Name: Osteoclast 형성과 생체 외에서 Osteoclast 선구자의 확산에 안티-c-fms 항 체의 효과 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-18T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: 배우세요 생쥐 장골에서 골수를 분리하여 대식세포와 파골세포를 생성하는 방법을. Anti-c-fms 항체가 파골세포 형성에 미치는 영향을 평가하여 염증성 골 질환 치료 가능성을 확인합니다.

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이 작품 일부 JSP KAKENHI에 의해 지원 되었다 (No. 16 케이 11776 H. K., No. 17 K 17306 K. S., No. 16 K 20637 K. K., No. 16 K 20636 M. S., No. 18 K 나 m 09862 하 하 하 하.) 과학의 승진에 대 한 일본 사회에서 부여.

모든 동물 절차 및 동물 보호는 도호쿠 대학 규칙 및 규정에 따라 수행 했다.
1. murine Hindlimb 해 부 및 처리
<ol><li>절 개, 앞 접시는 컨테이너의 크기에 따라 α-MEM의 약 50 mL와 함께 얼음에 배치. 모든 뼈의 해 부 완료 될 때까지이 컬렉션의 컨테이너 될 것입니다. 이 고 후속 실험, α-MEM 포함 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 100 IU/mL 페니실린 G, 및 100 μ g/mL 스 사용 합니다.</li>
	<li>5 %isoflurane 과다 복용의 흡입에 의해 C57Bl/6J 마우스를 안락사.</li>
	<li>야자수와 발 70% 에탄올으로 깨끗이 스프레이 통해 피어 싱 하는 핀을 사용 하 여 부정사 위치에 마우스를 수정.</li>
	<li>엉덩이의 수준에서 불 임 수술가 위, 핀셋을 사용 하 여 피부 절 개를 만들고 근육 노출 발까지 연장.</li>
	<li>Quadriceps 근육을 연결 하는 힘 줄과 뼈에 햄 스트링 근육을 연결 하는 힘 줄을 잘라. 껍질 멀리 엉덩이 무릎 관절을 노출 하는 근육. 이 힘 줄을 찾기 부드러운 조직 태그를 떠나지 않고 그들의 첨부 파일에서 두 근육을 자유롭게 하는 것을 쉽게 것입니다. 뼈를 잘라 하지 마십시오.</li>
	<li>대 퇴 골의 머리와 공동 공간 사이 위 놓고 자유롭게 대 퇴 골 뼈를 그대로 유지 하지만 그것을 잘라. 이 골 노출의 위험 없이 뼈의 분리를 수 있게 된다.</li>
	<li>마찬가지로 잘라 멀리 경골을 연결 하는 근육. 발목 관절 뼈 오염을 피하기 위하여 그대로 유지에 경골 첨부 파일에서 무료를 잘라.</li>
	<li>대 퇴 골 및 경골이 위 블레이드와 kimwipe를 사용 하 여 모든 나머지 부드러운 조직을 긁어 그리고 α-MEM 얼음에 배치와 함께 접시에 놓습니다.</li>
</ol>2. murine Hindlimb 골 격리
<ol><li>Α-MEM에 30 G 바늘 주사기를 채우십시오.</li>
	<li>경골 및 대 퇴 골 무릎 관절에서 뽑습니다.</li>
	<li>가 위를 사용 하 여 양쪽에서 긴 뼈의 끝을 잘라.</li>
	<li>핀셋을 사용 하 여 축에서 뼈를 잡고, 뼈의 골 수 공간에 바늘을 삽입 하 고 천천히 6 cm 문화 접시에 골 수의 콘텐츠를 플러시. 뼈는 흰색, 추출의 모든 골 수 콘텐츠를 나타내는 표시 됩니다. 모든 뼈를 반복 합니다.</li>
	<li>스트레인 골 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브를 5 분에 대 한 300 x g 에서 원심 분리기로 40 μ m 나일론 셀 스 트레이너를 사용 하 여 압축을 풉니다.</li>
	<li>삭제는 상쾌한, α-MEM의 5 mL로 세척 하 고 2 번의 총에 대 한 반복 세척 5 분에 대 한 300 x g 에서 원심.</li>
	<li>
Α-MEM의 10 mL에 펠 릿을 resuspend 하 고 세포 수는 hemocytometer를 사용 하 여 다음과 같이 수행 합니다.
	<ol>
<li>10 μ 세포 현 탁 액의 0.4% trypan 1.5 mL 튜브에 파란색의 10 μ에 추가 하 여 셀 서 스 펜 션의 1:1 희석을 만들고 한 번에 플라스틱.</li>
		<li>슬라이드 커버 hemocytometer 챔버를 커버 하 고 염료의 서 스 펜 션은 hemocytometer를 전송. 연극 또는 언더 필 챔버와 모 세관 작용에 의해 챔버를 채우기 위해 현 탁 액을 허용 하지 중요 하다.</li>
