Name: X 선 레이저에서 직렬 펨 결정학 시간 해결에 대 한 Microcrystals의 고 점도 압출을 개선 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 배우세요 고점도 압출법을 활용한 미세결정 시료 전달 최적화 방법을. 고속 카메라로 안정성을 측정하고 다양한 결정계에 적용 가능한 시계열 직렬 펨토초 결정학 기술을 익히세요.

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우리 인정 Gebhard Schertler, 라파엘 이탈리아 크리스 Milne PSI에 높은 점도 인젝터의 사용을 지원 합니다. 리처드 Neutze와 그의 팀은 시간 해결 결정학 및 샘플 배달 고 점도 인젝터를 사용 하 여 토론에 대 한 인정 됩니다. 스위스 국립 과학 재단 교부 금 31003A_141235, 31003A_159558 (에 제)에 대 한 재정 지원에 대 한 인정 및 (P.N.)를 PZ00P3_174169. 이 프로젝트는 유럽 연합의 수평선 2020 연구와 마리-Sklodowska-퀴리 부여 계약 아니오 701646 혁신 프로그램에서 자금을 받았다.

1. 단백질 크리스탈 샘플 준비
<ol><li>약 30 분 전에 샘플, 주입 하는 것입니다 monoolein 크리스탈-라덴의 부하 50 µ L 100 µ L 주사기에 LCP을 기반으로.</li>
	<li>대기압에서 주입에 대 한: 부하 10 µ L 주사기를 두 번째의 뒤쪽으로 액체 파라핀의. 수직으로 주사기를 들고, 주사기에서 공기 방울을 추방.<ol>
<li>진공 환경으로 주입에 대 한: 매기 7.9와 두 번째 주사기의 뒤쪽으로 액체 파라핀의 5 µ L의 부하 5 µ L. 수직으로 주사기를 들고, 주사기에서 공기 방울을 추방.</li>
	</ol>
</li>
	<li>파라핀/매기 7.9 표준 주사기 커플러에 주사기를 연결, 눌러 부드럽게 플런저에 작은 볼륨까지 커플러에서 공기를 제거 (&lt; 1 µ L) 파라핀/지질의 커플러 바늘의 끝에 표시 됩니다.</li>
	<li>샘플으로 공기를 소개 하지를 돌보는 주사기 커플러를 샘플 주사기를 연결 합니다. 커플러를 통해 시료를 여러 번 전달 하 여 지질/파라핀에 섞어.</li>
	<li>또 다른 100 µ L 주사기에 premixed LCP (27% 말뚝, 100 mM 소 렌 슨 pH 5.6 + 모)의 20 µ L를 로드 합니다. 필요에 따라 기포를 제거 합니다.</li>
	<li>커플러에서 빈 주사기를 제거 하 고 표준 주사기 커플러를 사용 하 여 주사기를 포함 하는 크리스탈에 premixed LCP를 연결 합니다. 100 번 커플러를 통해 샘플을 전달 합니다. 참고: 샘플을 열 수 있습니다 샘플 혼합 약간46. 혼합 할 수 느린 속도로 어디 샘플의 온도 보전 될 수 있다 합리적으로 일정.</li>
	<li>빛의 원천에 대 한 투명성에 대 한 샘플을 검사 합니다. 명확한 균질 LCP, 형성 하는 단계로 1.9 이동 합니다.</li>
	<li>입방 단계에 샘플을가지고, monoolein의 3 µ L을 추가 하 고 50 번 (위에서 설명한) 혼합. 그냥 투명 한 단계 monoolein의 과잉을 피하기 위해 형성 될 때까지이 절차를 반복 합니다. 참고:는 LCP의 형성 온도 종속47 이며 최상의 결과 20 ° c.의 위 약간 달성 추가 monoolein 양의 필요 결정 화에서이 월 된 잔여 precipitant 솔루션의 볼륨에 따라 달라 집니다.</li>
	<li>예비로 샘플 강성 (예상 대로 LCP 단계에서) 및 돌출 하는 능력에 대 한 테스트, 주사기 커플러에서 빈 주사기를 분리 하 고, 수직으로 주사기를 들고, 시비 거는 작은 양의 샘플 (&lt; 2 µ L) 커플러를 통해. 밀어낸된 샘플 수직 실린더, 형성 하는 경우,이 예제는 압출 테스트에 대 한 준비.</li>
	<li>(1.5 단계)로 더 premixed LCP를 추가 하 여 100 µ L 샘플의 전체 볼륨을 조정 합니다.</li>
	<li>(앞으로 커플러에서 공기를 제거) 하는 3 방향 주사 통 커플러를 샘플 주사기와 두 개의 빈 주사기를 첨부 합니다. 적어도 50 번 (또는 혼합 될 때까지 균질) 두 번째 주사기에는 샘플의 절반을 전달 하 고 다음 눌러 샘플의 두 반쪽 3 주사기로 동시에.</li>
	<li>결정의 균일 분포를 확인 하기 위해 스테레오 현미경 혼합된 샘플을 포함 하는 주사기를 놓습니다.</li>
</ol>2. 테스트 샘플 입체 고속 카메라 설치를 사용 하 여
<ol><li>실험적인 매개 변수를 결정합니다.<ol>
<li>테스트에 대 한 노즐 크기를 선택 합니다. 참고: 노즐 크기는 일반적으로 50 또는 75 µ m 내부 직경 (ID), 모든 크기에서 대략 30-100 µ m ID 간주 될 수 있습니다. 선택 의미 막힘 시간, 배경 산란, 샘플 소비, 명 중 율 사이의 균형을 기반으로 합니다.</li>
		<li>실험적인 레이저 크기 (1/e2 직경), 및 데이터 수집 계획 (예: 인터리빙된 빛과 어둠)는 XFEL에 사용 될에 따라 최적의 흐름 속도 계산 합니다.</li>
		<li>원하는 흐름 속도 계산 (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59087/59087eq1.jpg">) 최적의 흐름 속도에서 샘플의 (<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59087/59087eq2.jpg">)와 선택 된 노즐 직경 (<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/59087/59087eq3.jpg">): <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/59087/59087eq4.jpg"> 흐름 속도 결정 (<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/59087/59087eq5.jpg">)는 증폭 요인에 따라 HPLC 펌프에 입력 해야 