Name: 포유류 세포 라인 CRISPR Cas를 사용 하 여 게놈 편집 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: 배우세요 포유류 세포 라인에서 CRISPR-Cas9을 이용한 유전자 노크아웃 및 노크인 기법. 이 효율적인 프로토콜은 유전자 기능 연구와 질병 모델링에 필수적인 게놈 편집 기술을 초보 연구자도 쉽게 익힐 수 있도록 설계되었습니다.

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M.H.T.는 과학 기술 및 연구의 공동 위원회 사무실 그랜트 (1431AFG103)에 대 한 기관에 의해 지원 됩니다, 국가 의료 연구 위원회 (OFIRG/0017/2016) 부여, 국립 연구 재단 보조금 (NRF2013-THE001-046, NRF2013-THE001-093)는 교육부의 교육 1 단계 그랜트 (RG50/17 (S)), 난 양 기술 대학교, 난 양 기술 대학교에서 국제 유전자 공학 기계 (iGEM) 경쟁에 대 한 자금에서 시작 권한을 부여 합니다.

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<li>Arnould, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+I-CreI+derivatives+cleaving+sequences+from+the+human+XPC+gene+can+induce+highly+efficient+gene+correction+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Engineered I-CreI derivatives cleaving sequences from the human XPC gene can induce highly efficient gene correction in mammalian cells.</a> Journal of Molecular Biology. 371 (1), 49-65 (2007).</li>
<li>Chapdelaine, P., Pichavant, C., Rousseau, J., Paques, F., Tremblay, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meganucleases+can+restore+the+reading+frame+of+a+mutated+dystrophin%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Meganucleases can restore the reading frame of a mutated dystrophin.</a> Gene Therapy. 17 (7), 846-858 (2010).</li>
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<li>Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+with+engineered+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome editing with engineered zinc finger nucleases.</a> Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).</li>
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<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+construction+of+sequence-specific+TAL+effectors+for+modulating+mammalian+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription.</a> Nature Biotechnology. 29 (2), 149-153 (2011).</li>
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<li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).</li>
<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Nishimasu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+Cas9+in+complex+with+guide+RNA+and+target+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA.</a> Cell. 156 (5), 935-949 (2014).</li>
<li>Yamano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+Structure+of+Cpf1+in+Complex+with+Guide+RNA+and+Target+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal Structure of Cpf1 in Complex with Guide RNA and Target DNA.</a> Cell. 165 (4), 949-962 (2016).</li>
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<li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li>
<li>Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+interrogation+by+the+CRISPR+RNA-guided+endonuclease+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9.</a> Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).</li>
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<li>Kleinstiver, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadening+the+targeting+range+of+Staphylococcus+aureus+CRISPR-Cas9+by+modifying+PAM+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition.</a> Nature Biotechnology. 33 (12), 1293-1298 (2015).</li>
<li>Kleinstiver, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+CRISPR-Cas9+nucleases+with+altered+PAM+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities.</a> Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).</li>
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<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-programmed+genome+editing+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">RNA-programmed genome editing in human cells.</a> Elife. 2, e00471(2013).</li>
<li>Cho, S. W., Kim, S., Kim, J. M., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+engineering+in+human+cells+with+the+Cas9+RNA-guided+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease.</a> Nature Biotechnology. 31 (3), 230-232 (2013).</li>
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<li>Kim, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome+editing+with+a+small+Cas9+orthologue+derived+from+Campylobacter+jejuni%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">In vivo genome editing with a small Cas9 orthologue derived from Campylobacter jejuni.</a> Nature Communications. 8, 14500(2017).</li>
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<li>Zhang, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+precise+knockin+with+a+double+cut+HDR+donor+after+CRISPR%2FCas9-mediated+double-stranded+DNA+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage.</a> Genome Biology. 18 (1), 35(2017).</li>
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<li>Shmakov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+evolution+of+class+2+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems.</a> Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).</li>
<li>Moreno-Mateos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cpf1+mediates+efficient+homology-directed+repair+and+temperature-controlled+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cpf1 mediates efficient homology-directed repair and temperature-controlled genome editing.</a> Nature Communications. 8 (1), 2024(2017).</li>
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<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+scarless+human+stem+cell+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Optimization of scarless human stem cell genome editing.</a> Nucleic Acids Research. 41 (19), 9049-9061 (2013).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li>
</ol>

저자 경쟁 없는 금융 관심.

