Name: Falcarindiol 인간 중간 엽 줄기 세포에 의해 포함 된 새로운 지질 코팅 나노 입자의 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: 학습하세요 지질 코팅 나노입자의 신속 주입법 제조 기술을 통해 falcarindiol을 캡슐화하고 인간 중간 엽 줄기 세포에서 세포 흡수를 모니터링하는 방법을. 이 기술은 암 치료를 위한 안정적인 약물 전달 시스템을 제공합니다.

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저자는 인간 중간 엽 줄기 세포에 대 한 박사 Moustapha Kassem (덴마크, 오 덴 세 대학 병원) 감사합니다. 저자는 덴마크 의료 Bioimaging 센터 그들의 현미경에 대 한 액세스를 감사합니다. 저자는 칼 스 버그와 Villum 기초를 (E.A.C.)을 재정 지원에 대 한 감사합니다. 저자는 덴마크 국립 연구 재단에서 닐스 보어 교수 수상에 의해 제공 하는 금융 지원을 인정 합니다.

1. 나노 입자 합성 기술 변화는 급속 한 용 매에 의해
<ol><li>나노 입자 준비에 대 한 다음과 같은 설정: 블록 히터/샘플 집중, desiccator, 1 mL 유리 주사기, 12 mL 유리 유리병, 자력, 자석 벼룩 (15 m m x 4.5 m m, 원통 모양에서 디지털 분배 시스템 소계 [PTFE] 코팅) 유리 병, 및 회전 증발 기 내부.</li>
	<li>2.4 mL 섬광 유리병에 70 %EtOH 물 혼합물에 녹아 250 µ M falcarindiol 재고의 분배.</li>
	<li>증발 건조 falcarindiol를 대략 4 h에 대 한 샘플 집중 장치를 사용 하 여 액체 분수.<ol>
<li>삽입 섬광 유리병 블록 히터; 샘플 집중 집중 샘플 스테인리스 바늘을 사용 하 여 샘플을 통해 가스를 제공 합니다. 실내 온도;에서 증발 열을 사용 하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>건조 되 면, 위에서 언급 한 섬광 유리병으로 지질 코팅의 다음 구성 요소를 추가: 31.64 mm DSPC 16.3 µ L 클로 프롬 재고 솔루션, 17.82 mM DSPE 못 2000 클로 프롬 재고 솔루션의 3.4 µ L, 25mm 콜레스테롤 클로 프롬 주식의 24 µ L 솔루션, 그리고 4 mM DiI 클로 프롬 재고 솔루션의 6 µ L. 교차 오염을 방지 하는 각 구성 요소를 추가한 후 클로 프롬과 주사기를 청소. 주의: 즉시 용 매 증발 하 고 않는, 따라서, 농도 수정 있도록 지질을 포함 하는 튜브를 닫습니다. 증기 두건에서 작동 합니다. 참고: 클로 프롬 재고 솔루션의 농도가 달라질 수 있습니다, 화학 업체 또는 실험실에서 만든 희석에 따라.</li>
	<li>알루미늄 호 일 로부터 보호 하기 위해 DiI 빛 유리병을 감싸 줍니다. 밤새 껏 증발 하는 클로 프롬을 desiccator 샘플을 둡니다.</li>