합니다 (<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/59087/59087eq6.jpg">) 인젝터의. <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/59087/59087eq7.jpg"> 최대 압력 계산 (<img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/59087/59087eq8.jpg">)는 노즐의 정격된 압력에서 (<img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/59087/59087eq9.jpg">)와 인젝터의 증폭 요인은 (<img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/59087/59087eq10.jpg">): <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/59087/59087eq11.jpg">
</li>
	</ol>
</li>
	<li>그림 1에서 같이 오프 라인 사용에 대 한 고 점도 압출 인젝터의 설정. 참고: 유압 압출에 의해 인젝터 함수는 HPLC 펌프에 의해 구동 하 고 공동 흐르는 헬륨 가스 칼 집 가스 레 귤 레이 터에 의해 제어를 사용 합니다. 펌프와 레 귤 레이 터 설치 하지이 프로토콜에서 설명 되어 있습니다. 제 4 제임스 (2015)48 에 대 한 상세한 매뉴얼을 참조 하십시오.<ol>
<li>펌프와 정확 하 게는 flowrates를 보장 하기 위해 모든 물 라인을 제거. 인젝터의 유압 단계 제거.</li>
		<li>프레임 및 고속 동영상에 대 한 집중을 촉진 하는 3 축 단계에는 인젝터 (또는 카메라)를 탑재 합니다. 대물 렌즈, 조명, 반사, 스크린과 잡으려고 보낸된 샘플 작은 비 커에 대 한 주입 점의 주위 공간을 남겨 주세요.</li>
		<li>"더미 노즐" 구성 (노즐 연결 된 빈 저수지) 위치, 초점, 및 조명 인젝터에 설치.</li>
		<li>목표의 초점 근처 노즐 팁 고속 카메라를 탑재 합니다.</li>
		<li>인젝터 뒤 반사 화면을 전면 빛 노즐 조명 조정.</li>
		<li>설정 하 고 제공 된 소프트웨어와 함께 카메라에 연결. 시각적 피드백에 대 한 실행 라이브 비디오, 노즐 팁, 프레임의 중앙에 놓고 3 축 단 초점으로 그것을.</li>
		<li>노즐은 명확 하 게 표시 될 때까지 배경 균등 하 게 조명 조명을 조정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>고속 기록 시간 경과 비디오 카메라를 구성합니다.<ol>
<li>1000 fps 설정된 프레임 속도입니다. 512 x 512 픽셀 해상도 설정 합니다.</li>
		<li>지금 프레임 속도 설정 노출 시간, 조명 레벨 조정 노즐 표시 될 때까지 (즉, 아닌-또는 설쳐). 위치 변경 노즐 팁은 중심을 왼쪽에서 오른쪽 프레임의 최고 세 번째에 위치 하 고.</li>
		<li>어떤 배경 보정 이나 화이트 밸런스 작업을 실행 합니다.</li>
		<li>시간 경과 모드로 카메라를 설정 합니다. 간격에 30 s 반복 및 40 시간, 임의의 (또는 임의 리셋), 트리거 모드를 설정 하 고 1000녹화 프레임 수를 입력.</li>
	</ol>
</li>
	<li>테스트 샘플의 20 µ L와 저수지를 로드 하 고 모 세관 노즐 연결 합니다.</li>
	<li>인젝터 채워진된 저수지를 연결 합니다. 포트 노즐에 가스 관을 연결 하 고 가스 흐름을 시작 합니다.</li>
	<li>수동으로 인라인 밸브를 개방 하 고 눌러 주사기 피스톤을 사전. 때 피스톤 저수지에서 샘플 고체 접촉 밸브를 닫습니다.</li>
	<li>계산 된 유량과 펌프를 프로그램 하 고 계산 된 값을 최대 압력을 설정 (단계 2.1.3 참조).</li>
	<li>펌프 및 카메라 녹화 시작 동시에.</li>
	<li>돌출 시작으로, 조정 안정성을 증가 하는 가스 압력. 열 대신 노즐의 끝에 한 방울을 형성 하는 액체 가스 압력을 증가. 감소 압력 돌출 한다고 해 서 가스 흐름에서 과도 한 전단 또는 급속 하 게 진동 하는 경우 (흔든 다).</li>
	<li>돌출을 모니터링 (10 분은 일반적으로 균질 성 흐름 상태를 인식 하는 충분 한) 중단 하 고, 급격히 펌프 압력은 최대 예상된 종료 시간 근처 경사로 때 기록, 펌프, 차단 시스템 압력 릴리프 밸브를 개방 하 여 환기.</li>
	<li>비디오 파일의 분석 참고: 현실적으로 적절 하지 않은 샘플 압출 상세한 분석을 필요 하지 않습니다. 그러나, 그것은 여전히 실패 모드를 식별 하는 샘플을 최적화할 수 있습니다 유용 합니다.<ol>
<li>분석 소프트웨어 (예: 피지49) 비디오 파일을 열고 측정 도구를 보정 합니다.</li>
		<li>선 선택 도구로 비디오 이미지에서 알려진 길이의 라인을 선택 하 여 측정을 보정. 분석을 통해 비율 설정 창을 엽니다 | 설정 규모 알려진된 거리와 측정 단위를 입력 하십시오. 참고: 노즐의 알려진된 직경이 측정에 대 한 적절 한 교정 길이 제공합니다.</li>
		<li>비디오에서 한 프레임을 찾아 돌출에 추적 기능 표시 (예, 크리스털)입니다. 프레임 번호를 기록 합니다.</li>
		<li>프레임 같은 기능 볼 수는 있지만 이전 단계에서의 위치에서 이동 하는 비디오를 사전. 프레임 번호를 기록 합니다.</li>
		<li>기능 시작 및 분석을 통해 끝점에서 거리 측정 직선 측정 도구를 사용 하 여 | 측정. 참고: 추적 거리 측정에 적은 오류가 더 이상 것입니다 영향을 계산</li>
		<li>측정된 거리와 경과 시간 (경과 된 프레임 나눈 프레임의 수입니다.)에서 제트 속도 계산</li>
		<li>동영상의 모든 세그먼트에 대 한 단계 2.11.3-2.11.6 몇 번을 반복 합니다.</li>
		<li>그림2 데이터 계열을 플롯 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

