Name: 치경 대 식 세포 식 균 작용 및 생쥐에서 박테리아 클리어런스 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: 학습하세요 생쥐 폐포 대식세포의 식균작용 분석 및 Pseudomonas aeruginosa 체내 클리어런스 평가 방법을. 이 기술은 면역 반응 연구와 폐 감염 치료 개발에 활용됩니다.

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이 작품은 그랜트 R01HL116826 X. Zhao에 의해 지원 됩니다.

이 프로토콜은 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 동부 버지니아 의과대학의의 지침을 따릅니다.
1. 형광 구슬 먹어서
<ol><li>안락사는 마우스 (C57BL/6J, 6 주 오래 된, 여성) 동물의 윤리 안락사에 대 한 IACUC 프로토콜에 의하여 CO2 질에 의해.</li>
	<li>종이 수건으로 커버 해 부 보드에 아랫 배 위로 마우스를 놓는다. Spread-eagle 그것의 사지와 그것의 발을 파악 하 고 그것의 기도 바로 배치 되도록 다시 머리를 앞 니 및 수준에서 문자열 연결.</li>
	<li>마우스의 목, 가슴, 그리고 배꼽 소독 하 고 모피는 도구에 집착 하는 것을 방지 하려면 70% 에탄올과 젖은.</li>
	<li>일반 집게를 사용 하 여, 신체의 중심선에 피부를 당겨 하 고 목 구멍의 상단에 중심선을 수술가 위로 잘라.</li>
	<li>표준 수술가 위의 무뚝뚝한 끝을 사용 하 여 신중 하 게 멀리 근육과 결합 조직을 목 구멍에 이동 하 고 봄이 위 (microscissors)를 사용 하 여 기도 노출.</li>
	<li>연골의 반지는 집게와 창과, 신중 하 게 기도의 심 실 얼굴에 microscissors를 사용 하 여 작은 절 개 (~1.5 m m), 고 기도 18 G 캐 뉼 러를 삽입.</li>
	<li>부드럽게 게 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), 한 번에 1 mL의 3 mL. 때마다 부드럽게 주사기와 폐, 다시 reinfuse로 액체를 철수 연속에서 3 배. BALF 수집 후 안락사를 위해 자 궁 경부 전위를 수행 합니다. 튜브, 10 분, 1000 x g에서 원심 분리기를 수집된 PBS (~2.8 mL), bronchoalveolar 게 액체 (BALF)는 전송 및 펠 릿을 수집. 튜브 및 파편을 세척 하 고 수송과 치경 대 식 세포를 수집 10 분 1000 x g 에서 원심 분리기를 신선한 PBS의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>37 ° c 습도 분위기에서 유리 하단 접시에 2 일 동안 10 %nonheat 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 같은 미디어 문화 기본 치경 세포 Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM) 2 mL에 펠 릿 resuspend.</li>
	<li>오래 된 미디어를 발음, PBS의 1 mL와 함께 그것을 씻어 하 고 신선한 미디어의 2 개 mL를 추가. FITC 구슬 (carboxylated 라텍스 구슬, 직경에서 2 µ m, 50 구슬/셀)을 추가 하 고 37 ° c 습도 분위기에서 1 시간에 품 어.</li>
	<li>씻어 광범위 하 게 PBS (1 mL 5 세척의 총에 대 한 한 번에) extracellular 비즈 제거 하. 무작위로 100 셀을 이미지 하 고 세포내 구슬 가진 셀의 개수 (488 nm). 참고: Phagocytic 인덱스는 섭취 구슬; 대 식 세포의 총 수로 나눈 수 phagocytic 세포의 비율이 적어도 하나의 구슬 세포16의 총 수로 나눈 값을 섭취 하는 대 식 세포의 수입니다.<ol>