		<li>현미경 단계에 hemocytometer 장소입니다. 10 x 목표를 사용 하 여, 센터 광장에 초점. 3 라인에 의해 구속 하는 모든 셀을 계산 합니다. 셀 두 번 계산 되지 않습니다 있는지 확인 하려면, 각 사각형의 위쪽 및 오른쪽 모서리를 계산 합니다. 죽은 세포는 진한 파란색 표시 됩니다, 그리고이 카운트에서 제외 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>다운스트림 응용 프로그램에 따라 적절 한 문화 혈관으로 셀을 시드하십시오. 이 특정 실험에 대 한 섹션 3을 따릅니다.</li>
</ol>3입니다. BMM 세대
<ol><li>씨앗 1 x 107 셀/10 mL 10 cm에 요리 문화 고 M-CSF 100 ng/mL를 추가 합니다. M-CSF의 최종 농도가 100 ng/mL의 배양 이다. 37 ° C, 5% CO2 3 일에 문화를 품 어.</li>
	<li>3 일 후, 문화 매체를 제거 하 고 PBS에 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 비 부착 한 세포를 제거, 실내 온도 0.02% 트립 신-EDTA의 5 mL을 추가를 두 번의 10 mL와 함께 적극적으로 셀을 세척 하 고 37 ° C, 5% CO2 5 분 동안에 품 어.</li>
	<li>철저 한 pipetting 셀을 분리 합니다. 셀 (셀 표시 반올림과 미디어에 부동) 현미경 문화를 관찰 하 여 분리 된는 다는 것을 확인 하십시오. 셀 연결 된 남아, 철저 하 게 분리를 pipetting 반복 합니다. 세포를 분리 하는 경우 비활성화 반응에 α-MEM의 5 mL을 추가 합니다.</li>
	<li>50 mL 원뿔 튜브와 5 분 삭제, 상쾌한에 대 한 300 x g 에서 원심 분리기로 세포를 수집 하 고 α-MEM의 5 mL로 씻어.</li>
	<li>5 분에 대 한 300 x g 에서 centrifuge 고 α-MEM의 10 mL에 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>앞에서 설명한 단계 2.7.1에서에서 세포 수를 수행 합니다.</li>
	<li>씨앗 1 x 106 세포/10 mL 10 cm에 요리 문화 고 M-CSF 100 ng/mL를 추가 합니다. M-CSF의 최종 농도가 100 ng/mL의 배양 이다. 37 ° C, 5% CO2 3 일에 문화를 품 어.</li>
</ol>4. Osteoclast 선구자로 Osteoclasts BMM에서의 세대
<ol><li>3 일 후, 다음 단계 3.2-3.7 osteoclast 선구자로 BMM를 대표 하는 연결 된 셀을 수확.</li>
	<li>5 x 104 셀/200 μ α-MEM 96 잘 접시에서의 씨앗 BMM. RANKL 100 ng/mL의 최종 농도 50 ng/mL 또는 TNF-α의 최종 농도 대 한 추가 합니다. 각 잘을 100 ng/mL의 최종 농도 대 한 M-CSF를 추가 합니다.</li>
	<li>안티-c-fms 항 체를 추가 (최종 농도 0, 1, 10, 100, 1000 ng/mL)을 각 영역.</li>
	<li>37 ° C, 5% CO2 4 일에서 품 어. 4 일 동안 매일 미디어를 변경 합니다.</li>
</ol>5. 주석산 저항 산 성 인산 가수분해 효소 (함정) 얼룩
<ol><li>4 일 후 부 화, 각의 문화 매체를 발음 부드럽게. 실내 온도 1 x PBS의 200 μ에 각각 한 번 잘 씻는 다.</li>
	<li>고정을 위한 각 음을 10% 포 르 말린의 200 μ를 추가 하 고 실 온에서 1 h에 품 어. 포 르 말린을 발음 하 고 이온을 제거 된 물으로 잘 각 3 번 씻어.</li>
	<li>0.2% 트라이 톤 X-100 각 PBS에 permeabilization에 대 한 고 실 온에서 1 h에 대 한 품 어의 200 μ를 추가 합니다. Triton X-100을 발음 하 고 이온을 제거 된 물으로 잘 각 3 번 씻어.</li>
	<li>각 우물에 트랩 얼룩 솔루션의 200 μ를 추가 합니다. 현미경 얼룩을 시각화. 그것은 제대로 개발을 얼룩에 대 한 10-30 분에서 걸릴 것입니다.</li>
	<li>얼룩 및 세척 각 이온된 수 3 회, 잘 하 고 건조 한 공기를 발음. 관찰에 사용 하 여 실내 온도에서 보관.</li>
</ol>6. 확산 분석 결과
<ol><li>5 x 103 셀/200 μ α-MEM 96 잘 접시에서의 osteoclast 선구자로 씨앗 BMM. 각 잘을 100 ng/mL의 최종 농도 대 한 M-CSF를 추가 합니다.</li>
	<li>안티-c-fms 항 체를 추가 (최종 농도 0, 1, 10, 100, 1000 ng/mL)와 37 ° C, 5% CO2 중간 변화 없이 3 일 동안에 품 어.</li>
	<li>3 일 후, 1 x PBS로 세포 세척. 각 잘 100 μ α-MEM의 추가.</li>
	<li>10 μ 키트 솔루션을 계산 하는 셀의 추가 하 고 37 ° C, 5% CO2 2 h에서 품 어 각 450에서의 흡 광도 결정 nm microplate 리더를 사용 하 여.</li>
</ol>