CRISPR-Cas 시스템 엔지니어 유전자 및 식물 및 동물의 transcriptomes 강력 하 고 혁신적인 기술입니다. 많은 세균성 종의 게놈 및 transcriptome 목적44엔지니어링에 대 한 적응 수 있습니다 CRISPR Cas 시스템을 포함 하도록 발견 되었습니다. 연쇄 상 구 균 pyogenes (SpCas9)에서 Cas9 endonuclease은 배포할 성공적으로 인간 세포21,22,,2324, 다른 박테리아에서 효소를 첫 번째 효소 종, 표 1에 표시 된을 포함 하 여 또한 인간의16,26<s...

어떤 생명체의 게놈 엔지니어링 능력은 많은 생물 의학 및 바이오 응용 프로그램, 질병 발생의 수정 같은 돌연변이, 질병 연구에 대 한 정확한 휴대 전화 모델의 건설 또는 농업 생성 바람직한 특성을 가진 작물입니다. 세기의 차례 이후 다양 한 기술 개발 되었으며, meganucleases,12,3을 포함 한 포유류 세포에서 게놈 엔지니어링, 아연 손가락 nucleases4,5또는 전사 활성 제 같은 이펙터 nucleases (TALENs)6,7,,89. 그러나, 이러한 이전 기술을 어려운 프로그램 또는 조립, 지루한 연구 및 업계에서 광범위 하 게 채택 함으로써 방해.
최근 몇 년 동안에는 클러스터 된 정기적으로 짧은 구조 반복 (CRISPR) interspaced-CRISPR 관련 (Cas) 시스템 엔지니어링 기술10,11강력한 새로운 게놈으로 떠오르고 있다. 원래 박테리아에 적응 면역 체계, 되었습니다 성공적으로 식물과 동물, 인간을 포함 한 게놈 수정에 대 한 배포. CRISPR-Cas 같은 짧은 시간에 너무 많은 인기를 얻고 있다 왜 주된 이유 주요 Cas endonuclease, Cas9 또는 Cas12a (Cpf1 라고도 함) 등을 제공 하는 요소, 게놈에 있는 정확한 위치는 단순히 공상 단일 가이드 RN의 짧은 조각 (SgRNA), A는 디자인을 간단 하 고 저렴 한 합성. 대상 사이트에 보충 되 고, 후 Ca 효소 분자가 위 한 쌍으로 하 고 그것의 RuvC, 트, 또는 Nuc 도메인12,,1314바인딩된 DNA를 앞. 결과 두 배 좌초 휴식 (DSB)은 비 동종 끝 결합 (NHEJ) 또는 상 동 감독 수리 (HDR) 통로 통해 세포에 의해 연속적으로 복구 됩니다. 복구 서식 파일의 부재, DSB 단백질 코딩 유전자에 frameshift 돌연변이 일으키는 잠재적으로 야기할 수 있는 난수 삽입 또는 삭제 컷된 사이트에 뉴클레오티드 (indels), 오류가 NHEJ 통로 의해 수리는. 그러나, 원하는 DNA 변화를 포함 하는 기증자 템플릿을, 존재 DSB 고화질 HDR 통로 의해 수리는. 기증자 서식 파일의 일반적인 종류 단일 가닥 oligonucleotides (ssODNs) 및 플라스 미드 포함 됩니다. 전 반면 후자는 일반적으로 사용 하나 비교적 긴 시퀀스를 삽입 하고자 하는 경우 원하는 DNA 변경 (예: 단일 기본적인 쌍의) 작은 경우에 일반적으로 사용 됩니다 (예를 들어 녹색 형광 단백질의 코딩 순서 또는 GFP) 대상 장소에.
Cas 단백질의 endonuclease 활동 대상 사이트15에 protospacer 인접 한 모티프 (PAM)의 존재를 요구 한다. Cas9의 팸은 protospacer의 3' 끝에는 PAM의 Cas12a (Cpf1 라고도 함)는 5' 끝에 대신 하는 동안16. Cas-가이드 복잡 한 RNA는 PAM은17에 결 석 하는 경우는 DSB 소개 하 수 없습니다. 따라서, PAM 특정 Ca nuclease 쪼개 다 수가 게놈 위치에 제약 조건을 배치 합니다. 다행히, 다른 세균 종에서 Cas nucleases 일반적으로 다른 팸 요구를 전시 한다. 따라서, 우리의 엔지니어링 도구 상자에 다양 한 CRISPR Cas 시스템을 통합, 우리는 게놈에 타겟이 될 수 있습니다 사이트의 범위를 확장할 수 있습니다. 또한, 자연 Ca 효소 설계 수 있습니다 또는 대체 팸 시퀀스, 게놈 목표 조작18,,1920에 액세스할 수의 범위를 더욱 확대 인식 진화.
여러 CRISPR Cas 시스템 게놈 기술 설계 목적을 위해 사용할 수 있지만, 기술의 대부분의 사용자는 여러 이유로 주로 연쇄 상 구 균 pyogenes (SpCas9)에서 Cas9 nuclease에 의존 했습니다. 첫째,이 상대적으로 단순히 NGG 팸, 더 복잡 한 PAMs 존재만 쪼개 다 수 다른 많은 Ca 단백질 달리 필요 합니다. 둘째, 인간의 세포21,,2223,24에 성공적으로 배포 하는 첫 번째 Ca endonuclease 이다. 셋째, SpCas9까지 날짜에 최고의 특징이 효소 이다. 연구자 다른 Cas nuclease 사용 하고자 하는 경우 그 또는 그녀가 종종 것 디자인 실험 및 다른 효소 SpCas9에 비해 다른 생물학 문맥에서 얼마나 잘 수행 하는 최선의 방법에 대 한 명확한.
다른 CRISPR Cas 시스템의 상대적인 성능에 선명도 제공 하려면 우리 최근 포도 상 구 균 (SaCas9), 에서 Cas9 효소에서에서 Cas9 효소 5 개의 Ca endonucleases-SpCas9의 체계적인 비교를 수행 했습니다. Neisseria meningitidis (NmCas9) (AsCas12a)에 Acidaminococcus sp. BV3L6에서에서 Cas12a의 효소 및 Cas12a 효소 Lachnospiraceae 박테리아 ND2006에서에서 (LbCas12a)25. 공정한 비교를 위해 우리는 다른 실험 조건 및 대상 사이트의 동일한 세트를 사용 하 여 다양 한 Cas nucleases 평가. 연구 또한 delineated 디자인 매개 변수 각 CRISPR Cas 시스템 기술의 사용자를 위한 유용한 참고 자료 역할을. 여기, 더 나은 CRISPR Cas 사용 하도록 연구 활성화 시스템, 다른 Cas9 및 Cas12a 효소 ( 그림 1참조)로 최적의 게놈 엔지니어링에 대 한 단계별 프로토콜 제공. 프로토콜 뿐만 아니라 포유류 세포에서 게놈 성공적인 엔지니어링 결과의 가능성을 최대화 하기 또한 중요 한 디자인 고려 하지만 실험 내용을 포함 합니다.