	<li>Desiccated 샘플 DSPC, DSPE 나무 못 2000, 콜레스테롤, 및 0.43 m m, 0.05 m m, 0.5 m m, 0.02 m m의 DiI의 최종 농도 각각 주는 1.2 mL의 최종 볼륨을 절대 에탄올에 용 해. 이 솔루션은 유기 단계를 나타냅니다.</li>
	<li>12 mL 유리 약 병을가지고, 순화 된 물 9 mL와 함께 그것을 채울 그리고, 포함 하는 물 9 mL 유리병에 자석 벼룩을 추가. 500 rpm (그림 1)에서 교 반 자력에 유리병을 유지.</li>
	<li>분배 시스템을 1 mL 유리 주사기를 연결 하 고 어떤 오염 든 지 피하기 위하여 클로 프롬으로 그것을 청소. 이것으로, 천천히 유리 주사기에 클로 프롬 고 폐기물 수집 적어도 10 tiems에 수동으로 분배. 주의:이 증기 두건에서 수행 되어야 합니다.</li>
	<li>에탄올과 주사기 프라임. 못쓰게 된 용 매를 대체 뿐 아니라 모든 기포를 제거 합니다. 주의:이 증기 두건에서 수행 되어야 합니다.</li>
	<li>주사기를 사용 하 여, 유기 단계의 1 mL 발음.</li>
	<li>9 mL 워터 마크의 중간까지 유리 약 병에 주사기를 삽입 하 고 ( 그림 1에서 같이) 유리병 중간 꾸준한 유지.</li>
	<li>분배 시스템 (그림 2)에 디스 펜스 버튼을 누르면 사출 (833 µ L/s)의 선택 된 속도에 솔루션을 주입. 이 10% 에탄올이 포함 된 물에서 falcarindiol의 50 µ M 지질 코팅 나노의 10 mL를 생성합니다. 참고:이 사출 속도 좁은 입자 크기 분포를 얻는 최고의 입자를 달성 하기 위해 발견 되었습니다. 그것은 솔루션을 분배 하는 경우 주사기 센터, 꾸준히, 그리고 직선에서 인지 확인 중요 합니다.</li>
	<li>주입 직후는 교 반기에서 유리병을 제거 하 고 50 mL 둥근 바닥 플라스 크 (RBF)에 샘플을 전송 합니다.</li>
	<li>RBF 회전 증발 기를 부착 하 고 유기 용 매, 실내 온도에서 회전 증발 기를 사용 하 여 1 mL를 증발. 초과 거품 형성을 하지 마십시오. 참고:이 단계는 ~ 5 분을 걸릴 것 이다.</li>
	<li>나노 서 스 펜 션은 RBF에서 다른 12 mL 유리 유리병 전송. 볼륨 9 mL 인지 확인 합니다. 2 개의 12 mL 유리 튜브 (넣어 각 4.5 mL)에서 샘플을 분할.</li>
	<li>초순의 0.5 mL 튜브 중 하나 및 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 다른 유리병에 x 10의 0.5 mL를 추가 합니다. 입자 크기 측정에 대 한 각 샘플의 1 mL를 꺼내.</li>
</ol>2. 입자 크기 분석 DL 기술을 사용 하 여
참고: 크기 측정 입자 크기 분포를 결정 하는 DL 분석기를 사용 하 여 실행 되었다. 그것은 662.2의 파장에서 작동 하는 100 mW 레이저 장비 nm와 입사 각도를 90 ° 각도로 배치는 눈사태 포토 다이오드 발견자. 광선은 나노 입자에 의해 흩어져 고는 매칭에서 검색.