저자는 전혀 상반 되는 관심사를 선언합니다.

점성 돌출 인젝터와 TR SFX 메서드 bacteriorhodopsin9,10 , photosystem II13 의 구조 역학 연구에 대 한 가능한 기술을 입증 하 고 지금 공부 단백질 다른 운전 준비가 보인다 사진 빛 구동 이온 전송 등 감각 지 각5,50생물 학적 프로세스. 위에서 설명한 프로토콜 bacteriorhodopsin, TR-SFX 데이터 컬렉션의 성공을 극대화 하기 위해 설계 되었습니다 아직 다른 샘플에 데이터 수집을 최적화 하는 템플릿 역할을 할 수 있다고. 이 방법에서는, 귀중 한 beamtime의 많은 현재 막힘으로 인해 손실 또는 가난한 샘플 압출 대신 더 많은 시간 지연에 더 나은 데이터 수집에 사용 될 수 있습니다.
<p class="jove_c...

직렬 펨 결정학 (SFX)은 대부분의 잡기 동안 수천 마이크로미터 크기의 결정에서에서 x 선 자유 전자 레이저 (XFEL) 실 온 구조 결정의 독특한 속성을 이용 하는 구조 생물학 기술 "파괴 전에 회절" 원리1,2,3방사선 손상.
시간 해결 SFX (TR-SFX) 확장,는 XFEL에서 펨 펄스는 단백질4,5에 구조적인 변화를 공부 하는 데 사용 됩니다. 관심사의 단백질 XFEL 펌프-프로브 설치 프로그램에 의해 총 직전 광학 레이저 (또는 다른 활동 트리거) 활성화 됩니다. 정확 하 게 제어 함으로써 펌프와 프로브 펄스 사이의 지연, 다른 주에서 대상 단백질을 캡처할 수 있습니다. 시간 11 배나 통해 구조 변경의 분자 영화 보여 여러 단백질 목표6,7,,89의 역학을 공부 하는 새로운 XFEL 소스의 힘 10,11,,1213. 주로, 메서드 원자 해상도 근처에서 단백질 역동성으로 엿볼 제공 동적 광 및 정적 구조 기술을 하나로, 조인.
TR-SFX에 대 한 간단한 시스템 bacteriorhodopsin (bR)9,10에 망막, photosystem II12,13, chromophores 같은 사진에 민감한 구성 요소 활성화의 내 생 트리거 포함 될 수 있습니다. 광 노란색 단백질 (PYP)6,7 역 photoswitchable 형광 단백질11또는 myoglobin8일산화 탄소 photolyzable. 기술 개발에 여전히의 흥미로운 변이 혼합에 의존 하 고 주사 제도14,15 효소 반응 또는16구조적인 변화 유도 하는 데 사용 하는 전기 분야를 공부 하. XFEL 소스 겨우 사용할 수 있는 몇 년 동안 하 고 미래에 과거의 성공 바탕, 메서드를 보여 줍니다 방법에 대 한 우리의 이해에 관하여 진짜 게임 체인저로 잠재적인 단백질 기능.
생물 학적 샘플 단일 노출 고성능 XFEL 펄스에 의해 파괴 때문에 단백질 결정학에 새로운 접근 필요 했다. 이러한 절차 중 많은 양의 유니폼 microcrystals 성장 능력 개발된17,,1819필요가 있었다. XFEL에 데이터 컬렉션을 사용 하려면 이러한 결정 전달, 삭제, 고 각 XFEL 펄스에 대 한 다음 갱신 있습니다. XFELs 10-120 Hz에서 사용 가능한 펄스 발생, 샘플 배달 해야 되지, 안정, 빠르고 안정적 또한 유지 결정 그대로 제한 소비 하면서. 가장 성공적인 솔루션 중 continiously 펄스 x-선 빔20통해 실내 온도 크리스탈-라덴 lipidic 입방 단계 (LCP)의 열을 스트리밍을 제공 하는 높은 점성 마이크로 압출 인젝터가입니다. 무작위로 지향된 결정, XFEL 펄스 분산형 엑스레이 회절 패턴을 기록 하는 감지기에 의해 도청 하는 LCP 스트림에 포함. 그것은 자주 막 단백질 결정17,21,,2223, 아직 다른 점도 캐리어 미디어 성장 매체로 사용 LCP 샘플 전달 매체에 대 한 자연 선택은 24,25,26,,2728,29,30 및 수용 성 단백질31 또한 인젝터에 사용 되었습니다. 높은 점도 인젝터와 SFX 막 단백질13,32 G 단백질 결합 된 수용 체 (GPCRs)33,34, 등의 구조를 결정 하는 동안 성공 했습니다. 35,,3637, 네이티브 위상38,39 시간 및 효율적인 샘플 되는 동안에 대 한 충분 한 데이터 품질. 현재,이 인젝터는 사용 되 고 더 정기적으로 더 동안에 뿐만 아니라 싱크 로트 론 소스28,30,,4041 에서 실내 온도 측정에 대 한 기술적으로 XFELs9,10,,1342에서 TR SFX 실험을 요구.