<img alt="CRISPR 유전자 편집 프로세스 다이어그램; sgRNA 설계, 플라스미드 클로닝, 세포 형질도입, 클론 스크리닝" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59086/59086fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 그림 1 : 게놈을 생성 하는 워크플로 개요 편집 인간의 세포 라인. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59086/59086fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(PNK)</td><td>NEB</td><td>M0201</td><td></td></tr><tr><td>새우 알칼리성 인산가수분해효소(rSAP)</td><td>NEB</td><td>M0371</td><td></td></tr><tr><td>트리스-아세테이트-EDTA(TAE) 완충액, 50X</td><td>1염기</td><td>BUF-3000-50X4L</td><td>사용 전에 1X로 희석합니다. 1X 용액에는 40mM 트리스, 20mM 아세트산 및 1mM EDTA가 포함되어 있습니다.</td></tr><tr><td>Tris-EDTA (TE) 버퍼, 10X</td><td>1st Base</td><td>BUF-3020-10X4L</td><td>사용하기 전에 1X로 희석하십시오. 1X 용액에는 10mM Tris(pH 8.0)와 1mM EDTA가 포함되어 있습니다.</td></tr><tr><td>BbsI</td><td>NEB</td><td>R0539</td><td></td></tr><tr><td>BsmBI</td><td>NEB</td><td>R0580</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202</td><td>400,000 units/ml</td></tr><tr><td>빠른 결찰 키트</td><td>NEB</td><td>M2200</td><td>T4 DNA Ligase의 대안.</td></tr><tr><td>Rapid DNA 결찰 키트</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1423</td><td>T4 DNA 리가제의 대안.</td></tr><tr><td>무딘 제로 블런트 TOPO PCR 클로닝 키트</td><td>Thermo Scientific</td><td>451245</td><td>염 용액은 키트에 TOPO 벡터와 함께 제공됩니다.</td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA 어셈블리 마스터 믹스</td><td>NEB</td><td>E2621L</td><td>Gibson 어셈블리용 키트.</td></tr><tr><td>One Shot Stbl3 Chemically Competent E.Coli</td><td>Thermo Scientific</td><td>C737303</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth (Lennox), 분말</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3022</td><td>ddH20 및 한</td></tr><tr><td>천(Lennox)이 있는 LB Broth</td> 사용 전 오토클레이브, 분말 <td>Sigma Aldrich</td><td>L2897</td><td>ddH20 재구성 및 SOC 매체 사용 전 오토클레이브</td></tr>-<tr><td></td><td></td><td>-</td><td>2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 L LB Broth</td></tr><tr><td>Ampicillin(나트륨)</td> 중 20 mM 포도당, USP Grade <td>Gold Biotechnology</td><td>A-301</td><td></td></tr><tr><td>REDiant 2X PCR Mastermix</td><td>1st Base</td><td>BIO-5185</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>1st Base</td><td>BIO-1000</td><td></td></tr><tr><td>T7 Endonuclease I</td><td>NEB</td><td>M0302</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid DNA Extraction Miniprep Kit</td><td>Favorgen</td><td>FAPDE 300</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM), 고혈당</td><td>하이클론</td><td>SH30081.01</td><td>4.5g/L 포도당, L-글루타민 없음, HEPES 및 피루브산 나트륨</td></tr><tr><td>L-글루타민, 200mM</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신, 10, 000U/mL</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 트립신-EDTA, 1X</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Hyclone</td><td>SV30160</td><td>FBS는 56 oC에서 30분 동안 사용하기 전에 열을 비활성화합니다</td></tr>. <tr><td>인산염 완충 식염수, 1X</td><td>Gibco</td><td>20012</td><td></td></tr><tr><td>jetPRIME transfection 시약</td><td>Polyplus