<li>또는, 구슬 1 시간 배양 후 3 mL의 PBS로 세포 세척 하 고 cytometry 먹어서의 정량화에 대 한에 대 한 처리 키를 누릅니다. 마찬가지로, 흠 없는 셀 또는 컨트롤 셀 구슬 없이 AMs를 처리 합니다. 계산 비율 양성 하 고 소프트웨어에서 이러한 옵션을 선택 하 여 흐름 cytometry 소프트웨어를 사용 하 여 형광 강도 의미.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. FcγR 및 CR 중재 먹어서
<ol><li>Opsonization를 위해 토끼 안티-SRBC-IgM의 50 µ L 또는 안티-SRBC-IgG 실내 온도11시 30 분에 대 한 토끼의 50 µ L 2 x 108 양 적혈구 (SRBCs)를 품 어.</li>
	<li>IgM 코팅 SRBCs에 C3b 그리고 C3bi 보완 파편을 해결 하기 위해 37 ° C에서 30 분 동안 C5-불충분 한 (C5D) 인간의 혈 청의 50 µ L로 IgM opsonized SRBCs를 품 어.</li>
	<li>Murine 대 식 세포 (수소-S 셀) 씨앗 (10, 000 셀/잘) 96 잘 접시에서와 하룻밤 ~ 70%의 합류를 품 어. 1 x 107/mL의 100 µ L opsonized SRBCs MH-S 셀의 각 음을 추가 하 고 37 ° c.에 1 시간에 대 한 품 어 워시 언바운드 SRBCs 매우 신속 하 게 (~ 1 분) 100 µ L 염화 염화-칼륨 (ACK) 세포의 용 해 버퍼의와.</li>
	<li>0.1 %SDS 세포를 lyse 고 2, 7-diaminofluorene (DAF) 과산화 수소 3% 및 6 M 우 레 아의 50 µ L를 추가 합니다. 620에서 헤모글로빈 촉매 fluorene 블루 형성의 흡 광도 측정 nm.</li>
	<li>SRBCs의 알려진된 번호와 620 nm 흡 광도 값에서 표준 곡선을 사용 하 여 SRBCs의 수를 결정 합니다. 마찬가지로, 프로세스 MH-S 셀 부정적인 컨트롤로 사용 하 여 nonopsonized SRBCs와 인 큐베이 팅.</li>
</ol>3. PRR 중재 먹어서
<ol><li>1.1-1.9 고립과 마우스 기본 치경 대 식 세포의 경작에 대 한 단계를 수행.</li>
	<li>2 일 후, 미디어를 제거 하 고 씻어 1 mL의 PBS, 셀 알 렉 사 Fluor-488-활용 zymosan A bioparticles (100 입자/요리)를 포함 하는 신선한 미디어의 500 µ L을 추가.</li>
	<li>1 h 37 ° c.에 품 어 얼음 처럼 차가운 PBS의 500 µ L을 추가 하 여는 식 균 작용을 중지 합니다.</li>
	<li>PBS (5 세척의 총에 대 한 한 번에 1 mL)으로 광범위 하 게 세포를 씻어. 실 온에서 10 분 동안 4 %paraformaldehyde 셀을 수정 합니다.</li>
	<li>PBS (5 세척의 총에 대 한 한 번에 1 mL)으로 광범위 하 게 세포를 세척 하 고 PBS의 500 µ L에는 셀을 계속.</li>
	<li>미분 간섭 명암 및 488에서 형광 채널 셀 이미지 nm. AMs zymosan A bioparticles를 포함 하 고 먹어서의 비율을 결정.</li>
</ol>4. 폐 포 대 식 세포에 의해 Vivo에서 먹어서
참고: 영양 한 천 배지에서 P. 농 균 GFP를 Inoculate 하 고 37 ° C에서 접시를 밤새 품 어. 다음 날, 단일 식민지 영양 국물의 2 개 mL를 접종 하 고 하룻밤 37 ° C에서 박테리아를 성장.