그러나 유사한 TR SFX 실험 진행 되었습니다 밖으로 액체 단계 흐름에서 배달 집중 노즐6,,712같은 다른 인젝터 종류를 사용 하 여,,이 방법은 많은 단백질 양을 사용할 수 없는 필요 합니다. 생물학적으로 목표를 재미 있는. 액체 제트에 대 한 10000 인덱싱된 회절 패턴 9.35 mg에 비해 당 단백질의 0.072 밀리 그램의 평균 소비 점성 돌출을 사용 하 여 정적 구조체의 결정에 대 한 노즐 (즉, 130 배 더 많은 샘플에 대해 보고 되었습니다. 효율적인)20. 고 점도 인젝터만이 샘플 효율43의 일부 희생 하면서 TR SFX를 위한 실행 가능한 샘플 배달 장치를 보였다. Nogly 외. (2018)에10, 예를 들어 샘플 소비는 약 1.5 m g 10000 인덱싱된 패턴 당 평균 샘플 소비는 74 밀리 그램의 10000 당 단백질의 훨씬 더 높은 PYP를 사용 하 여 비슷한 TR SFX 실험을 호의적으로 비교 하는 인덱싱된 패턴6. 고 점도 인젝터는 따라서 사용 가능한 단백질의 양을 제한 하거나 결정 LCP 직접 재배 명확한 장점이 있다.
TR-SFX 높은 점도 사용 하 여에 대 한 몇 가지 기술적인 문제가 가장 신뢰할 수 있는 데이터를 인젝터 해결 해야: 흐름 속도 최소 임계값; 위에 남아 있어야 히트-속도 느린 데이터 컬렉션을 렌더링 하지 않는 수준에서 유지 되어야 한다 (예를 들어, 보다 큰 5%); 샘플 과도 한 중단 없이 전달 했다. 이상적으로, 이러한 조건을 이미 충족 하는 사용 가능한 XFEL 시간을 가능한 한 효율적으로 사용 하는 예약 된 TR SFX 실험 하기. Pricipally, LCP 스트림의 둔화 이상의 광학 레이저 펄스와 혼합된 활성 상태에 결과 활성화 된 결정 프로 빙 또는 umpumped 물자는 빔에 예상 되는 경우 펌핑된 소재를 프로 빙 수. 있습니다 사출 사전 테스트의 추가 혜택은 강등 압출 비 샘플 변경 막힌된 노즐을 교체 하는 시간으로는 XFEL에서 데이터 수집 하는 동안 가동 중지 시간 최소화 및 기타 유지 관리 작업 감소.
여기, 우리는 높은 점도 마이크로 압출 인젝터와 TR SFX 데이터 컬렉션에 대 한 샘플 배달을 최적화 하는 방법을 제시. 편의상, 설명된 방법 의존 하지 마십시오 X-ray 소스에 액세스할 수 있지만 싱크 로트 론 beamline29 일 것 이다 추가 제공 정보 예상된 적중된 속도 크리스탈 회절에. 우리의 프로토콜 양성자 펌프 bacteriorhodopsin10 에 망막 isomerization 캡처 실험을 최적화 하기 위해 개발 되었다 고 돌출을 모니터링 하 여 다음 돌출 크리스탈 샘플을 준비와 함께 시작 하는 두 단계에서 수행 됩니다. 고속 카메라 설치를 사용 하 여. 1 단계에서 결정-라덴 LCP 최종 혼합물은 막힘 또는 감속 없이 배달 샘플 환경에 적합 하도록 추가 LCP, 낮은 전환 온도 지질 또는 다른 첨가제 혼합입니다. 새로운 3 방향 주사 통 커플러는 혼합 성능 및 샘플 동질성을 개선 하기 위해 개발 되었다. 직접 압출 속도 안정성을 측정 하는 고속 카메라에 의해 기록 된 압출 테스트 두 번째 단계에 의하여 이루어져 있다. 비디오 데이터의 분석에 따라 조정 할 수 있다 샘플 준비 프로토콜에 실험 결과 개선 하기 위해. 이 절차는 최소한의 수정, TR-SFX 데이터 수집을 위해 준비 하는 다른 단백질을 적응 시킬 수 있다 및 제한 XFEL beamtime의 효율적인 사용에 기여할 것입니다. 그냥 그들의 작업44,45 synchrotrons28,30,40,41 인젝터 기반 직렬 데이터 수집 방법의 전송 시작 하는 새로운 XFEL 시설 , 다음 몇 년 동안 확실 하 게 계속 제공할 것 이다 단백질 목표의 적 넓은 범위의 구조 역학에 대 한 흥미로운 새로운 통찰력.