Transfection</td><td>114-75</td><td></td></tr><tr><td>QuickExtract DNA 추출 솔루션, 1.0</td><td>진원지</td><td>LUCG-QE09050</td><td></td></tr><tr><td>ISOLATE II Genomic DNA Kit</td><td>Bioline</td><td>BIO-52067</td><td>QuickExtract</td></tr><tr><td>Q5 고충실도 DNA 중합효소</td><td>NEB</td><td>M0491</td><td></td></tr><tr><td>데옥시뉴클레오티드(dNTP) 용액 혼합물</td>의 대안 <td>NEB</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>6X DNA 로딩 염료</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td>10mM Tris-HCl(pH 7.6) 0.03% 브로모페놀 블루, 0.03% 자일렌 시아놀 FF, 60% 글리세롤, 60mM EDTA</td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일, Set3</td><td>Merck</td><td></td><td></td>539134</tr><tr><td>니트로 셀룰로오스 막, 0.2&micro; m</td><td>Bio-Rad</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>Tris-glycine-SDS 완충액, 10X</td><td>Bio-Rad</td><td>1610772</td><td>사용 전에 1X로 희석하십시오. 1x 용액에는 25mM 트리스, 192mM 글리신 및 0.1% SDS가 포함되어 있습니다.</td></tr><tr><td>트리스-글리신 완충액, 10X</td><td>1염기</td><td>BUF-2020</td><td>사용 전에 1X로 희석하십시오. 1x 용액에는 25mM 트리스와 192mM 글리신이 포함되어 있습니다.</td></tr><tr><td>Ponceau S 솔루션</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7170</td><td></td></tr><tr><td>TBS, 20X</td><td>1st base</td><td>BUF-3030</td><td>사용 전에 1X로 희석하십시오. 1x 용액에는 25mM Tris-HCl(pH 7.5) 및 150mM NaCl이 포함되어 있습니다.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Skim Milk for immunoassay</td><td>Nacalai Tesque</td><td>31149-75</td><td></td></tr><tr><td>WesternBright Sirius-femtogram HRP</td><td>Advansta</td><td>K12043</td><td></td></tr><tr><td>항체 &beta;-actin (C4)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-47778</td><td>로트 번호: C0916</td></tr><tr><td>MiSeq system</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 분광 광도계</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>큐비트 형광계</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q33226</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL 세포 이미징 시스템</td><td>Thermo Scientific</td><td>AMF4300</td><td></td></tr><tr><td>CRISPR 플라스미드: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)</td><td>Addgene</td><td>48138</td><td>단일 벡터 시스템: gRNA는 동일한 플라스미드에서 발현됩니다.</td></tr><tr><td>CRISPR plasmid: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA</td><td>Addgene</td><td>61591</td><td>Single vector system: gRNA는 동일한 plasmid에서 발현됩니다.</td></tr><tr><td>CRISPR plasmid: xCas9 3.7</td><td>Addgene</td><td>108379</td><td>Dual vector system: gRNA는 다른 plasmid에서 발현됩니다.</td></tr><tr><td>CRISPR plasmid: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9</td><td>Addgene</td><td>42230</td><td>Single vector system: gRNA는 동일한 plasmid에서 발현됩니다.</td></tr><tr><td>CRISPR plasmid: hCas9</td><td>Addgene</td><td>41815</td><td>Dual vector system: gRNA는 다른 plasmid에서 발현됩니다.</td></tr><tr><td>CRISPR plasmid: eSpCas9(1.1)</td><td>Addgene</td><td>71814</td><td>Single vector system: gRNA는 동일한 plasmid에서 발현됩니다.</td></tr><tr><td>CRISPR plasmid: VP12 (SpCas9-HF1)</td><td>Addgene</td><td>72247</td><td>Dual vector system: gRNA는 다른 plasmid에서 발현됩니다.</td></tr></tbody></table>