<ol><li>DLS 악기를 켜고 안정화 될 때까지 20 ° C에서 원하는 온도 설정.</li>
	<li>악기 매개 변수를 다음과 같이 설정: 데이터 수집 시간 = 4 s, 취득의 수 = 30, 자동 감쇠 기능에, = 및 자동 감쇠 시간 제한 = 0.</li>
	<li>나노 서 스 펜 션의 1 mL와 함께 플라스틱 베트를 측정 시작.</li>
	<li>용 매 사용 (물 또는 PBS)에 따라 측정 된 크기를 보고 합니다. 참고: PBS에서 측정 한 아이디어가 대략적인 매체에서 셀의 크기의 셀을 대우 할 때 이루어집니다. 세포 치료는 물에 용 해 하는 나노 입자와 함께 할 것입니다.</li>
	<li>합성 입자 집계에 대 한 확인 후 24 시간 측정을 반복 합니다.</li>
</ol>3. 세포 치료
<ol><li>최소 필수 매체 (MEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 페니실린/스, 5% CO2와 37 ° C에서 humified 챔버에 보충에서 hMSCs를 성장 한다. 주의: 3.1, 3.2, 3.3 단계에 대 한 살 균 층 류 두건에서 작동 합니다.</li>
	<li>#1.5 coverslips 이전 절대 EtOH 소독에 약 30%의 셀 밀도 얻기 위해 씨앗 약 50, 000 셀 6 잘 플레이트에 배치. 각 잘에서 3 mL의 최종 볼륨을 가지기 위해 메모리를 추가 합니다. 3.1 단계 에서처럼 동일한 조건 하에서 24 h에 대 한 품 어. 세포 치료 전에 24 h 씨입니다. 참고: 셀 나노 치료는 세포는 적절 한 합류에 있는지 확인 하기 전에 적어도 24 시간 시드는 긴요 하다.</li>
	<li>매체를 제거 하지 않고 추가 5 µ M.의 마지막 falcarindiol 농도 대 한 나노 솔루션의 3 µ L 3.1 단계 에서처럼 동일한 조건에서 24 시간에 대 한 품. 참고: 나노 입자 준비 입자 집계를 피하기 위해 세포 치료의 날에 실시 되었다.</li>
	<li>그 후, 치료의 24 시간 후 씻어 셀 2 x PBS, 실 온에서 10 분 동안 4% 포름알데히드에 그들을 수정 하 고 몇 개월 몇 군데 때까지 4 ° C에서 PBS에 보관. 주의:이 증기 두건에서 수행 되어야 합니다.<ol>
<li>또는, 고정, 4 ', 후 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 핵 얼룩 수행할 수 있습니다. 이 위해, 세포, 고정 후 permeabilize 그들 0.1% 트라이 톤 X-100 30 분 동안 그들을 씻어 PBS, 2 x 300 250 µ L로 얼룩 그리고 빛 으로부터 보호 5 분간 nM DAPI.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4입니다. 현미경
<ol><li>
형광 현미경 검사 법
	<ol>
<li>Widefield 형광 현미경 전자 곱한 CCD 카메라와 장비를 사용 하 여 이미지. NA 1.45 오일 목표 x 150 GFP lp로 채널을 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Confocal 현미경 검사 법
	<ol>
<li>Confocal 현미경 검사 법의 이미지, 나 1.4 석유 목표, 아르곤 레이저 x 63을 사용 하 여 (514 nm) DiI, 및 2 광자 레이저 (780 nm) DAPI, 세포에는 나노 입자의 이해를 확인에 대 한.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

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간단한 약물 전달에 대 한 지질 코팅 나노 날조를 위한 상세한 프로토콜, 용 매 이동의 재현, 빠르고 확장 가능한 급속 한 주입 방법 뒤27,28 되었고로이 문서에 제공 됩니다. falcarindiol에 적용. 수성 단계로 유기 단계의 주입 속도 조절 하 여, 코트 falcarindiol 코어를 적절 한 농도에서 코팅 지질을 사용 하 여 하위-100 nm 범위에 있는 입자를 성공적으로 얻을 수 있습니다. 혼자 falcarindiol 강 수에 대 한 난 류 혼합의 개입으로 인해 유발된 증가할수록 가능성 코팅 지질의 존재에 의해 통제 되었다. 이러한 지질 코팅 된 나노 입자의 구조 닮은 네이티브 500000 kDa ApoB100의 배제 및 입체 안정성에 대 한 추가 말뚝-지질 존재의 예외 저밀도 지 단백질). 이 수 동적 대상된 약물 전달 시스템 수 특히 소수 성 약물과 진단 자료18<...

