<li>Komander, D., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ubiquitin+Code%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Ubiquitin Code.</a> Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).</li>
<li>Michel, M. A., Swatek, K. N., Hospenthal, M. K., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+Linkage-Specific+Affimers+Reveal+Insights+into+K6-Linked+Ubiquitin+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin Linkage-Specific Affimers Reveal Insights into K6-Linked Ubiquitin Signaling.</a> Molecular Cell. 68 (1), 233-246 (2017).</li>
<li>Swatek, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+ubiquitin+chain+architecture+using+Ub-clipping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insights into ubiquitin chain architecture using Ub-clipping.</a> Nature. 572, 533-537 (2019).</li>
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<li>Sap, K. A., Bezstarosti, K., Dekkers, D. H., Voets, O., Demmers, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+reveals+extensive+remodeling+of+the+ubiquitinome+after+perturbation+of+the+proteasome+by+dsRNA+mediated+subunit+knockdown%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics reveals extensive remodeling of the ubiquitinome after perturbation of the proteasome by dsRNA mediated subunit knockdown.</a> Journal of Proteome Research. 16 (8), 2848-2862 (2017).</li>
<li>Xu, G., Paige, J. S., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+lysine+ubiquitination+by+ubiquitin+remnant+immunoaffinity+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Global analysis of lysine ubiquitination by ubiquitin remnant immunoaffinity profiling.</a> Nature Biotechnology. 28 (8), 868-873 (2010).</li>
<li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li>
<li>Wakabayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteome+analysis+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+tissue+sections+mounted+on+microscope+slides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteome analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue sections mounted on microscope slides.</a> Journal of Proteome Research. 13 (2), 915-924 (2014).</li>
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<li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+%28prote%29omics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (June), 731-740 (2016).</li>
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<li>Kaiser, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+standard+absolute+quantification+%28PSAQ%29+method+for+the+measurement+of+cellular+ubiquitin+pools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein standard absolute quantification (PSAQ) method for the measurement of cellular ubiquitin pools.</a> Nature Methods. 8 (8), 691-696 (2011).</li>
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</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

여기서 기재된 프로토콜은 배양된 세포 및 생체내 조직과 같은 다양한 생물학적 공급원으로부터의 샘플에 적용되었다. 모든 경우에 우리는 diGly 펩티드의 수천을 확인, 총 단백질 입력 량이 적어도 이었다는 것을 제공 1 mg. 특이적 항체를 이용한 농축은 유비퀴틴화 단백질 또는 diGly 펩티드에 대한 농축 절차가 적용되지 않은 경우 전체 세포 용해물에서 만 100-150 매우 낮은 풍부한 diGly 펩티드만이 확인되었다는 점을 감안할 때 매우 효율적입니다. 분명히 민감한 질량 분석법은 많은 수의 diGly 식별을 얻기 위한 전제 조건입니다. 우리는 성공적으로 여러 가지 질량 분석기를 사용했지만, 우리는 Orbitrap Tribrid Lumos가 가장 높은 수율을 준 가장 민감한 것으로 나타났습니다.
높은 pH 용출이 있는 오프라인 RP 크로마토그래피는 IP가 수행되기 전에 테스트되어야 합니다. 펩티드 식별의 관점에서 분획 사이의 중첩은 최적의 실험을 위해 가능한 한 낮아야 한다....