<table><tbody><tr><td>모기 LCP 주사기 커플 링</td><td>TTP labtech 상점</td><td>3072-01050</td><td></td></tr><tr><td>해밀턴 주사기 1710 RNR, 100 &micro; l</td><td>해밀턴</td><td>HA-81065</td><td></td></tr><tr><td>해밀턴 주사기 1750 RNR, 500 &micro; l</td><td>해밀턴</td><td>HA-81265</td><td></td></tr><tr><td>모노올레인</td><td>누첵 프렙, Inc.</td><td>M-239</td><td></td></tr><tr><td>7.9 MAG</td><td>Avanti 극지 지질 Inc.</td><td>850534O</td><td></td></tr><tr><td>50% w/v PEG 2000</td><td>분자 치수</td><td>MD2-250-7</td><td></td></tr><tr><td>파라핀(액체)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.07162</td><td></td></tr><tr><td>고속 카메라</td><td>Photron</td><td></td><td>Photron Mini AX</td></tr><tr><td>고배율 렌즈</td><td>Navitar</td><td></td><td>12X 줌 렌즈 시스템</td></tr><tr><td>3축 스테이지</td><td>ThorLabs</td><td>PT3/M</td><td></td></tr><tr><td>섬유 광</td><td>Thorlabs</td><td>OSL2</td><td></td></tr><tr><td>용융 실리카 섬유</td><td>Molex / Polymicro</td><td>TSP-505375</td><td></td></tr><tr><td>Lite 터치 페룰</td><td>IDEX</td><td>LT-100</td><td></td></tr><tr><td>ASU 고점도 인젝터</td><td>애리조나 주립 대학</td><td></td><td>Uwe Weierstall (weier@asu.edu)</td></tr> <tr><td>HPLC 펌프</td>에서 구매 가능 <td>Shimadzu</td><td>LC-20AD</td><td></td></tr><tr><td>전자 가스 조절기</td><td>비율 공기</td><td>GP1</td><td></td></tr></tbody></table>