<ol><li>다음 날, anesthetize 100 mg/kg 케 타 민 고 10 mg/kg xylazine의 복 관리와 쥐. 발가락 핀치에 응답의 부족을 통해 적절 한 anesthetization를 확인 합니다.</li>
	<li>마우스 플랫 보드에 고무 밴드와 함께 위 앞 니에 걸쳐을 복 부 표면 및 연단 위 semirecumbent (45 °) 위치에 놓습니다. 혀를 철회 곡선된 겸 자 사용 하 여, 부분적으로. Intratracheally는 microsprayer를 사용 하 여 50 µ L (5 x 106 식민지 형성 단위 [CFU])17 피 농 균 GFP의 마 취 쥐의 폐로를 관리 합니다.</li>
	<li>감염의 1 시간 후 단계 1.1-1.7.</li>
	<li>PBS의 셀 cytocentrifuge resuspend 유리 슬라이드에 그들 (1000 x g, 실 온에서 1 분).</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 치경 대 식 세포, 호 중구, 림프 구, 대 한 cytospin 슬라이드를 얼룩 차동.</li>
	<li>무작위로 100 AMs를 선택 하 고 세포내 박테리아를 포함 하는 AMs를 계산 하 고, 식 균 작용의 비율을 결정.</li>
</ol>5. Vivo에서 박테리아 클리어런스를 사용 하 여 피 녹 농 균
<ol><li>P. 농 균 격리 한 접시에 피 녹 농 균 을 접종 하 고 하룻밤 37 ° C에서 접시를 품 어. 단일 식민지 lysogeny 국물 (파운드)의 2 개 mL를 접종 하 고 하룻밤 37 ° C에서 박테리아를 성장. CFU, 다음 수식을 사용 하 여 계산 합니다. CFU/mL = (희석 요인 x 식민지의 수) / 문화 판의 볼륨. 희석을 원하는 CFU/mL PBS 가진 문화.</li>
	<li>재판 1, intratracheally 마 취 야생-타입 (WT)로 ~2.5 x 105 CFU/mL 피 녹 농 균 의 sublethal 복용량을 주사와 TRIM72코 마우스, 4.2 단계에서 제시 된 대로. 6 일 동안 매일 몸 무게를 측정 합니다.</li>
	<li>시험 2, 재판 1에서 살아남 고 4 일 동안 몸 무게를 측정 하는 쥐로 피 녹 농 균 (5 x 105 CFU/mL)의 두 번째 복용량을 주사.</li>
	<li>마우스의 다른 세트를 사용 하 여 시험 3에서 P. 녹 농 균 의 치명적인 복용량 (3 x 107 CFU/mL)으로 WT와 TRIM72코 쥐를 주입 하 고 주입의 2 일 이내 사망률을 기록 합니다. 동물의 상당한 몸 무게 감량 같은 심한 스트레스, 돌출, 거식 증, 또는 호흡 곤란 참석 의사에 의해 사정 될 것 이다. Untreatable 동물 즉시 희생 될 것입니다.</li>
	<li>죽음 또는 안락사 주사 후 2 일에 후, 전체 폐 조직 피크 감염에서 폐 세균의 정량화에 대 한 수집 합니다.</li>
	<li>테스트 하려면 폐 세균 부담, 폐 조직에 정상적인 염 분의 200 µ L을 추가 하 고 완전히 박테리아를 파괴 하지 않고 폐 조직 방해는 전자 균질 화기에 이전 테스트 설정을 사용 하 여 그들을 균질. 폐 사진 직렬 희석에 녹 절연 한 천 배지에 lysate의 1 mL 및 플레이트 100 µ L 폐 homogenate의 총 볼륨을 조정 합니다.</li>
	<li>24 h에 대 한 37 ° C에서 번호판을 품 어과 전체 폐 당 CFU 결정 세균성 식민지.</li>
</ol>6. 통계 분석
<ol><li>학생의 t를 사용 하 여-두 그룹 간의 차이의 통계적 의미를 확인 하려면 테스트. 때 차이 통계적 고려 p < 0.05. 모든 데이터는 평균 (SEM)의 ± 표준 오차를 의미 하는 대로 표시 됩니다.</li>
</ol>