<ol><li>Crotti, T. N., Dharmapatni, A. A., Alias, E., Haynes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoimmunology%3A+Major+and+Costimulatory+Pathway+Expression+Associated+with+Chronic+Inflammatory+Induced+Bone+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Osteoimmunology: Major and Costimulatory Pathway Expression Associated with Chronic Inflammatory Induced Bone Loss.</a> Journal of Immunology Research. 2015, 281287(2015).</li>
<li>Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+resorption+by+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bone resorption by osteoclasts.</a> Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).</li>
<li>Azuma, Y., Kaji, K., Katogi, R., Takeshita, S., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-alpha+induces+differentiation+of+and+bone+resorption+by+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-alpha induces differentiation of and bone resorption by osteoclasts.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4858-4864 (2000).</li>
<li>Kobayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor+alpha+stimulates+osteoclast+differentiation+by+a+mechanism+independent+of+the+ODF%2FRANKL-RANK+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor alpha stimulates osteoclast differentiation by a mechanism independent of the ODF/RANKL-RANK interaction.</a> Journal of Experimental Medicine. 191 (2), 275-286 (2000).</li>
<li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+differentiation+independent+of+the+TRANCE-RANK-TRAF6+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Osteoclast differentiation independent of the TRANCE-RANK-TRAF6 axis.</a> Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 589-595 (2005).</li>
<li>Redlich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclasts+are+essential+for+TNF-alpha-mediated+joint+destruction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investestigation%22%5BJournal%5D)">Osteoclasts are essential for TNF-alpha-mediated joint destruction.</a> Journal of Clinical Investestigation. 110 (10), 1419-1427 (2002).</li>
<li>Abu-Amer, Y., Ross, F. P., Edwards, J., Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-stimulated+osteoclastogenesis+is+mediated+by+tumor+necrosis+factor+via+its+P55+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investestigation%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-stimulated osteoclastogenesis is mediated by tumor necrosis factor via its P55 receptor.</a> Journal of Clinical Investestigation. 100 (6), 1557-1565 (1997).</li>
<li>Zha, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-alpha+contributes+to+postmenopausal+osteoporosis+by+synergistically+promoting+RANKL-induced+osteoclast+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">TNF-alpha contributes to postmenopausal osteoporosis by synergistically promoting RANKL-induced osteoclast formation.</a> Biomedicine & Pharmacotherapy. 102, 369-374 (2018).</li>
<li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M-CSF+mediates+TNF-induced+inflammatory+osteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">M-CSF mediates TNF-induced inflammatory osteolysis.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3418-3427 (2005).</li>
<li>Kimura, K., Kitaura, H., Fujii, T., Hakami, Z. W., Takano-Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-c-Fms+antibody+inhibits+lipopolysaccharide-induced+osteoclastogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunology+and+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Anti-c-Fms antibody inhibits lipopolysaccharide-induced osteoclastogenesis in vivo.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 64 (2), 219-227 (2012).</li>
<li>Kimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+anti-c-Fms+antibody+inhibits+osteoclastogenesis+in+a+mouse+periodontitis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Diseases%22%5BJournal%5D)">An anti-c-Fms antibody inhibits osteoclastogenesis in a mouse periodontitis model.</a> Oral Diseases. 20 (3), 319-324 (2014).</li>
<li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+M-CSF+receptor+c-Fms+antibody+inhibits+mechanical+stress-induced+root+resorption+during+orthodontic+tooth+movement+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Angle+Orthodontist%22%5BJournal%5D)">An M-CSF receptor c-Fms antibody inhibits mechanical stress-induced root resorption during orthodontic tooth movement in mice.</a> Angle Orthodontist. 79 (5), 835-841 (2009).</li>
<li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+anti-c-Fms+antibody+inhibits+orthodontic+tooth+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">An anti-c-Fms antibody inhibits orthodontic tooth movement.</a> Journal of Dental Research. 87 (4), 396-400 (2008).</li>
<li>Bettina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M-CSF+Mediates+Host+Defense+during+Bacterial+Pneumonia+by+Promoting+the+Survival+of+Lung+and+Liver+Mononuclear+Phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">M-CSF Mediates Host Defense during Bacterial Pneumonia by Promoting the Survival of Lung and Liver Mononuclear Phagocytes.</a> Journal of Immunology. 196 (12), 5047-5055 (2016).</li>
<li>Dougall, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RANK+is+essential+for+osteoclast+and+lymph+node+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Develpoment%22%5BJournal%5D)">RANK is essential for osteoclast and lymph node development.</a> Genes & Develpoment. 13 (18), 2412-2424 (1999).</li>
<li>Wiktor-Jedrzejczak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+absence+of+colony-stimulating+factor+1+in+the+macrophage-deficient+osteopetrotic+%28op%2Fop%29+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Total absence of colony-stimulating factor 1 in the macrophage-deficient osteopetrotic (op/op) mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (12), 4828-4832 (1990).</li>
<li>Yang, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+macrophage+colony-stimulating+factor+in+ankylosing+spondylitis+and+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">Increased expression of macrophage colony-stimulating factor in ankylosing spondylitis and rheumatoid arthritis.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 65 (12), 1671-1672 (2006).</li>
<li>Takei, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+macrophage-colony+stimulating+factor+levels+in+synovial+fluid+of+loose+artificial+hip+joints%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">High macrophage-colony stimulating factor levels in synovial fluid of loose artificial hip joints.</a> The Journal of Rheumatology. 27 (4), 894-899 (2000).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 연구에서 우리는 RANKL 유도 osteoclast 형성, TNF-α 유도 osteoclast 형성과 M CSF 유도 osteoclast 전조 확산에 안티-c-fms 항 체의 효과 조사. 우리는 안티-c-fms RANKL 유도 osteoclast 형성, TNF-α 유도 osteoclast 형성과 osteoclast 선구자의 M CSF 유도 확산 중 osteoclastogenesis의 억제에 대 한 항 체의 효과적인 금액은 다른 것을 발견.
RANKL 중재 osteoclastogenesis M-CSF 생체 외에서, 존재 하 고 순위 null 마우스 경험 심한 osteopetrosis15, 이렇게 RANKL은 osteoclastogenesis에 대 한 의무 cytokine 있으며 개발 osteoclasts의 실패는 뼈 항상 성에 중요 한 규제 역할입니다. 따라서, RANKL 유도 osteoclast 형성을 제어할 수 있습...