x 선 레이저에서 직렬 펨 결정학 시간 해결에 대 한 microcrystals의 고 점도 압출을 개선

Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

높은 점도 마이크로 압출 인젝터는 극적으로 x 선 자유 전자 레이저 (XFELs)에서 직렬 펨 결정학 실험 (SFX)에서 샘플 소비를 감소 했습니다. 일련의 실험 빛 구동 양성자 펌프 bacteriorhodopsin를 사용 하 여 추가 설정한이 인젝터의 구조 변화를 해결 하려면 시간 해결 직렬 펨 결정학 (TR-SFX)에 대 한 결정을 제공 하는 기본 옵션으로 photoactivation 후 단백질입니다. 높은 품질의 여러 구조 스냅샷, 많은 양의 데이터를 수집 하 고 모든 펌프 레이저 펄스 사이의 결정의 보장에 필수적 이다. 여기, 우리가 어떻게 우리가 우리의 최근 TR SFX 실험 Linac 일관 된 빛 소스 (LCLS)에서 bacteriorhodopsin microcrystals의 입체 최적화 자세히 설명 합니다. 방법의 목표 속도 증가 하는 결정의 높은 밀도 유지 하면서 안정적이 고 지속적인 흐름에 대 한 압출을 최적화 하는 실험에서 TR SFX에 데이터를 수집할 수 있습니다. 우리 커플링 장치는 고속으로 찍은 압출 안정성의 측정에 따라 샘플 구성 조정 하 여 다음 소설 3-방법으로 주사기를 사용 하 여 결정의 균일 분포 lipidic 입방 단계를 준비 하 여이 목표를 달성 카메라 설정입니다. 방법론은 다른 microcrystals의 흐름을 최적화 하기 위해 적용할 수 있습니다. 설치는 새로운 스위스 자유 전자 레이저 시설 사용자가 가능할 것 이다.

여기에 설명 된 절차 (그림 3)에 대 한 이상적인 시작 물자는 인젝터를 위한 점성 운반대 매체에 통합 하는 microcrystals의 높은 밀도 이다. 절차의 크리스탈 라덴 각 준비를 위해 약 50 µ L에 대 한 호출합니다. 이러한 bR9,10 여기, 예를 들어 (그림 4), 사용 또는 기존의 증기 확산 설정에서 성장 하는 결정을 사용 하 여 준비로 LCP에 직접 성장 수 있다. 우수한 비디오 가이드 기밀 주사기에서 직접 결정 화를 찾을 수 있습니다 Ishchenko 외. (2016)37. BR, 결정 플레이트의 이상적인 직경 회절 능력과 펌프 레이저 동질적인 활성화 사이 좋은 타협으로 약 20 μ m입니다. 단백질...

시간이 해결 직렬 펨 결정학 실험의 성공 효율적인 샘플에 따라 달라 집니다. 여기, 우리는 프로토콜 최적화 높은 점도 마이크로 압출 인젝터에서 bacteriorhodopsin microcrystals의 입체 면을 설명 합니다. 방법론은 소설 3 방향 커플러와 샘플 균질 및 고속 카메라와 시각화에 의존합니다.

X 선 레이저에서 직렬 펨 결정학 시간 해결에 대 한 Microcrystals의 고 점도 압출을 개선

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray ...