<ol><li>Hussell, T., Bell, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages%3A+plasticity+in+a+tissue-specific+context%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages: plasticity in a tissue-specific context.</a> Nature Reviews Immunology. 14, 81-93 (2014).</li>
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<li>Su, H., Chen, H., Jen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+exercise+enhances+phagocytosis+by+murine+bronchoalveolar+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Severe exercise enhances phagocytosis by murine bronchoalveolar macrophages.</a> Journal of Leukocyte Biology. 69, 75-80 (2001).</li>
<li>Amiel, E., Lovewell, R. R., O'Toole, G. A., Hogan, D. A., Berwin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa.+evasion+of+phagocytosis+is+mediated+by+loss+of+swimming+motility+and+is+independent+of+flagellum+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa. evasion of phagocytosis is mediated by loss of swimming motility and is independent of flagellum expression.</a> Infection and Immunity. 78, 2937-2945 (2010).</li>
<li>Giannoni, E., Sawa, T., Allen, L., Wiener-Kronish, J., Hawgood, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfactant+Proteins+A+and+D+Enhance+Pulmonary+Clearance+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Surfactant Proteins A and D Enhance Pulmonary Clearance of Pseudomonas aeruginosa.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34, 704-710 (2006).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

가스 교환 기능을 수행 하는 동안 폐 지속적으로 외국 입자, 병원 체, 및 알레르기 증상을 직면 한다. AMs는 그들의 주요 기능, 즉 먹어서 덕택으로 방어의 첫 번째 줄을 제공합니다. AMs는 또한 다른 면역 세포는 병원 체를 파괴와 염증의 해상도 함께 조정. 여기, 우리가 구체적으로 AMs 마우스 폐에서 분리 하 여 식 균 작용을 평가 하기 위한 방법을 설명 합니다. 이 원고에 프로토콜 먹어서 vivo에서 그리고 생체 외에서, 또한 다른 기관에서 세균 정리 대 식 세포 기능을 공부 하 고 사용할 수 있는 상세한 연구를 설명 합니다.
설명된 체 외 먹어서 혈 청 치료 FITC 구슬 잠복기의 간단한 아이디어에 의존 하거나 opsonized 먹어서 시작 교양된 AMs와 SRBCs. 이 방법은 광범위 한 세척의 단계와 백그라운드를 줄이기 위해 nonphagocytized Rbc의 세포를 포함 합니다. 하지 준수 AMs를 분리 하려면 주의 해야 합니다. ACK 세포 솔루션 관련 세척 ...

AMs는 휴식 단계와 중 인정을 통해 타고 난 면역 반응의 주요 선수와 흡입된 병원 체와 외국 입자1,2의 국제화에는 폐 포에서 주요 거주 식 세포. 그것은 알려졌다 그래서 오전 먹어서 결핍 호흡에 종종 결과 AMs P. 녹 농 균 및 Klebsiella 폐 렴3,4, 등 많은 폐 병원 균의 급속 한 정리를 위한 필수적입니다. 감염, 급성 폐 렴과 같은 더 높은 사망률과 병 적 속도 일으킬.
AMs는 또한 cytokines 및 발산 TNF-α, IL 1β, 생산 발산 하 여 염증 성 호 중구, monocytes, 모집 치경 환경의 다른 세포와는 누화 등을 생산 하 여 폐에 타고 난 선 동적인 응답을 시작 하 고 적응 면역 세포 폐5에. 예를 들어 IL 1β AMs 제작한6상피 세포 호 중구 chemokine CXCL8의 릴리스를 도움이 됩니다. 또한, AMs apoptotic polymorphonuclear 백혈구 (PMNs)의 먹어서 주변 조직, 조직 손상의 결과로, 장기 염증 PMNs에서 세포내 효소의 지속적인된 유출에는 리드의 실패에 기여 7 , 8 , 9.
AMs에 의해 식 균 작용은 AMs의 패턴 인식 수용 체 (호흡기)에 의해 또는 AMs의 수용 체 면역 이펙터와 opsonized 병원 체의 바인딩에 의해 병원 체 표면에 병원 체 관련 된 분자 패턴의 직접 인식 하 여 중재 10. 후자의 경우, AMs 그들의 Fcγ 수용 체 (FcγR)를 통해 면역 글로불린 (IgG)와 opsonized 목표를 인식할 수 또는 병원 체 코팅 보수 조각, C3b 및 C3bi, 그들의 보완의 수용 체를 통해 (CR)11. 보충 수용 체 중 면역 글로불린의 superfamily (CRIg)의 CR은 선택적으로 조직 세포12, 나타나며 최근 발견에 피 녹 농 균 폐 렴의 맥락에서 오전 먹어서 CRIg의 역할 강조 13.
많은 원래 연구 메서드를 사용 하 여 대 식 세포 기능14,15의 분자 메커니즘을 설명 하기 위해 대 식 세포 식 균 작용을 평가. 그러나, vivo에서 먹어서 같은 방법 식 균 작용의 정확한 정량화를 해야합니다. 여기, 우리 둘 다 생체 외에서 그리고 vivo에서 먹어서 fluorescein isothiocyanate (FITC)를 사용 하 여에 대 한 상세한 방법론 요약-유리 구슬과 피 농 균 녹색 형광 단백질 (GFP), 각각. 또한, 우리 PRR, CR 및 FcγR 중재 먹어서 가운데 차별화 하는 방법을 설명 합니다. 마지막으로, 우리는 피 농 균 폐 렴에 대해 마우스에 세균 정리 하는 방법을 보고 합니다.