Osteoclasts는 고도로 전문화 된 세포, 그리고 그들은 여러 osteoclast 선구자의 융합을 통해 조 혈 줄기 세포에서 분화. 그들은 건강 한 뼈에 필수적인 고 류 마티스 관절염, 치 주 질환1등 염증 성 osteolytic 질병와 관련 된 pathologic 뼈 재흡수에 기여.
Osteoclastogenesis 및 osteoclast 함수는 두 가지 주요 요인;에 의해 중재 (M-CSF) 비율과 핵 요인 kappa B ligand (RANKL)의 수용 체 활성을 자극 하는 대 식 세포 식민지. M-CSF와 RANKL osteoclast 차별화2중요 하다. 골 수 세포를 체 외에서 osteoclast 형성을 유도 하기 위해 표시 되었습니다 다른 요인은 종양 괴 사 요인 알파 (TNF-α)3,,45이다. TNF-α 중재 osteoclast 형성 osteolysis6류 마치 스 성 관절염, 치 주 질환7, 폐 경 후 골다공증8등 파괴적인 뼈 질환에 대 한 중요 한 표시 되었습니다.
C-fms M-CSF의 막 수용 체 이며, 그것의 활동을 중재 한다. C-fms의 역할은 잘 문서화는 문학에는 c-fms (안티-c-fms 항 체)에 대 한 항 체의 완전히 체포 관절염 모델에서 osteoclastogenesis로 TNF-α에 유도 하면서 뼈 아픕니다 시연 되었다 osteoclastogenesis 먼 염증이 관절에서 여전히 강력한9했다. 안티-c-fms 항 체의 저해 osteoclast 형성과 뼈 재흡수 lipopolysaccharide (LPS) 마우스 calvariae10 도에서 LPS 유발 염 모델11. 에 의해 유도 된 또한, 안티-c-fms 항 체 억제 교정 치아 운동으로 교정 치아 운동12, 동안 기계적 스트레스 유발 루트 재흡수와 교정 치아 운동13와 관련 된 뼈 재흡수.
M-CSF 호스트 면역 반응에 필수적인 다른 기능을 보고 되었습니다. 세균성 폐 렴으로 op/op 생쥐에서 M-CSF의 부재는 세균성 짐과 간장 괴 사14간 세균성 보급의 증가 이어질. 따라서, M-CSF 감염 으로부터 보호에서 면역 반응에 대 한 중요 하다.
이 연구에서는 M-CSF와 RANKL 또는 TNF-α에 안티-c-fms 항 체의 효과 유도 osteoclast 형성 체 외 osteoclast 선구자의 확산을 유도 하는 M-CSF 보여 줍니다. 이 프로토콜이 보여줍니다 murine 골 수 세포의 긴 뼈, 골 수 세포 (BMM) osteoclast 선구자로 간주 되는 생성 하 고 두 多 osteoclasts에 BMM의 차별화를 유도 단계에서 방법; RANKL 또는 TNF-α입니다. 프로토콜은 또한 안티-c-fms 항 체를 사용 하 여 두 방법에 osteoclastogenesis의 검거를 비교 합니다.
프로세스는 골은 추출 이후 osteoclast 선구자를 생성 하는 데 사용 약물 테스트 등 여러 다운스트림 응용 프로그램에 사용 될 수 있는 순수한 osteoclast 문화의 대량 생산에 안정적입니다. RANKL 또는 TNF-α 유도이 프로토콜에서 osteoclastogenesis의 사용 구분 osteoclastogenesis physiologic 프로세스 (RANKL)로 osteoclastogenesis에서 프로세스로 pathologic (TNF-α), 차례 차례로 두 대체 절차 안내를 제공 하 어떤 결정 하나 다운스트림 응용 프로그램에 사용 될 시 약의 관점에서 우수한입니다. 이 프로토콜은 또한 우리가 뼈 재흡수 및 osteolytic 질병에 관련 된 최신 연구에 대 한 안전 하 게 사용할 수 있는 안티-c-fms 항 체의 적당 한 농도 확인할 수 있는 메서드를 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>항-c-Fms 항체</td><td></td><td></td><td>AFS98, 쥐 단클론, 항무린, c-Fms 항체(IgG2a)</td></tr><tr><td>TNF-&알파;</td><td></td><td></td><td>재조합 쥐 TNF-&알파; 우리 실험실에서 준비. TNF-&알파; RT-PCR에 의해 클로닝된 cDNA 단편을 pGEX-6P-I(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)로 클로닝하여 GST-융합 단백질을 생성했습니다. GST-TNF-&알파; 대장균 BL21 세포 세포(Stratagene, La Jolla, CA)에서 발현되었습니다. 세포는 비변성 조건 및 GST-TNF-알파 하에서 용해되었습니다. 글루타티온-세파로스(glutathione-Sepharose) 컬럼을 통해 정제하였다. GST는 제조업체에 의해 PreScission Protease(Amersham Biosciences)에 의해 절단되었습니다. 의 지시를 내리고 글루타티온-세파로스 컬럼에 의해 제거하였다.</td></tr><tr><td>RANKL</td><td>PEPROTECH</td><td>315-11</td><td>재조합 쥐 sRANK 리간드, 출처: E. coli</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td></td><td></td><td>재조합 인간 M-CSF. CMG14&ndash의 1/10 권; 5x106&nbsp의 12 세포주 배양 상등액; 10cm 현탁 배양 접시에 있는 세포.</td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Wako</td><td></td><td>with L-Glutamine and phenol red</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Biowest</td><td>s1820-500</td><td>Fetal Bovine Serum French Origin</td></tr><tr><td>Culture dish</td><td>Corning</td><td></td><td>100 mm x 20 mm 스타일 접시</td></tr><tr><td>96-웰 플레이트</td><td>Thermofischer Scientific</td><td></td><td>Nun clon Delta surface</td></tr><tr><td>Cell counting kit-8</td><td>Dojindo, Kumamoto, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로플레이트 리더</td><td>Sunrise REMOTE; Tekan Japan, 가와사키, 일본</td><td></td><td></td></tr><tr><td>셀 스트레이너</td><td>코닝</td><td></td><td>40 &mu; m 나일론</td></tr><tr><td>원심분리기 튜브</td><td>Corning</td><td></td><td>50mL CentriStar 캡</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Wako</td><td></td><td>폴리옥시에틸렌 (10) 옥티페닐 에테르</td></tr></tbody></table>