포유류 세포 라인 crispr cas를 사용 하 여 게놈 편집

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

클러스터 된 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR) 시스템 세균성 적응 면역에 자연스럽 게 작동 하지만 성공적으로 많은 다른 살아있는 유기 체에 있는 게놈 엔지니어링에 대 한 용도가 변경 되었습니다. 가장 일반적으로, CRISPR wildtype 관련 9 (Cas9) 또는 Cas12a endonuclease 게놈, DNA 이중 가닥 휴식 비 동종 끝 결합 (NHEJ) 통로 또는 상 동 감독 수리 (를 통해 복구 후에 특정 사이트를 쪼개 다 하는 데 사용 됩니다. HDR) 통로 기증자 서식 파일 인지에 따라 결 석 또는 각각 제시. 날짜 하려면, 다른 세균 종에서 CRISPR 시스템 게놈 포유류 세포에서 편집을 수행 할 수 표시 되었습니다. 그러나, 기술의 명백한 단순에도 불구 하 고 여러 설계 매개 변수 필요 간주, 종종 그들의 게놈 편집 실험 수행에 최고의 방법에 대 한 당황 하 게 하는 사용자를 떠나. 여기, 우리가 원하는 DNA 수정, 편집 하는 포유류 세포에 실험 하는 게놈의 성공적인 실행을 촉진의 목표를 수행 하는 세포 클론의 식별에 실험적인 디자인의 완벽 한 워크플로우를 설명 합니다. 우리는 사용자의를 위한 주요 고려 사항 선택 CRISPR 시스템, 공백 길이 그리고 단일 가닥 oligodeoxynucleotide (ssODN) 기증자 서식 파일의 디자인을 포함 하 여 강조 표시 합니다. 우리는이 워크플로 유전자 녹아웃 연구, 모델링 노력, 질병에 대 한 도움이 될 것입니다 또는 기자 생성 세포 라인을 구상.

실험, 관심 소재 시 복제 될 필요가 타겟팅 sgRNA 표현 CRISPR 플라스 미드를 편집 하는 게놈을 수행 합니다. 첫째, 플라스 미드는 그것을 선형화 하는 제한 효소 (일반적으로 타입 IIs 효소)로 소화 된다. 완전 하 고 부분 소화 사이 구별 하는 소화 되지 않은 플라스 미드와 함께 1 %agarose 젤에 소화 제품을 확인 하는 것이 좋습니다. 소화 되지 않은 플라스 미드는 supercoiled, 그들은 선형화 (참조 그림 7는) 보다 더 빠르게 실행 하는 경향이. 둘째, 해야는 sgRNA에 대 한 두 개의 oligonucleotides을 단련 컷된 플라스 미드에 출혈. oligonucleotides CRISPR 플라스 미드 등뼈로 성공적으로 복제 된 경우 확인 하려면 식민지 PCR ( 그림 7b참조) 수행 됩니다. 긍정적인 복제품은 플라스 미드 추출 ...