<table><tbody><tr><td>18-G 바늘</td><td>Nipro Medical&nbsp;</td><td>CI + 1832-2C</td><td>분자 생물학 등급</td></tr><tr><td>2,7-디아미노 플루오렌 (DAF)</td> <td>시그마 - 알드리치</td><td>D17106</td><td>분자 생물학 등급</td></tr><tr><td>70 % 에탄올</td><td>Decon Labs Inc.</td><td>18C27B</td><td>분석 등급</td></tr><tr><td>96-웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>세포 생물학 등급</td></tr><tr><td>ACK 용해 버퍼</td><td>Life Technologies</td><td>A10492</td><td>분자 생물학 등급</td></tr><tr><td>Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Z23373</td><td>분자 생물학 등급</td></tr><tr><td>C5 결핍 혈청&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1163</td><td>생화학 시약</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Labnet International</td><td>C0160-R</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 4 Cytospin 4 Cytocentrifuge</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A78300101 Issue 11</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 세포 배양 매체</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>세포 생물학 등급</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td>세포 생물학 등급</td></tr><tr><td>흐름 Cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSCalibur</td><td></td></tr><tr><td>Flow Jo Software</td><td>FlowJo, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>겸자</td><td>Dumont</td><td>0508-SS/45-PS-1</td><td>실험실 동물 해부에 적합</td></tr><tr><td>FITC-카르복실화 라텍스 비드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4530</td><td>세포 생물학 등급</td></tr><tr><td>GFP-P. aeruginosa</td><td>ATCC</td><td>101045GFP</td><td>적합 에 대한&nbsp; 세포 감염 분석</td></tr><tr><td>유리 바닥 접시</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-0.170-14-C</td><td>세포 생물학 등급</td></tr><tr><td>고압 주사기</td><td>Penn-Century</td><td>FMJ-250</td><td>실험실 동물 사용에 적합</td></tr><tr><td>균질화기</td><td>Omni International</td><td>TH-01</td><td></td></tr><tr><td>과산화수소</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td>분석 등급</td></tr><tr><td>도립 형광 현미경</td><td>Olympus</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>케타민 Hydrochloride</td><td>Hospira</td><td>CA-2904</td><td>제약 등급</td></tr><tr><td>Shandon Kwik-Diff 염색</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>9990700</td><td>세포 생물학 등급</td></tr><tr><td>LB 한천</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425</td><td>분자 생물학 등급</td></tr><tr><td>LB 국물</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1427</td><td>분자 생물학 등급</td></tr><tr><td>MicroSprayer 에어로졸라이저</td><td>Penn-Century</td><td>IA-1C</td><td>실험실 동물 사용에 적합</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>시약 등급</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-027</td><td>세포 생물학 등급</td></tr><tr><td>토끼 항-SRBC-IgG&nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>55806</td><td>면역 분석</td></tr><tr><td>토끼 항-SRBC-IgM에 적합&nbsp;</td><td>Cedarline Laboratories</td><td>CL9000-M</td><td>면역 분석에 적합</td></tr><tr><td>가위</td><td>Miltex</td><td>5-2</td><td>실험실 동물 해부</td></tr><tr><td>에 적합 작은 동물 후두경</td><td>Penn-Century</td><td>LS-2</td><td>실험실 동물 사용에 적합</td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td> <td>BioRad</td><td>1610301</td><td>분석 등급</td></tr><tr><td>Spring Scissors (Med)</td> <td>Fine Science Tools</td><td>15012-12</td><td>실험실 동물 해부</td></tr><tr><td>스프링 가위 (작은)</td> <td>미세 과학 도구에</td> 적합 <td>91500-09</td><td>실험실 동물 해부</td></tr><tr><td>양 적혈구 (SRBC)에 적합&nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>55876</td><td>세척, 보존 SRBC</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378</td><td>분자 생물학 등급</td></tr><tr><td>Xylazine&nbsp;</td><td>Akorn Animal Health</td><td>59399-110-20</td><td>제약 등급</td></tr></tbody></table>