osteoclast 형성과 생체 외에서 osteoclast 선구자의 확산에 안티-c-fms 항 체의 효과

Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro

뼈는 복잡 한 프로세스 이며 그것은 증 착과 재흡수의 기간을 포함 한다. 뼈 재흡수는 뼈는에 의해 분해 osteoclasts 다른 자극에 응답에서 하는 프로세스입니다. Osteoclast 선구자 多 osteoclasts 대 식 세포 콜로 니 계수 (M-CSF) 및 핵 요인 Kappa B ligand (RANKL)의 수용 체 활성 자극에 대 한 응답으로 구분 합니다. Pathologic 조건 cytokine 프로필은 다른 염증 성 cytokines의 혼합물을 포함 한다. 종양 괴 사 요인 알파 (TNF-α) 염증 osteolysis와 관련 된 분야에서 다량에서 발견 되는 가장 중요 한 cytokines의 하나입니다. 이 프로토콜의 목적은는 murine 골 생성 M-CSF RANKL 및 안티-c-fms 항 체, 수용 체의 복용량을 증가 하 여 이후 저해 될 것입니다 TNF-α와 유도 통해 osteoclasts 하 격리 된 방법을 제공 하 M-CSF에 대 한. 이 실험 염증 뼈 재흡수의 질병 항 체 안티-c-fms의 치료 가치를 강조 한다.

이 프로토콜의 목적은 RANKL 또는 TNF-α, 존재 osteoclast 형성에 안티-c-fms 항 체의 효과 평가 하 고 osteoclast 선구자 확산에 M-CSF의 효과 결정 하. 이 프로토콜에서 우리는 순수 osteoclast 문화의 대량 생성 됩니다 신뢰할 수 있는 프로세스 제공. 우리는 또한 다른 문화 조건 osteoclast 형성 억제에 대 한 안티-c-fms 항 체 적당 한 농도 테스트 하는 방법 제공.
M에서 osteoclast 형성-CSF + RANKL 문화 안티-c-fms 항 체를 그림 1에 표시 됩니다. 1, 10 ng/mL 안티-c-fms 항 체, osteoclasts 제어 (0 ng/mL)에 비해 수가 크게 감소 했다. 100에서 1000 ng 안티-c-fms 항 체, osteocla...

이 프로토콜 포함 murine 긴 뼈와 골 절연, 골 수 세포를 생성 하 고 osteoclasts 대 식 세포 콜로 니 계수 (M-CSF) 및 핵 요인 Kappa B ligand (RANKL)의 수용 체 활성을 자극을 사용 하 여 생산의 해 부 또는 종양 괴 사 요인 알파 (TNF-α) 그리고 안티-c-fms 항 체, M-CSF 수용 체에 의해 그들의 체포.

Osteoclast 형성과 생체 외에서 Osteoclast 선구자의 확산에 안티-c-fms 항 체의 효과

Bone remodeling is a complex process and it involves periods of deposition and resorption. Bone resorption is a process by which bone is broken down by ...