단백질에 유비퀴틴의 융합은 프로테아솜에 의한 분해를 표시하고 프로테오스타증에서 중요한 과정입니다. 유비퀴틴의 C 말단 카르복실 그룹은 표적 단백질1,,2의리신 θ-아미노 기와 이소펩티드 결합을 형성한다. 또한, 유비퀴틴은 다른 유비퀴틴 모듈에 부착될 수 있으며, 이로 인해 균질한(즉, K48 또는 K11) 또는 분기(즉, 이질성 또는 혼합) 폴리유비퀴틴구조1,,3의형성을 초래한다. 유비퀴틴의 가장 잘 알려진 기능은 K48 연결 폴리유비퀴틴에 의해 매개된 프로테소말 분해에서의 역할입니다. 그러나, 모노-뿐만 아니라 polyubiquitination 또한 proteasome에 의한 분해와 무관하게 많은 프로세스에서 역할을 한다는 것이 분명해졌습니다. 예를 들어, K63 연결 체인은 세포 내 인신 매매, 리소좀 분해, 키나아제 신호 및 DNA 손상 반응4,,5에서비분해적 역할을 합니다. 다른 6개의 연계 유형은 덜 풍부하고 그들의 역할은 여전히 대체로 수수께끼이지만, 세포에서의 기능에 대한 첫 번째 징후가 나타나고 있지만, 주로 링크지 별검출을가능하게하는 새로운 도구의 개발로 인해 6,7.
질량 분석법은 프로테오메 분석을 위한 필수 도구가 되었으며, 오늘날 거의 모든 생물학적 공급원으로부터 수천 개의 다른 단백질이 단일 실험에서 확인될 수 있습니다. 복잡성의 추가 층은 단백질 활동을 조절할 수 있는 단백질의 번역 후 수정 (PTM)에 의해 제시됩니다 (예를 들어, 인산화, 메틸화, 아세틸화 및 유비퀴틴화). PTM 베어링 단백질의 대규모 식별은 질량 분석 분야의 개발에 의해 가능하게 되었습니다. PTM을 함유하는 펩티드의 상대적으로 낮은 화학적 분석은 수정되지 않은 펩티드에 비해 기술적 과제를 제시하며, 질량 분석 분석 이전에 는 생화학적 농축 단계가 일반적으로 필요하다. 지난 2년 동안 PTM 분석을 위해 여러 가지 특정 농축 방법이 개발되었습니다.
세포에서 단백질 유비퀴틴화의 다각적인 역할 때문에, 단백질 에 대한 유비퀴틴화 부위의 검출을 위한 분석 방법의 개발에 대한 수요가 매우 크다8. 질량 분광 방법의 적용은 과일 플라이, 마우스, 인간 및 효모 단백질9,,10,,11,,12,,13,,14에서확인 된 유비퀴틴 화 부위의 수의 폭발로 이어졌다. 주요 단계는 K-θ-GG 잔여 모티프('디글리신' 또는 'diGly'라고도 함)에 대한 항체를 사용하여 펩타이드 수준에서 면역 침전 기반 농축 전략의 개발에 의해 제시되었다. 이들 디글리 펩티드는 프로테아제15,,16으로서트립신을 사용하여 유비퀴틴화 단백질의 소화시 생산된다.
여기서, 우리는 Orbitrap 질량 분광법에 의한 면역 정화 및 후속 검출을 사용하여 diGly 펩티드를 풍부하게 하는 최적화된 워크플로우를 제시합니다. 특히 시료 전처리 및 질량 분석 단계에서 기존 워크플로우의 여러 변형을 조합하여 proteasome로 처리된 HeLa 세포의 단일 샘플에서 23,000개 이상의 diGly 펩타이드를 일상적으로 식별할 수 있습니다. 억제제 및 치료되지 않은 HeLa 세포로부터 ~10,000. 우리는 세포 배양에 있는 아미노산으로 표지되지 않은 안정한 동위원소 표지둘 다에서 용해하기 위하여 이 프로토콜을 적용했습니다 (SILAC) HeLa 세포를 표지하고 두뇌 조직과 같은 내인성 견본에.
이 워크플로우는 깊은 유비퀴티노메를 발견하기 위해 유비퀴틴 사이트를 분석하기 위한 도구의 레퍼토리에 귀중한 추가를 제공합니다. 다음 프로토콜은 워크플로의 모든 단계를 자세히 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>1,4-Dithioerythritol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8255</td><td></td></tr><tr><td>3M Empore C18 Octadecyl 디스크</td><td>Supelco</td><td>66883-U</td><td>제품은 Supelco에서 단종되었습니다. CDS Analytical은 새로운 제조업체 (https://www.cdsanalytical.com/empore)</td></tr> <tr><td>포름산 암모늄</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>70221</td><td></td></tr><tr><td>Bortezomib</td><td>UBPbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CSH130 수지, 3.5 &mu; m, 130 &Aring;</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34869</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EASY-nanoLC 1200</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GF/F 필터 플러그</td><td>Whatman</td><td>1825-021</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>라이신, 아르기닌</td><td>시그마-알드리치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>라이신-8 (13C6; 15N2), 아르기닌-10 (13C6; 15N4)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lysyl Endopeptidase(LysC)</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>129-02541</td><td></td></tr><tr><td>NanoLC 오븐</td><td>MPI 설계, MS Wil GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosine 나트륨 염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-5125</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos 질량 분석기</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA 단백질 분석 키트</td><td>ThermoFisher / Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>PLRP-S (300 &Aring;, 50 & micro; m) 고분자 역상 입자</td><td>Agilent Technologies</td><td>PL1412-2K01</td><td></td></tr><tr><td>PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-&epsilon;-GG) Kit</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>5562</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak tC18 6 cc Vac 카트리지</td><td>Waters</td><td>WAT036790</td> PLRP-S Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich 30970<td>으로 카트리지를 채우기 전에 카트리지에서 tC18 재료를 제거하십시오</td></tr>.<tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin, TPCK 처리</td><td>ThermoFisher</td><td>20233</td><td></td></tr></tbody></table>