치경 대 식 세포 식 균 작용 및 생쥐에서 박테리아 클리어런스

Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice

치경 세포 (AMs)는 폐의 폐 포 공간 경비. AMs에 의해 먹어서 침입 병원 체, 죽은 세포 또는 외국 입자의 제거에 대 한 방어에 중요 한 역할을 한다 그리고 염증 반응과 조직 리 모델링의 해상도, 처리의 다양 한 표면 수용 체에 의해 중재 AMs입니다. 여기, 우리는 패턴 인식 수용 체-, 보완 수용 체 및 Fc 감마 수용 체-중재를 생체 외에서 그리고 vivo에서 분석 실험 및 실험적인 전략을 사용 하 여 AMs의 phagocytic 기능 분석에 대 한 방법을 보고합니다 식 균 작용입니다. 마지막으로, 설정 하 고 세균성 클리어런스 vivo에서 평가 하기 위해 쥐에 피 녹 농 균 폐 렴 모델을 특성화 하는 방법을 다루겠습니다. 이 분석 실험 오전 기능을 평가 하는 가장 일반적인 방법을 대표 하 고 또한 대 식 세포 기능 및 다른 기관에서 세균 정리를 공부 하는 데 사용 수 있습니다.

우리는 먼저 마우스에 의해 식 균 작용을 분석 하는 실험을 수행 기본 AMs. 모든 분석을 통해 우리는 AMs WT 및 TRIM72코 쥐에서 고립 된 비교. 그림 1A같이 형광 현미경 검사 법 기본 AMs 외피의 1 시간 후 발생 하는 마우스를 먹어서 FITC 유리 구슬의 공개. 그림 1 B cytometry에 의해 식 균 작용의 분석을 보여줍니다. 식 균 작용의 부 량 측정 현미경 고 cytometry 각각 그림 1C 와D 그림 1표시 됩니다. 그림 2...

여기 우리 보고 murine 치경 대 식 세포와 폐에서 세균성 클리어런스 phagocytic 기능을 분석 하는 일반적인 방법. 이러한 방법을 연구 fluorescein isothiocyanate 구슬의 생체 외에서 먹어서 및 녹 농 균 녹색 형광 단백질의 vivo에서 먹어서. 우리는 또한 쥐에 피 녹 농 균 을 삭제 하는 방법을 설명 합니다.

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the ...