이 실험은 류마티스 관절염 및 치주염과 같은 염증성 뼈 붕괴 의 질병에 있는 항 c-fms 항체의 치료 가치를 강조합니다. 골수가 추출되어 골세포 전구체를 생성하는 데 사용되는 프로세스는 여러 다운스트림 응용 프로그램에서 사용할 수 있는 다량의 순수 한 골세포를 생성합니다. 이 프로토콜은 RANKL 리간드 또는 TNF 알파를 사용하여 두 가지 대체 골형성 을 제공합니다.그 외에도, 이 방법은 항 c-fms 항체가 골세포 발생에 미치는 영향에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 절차의 시각적 데모는 해부 및 다량의 골수 세포를 얻는 과정에 연구원을 친숙시게합니다. 용기의 크기에 따라 약 50 밀리리터의 알파 MEM이 있는 수집 용기역할을 하는 접시를 채우기 시작하고 얼음 위에 놓습니다.핀을 사용하여 안락사 된 마우스의 손바닥과 발을 관통하여 supine 위치에 고정하고 70 %의 에탄올로 철저히 스프레이하십시오. 멸균 수술 가위와 핀셋을 사용하여 엉덩이 수준에서 피부 절개를하고 발까지 확장하여 근육을 노출시십시오. 사두근 근육을 부착하는 힘줄을 찾아 잘라냅니다.근육을 껍질을 벗기고 엉덩이 수준에서 자른다. 그런 다음 뼈에 햄스트링 근육을 부착하는 힘줄을 찾습니다. 뼈를 드러내는 근육을 벗겨내고, 햄스트링을 부착에서 풀어 뼈로 자르지 않도록 하십시오.대퇴골의 머리와 공동 공간 사이에 가위를 배치합니다. 대퇴골을 풀어주지만 뼈를 그대로 유지하면 골수를 노출시킬 위험 없이 뼈를 분리할 수 있습니다. 비슷한 방식으로 경골에 부착 된 근육을 잘라.그런 다음 오염을 피하기 위해 뼈를 그대로 유지하면서 발목 관절의 부착에서 경골을 잘라냅니다. 가위 블레이드와 실험실 물티슈를 사용하여 대퇴골과 경골에서 남은 연조직을 긁어 내고 얼음 위에 알파 MEM을 놓아 준비된 접시에 놓습니다. 해부는 오염을 최소화하기 위해 신중하게 수행해야합니다.그래서 철저한 연조직 제거와 뼈 국소화가 중요합니다. 알파 MEM으로 30 게이지 바늘 주사기를 채웁니다. 경골과 대퇴골을 무릎 관절에서 분리하고 가위를 사용하여 양쪽에서 긴 뼈의 끝을 잘라냅니다.핀셋을 사용하여 샤프트에서 뼈를 잡습니다. 골수 공간에 바늘을 삽입하여 골수의 함량을 6센티미터 배양 접시에 천천히 씻어 내고 모든 뼈를 반복합니다. 뼈는 모든 골수 함량의 추출을 나타내는 흰색으로 바뀝니다.40 마이크로미터 나일론 세포 스트레이너를 사용하여 골수 추출물을 50밀리리터 원추형 원심분리기 튜브로 변형시려면. 튜브를 300배 G로 5분간 원심분리합니다. 상부체를 폐기합니다.세척하려면 펠릿에 알파 MEM 5 밀리리터를 추가합니다. 세포를 분리하고 원심분리기를 분리하고 총 2회 세척을 반복합니다. 원고에 설명된 바와 같이 이러한 고립된 세포를 계산한 후, 10센티미터 배양 접시에 10 밀리리터 당 1,000만 개의 세포를 시드하고 세포에 M-CSF를 추가한다.3일 동안 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다. 3 일 후에 매체를 제거하고, 비 부착 세포를 제거하기 위해 PBS의 10 밀리리터로 두 번 격렬하게 세포를 씻는다. 