펩타이드 농축 및 질량 분광법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

작은 단백질 유비퀴틴에 의한 단백질의 번역 후 변형은 많은 세포 이벤트에서 관여한다. 유비퀴틴화된 단백질의 트리펩티드 소화 후, 리신의 엡실론 아미노 그룹('K-θ-디글리신' 또는 단순히 'diGly')에 컨쥬게이징된 디글리신 잔재를 함유한 펩티드를 원래의 수정 부위를 추적하는데 사용할 수 있다. 질량 분석법에 의한 민감한 검출과 결합된 diGly 펩티드의 효율적인 면역정화는 현재까지 확인된 유비퀴틴화 부위의 수가 크게 증가하였다. 우리는 농축 절차 이전에 펩타이드의 오프라인 높은 pH 역상 분획및 이온 라우팅 멀티폴에 보다 진보된 펩티드 단편화 설정을 포함하는 이 워크플로우를 몇 가지 개선했습니다. 또한, 항체 비드를 보유하기 위해 필터 기반 플러그를 사용하여 시료를 보다 효율적으로 정리하면 diGly 펩티드에 대한 더 큰 특이성을 초래한다. 이러한 개선은 인간 자궁 경부암 세포 (HeLa) 세포에서 23,000 개 이상의 diGly 펩티드의 일상적인 검출을 초래하여 세포에서 프로테아좀 억제에 따라 용해됩니다. 우리는 몇몇 다른 세포 모형및 두뇌 조직과 같은 생체 내 견본의 보편성 프로파일의 심층 분석을 위한 이 전략의 효험을 보여줍니다. 이 연구는 깊은 세포 유비퀴티노메를 밝히기 위해 단백질 유비퀴틴 분석을 위한 도구 상자에 원래 추가된 것을 제시합니다.

유비퀴틴화 단백질은 단백질이 트립신으로 소화될 때 대상 리신 잔류물 위에 114.04 Da 디글리신 잔재를 남깁니다. 이 모티프에 의한 질량 차이는 질량 분석 실험에서 유비퀴틴화 부위를 명확하게 인식하는 데 사용되었습니다. 여기서 설명하는 전략은 나노흐름 LC-MS/MS에 의한 diGly 펩티드의 농축 및 후속 식별을 위한 최첨단방법(그림 1A)입니다. 본 연구에서, 배양된 세포와 생체 내 물질 모두 단백질의 생물학적 공급원으로 사용되었지만, 이 프로토콜은 단백질의 임의의 공급원과 호환된다. 프로토콜의 단계에 따라 단백질 입력의 2-20 mg에서 10,000-25,000 diGly 펩티드를 확인하는 것이 간단해야한다. 세포에서 단백질 유비퀴틴화의 정도를 증가시키기 위해, 보르테조미브 또는 MG132와 같은 프로테아좀 억제제는 세포를 수확하기 몇 시간 전에 첨가될 수 있다. 프로테아좀 억제...