이 프로토콜은 시간 해결 된 직렬 결정 실험 중에 자주 발생하는 문제가 데이터 품질을 손상시키지 않도록 설계되었습니다. 이 방법의 한 가지 주요 장점은 개별 결정 시스템에 대한 적응성입니다. 고속 카메라 압출 테스트를 통해 압출 안정성을 직접 측정할 수 있습니다.첫째, 주사 30분 전에 100 마이크로리터 주사기에 결정적 모노올렌 기반 LCP의 50 마이크로리터를 적재한다. 진공 환경에 주입하기 위해 MAG 7.9의 마이크로리터 5개와 액체 파라핀 5마이크로리터를 두 번째 주사기 뒤쪽에 적재합니다. 주사기를 수직으로 잡고 주사기에서 기포를 추방합니다.주사기를 MAG 7.9및 파라핀과 연결하여 표준 주사기 커플러에 연결합니다. 그리고 혼합물의 작은 양이 커플러 바늘의 끝에 보일 때까지 플런저를 부드럽게 눌러 커플러에서 공기를 제거합니다. 시료 주사기를 시료에 공기를 유입시키지 않는 자동차를 복용하는 주사기 커플러에 연결합니다.커플러를 여러 번 통과하여 지질과 파라핀에 섞는다. 다음으로, 다른 100 마이크로 리터 주사기에 미리 혼합 된 LCP의 20 마이크로 리터를로드합니다. 커플러에서 빈 주사기를 제거하고 표준 주사기 커플러를 사용하여 주사기를 함유하는 크리스탈에 미리 혼합된 LCP를 부착합니다.그런 다음, 커플러를 통해 샘플을 100 번 전달합니다. 입방 상에 샘플을 가져오려면 모노올렌 3 마이크로 리터를 넣고 50 번 섞습니다. 과도한 모노올렌을 피하기 위해 투명한 단계가 형성될 때까지 이 절차를 반복하십시오.시료 강성 및 압출가능성에 대한 예비 테스트로서, 주사기 커플러로부터 빈 주사기를 분리하고 주사기를 수직으로 잡고, 커플러를 통해 소량의 샘플러를 짜냅니다. 압출된 샘플이 직립 원통을 형성하면 샘플이 압출 테스트를 위한 준비가 되었습니다. 미리 혼합된 LCP를 추가하여 샘플의 총 부피를 100 마이크로리터로 조정합니다.샘플 주사기와 두 개의 빈 주사기를 3방향 주사기 커플러에 부착합니다. 샘플의 절반을 두 번째 주사기로 전달한 다음 샘플의 두 절반을 동시에 세 번째 주사기로 눌러 50회 이상 섞는다. 결정의 균일한 분포를 확인하기 위해 스테레오 현미경의 밑에 혼합 된 샘플을 포함하는 주사기를 놓습니다.HPLC 펌프와 모든 수로를 제거하여 유량이 정확한지 확인합니다. 그런 다음 인젝터의 유압 단계를 제거합니다. 그런 다음 카메라를 켜고 제공된 소프트웨어에 연결합니다.시각적 피드백을 위해 라이브 비디오를 실행하면 노즐 팁을 프레임 중앙에 배치하고 3축 스테이지에 초점을 맞춥니다. 카메라의 프레임 속도를 초당 1, 000 프레임으로 설정합니다. 그런 다음 해상도를 512x 512픽셀로 설정합니다.이제 프레임 속도에 의해 설정된 노출 시간을 통해 노즐이 표시될 때까지 조명 레벨을 조정합니다. 노즐 팁을 왼쪽에서 오른쪽으로 중앙에 배치하고 프레임의 상위 3분의 1에 위치합니다. 시간 경과 모드에서 카메라를 설정합니다.간격을 30초로 설정하고 반복을 40번으로 설정합니다. 트리거 모드를 임의로 설정합니다. 그리고 1, 000으로 기록할 프레임 수를 입력합니다.이제 시험 샘플의 20 마이크로리터로 저장소를 적재하고 모세관 노즐을 부착합니다. 채워진 저장소를 인젝터에 부착합니다. 그런 다음, 노즐의 포트에 가스 라인을 부착하고 가스 흐름을 시작합니다.이에 따라 펌프와 카메라 레코딩을 동시에 시작합니다. 펌프 압력이 예상 종료 시간 가까이 급격히 상승할 때까지 압출을 모니터링합니다. 그런 다음, 레코딩을 멈추고 펌프를 차단하고 릴리프 밸브를 열어 시스템 압력을 배출합니다.그런 다음 분석 소프트웨어로 비디오 파일을 열고 측정 도구를 보정합니다. 압출에 추적 가능한 기능이 있는 비디오에서 프레임을 찾습니다. 프레임 번호를 기록합니다.다음으로 동일한 기능이 표시되지만 이전 단계에서 위치에서 이동한 프레임으로 비디오를 진행합니다. 프레임 번호를 기록합니다. 직선 측정 도구를 사용하여 분석 측정을 통해 피쳐의 시작점과 끝점에서의 거리를 측정합니다.비디오의 모든 세그먼트에 대해 이전 단계를 몇 번 반복합니다. 마지막으로 데이터 계열을 플롯합니다. 여기에 설명된 절차에 이상적인 시작 재료는 인젝터를 위한 점성 담체 배지에 통합된 미세 결정의 높은 밀도이다.단백질 결정은 양성자 펌핑 박테리아 rhodopsin에 TRSFX 데이터를 수집하는 데 사용되었으며, 이는 광자 흡수 후 발생하는 매우 빠른 변화를 드러냈다. 3방향 커플러를 이용한 시료 준비 후, 주사기 내의 소재의 육안 검사는 시료 균질성을 나타낸다. 그리고 현미경 심시경 심은 결정의 밀도를 확인할 수 있습니다.샘플은 전달 매체가 명확하고 점성이 있을 때 입방 상에 있습니다. 탁하 혼합물은 샘플이 스폰지 또는 라멜라 상에 있다는 것을 나타내지만 고결정 밀도가 LCP의 선명도를 모호하게 할 수 있기 때문에 결정적이지 않습니다. 스폰지 위상을 식별하는 저압 테스트는 샘플에서 주사기 플런저를 당겨 수행 할 수 있습니다.제트 테스트 중에 샘플은 거의 일정한 속도로 이동하는 LCP의 긴 연속 열을 돌출해야 합니다. 드립 모드에서 실행되는 샘플은 점도가 너무 낮다는 것을 나타냅니다. 열을 형성하는 샘플의 데이터는 압출이 실험 매개 변수에 의해 지시된 최소 속도 이상으로 유지된다는 것을 보여줘야 합니다.이 프로토콜을 사용하여 최적화한 후 직렬 결정 데이터를 전문가 시설에서 수집할 수 있습니다. 이것은 그것의 기능을 수행할 때 전체 단백질에 있는 형성 변경을 밝힐 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

X선 자유전자 레이저 및 싱크로트론 소스에서 연속 결정학을 위한 지질 입방상의 막 단백질 미세결정의 준비 및 전달 절차를 설명합니다. 이러한 프로토콜은 또한 용해성 단백질 미세결정의 통합 및 전달에 적용할 수 있으며, 이로 인해 액체 주입에 비해 샘플 소비를 크게 줄일 수 있습니다.