실온 0.02%의 트립신-EDTA 및 PBS5밀리리터를 추가하고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 5분간 배양합니다.세포를 분리하기 위해 셀을 철저히 피펫합니다. 현미경으로 배양을 관찰하여 세포가 분리되어 둥근 상태로 표시되고 미디어에 떠 있는 것처럼 보이게 하십시오. 세포가 분리되면 알파 MEM의 5 밀리리터를 추가하여 반응을 비활성화합니다.50 밀리리터 원모 관과 원심분리기는 5분 동안 300배 G로 세포를 수집합니다. 상체를 폐기한 후 알파 MEM 5밀리리터로 세척하고 원심분리기를 300회 G로 5분간 다시 세척합니다. 알파 MEM의 10 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다.10센티미터 배양 접시에 10 밀리리터 당 1백만 개의 세포를 시드하고 M-CSF를 추가합니다. 3일 동안 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다. BmM의 생성 도중 이전에 했던 것처럼 3 일 후에 골세포 전구체로 BMM을 나타내는 부착된 세포를 수확하십시오.잘 당 96 웰 플레이트에서 알파 MEM의 200 마이크로 리터 당 50, 000 세포에서 BmM을 시드. 각 웰에 원하는 자극을 추가합니다. 그런 다음 밀리리터당 100 나노그램의 최종 농도를 위해 M-CSF를 추가합니다.각 웰에 안티-c-fms 항체를 추가합니다. 4일 동안 매일 미디어를 변경하면서 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 원고에 설명된 대로 염색 및 에세이를 진행합니다.항-c-fms 항체를 가진 M-CSF 및 RANKL 처리 배양에서 의 골세포 형성을 평가하였다. 101, 밀리리터 안티-c-fms 항체당 000 나노그램으로, 대조군과 비교하여 골세포 수의 현저한 감소가 관찰되었다. 반면, 밀리리터 안티-c-fms 항체당 10 나노그램 중 1개씩은 현저한 감소는 없었다.이어서, 항-c-fm항체를 통해 M-CSF 및 TNF 알파 처리 배양에서 의골세포 형성을 평가하였다. 밀리리터 안티-c-fms 항체당 10, 100, 1, 000 나노그램으로, 밀리리터당 1나노그램에서 현저한 감소와 함께 대조군과 비교하여 골세포 수가 현저한 감소가 관찰되었다. 그리고 밀리리터 안티-c-fms 항체당 1, 10, 100 나노그램을 가진 M-CSF 배양, 대조군에 비해 골세포 전구체의 수는 현저한 감소는 없었다.그러나, 밀리리터당 1, 000 나노그램에서, 골세포 전구체의 수가 현저히 감소하여 밀리리터당 1, 000 나노그램의 농도가 골세포 전구체의 증식을 현저히 억제하는 데 필요하다는 것을 나타낸다. 뼈를 그대로 유지하면서 결합을 해제하여 오염 가능성을 최소화하십시오.

effect-anti-c-fms-antibody-on-osteoclast-formation-proliferation

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오에서는 파골세포 전구세포의 파골세포 형성 과정인 파골세포 형성에 대한 다양한 항-c-fms 항체 농도의 효과를 보여줍니다.