슈도모나스 아에루기노사는 BSL-2 레벨 병원균이다. 이 유기체를 취급할 때 모든 BSL-2 수준의 안전 관행을 따르는 것을 기억하십시오. 여기에서 우리는 1 차세포 격리, 체외 phagocytosis 및 phagocytic 통로 분석, 그리고 생쥐에 있는 생체 교피토증 및 세균성 통관 평가를 보여줄 것입니다.성공적인 장내 전달에는 마스터하는 연습이 필요합니다. 마이크로스프레이가 제대로 로드되고 바늘이 두 개의 보컬 접기 사이에 있고 플런저 속도가 제대로 제어되는지 확인하십시오. 종이 타월로 덮인 해부 보드에 팔다리가 퍼지는 척추 위치에 마우스를 고정하고 앞니 아래에 끈을 연결하여 기관을 직선과 레벨로 배치할 수 있도록 하십시오.70%에탄올로 마우스를 소독하고 일반 집게를 사용하여 신체의 중심선에서 피부를 당깁니다. 외과 가위를 사용하여 복부에서 목구멍 의 상단까지 피부를 자른다. 표준 수술 가위의 무딘 끝을 사용하여 목 근육과 결합 조직을 조심스럽게 해부하십시오.흉곽 아래 복벽을 엽니다. 다이어프램을 자르고 흉곽의 하부부분을 잘라 폐를 부분적으로 노출시합니다. 스프링 가위를 사용하여 기관지를 노출하고 집게를 사용하여 연골 링을 잡습니다.마이크로 가위를 사용하여 기관지의 복부 면에 약 1.5 밀리미터 절개를 조심스럽게 만듭니다. 기관 아래에 짧은 봉합사 스레드를 조심스럽게 묶고 기관지에 18 게이지 캐뉼라를 삽입합니다. 캐뉼라가 제자리에 있을 때, 세척당 신선한 PBS 1밀리리터로 폐를 세 번 부드럽게 씻어내고, 액체를 주사기로 부드럽게 인출한 후 3회 연속 폐로 되돌려 놓습니다.각 라베이지 후, 수집된 기관지알베올라 라베이지 유체 또는 BALF를 15밀리리터 원추형 튜브로 이송하여 총 수확된 유체의 원심분리를 한다. 두 번째 원심 분리를 위해 신선한 PBS의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 세척 된 폐포 대식세포를 덜베코의 수정 된 독수리 매체 또는 DMEM의 2 밀리리터로 10 % 불열 불활성 태아 소 혈청으로 보충합니다. 그런 다음 1 차 폐포 대식세포를 세포 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 2 일 간의 문화를 위해 유리 바닥 페트리 접시에 옮습니다.48 시간 후, 신선한 매체의 두 밀리리터와 문화를 공급하기 전에 PBS의 1 밀리리터로 문화를 씻어. 다음으로, 세포당 50마이크로미터 직경의 카박스형 라텍스 FITC-컨쥬게이트 구슬을 세포 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 1시간 배양배기에 첨가합니다. 인

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

여기, 우리는 폐에 타고난 면역 세포를 거주하고 polyanhydride의 nanoparticles와 공동으로 문화에 대한 응답으로 자신의 활성화를 검토하고 있습니다 murine 폐포 macrophages를 수확을위한 프로토콜을 설명합니다.

Polyanhydride의 Nanoparticles에 의해 유도된 Murine Macrophages 폐포 수확 및 평가 세포 활성화

Macrophages는 항상성의 중심 역할을하고 여러 조직의 병리. 여기에 제시된 프로토콜은 macrophages를 파괴하는 방법을...

마우스의 Macrophages의 고갈과 Reconstitution

출처: Nagre, N. 외 마우스의 폐포 대식세포 섭취와 박테리아 제거. J. Vis. Exp. (2019).이 영상은 IgM과 보보체로 옵소니시된 양 적혈구를 이용한 보체 수용체 매개 식구 평가를 시연하며, 이후 쥐 대식세포에 의한 흡수를 보여줍니다. 식의 정도는 헤모글로빈 촉매에 의해 산화된 디아미노플루렌의 청색색 생성 산물을 측정하여 정량화됩니다.

옵소니즈드 적혈구를 이용한 보체 매개 식세포작용 모델 in vitro

관측 마우스 대식세포 배양을 예로 들어보겠습니다.Wnt5A라는 신호 분자를 포함한 버퍼와 버퍼만 포함하는 대조군으로 검사를 잘 처리하세요.박테리아 병원체에 감염시키고 배양하세요.시험 세포에서 Wnt5A는 세포골격 재조직을 강화하는 신호 전달 연쇄 반응을 활성화하여 박테리아의 포가좀 흡수를 촉진하는 반면, 이 신호가 없는 대조 세포는 박테리아 수가 적게 내화됩니다.내부화되지 않은 박테리아를 제거하기 위해 세척한 후, 항생제가 포함된 배지와 함께 배양하여 남은 세포외 박테리아를 제거합니다.Wnt5A 신호전달은 박테리아 내 포고좀이 리소좀과 융합될 준비를 하여 박테리아 분해를 가능하게 합니다.일부 박테리아는 포갈리소좀을 파열시켜 탈출합니다.대조 세포에서는 제한된 식체 성숙이 탈출을 촉진합니다.정해진 시점에 세포를 채취하세요. 증류수를 넣어 삼투압 충격을 유도하여 세포를 용해시키고 세포 내 박테리아를 방출합니다.용해물을 한천 배지에 바르고 배양하세요.Wnt5A 처리 세포에서 더 큰 시간...