준비 및 직렬 펨토초 결정학에 대한 지질 큐빅 단계에서 단백질 미세 배달

단백질 미세 결정을 사용하는 X 선 결정학을위한 프로토콜이 제시됩니다. 정제 후 또는 cellulo에서 미세 -grown 생체 분석 두 예가 비교된다.

단백질 결정의 미세 결정학 및<em&gt; 셀룰로에서</em&gt; 회절

우리는 엑스레이의 강렬한, 펨 펄스에 의해 Buckminsterfullerene (C60)의 나노에서 유도 된 전자 피해를 조사 하도록 실험을 설명 합니다. 실험, 놀랍게도, 추계 되 고, 보다는 오히려 x-선 유도 전자 역학 C60 의 높은 상관, 수백 결정1내의 단위 셀의 확장 발견.

펨 회절 실험 Buckminsterfullerene의 나노에 수행 하는 동안 장거리 전자 상관 관계의 측정

이 프로토콜은 자세하게에서 조작 상 온에서 x 선 회절 데이터 컬렉션에 대 한 미세 장치를 작동 하는 방법을 설명 합니다. 또한, 그것은 동적 산란에 의해 단백질 결정 화를 모니터링 하는 방법 설명 하 고 처리 하 고 분석 하는 방법을 얻은 회절 데이터.

현장에서 크리스탈 x-선 회절 및 현장에서 직렬 결정학에 대 한 동적 빛 산란에 대 한 미세 칩

이 프로토콜의 목표는 최근 호주 싱크로트론에서 의뢰한 고점성 인젝터 인Lipidico에서 데이터 수집을 위한 직렬 결정예학 샘플을 준비하는 방법을 시연하는 것입니다.

오스트레일리아 싱크로트론의 직렬 결정학 측정을 위한 지질 주입 프로토콜

이 논문은 투석 방법과 시투X선 회절 실험을 통해 온칩 단백질 결정화를 위해 개발된 미세유체 칩의 제조 프로토콜을 자세히 설명합니다. 미세 제조 공정을 통해 반과소성 재생셀룰로오스 투석 막을 칩의 두 층 사이에 분자량 차단과 통합할 수 있습니다.

시투 X선 회절 연구를 위한 미세 투약에 의한 칩에 단백질의 결정화

이 기사의 목적은 시청자에게 대규모 단일 단백질 결정을 성장시키기 위한 소량의 증기 확산 프로토콜을 직렬 결정학을 위한 대용량 배치 미세 결정화 방법으로 변환하는 방법에 대한 확실한 이해를 제공하는 것입니다.

연속 결정학 실험을 위한 Endothiapepsin 결정의 성장 최적화

다이아몬드 빔라인 I24에서 직렬 싱크로트론 결정예촬영을 위한 고정 대상 샘플 준비, 데이터 수집 및 데이터 처리에 대한 포괄적인 가이드를 제시합니다.

다이아몬드 광원의 대상 시리얼 데이터 수집 수정

데이터의 신호 대 잡음 비율은 마이크로 결정에서 X 선 회절 측정을 수행하는 데 가장 중요한 고려 사항 중 하나입니다. VMXm 빔라인은 이러한 실험을 위한 저소음 환경과 마이크로빔을 제공합니다. 여기서는 VMXm 및 기타 마이크로포커스 대식분자 결정학 빔라인에 대한 미세 결정의 장착 및 냉각을 위한 샘플 준비 방법을 설명합니다.

VMXm 빔라인의 미세 결정을 위한 샘플 준비 파이프라인

이 기고는 결정-온-크리스탈 장치에서 단백질 결정화를 설정하는 방법과 온칩 결정화 플랫폼을 사용하여 실온에서 자동화된 직렬 데이터 수집을 수행하는 방법을 설명합니다.

온칩 결정화 및 실온에서의 대규모 연속 회절

제시된 프로토콜은 96웰 고처리량 투석 플레이트를 사용하여 단백질 결정화 조건 및 결정 성장을 스크리닝하기 위한 간단한 접근 방식을 설명합니다. 미세 결정의 대규모 성장을 위한 투석기 튜브의 사용은 직렬 결정학 및 MicroED 응용 분야에서도 입증됩니다.

Microdialysis를 통한 High-Throughput Protein Crystallization

배우세요 고점도 압출법을 활용한 미세결정 시료 전달 최적화 방법을. 고속 카메라로 안정성을 측정하고 다양한 결정계에 적용 가능한 시계열 직렬 펨토초 결정학 기술을 익히세요.

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