지질 코팅 나노 암 치료1약물 전달 시스템으로 그들의 기능에 관한 관심 증가 보고 있다. 암은 바꾸 인된 지질 대사 재활2 와3에 콜레스테롤 증가 필요 있다. 그들은 LDLs1 overexpress 고 정상 세포 보다 더 많은 LDLs에서 암 환자의 LDL 수 내려4도 갈 수 있는 범위. LDL 이해 확산 및 유 방 암6내 습 결과로 공격적 고기5 촉진 합니다. LDL 수용 체 (LDLRs)의 전이성 잠재적인7의 예 후 지시자 이다. Ldl 콜레스테롤과 암 세포에 의해 그것의 이해에 의해 영감, 새로운 전략 이라고: 암의 음식 처럼 마약을 확인8. 따라서, 이러한 새로운 나노 약물 전달 설계8,,910 항 암 약물을 전달 하기 위한 메커니즘으로 자연 LDLs11 의 코어 및 지질 안정 된 디자인에 의해 고무 되 에 암 세포. 이 수동 배달 시스템을 대상으로 지원 특히, 캡슐화, 소수 성 약물, 구두 복용량 양식에서 일반적으로 제공 하지만 그래서 그들의 예상된 효능12제한 혈 류 약물의 작은 금액을 제공 합니다. 스텔스 리13, 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) 코팅 면역학 응답을 줄이는 데 도움이 됩니다 하 고 최적의 종양 통풍 관에 대 한 혈 류에서 순환은 의미에 의해 확장 향상 된 침투 및 보존 (EPR) 효과 14 , 그러나 15., 이외에, 일부 인스턴스, 순환에 있는 불안정과 시스템16에 바람직하지 않는 배급에 어떤 장애물 유지 이러한 나노 입자는 세포에 의해에서 촬영 방법과 어느 정도 이며 어떤 같은 미해결 그들의 세포내 운명입니다. 그것은 여기이 종이의 특정 소수 성 항 암 제 약물 falcarindiol, 공초점 레이저를 사용 하 여 epifluorescence 이미징 기술을 나노 통풍 관을 해결.
연구의 목표는 falcarindiol의 지질 코팅 된 나노 입자를 조작 하 고 hMSCs에 그들의 세포내 이해 연구. 따라서, 잠재적으로 안정화의 관리, 배달와 관련 된 도전을 극복 하 고 bioavailability 향상. 따라서이 항 암 약에 대 한 새로운 전달 시스템 평가. 이전에, falcarindiol는 되었습니다 관리 구두로 정화 높은 농도 falcarindiol 통해17음식 보충. 그러나,이 유망한 약을 제공 하는 더 체계적인된 접근 방법 위한 필요가 있다. 따라서, falcarindiol 나노 입자, 인지질 및 콜레스테롤 입자의 핵심 구성 정화 약으로 단층을 캡슐화 디자인 되었다. 용 매 변화, 급속 한 주입 방법으로 최근 개발한 Needham 외. 8이 연구에서 polyacetylene falcarindiol를 캡슐화 하는 데 사용 됩니다.
메서드를 사용 하면 이전 지질 나노 입자의 제조에 대 한 진단 이미징 에이전트18,19, 캡슐화 하 고 분자 (triolein)27 및 약물 (orlistat, niclosamide stearate) 테스트 사용 되었습니다8 ,,2728. 그것은 상대적으로 간단한 기술을 바로 분자와 함께 실시입니다. 그것은 극 지 용 매에 용 해 하는 매우 불용 성 소수 용액의 nanosized 입자, 그들의 중요 한 nucleation (~ 20 nm 직경)의 한계에 형성. 솔벤트 exchange antisolvent의 과잉으로 유기 솔루션의 빠른 주입에 의해 수행 됩니다 (일반적으로, 1:9 유기에서 수성 단계: 수성 볼륨 비율)20,21.