CRISPR-Cas는 식물과 동물의 복잡 한 유전자를 강력한 기술. 여기, 우리는 효율적으로 다른 Cas endonucleases를 사용 하 여 인간 게놈을 편집 하려면 프로토콜 선발. 우리는 중요 한 고려 사항 및 설계 매개 변수 편집 효율 최적화를 강조 표시 합니다.

포유류 세포 라인 CRISPR Cas를 사용 하 여 게놈 편집

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

이 프로토콜은 CRISPR-Cas9를 사용하여 녹아웃 또는 녹아웃 라인을 만듭니다. 이 기술의 주요 장점은 초보 연구원을 위해 특히 따르는 것이 간단하고 효율적이라는 것입니다. 세포 통과의 경우, 2 분 동안 섭씨 37도에서 플레이트 당 0.25 %의 트립신 EDTA의 2 밀리리터로 하룻밤 배양 세포를 치료하십시오.세포가 플레이트 바닥에서 들어 올릴 때, 세포 배양 배지의 2밀리리터로 효소 반응을 중화시키고, 세포 현탁액을 원내 튜브로 옮기다. 원심분리에 의해 세포를 수집하고 계산을 위한 신선한 세포 배양 배지의 5밀리리터에서 펠릿을 재중단합니다. 그런 다음 1.8배 10번을 5세포에 1.8배, 즉 24웰의 조직 배양판으로 1.8배, 이산화탄소는 5%로 하룻밤 문화를 갖는다.세포의 배설을 위해, 실험 설계 및 제조업체의 지시에 따라, 검사 시약의 적절한 부피에 CRISPR 플라스미드의 적절한 농도를 포함하는 경질 혼합의 적절한 볼륨을 추가합니다. 권장 시간 동안 실온에서 형질 혼합을 배양 한 후 낙하 방식으로 세포에 용액을 추가하십시오. 그런 다음 접시를 부드럽게 소용돌이어 접시를 혼합하고 5 %의 이산화탄소와 가습 섭씨 37도 인큐베이터에 놓습니다.형질 전환의 끝에서, 단지 입증 된 대로 세포를 해리하고 원심 분리에 의해 분리 된 세포를 수집하기 위해 트립신-EDTA의 150 마이크로 리터를 추가합니다. PBS에서 2% 태아 소 혈청에서 펠릿을 다시 중단하고 30 마이크로미터 메쉬 스트레이너를 통해 세포를 5밀리리터 형광 활성화 세포 선별 또는 FACS 튜브로 필터링합니다. 그런 다음 비-전염된 세포를 사용하여 유동 세포계상에 음수 조절 게이트를 설정하고 100 마이크로리터를 함유하는 튜브내형에 사용되는 CRISPR 플라스미드상형마커에 따라 전관된 세포를 분류한다.모든 전감염된 세포가 수집되었을 때, 세포배양 배지의 300마이크로리터에서 원심분리에 의해 세포를 원심분리하여 펠릿을 재연한다. 24웰 조직 배양 판의 한 우물에 세포의 200 마이크로 리터를 종자 하 고 세포37 섭씨 인큐베이터에서 며칠 동안 복구 할 수 있도록. 펠릿 5 분 동안 최대 속도로 선별 된 세포의 나머지 100 마이크로 리터를 펠릿 과 표준 DNA 추출 프로토콜에 따라 결과 펠릿에서 게놈 DNA를 추출.다음으로, 폴리머라제 연쇄 반응 완충제 10마이크로리터, 탈옥뉴클레오티드 믹스 1마이크로리터, 사용자 정의 역프라이머 2.5 마이크로리터, DNA 폴리머라제 0.5 마이크로리터, 추출된 게놈 DNA 템플릿의 2~5마이크로리터, 50마이크로리터의 최종 부피에 대한 반응을 가져올 수 있는 충분한 이중 증류수를 추가한다. 열 사이클러에 혼합물을 실행하고 표준 프로토콜에 따라 1X TAE 버퍼를 사용하여 2% 아가로즈 젤에 대한 반응을 해결한다. 깨끗하고 날카로운 메스를 사용하여 폴리머라제 체인 반응 생성물을 소비하고 제조업체의 지침에 따라 젤 추출 키트를 사용하여 DNA를 정화합니다.260 나노미터 흡광도에서 분광계를 사용하여 제품의 농도를 측정합니다. 격리된 DNA의 200 나노그램, T7 의 마이크로리터 I 반응 버퍼, 19 마이크로리터에 혼합물의 최종 부피를 가져오기에 충분한 이중 증류수를 포함하는 분석 믹스를 준비한다. 