X 선 레이저에서 직렬 펨 결정학 시간 해결에 대 한 Microcrystals의 고 점도 압출을 개선

이 프로토콜은 시간 해결 된 직렬 결정 실험 중에 자주 발생하는 문제가 데이터 품질을 손상시키지 않도록 설계되었습니다. 이 방법의 한 가지 주요 장점은 개별 결정 시스템에 대한 적응성입니다. 고속 카메라 압출 테스트를 통해 압출 안정성을 직접 측정할 수 있습니다.

첫째, 주사 30분 전에 100 마이크로리터 주사기에 결정적 모노올렌 기반 LCP의 50 마이크로리터를 적재한다. 진공 환경에 주입하기 위해 MAG 7.9의 마이크로리터 5개와 액체 파라핀 5마이크로리터를 두 번째 주사기 뒤쪽에 적재합니다. 주사기를 수직으로 잡고 주사기에서 기포를 추방합니다.

주사기를 MAG 7.9및 파라핀과 연결하여 표준 주사기 커플러에 연결합니다. 그리고 혼합물의 작은 양이 커플러 바늘의 끝에 보일 때까지 플런저를 부드럽게 눌러 커플러에서 공기를 제거합니다. 시료 주사기를 시료에 공기를 유입시키지 않는 자동차를 복용하는 주사기 커플러에 연결합니다.

커플러를 여러 번 통과하여 지질과 파라핀에 섞는다. 다음으로, 다른 100 마이크로 리터 주사기에 미리 혼합 된 LCP의 20 마이크로 리터를로드합니다. 커플러에서 빈 주사기를 제거하고 표준 주사기 커플러를 사용하여 주사기를 함유하는 크리스탈에 미리 혼합된 LCP를 부착합니다.

그런 다음, 커플러를 통해 샘플을 100 번 전달합니다. 입방 상에 샘플을 가져오려면 모노올렌 3 마이크로 리터를 넣고 50 번 섞습니다. 과도한 모노올렌을 피하기 위해 투명한 단계가 형성될 때까지 이 절차를 반복하십시오.

시료 강성 및 압출가능성에 대한 예비 테스트로서, 주사기 커플러로부터 빈 주사기를 분리하고 주사기를 수직으로 잡고, 커플러를 통해 소량의 샘플러를 짜냅니다. 압출된 샘플이 직립 원통을 형성하면 샘플이 압출 테스트를 위한 준비가 되었습니다. 미리 혼합된 LCP를 추가하여 샘플의 총 부피를 100 마이크로리터로 조정합니다.

샘플 주사기와 두 개의 빈 주사기를 3방향 주사기 커플러에 부착합니다. 샘플의 절반을 두 번째 주사기로 전달한 다음 샘플의 두 절반을 동시에 세 번째 주사기로 눌러 50회 이상 섞는다. 결정의 균일한 분포를 확인하기 위해 스테레오 현미경의 밑에 혼합 된 샘플을 포함하는 주사기를 놓습니다.

HPLC 펌프와 모든 수로를 제거하여 유량이 정확한지 확인합니다. 그런 다음 인젝터의 유압 단계를 제거합니다. 그런 다음 카메라를 켜고 제공된 소프트웨어에 연결합니다.

시각적 피드백을 위해 라이브 비디오를 실행하면 노즐 팁을 프레임 중앙에 배치하고 3축 스테이지에 초점을 맞춥니다. 카메라의 프레임 속도를 초당 1, 000 프레임으로 설정합니다. 그런 다음 해상도를 512x 512픽셀로 설정합니다.

이제 프레임 속도에 의해 설정된 노출 시간을 통해 노즐이 표시될 때까지 조명 레벨을 조정합니다. 노즐 팁을 왼쪽에서 오른쪽으로 중앙에 배치하고 프레임의 상위 3분의 1에 위치합니다. 시간 경과 모드에서 카메라를 설정합니다.

간격을 30초로 설정하고 반복을 40번으로 설정합니다. 트리거 모드를 임의로 설정합니다. 그리고 1, 000으로 기록할 프레임 수를 입력합니다.

이제 시험 샘플의 20 마이크로리터로 저장소를 적재하고 모세관 노즐을 부착합니다. 채워진 저장소를 인젝터에 부착합니다. 그런 다음, 노즐의 포트에 가스 라인을 부착하고 가스 흐름을 시작합니다.

이에 따라 펌프와 카메라 레코딩을 동시에 시작합니다. 펌프 압력이 예상 종료 시간 가까이 급격히 상승할 때까지 압출을 모니터링합니다. 그런 다음, 레코딩을 멈추고 펌프를 차단하고 릴리프 밸브를 열어 시스템 압력을 배출합니다.

그런 다음 분석 소프트웨어로 비디오 파일을 열고 측정 도구를 보정합니다. 압출에 추적 가능한 기능이 있는 비디오에서 프레임을 찾습니다. 프레임 번호를 기록합니다.

다음으로 동일한 기능이 표시되지만 이전 단계에서 위치에서 이동한 프레임으로 비디오를 진행합니다. 프레임 번호를 기록합니다. 직선 측정 도구를 사용하여 분석 측정을 통해 피쳐의 시작점과 끝점에서의 거리를 측정합니다.

비디오의 모든 세그먼트에 대해 이전 단계를 몇 번 반복합니다. 마지막으로 데이터 계열을 플롯합니다. 여기에 설명된 절차에 이상적인 시작 재료는 인젝터를 위한 점성 담체 배지에 통합된 미세 결정의 높은 밀도이다.

단백질 결정은 양성자 펌핑 박테리아 rhodopsin에 TRSFX 데이터를 수집하는 데 사용되었으며, 이는 광자 흡수 후 발생하는 매우 빠른 변화를 드러냈다. 3방향 커플러를 이용한 시료 준비 후, 주사기 내의 소재의 육안 검사는 시료 균질성을 나타낸다. 그리고 현미경 심시경 심은 결정의 밀도를 확인할 수 있습니다.

샘플은 전달 매체가 명확하고 점성이 있을 때 입방 상에 있습니다. 탁하 혼합물은 샘플이 스폰지 또는 라멜라 상에 있다는 것을 나타내지만 고결정 밀도가 LCP의 선명도를 모호하게 할 수 있기 때문에 결정적이지 않습니다. 스폰지 위상을 식별하는 저압 테스트는 샘플에서 주사기 플런저를 당겨 수행 할 수 있습니다.

제트 테스트 중에 샘플은 거의 일정한 속도로 이동하는 LCP의 긴 연속 열을 돌출해야 합니다. 드립 모드에서 실행되는 샘플은 점도가 너무 낮다는 것을 나타냅니다. 열을 형성하는 샘플의 데이터는 압출이 실험 매개 변수에 의해 지시된 최소 속도 이상으로 유지된다는 것을 보여줘야 합니다.

이 프로토콜을 사용하여 최적화한 후 직렬 결정 데이터를 전문가 시설에서 수집할 수 있습니다. 이것은 그것의 기능을 수행할 때 전체 단백질에 있는 형성 변경을 밝힐 것입니다.