나노 입자의 구성 디자인 여러 장점을 일으키 다. DSPC:Chol 구성 요소는 매우 빡 빡, 거의 불 침투성, 생체, 그리고 생 분해성 단층을 제공합니다. Reticuloendothelial 시스템 (간, 비장)과 단 식 시스템에 대 한 보호, 예방 하 여 어떤 글귀 둔화 못이 면역 체계에 의해 opsonization에서 방패 역할 sterically 안정화 인터페이스를 제공 한다. 그들의 유지와 면역 시스템 저하 고 그러므로, 그들의 순환 혈액22에 하프 타임 증가. 그러면 그들은 병에 걸리는 사이트에 extravasate 때까지 순환 하는 입자 같은 종양, 혈관 시스템이 새, EPR 효과 입자의 수동 축적을 허용. 또한, 지질 코트 네의 중요 한 핵 차원27,28에서 코어를 트래핑에 의해 나노 입자의 크기에 더 나은 통제를가지고 있습니다. 지질 (은 아직이 프로젝트에 사용할 수 있는 대상, 펩타이드를 포함 하 여) 다양 한 표면 특성, 순수한 마약 코어 및 낮은 증가할수록22,,2728유도. 입자 크기 분석을 위해 사용 되는 방법은 DL, 동시에 많은 수의 입자의 크기를 측정 하는 연구를 허용 하는 기술입니다. 그러나,이 메서드는 나노 입자 monodispersed23없는 경우 더 큰 크기를 측정 편견 수 있습니다. 이 문제는 또한 지질 코트와 함께 평가 됩니다. 이러한 기본적인 디자인의 자세한 내용과 모든 특성의 정량화는 다른 간행물27,28에 부여 됩니다.
나노 입자에 약물은 falcarindiol, 식이 polyacetylene 미나리과 가족에서 식물에서 발견. 그것은 건강 증진 효과, 항균 효과, 항 염증 성 활동과 암 세포 라인의 다양 한 범위에 대 한 세포 독성을 포함 하 여 표시를 발견 되었습니다 지방 족 C17polyacetylenes 형식에서 2 차 대사 산물. 그것의 높은 반응성 mercapto 및 아미노 그룹24매우 반응 alkylating 에이전트 역할 다른 생체와 상호 작용 하는 기능에 관련 되어 있습니다. Falcarindiol 생물 학적 메커니즘은 여전히 알려진 콜론17,25, 종양 약 병의 수를 줄이기 위해 표시 되었습니다 이전. 그러나, 그것은 생체 COX1, NF-κB-2, 같은 상호 작용 및 그들의 종양 진행과 셀 확산 프로세스, 세포 주기, 바인딩과 그물 (응급실)을 체포로 이어지는 억제 cytokines, 스트레스, 생각 및 apoptosis 17,26 암 세포에서. Falcarindiol 제 잠재력 및 메커니즘 예 항 암 제 약물 현재 공부 되 고 있다 그리고 그것은 유망한 항 암 효과 보여주기 때문에이 연구에 사용 됩니다. 나노 입자의 세포질 통풍 관 hMSCs에서 테스트 하 고 epifluorescence 그리고 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 몇 군데. 이 세포 유형은 현미경에 이상적 그것의 큰 크기 때문에 선택 되었다.