Wnt5A 매개 생쥐 대식세포에서 박테리아 제거 증진

공 초점 현미경에 의해 포식 누룩 곰팡이 포자의 성장을 제어하는 절연 쥐 폐포 대식 세포의 능력을 평가하는 방법.

공 초점 현미경으로 고립 된 폐포 대 식세포의 반대로 곰팡이 활동을 평가

숙주-병원체 상호 작용에 대한 체외 연구는 특정 면역 반응의 특성을 규명할 수 있지만 복잡한 반응의 영향을 관찰하려면 생체 내 모델이 필요합니다. 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 노출 후 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 매개 폐 감염을 사용하여 인공호흡기 관련 폐렴 병원성과 관련된 미생물 상호 작용에 대한 쥐 모델을 확립했습니다.

미생물 커뮤니티를 공부<em&gt; 생체</em&gt; 사이에 호스트 매개 상호 작용의 모델<em&gt; 칸디다 알비 칸스</em&gt; 및<em&gt; 녹농균</em&gt; 항공에

여기에서는 암 전이에서 폐포 대식세포의 기능을 연구하기 위한 모델과 접근 방식을 설명합니다. 전이에서 이러한 세포의 역할을 입증하기 위해 클로드로네이트 리포좀을 사용한 폐포 대식세포의 고갈과 함께 유방암의 syngeneic(4T1) 모델을 사용했습니다.

유방암 전이에 폐포 대 식세포의 역할을 공부

여러 가지 방법 마우스에서 세균성 폐렴 모델링 문헌에 기재되어있다. 여기서, 우리는 구강 인두로 피펫 세균 접종의 흡인 (즉, 흡입)를 통해 폐렴을 유도하기위한 비 침습적, 저렴하고 빠른 방법을 설명합니다. 폐 선천성 면역 반응의 평가를위한 다운 스트림 방법도 자세히 설명되어 있습니다.

마우스의 실험 세균성 폐렴의 유도 및 표현형에 대한 비 침습적 및 기술적 비 집약적 인 방법

이 통신 격리와 인간에서 치경 대 식 세포의 문화에 대 한 방법론 및 실험적인 목적을 위한 murine 모델에 설명합니다.

고립과 Murine 인간과 치경 대 식 세포의 생체 외에서 문화

이 원고는 오존에 노출 여부를 결정하기위한 프로토콜을 설명, 기준 대기 오염 물질, 생체 내에서 폐포 대식세포 efferocysis를 손상. 이 프로토콜은 일반적으로 사용되는 시약 및 기술을 활용하고 폐 포상 손상의 여러 모델에 적응하여 폐포 대식세포 효능에 미치는 영향을 결정할 수 있습니다.

오존 노출 에 따른 폐포 대식세포 비세포증의 생체내 평가

이 프로토콜은 특발성 폐 섬유증(IPF)의 생체 내 연구를 용이하게 할 수 있는 마우스 모델에서 폐포의 IL-33 자극 후 폐 간질 대식세포(IM)의 분리 및 입양 전달을 설명합니다.

생체 내에서 특발성 폐 섬유증에 미치는 영향을 연구하기 위해 IL-33 자극 대식세포를 블레오마이신 유도 마우스 모델로 입양 전달

학습하세요 생쥐 폐포 대식세포의 식균작용 분석 및 Pseudomonas aeruginosa 체내 클리어런스 평가 방법을. 이 기술은 면역 반응 연구와 폐 감염 치료 개발에 활용됩니다.

치경 대 식 세포 식 균 작용 및 생쥐에서 박테리아 클리어런스

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