폴리머라제 연쇄 반응 생성물을 표시된 파라미터에서 열 사이클러로 회수하고 T7 엔도니클로스 I의 5단위를 섭씨 37도에서 50분 동안 배양한 제품으로 혼합한다.인큐베이션의 끝에서, 1X TAE 버퍼를 사용하여 2.5%의 아가로즈 젤로에서 소화된 DNA를 해결하고, 적절한 겔 이미징 시스템에서 겔을 이미지화한다. ImageJ에서 젤 이미지를 열고 밴드 주위에 사각형 상자를 가능한 한 경계에 가깝게 그립니다. 분석 및 측정 설정을 클릭하여 영역, 평균 회색 값 및 통합 밀도 옵션을 확인합니다.확인을 클릭하고 분석 및 측정을 선택합니다. 평균 또는 원시 강도 밀도 값은 대역 강도를 나타냅니다. 배양-전염된 세포가 컨부유해지기 시작하면, 입증된 바와 같이 트립신-EDTA로 세포를 분리하고, 세포 배양배기로 세포를 되돌리기 전에 개별 식민지가 성장할 수 있도록 100mm 조직 배양 접시에서 세포를 희소하게 파종한다.식민지가 형성되기 시작하면 4 X 배율의 현미경을 사용하여 4 개의 X 배율로 현미경을 사용하여 500 마이크로 리터의 세포 배양 배지를 포함하는 24 웰 플레이트의 개별 우물로 옮길 개별 식민지를 선택하십시오. 팁이 개별 우물 내에서 식민지의 혼합을 방지하기 위해 주변 식민지를 만지지 않도록주의하거나 희소 식민지 성장의 영역에서 선택. 모든 클론을 골랐을 때, 배양이 수렴될 때까지 세포 배양 인큐베이터에 접시를 놓습니다.소화되지 않은 플라스미드는 매우 코일러이기 때문에 선형화된 플라스미드보다 빠르게 달리는 경향이 있습니다. 올리고뉴클레오티드가 CRISPR 플라스미드 백본으로 성공적으로 복제되었는지 확인하기 위해, 콜로니 PCR이 수행되고 플라스미드가 추출되기 전에 양성 클론이 접종되어 Sanger 시퀀싱을 위해 전송된다. 형광 신호는 플라스미드의 성공적인 납품시 현미경으로 쉽게 시각화될 수 있으며, 전감염된 세포는 유동 세포측정에 의해 정렬될 수 있게 한다.A T7 엔도나크리스 I 분석은 아가로즈 겔상에서 관찰된 밴드의 강도로부터 계산된 바와 같이 게놈 DNA의 절단 효율을 확인하기 위해 수행된다. 또한, 상동성 지향 수리 기반 실험이 표적 궤적에 제한 부위를 통합하도록 설계된 경우, 제한 단편 길이 다형성 분석은 해당 제한 효소로 수행될 수 있다. 단백질 코딩 유전자가 성공적으로 비활성화되었음을 더욱 검증하기 위해, 표적 단백질이 존재하지 않도록 서양 얼룩을 수행할 수 있습니다.이식 후 세포를 분류하면 통합 된 플라스미드없이 세포를 제거하여 나중에 선별 된 세포의 비율을 녹아웃 또는 녹아웃 유전자로 증가시합니다. 이 기술의 발달로, 우리는 지금 그들의 기계장치를 이해하기 위하여 특정 질병을 모델링하기 위하여 유전자 기능 및 노크에 세포주를 공부하기 위하여 녹아웃 세포주를 생성할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

CRISPR/Cas9는 유전자와 유전적 요소를 파괴하는 강력한 시스템입니다. 여기에서는 CRISPR/Cas9을 사용하여 포유류 세포주에서 게놈 결실을 효율적으로 생성하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

CRISPR / Cas9를 통해 포유 동물 세포주의 게놈에 삭제 세대

체세포를 유 전적으로 조작하는 능력의 최근 진보는 기본 및 응용 연구에 큰 가능성을 안겨줍니다. 여기, 우리는 선택 마커의 사용 여부에 관계없이 포유류 세포주에서 CRISP / Cas9 생성 녹아웃 생산 및 스크리닝을위한 두 가지 접근법을 제시한다.