우리는 복잡한 생물학적 샘플에서 유비퀴틴화 된 단백질에서 유래 한 diGly 펩티드의 정제, 검출 및 식별방법을 제시합니다. 제시된 방법은 유비퀴티노메 분석의 깊이 수준에 대하여 공표된 방법을 재현가능하고 견고하며 능가합니다.

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

작은 단백질 유비퀴틴에 의한 단백질의 번역 후 변형은 세포내의 많은 사건에 관여한다. 이 연구는 단백질 유비쿼터티화 분석을 위한 툴박스에 원래 추가된 것을 제시합니다. 우리는 깊은 유비쿼터티노메를 밝히기 위해 농축 기술과 질량 분광법을 사용합니다.우리는 유비쿼터티 단백질에서 유래하는 diGly 펩티드의 분석에 몇몇 개선을 했습니다. 이들은 농축하기 전에 조질 펩티드 분획을 포함하고, Orbitrap에서 더 진보된 펩티드 단편화 설정의 적용. 전부이 유비 쿼터 티노메의 더 큰 범위 결과.프로토콜의 여러 측면을 단어로 설명하기가 어렵습니다. 일부 주요 단계의 시각화는 다른 랩의 다른 작업자가 이러한 분석을 반복할 수 있어야 합니다. 절차는 내 실험실에서 수석 기술자 인 Karel Bezstarosti에 의해 입증될 것입니다.실험을 위한 배양된 세포 또는 마우스 두뇌 조직을 준비하는 것으로 시작합니다. 세포와 함께 작동하는 경우, 얼음 감기의 두 밀리리터에 하나의 150 센티미터 제곱 배양 플레이트에서 세포 펠릿을 lyse, 50 0.5 %의 탈옥 나트륨 과 트리S HCL. 용액을 섭씨 95도에서 5분간 끓입니다.그런 다음 섭씨 4도에서 10 분 동안 초음파 처리하십시오. 생체 내 마우스 뇌 조직을 사용하는 경우, 100 밀리머 트리스 HCL, 12 밀리머 나트륨 deoxycholate 및 12 밀리머 나트륨 N-lauroylsarcosinate를 포함하는 얼음 차가운 버퍼에 lyse. 섭씨 4도에서 10분 동안 용사를 음초음파 처리합니다.그런 다음 섭씨 95도에서 5 분간 끓입니다. 다음으로, 칼로리 흡광도 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 총 단백질 양을 양량화하며, 이는 성공적인 diGly 펩티드 면역 침전을 위해 적어도 몇 밀리그램이어야 한다. SILAC 실험의 경우, 총 단백질 량에 따라 빛과 무거운 라벨단백질을 1 대 1 비율로 혼합한다.섭씨 50도에서 30분 동안 5밀리몰러 DTT로 모든 단백질을 줄입니다. 그리고 그 후 어둠 속에서 15 분 동안 10 밀리마일라 요오도아세타미드로 그들을 알킬 수 있습니다. 그런 다음 Lys-C로 4 시간 동안 단백질 소화를 수행합니다.그리고 트립신 소화는 섭씨 30도, 또는 실온에서 하룻밤. 다음 날, 샘플을 2밀리리터 Eppendorf 튜브 2개로 나누고 TFA를 소화된 시료에 0.5%의 최종 농도로 10, 000배 G에서 10분간 침전하고 제거합니다. 