생쥐 골수 세포의 골수 형성에 대한 Anti C-fms 항체의 효과시험관 내

전구세포의 파골세포로의 분화는 사이토카인과 성장인자에 의해 조절됩니다. 여기에서는 사이토카인이 파골세포형성에 미치는 영향을 연구하는 방법으로서 in vivo에서 파골세포를 파골세포로 분화하기 위한 새로운 유전자 전달 기술과 전구세포를 in vitro에서 파골세포로 분화하기 위한 세포 배양 프로토콜에 대해 설명합니다.

소설 생체 유전자 전달 기술과 시험관 셀 기반 분석 실험

파골 세포는 신체의 주요 뼈 재 흡수 세포이다. 많은 수의 파골 세포를 분리 할 수​​있는 능력은 파골 세포 생물학의 이해에 상당한 발전을 가져왔다. 이 프로토콜에서는 배양 및 in vitro에서 파골 세포 활성을 정량화, 단리하는 방법을 설명한다.

마우스 골수에서 파골 세포의 유도

노치 신호는 세포 간의 직접 접촉에 의존하는 셀룰러 통신의 한 형태입니다. 체외에서 Notch 신호를 적절하게 유도하려면 Notch 리간드를 고정된 상태의 세포에 제공해야 합니다. 이 프로토콜은 마우스 파골세포 전구체에서 Notch 신호의 체외 자극 방법을 설명합니다.

마우스 파골 세포 전구체의 노치 신호 전달의 자극

이 원고 osteoclast 형성에서 복잡 한 1 rapamycin의 포유류/기계적 대상의 역할을 연구 하 고 마우스 골 수에서 분리 및 문화 osteoclasts에 생체 외에서 프로토콜을 설명 합니다.

RANKL 기반 Osteoclast 문화 분석 결과의 마우스 골 수 mTORC1 Osteoclast 형성에의 역할을 조사 하

파 골 세포는 조 혈 간세포의 대 식 세포 혈통에서 유래한 조직 특유의 대 식 세포 폴 리 에틸렌 이다. 이 프로토콜은 기존의 방법에서 발견 되는 사고의 위험을 줄이면서 많은 양의 파 골 세포를 얻을 수 있도록 골 수 셀을 분리 하는 방법을 설명 합니다.

쥐 골 골에서의 파 골 세포 전 구체의 분리, 정제 및 분화

여기에서, 우리는 인산칼슘 코팅 세포 배양 플레이트를 이용한 재흡수 구덩이 분석을 위한 간단하고 효과적인 분석 절차를 제시한다.

시험관 내에서 파골세포 재흡수를 시각화하고 정량화하는 간단한 구덩이 분석 프로토콜

파골세포는 신체의 주요 뼈 흡수 세포입니다. 이 프로토콜은 인간 말초 혈액 단핵구로부터 파골세포의 시험관내 분화를 위한 신뢰할 수 있는 방법을 설명합니다. 이 방법은 항상성 및 질병에서 파골세포 생물학을 더 깊이 이해하는 데 중요한 도구로 사용될 수 있습니다.

기능성 파골세포와 인간 말초 혈액 CD14+ 단핵구의 분화

이 문서는 8 자 챔버 슬라이드 내에서 성장 세균 biofilm의 형성과 시각화를위한 절차를...

8 잘 회의소 슬라이드에서 체외의 Biofilm 형성에

제시 방법은 절연 쥐 cardiomyocytes의 휴대폰 단축하고 세포 내 칼슘 과도에 절연 환자의 면역 글로불린의 영향을 분석하여, 관계없이 특정 항원의, 확장 성 심근증 환자의 혈장에 기능을 효과적으로 cardiotropic autoantibodies를 감지 할 수있는 방법을 제공합니다.

절연 Cardiomyocytes의 세포 기능에 대한 항체 효과 측정

배우세요 생쥐 장골에서 골수를 분리하여 대식세포와 파골세포를 생성하는 방법을. Anti-c-fms 항체가 파골세포 형성에 미치는 영향을 평가하여 염증성 골 질환 치료 가능성을 확인합니다.

Osteoclast 형성과 생체 외에서 Osteoclast 선구자의 확산에 안티-c-fms 항 체의 효과

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