포유류 세포에서 CRISPR / Cas9 매개 유전자 knockouts의 선택 의존 및 독립적 생성

이 프로토콜 편집 시스템 복구에 대 한 포유류 세포에 있는 점 돌연변이의 CRISPR/Cas9 기반 유전자의 워크플로 설명 합니다. 여기, 우리 유전자 편집 대상 사이트에서 indel 형성을 측정 하기 위한 상세한 후속 실험 전략으로 조합 방식을 사용-본질적으로, 현장 mutagenesis 분석.

점 돌연변이 수리 CRISPR/Cas9 및 SsODN 인간 세포에 의해 촉매의 기능으로 현지 변이 검사 하는 표준 방법론

소 Cas9를 활용 하 여 복잡 한 ribonucleoprotein (RNP)은 정확 하 고 효율적인 게놈 편집에 대 한 강력한 방법입니다. 여기, 우리가 강조의 유틸리티 세포와 생물의 광범위 한 범위에 걸쳐 기본 인간 세포 등 모두 클래식 하 고 모형 유기 체를 신흥.

향상 된 게놈 세포와 유기 체에서 다양 한 Cas9 Ribonucleoprotein 편집

여기에 제시된 것은 튜브 전기포공을 이용한 포유류 세포에서 효율적인 CRISPR/Cas9 리보뉴클레오단백질 매개 유전자 편집을 위한 프로토콜이다.

CRISPR/Cas9 리보뉴클레오단백질-튜브 전기포공에 의한 정밀 유전자 편집

이 프로토콜은 인간 다능성 줄기 세포에서 CRISPR-CAS9를 사용하여 정의된 이형 이형 또는 동형접합 뉴클레오티드 변화의 생성을 용이하게 하는 방법을 제공한다.

인간 다능성 줄기 세포에서 CRISPR-CAS9를 사용하여 정의된 게놈 수정 생성

여기에서는 piggyBac계 공여 플라스미드와 Cas9 nickase 돌연변이체를 이용한 인간 만능줄기세포에서 원활한 유전자 편집을 위한 상세한 방법을 설명한다. 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)에서 간세포 핵 인자 4 알파 (HNF4α) 유전자좌의 엑손 8에 2 점 돌연변이가 도입되었다.

원활한 게놈 편집을 사용하여 인간 만능 줄기 세포에 점 돌연변이 도입

여기에서는 CRISPR RNP 접합체 전기천공(CRISPR-EZ)이라고 하는 유전자 변형 마우스의 효율적인 생성을 위한 간단한 기술을 설명합니다. 이 방법은 100%에 가까운 효율로 배아에 전기천공을 통해 편집 시약을 전달합니다. 이 프로토콜은 포유류 배아의 점 돌연변이, 작은 게놈 삽입 및 결실에 효과적입니다.

접합체의 CRISPR 전기천공에 의한 마우스의 효율적인 게놈 편집

이 프로토콜은 플라스미드 DNA 형질주입 및 mRNA 핵 박션을 사용하여 인간 세포주에서 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 기반 후성유전체 편집 방법을 설명합니다.

Plasmid DNA Transfection 및 mRNA Nucleofection Delivery를 사용한 인간 세포의 CRISPR 에피게놈 편집

RNA로서 게놈 편집자를 전달하는 것은 1차 포유류 세포와 세포주의 게놈을 변형하는 데 특히 강력한 방법입니다. 이 프로토콜의 목표는 유전체 편집기를 mRNA로 1차 포유류 세포와 세포주에 전달한 후, 표적 Illumina 시퀀싱과 분석을 통해 편집 결과를 정량화하는 것입니다.

1차 포유류 세포에서 편집자 RNA의 전기천공을 통한 유전체 편집

배우세요 포유류 세포 라인에서 CRISPR-Cas9을 이용한 유전자 노크아웃 및 노크인 기법. 이 효율적인 프로토콜은 유전자 기능 연구와 질병 모델링에 필수적인 게놈 편집 기술을 초보 연구자도 쉽게 익힐 수 있도록 설계되었습니다.

포유류 세포 라인 CRISPR Cas를 사용 하 여 게놈 편집

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