후속 분획을 위해 상체가 함유된 펩티드를 수집합니다.고pH 역상 C18 크로마토그래피를 사용하여 트립틱 펩티드를 분별하십시오. 단백질 다이제스트의 대략 10 밀리그램을 위한 고정상 물질의 0.5 그램으로 채워진 빈 6 밀리리터 컬럼 카트리지를 준비합니다. 펩티드를 준비된 컬럼에 적재하고 약 10권의 0.1%TFA로 세척한 다음 10권의 물로 세척합니다.펩티드를 10개의 컬럼 부피를 사용하여 각각 7, 13.5 및 50%의 아세토나이트를 함유하고 있습니다. 그런 다음, 모든 분수 를 litholyse. 단백질 A 아가로즈 비드 슬러리에 컨쥬게이트된 유비퀴틴 잔재 모티프 항체의 1배치는 6개의 동등한 분획으로 나뉩니다.원고 방향에 따라 세 개의 펩티드 분획을 녹이고 이물질을 회전시합니다. 얼음에 다른 세 분획을 유지하면서 비드 슬러리에 세 분획의 슈퍼 네이트인을 추가합니다. 그리고 회전기 단위에 섭씨 4도에서 2 시간 동안 그들을 배양.그런 다음 구슬을 회전시합니다. 상체를 신선한 구슬 배치로 옮기습니다. 그리고 나머지 세 개의 비드 슬러리 분획으로 인큐베이션을 반복합니다.후속 글로벌 프로테오메 분석을 위해 수퍼네티어를 저장합니다. 그리고 구슬을 GFF 필터 플러그가 장착된 200 마이크로리터 파이펫 팁으로 전송합니다. 원심분리기 팁 어댑터가 장착된 1.5 밀리리터 튜브에 팁을 넣고 얼음 차가운 IAP 버퍼 200 마이크로리터로 구슬을 세 번 씻은 다음 얼음 냉간 정제수로 세 번 세척합니다.열을 200회 G로 회전시켜 세서즈 사이에 2분간 회전하여 컬럼을 건조하게 만들지 않도록 합니다. 마지막 세척 후, 0.15%TFA의 50 마이크로리터에서 2사이클로 펩티드를 엘테. C18 단계 끝으로 펩티드를 탈염하고 진공 원심 분리로 건조시합니다.나노플로우 LC 시스템에 결합된 민감한 질량 분광계에서 LC-MS/MS 실험을 수행합니다. 이 열은 원고의 지시에 따라 설정되어 섭씨 50도에 유지됩니다. 데이터 종속 획득 모드에서 질량 분광계를 작동합니다.4E5의 자동 게인 제어 대상 설정과 최대 주입 시간 50 밀리초로 MS1 질량 스펙트럼을 고해상도로 수집합니다. 총 사이클 시간이 3초인 최고 속도 방법을 사용하여 가장 강렬한 첫 번째 모드에서 질량 분광법 분석을 수행합니다. 그런 다음 낮은 풍부 펩티드의 최적의 검출을 보장합니다 가장 강렬한 첫 번째 모드에서 DDA MS 분석의 두 번째 라운드를 수행합니다.전구체 이온을 충전 상태 및 단일화 피크 할당에 따라 필터링합니다. 그리고 이전에 심문된 전구체를 60초 동안 동적으로 제외합니다. 1.6 Thomson의 폭으로 설정된 쿼드러폴 질량 필터로 펩티드 전구체를 분리합니다.그런 다음 최대 주입 시간 50밀리초와 HCD 충돌 에너지 30%의 자동 게인 제어에서 이온 트랩에서 MS2 스펙트럼을 수집하여 안드로메다 검색 엔진을 기반으로 자유롭게 사용할 수 있는 MaxQuant 소프트웨어 제품군과 같은 적절한 검색 엔진을 사용하여 질량 분석 원시 파일을 분석합니다. MaxQuant를 열고 적절한 원시 데이터 파일을 선택합니다. 프로세서 수를 설정하고 그룹 특정 매개 변수 탭을 클릭합니다.소화를 선택하고 세 개의 누락된 골짜기를 허용합니다. 그런 다음 수정 사항을 선택하고 변수 수정에 diGly를 추가합니다. 전역 매개 변수 탭을 선택하고 올바른 단백질 서열 데이터베이스를 추가합니다.다른 설정을 기본값으로 두고 데이터베이스 검색을 수행하기 위해 누릅니다. SILAC 실험 파일의 정량적 분석을 위해 복합성을 2개로 설정하고 중아미노산 라벨을 선택합니다. 검색이 완료되면 텍스트 파일을 Perseus로 가져옵니다.이 프로토콜은 나노플로우 LC-MS/MS를 이용한 디글리 펩티드를 검출함으로써 배양된 세포 및 생체 내 물질의 단백질에서 유비쿼터티닝 부위를 식별하는 데 사용되었다. 검출된 디글리 펩티드의 수가 더 많은 기존 프로토콜에 대한 몇 가지 개선이 이루어졌다. 면역 침전 전에 3개의 분획으로 조분획을 수행했습니다.분수 중 하나는 LC 크로마토그램의 넓은 피크를 특징으로하는 유비퀴틴의 자체 K48 변형 된 트립틱 디그 펩티드를 함유하고 있습니다. 더욱이, 펩티드 단편화 정권은 LC-MS 실행을 데이터 분석 절차에서 가장 높은 첫 번째 및 최저 제1 단편화 요법과 결합하도록 조정되었으며, 이는 4, 000 개 이상의 고유 디글리 펩티드를 생산했다. 23개 이상의, 000 디글리 펩타이드는 프로테좀 억제제로 처리된 HeLa 세포의 단일 샘플에서 일상적으로 식별될 수 있다.3개의 생물학적 복제 스크린을 통해 확인된 모든 diGly 펩티드의, 9, 000 이상은 3개의 복제중 적어도 2개에서 존재한 반면, 3개 모두에 존재했습니다. 펩티드 식별의 수는 입력 재료의 양에 매우 우발적이다. 확인된 디글리 펩타이드의 대략적인 수는 시작 물질에 따라 예상될 수 있지만, 이러한 숫자는 추정일 뿐이며 사용되는 질량 분광계의 종류에 따라 달라집니다.이 프로토콜을 수행할 때 질량 분석 기반 프로테오믹스 방법과 미세 샘플 양을 처리하고 분석한 이전 경험은 확실히 유리할 것입니다. MaxQuant 소프트웨어는 다른 데이터베이스 검색 알고리즘으로 대체될 수 있습니다. 또한 다른 유형의 질량 분광계가 사용될 수 있다.펩티드 식별의 관점에서 결과는 약간 다를 수 있습니다, 그러나 이것은 어떤 질량 분광계 기지를 둔 proteomics 분석에 대 한 일반적이다. 유비퀴틴은 중재된 단백질 분해의 진행에 중요하지만, 또한 세포내의 많은 다른 프로세스에서 역할을 한다. 번역 후 수정으로 유비퀴틴에 대한 깊은 지식은 그 기능을 더 잘 이해하는 데 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

Ubiquitination 세 효소의 집합으로 실시하는 핵심 posttranslational 수정합니다. 이 수정에 관여 유전자의 돌연변이가 여러 가지 인간의 질병와 관련된 있습니다. 여기, 우리는 교양 세포에 단백질 ubiquitination을 감지 프로토콜...

단백질 Ubiquitination의 감지

안정 동위 원소 표준 및 안티 펩타이드 항체 (SISCAPA) 각각의 단백질에 대한 surrogates으로 펩티드의 양적 측정을 제공하기 위해 안정 동위 원소 희석 질량 분석법 (MRM - MS)과 펩티드의 커플 선호도 농축하여 캡처합니다. 여기서 우리는 부분적으로 자동화된 형식으로 자기 입자를 사용하여 프로토콜을 설명합니다.

펩타이드 면역 친 화성 농축을 사용하여 단백질의 양을 정함은 질량 분광법과 함께

이 비디오에서는 펩타이드 혼합물에서 포스호펩타이드의 항체 기반 면역침전을 보여줍니다. 농축된 인산펩타이드는 진공 농축되어 다운스트림 분석을 위해 보관됩니다.

인산펩타이드 농축: 복합 펩타이드 혼합물에서 특정 인산화 펩타이드를 분리하는 항체 기반 면역침전 기법

이 동영상은 복합 펩타이드 혼합물에서 잔류 디글리신 펩타이드를 포함하는 유비퀴틴닐화 펩타이드를 추출하고 정제하는 방법을 설명합니다. 제시된 방법은 단백질의 원래 유비퀴틴(ubiquitination) 부위를 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다.

유비퀴틴화 펩타이드의 면역친화성 기반 추출: 정제된 펩타이드 분획에서 유비퀴틴 태그 펩타이드를 선택적으로 추출하는 기술

이 프로토콜에는 전립선 암 세포 선 또는 단백질 질량 분석 기반 을 통해 phosphoproteome의 분석에 대 한 조직에서 phosphopeptides을 풍부 하 게 추출 하는 절차를 설명 합니다.

전립선 암에 있는 Phosphoproteome를 조사 하기 위해 양적 라벨 무료 질량 분석으로 결합 된 Phosphopeptide 농축

이 프로토콜은 치료 또는 표현형과 같은 특정 조건과 관련된 이러한 종류의 번역 후 수정 (PTM)의 변경을 식별하기 위해 유비퀴틴 (Ub) 및 유비퀴틴 -좋아요 (Ubls) 특정 프로테오옴을 확립하는 것을 목표로합니다.

유비퀴틴 및 유비퀴틴과 같은 종속 적 번역 후 수정 및 중대한 변경 식별 프로파일링

이 방법은 유비퀴틴 체인 토폴로지의 글로벌 변화에 대한 평가를 설명합니다. 평가는 질량 분광계 기지를 둔 표적 proteomics 접근의 응용에 의해 수행됩니다.

병렬 반응 모니터링에 의한 유비퀴틴 연쇄 분석

CENP-A 유비쿼터스는 세포 분열 사이의 분화를 통해 계승되고 세포 생존가능성에 필수적입니다. 여기서 우리는 EYFP 태그CENP-A (EYFP-CENP-A) 단백질의 유비쿼터션을 확인하기 위해 질량 분광분석 분석을 설명합니다.

EYFP 태그CENP-A(EYFP-CENP-A)의 유비쿼터션을 식별하기 위한 질량 분광분석

우리는 포유동물 세포에서 특정 기질 및 E3 유비퀴틴 리가아제의 유비퀴틸화 검정을 위한 상세한 프로토콜을 제공한다. HEK293T 세포주는 단백질 과발현을 위해 사용되었고, 폴리유비퀴틸화된 기질은 면역침전에 의해 세포 용해물로부터 정제되고, SDS-PAGE에서 분해되었다. 면역블롯팅은 이러한 번역 후 변형을 시각화하기 위해 사용되었다.

포유동물 세포 용해물에서 E3 유비퀴틴-리가아제에 의한 기질 유비퀴틸화의 평가

프로토콜은 p53 종양 억제 단백질을 예로 사용하여 포유류 세포로부터 유비퀴틴화된 단백질을 정제하는 단계별 방법을 설명합니다. 유비퀴틴화된 p53 단백질은 엄격한 비변성 및 변성 조건 하에서 세포로부터 정제하였다.

포유류 세포에서 유비퀴틴화된 p53 단백질의 정제

유비퀴틴화는 세포 내 단백질 기능의 중요한 조절자입니다. 여기서는 포유류 세포에서 기질 단백질 유비퀴틴화 수준을 검출하는 두 가지 세포 용해 방법을 설명하고, 유비퀴틴화 수준 분석에 미치는 효과를 비교합니다. HEK293T 세포 내 단백질 과발현은 일시적 형질전환에 의해 유도되었고, 유비퀴틴화된 단백질은 웨스턴 블롯 분석을 통해 검출되었습니다.

SMAD2/SMURF2를 모델로 삼은 포유류 세포 용해체에서의 유비퀴틴화 검출 비교 전략

배우세요 펩타이드 농축 및 질량 분광법을 이용한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출 방법입니다. 개선된 분획화와 조각화 설정으로 유비퀴틴모 분석의 커버리지를 크게 향상시킵니다.

펩타이드 농축 및 질량 분광법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출

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