<table><tbody><tr><td>12mL 스크류 넥 바이알(투명 유리, 15-425 나사, 66 X 18.5mm)</td><td>Microlab Aarhus A/S</td><td>ML 33154LP</td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>Greiner Bio One International GmbH</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>앱솔루트 에탄올</td><td>EMD Millipore (VWR)</td><td>EM8.18760.1000</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>Rathburn Chemicals Ltd.</td><td>RH1009</td><td></td></tr><tr><td>콜레스테롤</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>700000P</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Zeiss LSM510</td><td></td><td></td></tr><tr><td>커버 슬립 두께 #1.5</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co</td><td>117650</td><td></td></tr><tr><td>데시케이터</td><td>자체 구축</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DiI</td><td>Invitrogen</td><td>D282</td><td></td></tr><tr><td>DLS</td><td>Beckman Coulter</td><td>DelsaMAXpro 3167-DMP</td><td></td></tr><tr><td>DSPC (클로로포름 재고)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>850365C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DSPE PEG 2000 (클로로포름 주식)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>880120C</td><td></td></tr><tr><td>eVol XR</td><td>SGE 분석 과학, Trajan Scientific Australia Pty Ltd.</td><td>2910200</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>형광 마이크로스코프</td><td>Olymous IX81</td><td></td><td>수동 TIRF 및 Andor iXon EMCCD</td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>Panasonic&nbsp;</td><td>MCO-18AC</td><td></td></tr><tr><td>마그네틱 벼룩</td><td>VWR 화학 물질</td><td>15 x 4.5 mm</td><td>PTFE 코팅이 된 원통형</td></tr><tr><td>마그네틱 교반기</td><td>IKA</td><td>RT-10</td><td></td></tr><tr><td>최소 필수 매체</td><td>Gibco</td><td>32561-029</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 용 PBS 정제</td><td>VWR Chemicals</td><td>97062-732</td><td></td></tr><tr><td>펜 / strep</td><td>VWR Chemicals</td><td>97063-708</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충액 식염수 (PBS, pH 7.4)</td><td>Thermo Fisher</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>회전 증발기</td><td>Rotavapor, B&uuml; chi Labortechnik AG</td><td>R-210</td><td></td></tr><tr><td>샘플 집중 장치&nbsp;</td><td>스튜어트, 콜-파머 인스트루먼트 컴퍼니, LLC</td><td>SBHCONC/1</td><td></td></tr></tbody></table>

falcarindiol 인간 중간 엽 줄기 세포에 의해 포함 된 새로운 지질 코팅 나노 입자의

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

나노 암 치료를 위한 약물 전달 시스템에 대 한 관심 증가의 초점입니다. 지질 코팅 나노 구조와 크기에 의해 영감을 저밀도 지 단백질 (LDLs) 암 세포에, 콜레스테롤을 위한 증가 필요 때문에이 암에 항 암 제 약물을 전달 하기 위한 메커니즘으로 이용 되 셀입니다. 또한, 약물 화학에 따라 약물을 캡슐화 수 순환 vivo에서 동안 약물의 저하를 방지에 유리. 따라서,이 연구에서이 디자인은 사용 falcarindiol 저하에 대 한 그것의 화학 구조를 안정화 하 고 개선의 잠재적인 새로운 배달 시스템을 제공 하는 항 암 약 falcarindiol의 지질 코팅 된 나노 입자를 조작 하는 종양에 의해 통풍 관입니다. Falcarindiol 나노 입자의 정제 약 코어 캡슐화 인지질 및 콜레스테롤 단층으로 설계 되었다. 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), 콜레스테롤 (철), 및 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000 지질 단층 코팅에 의하여 이루어져 있다] (DSPE 못 2000)는 형광 함께 레이블 DiI (43:50:5:2의 어 금 니 비율). 나노 입자는 반대로 용 매 교환에 대 한 좋은 용 매에 의해 나노 입자를 침전 하는 빠르고 간단한 기법 급속 한 주입 방법을 사용 하 여 조작. 그것은 수성 단계로 나노 부품을 포함 하는 에탄올 솔루션의 급속 한 주사를 이루어져 있다. 형광 나노 입자의 크기는 74.1 ± 6.7 nm에서 동적 산란 (DL)을 사용 하 여 측정 됩니다. 나노 입자의 이해 인간 중간 엽 줄기 세포 (hMSCs)에서 테스트 하 고 형광 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 몇 군데. 나노 입자의 통풍 관은 안정적인 약물 전달 시스템 falcarindiol에 대 한 잠재력을 제안 하는 hMSCs에서 관찰 됩니다.

두 가지 유형의 나노 조작, 즉 순수한 falcarindiol 나노 입자와 지질 코팅 falcarindiol 나노 입자 했다. 지질과 콜레스테롤의 농도 다양 한 테스트 되었습니다. 표 1에서 보듯이 코팅된 나노 입자 물에서 형성 하 고 PBS에 측정 0.571의 증가할수록 인덱스 (PDI)와 71 ± 20.3 nm의 직경을 했다. 이러한 매개 변수는 DL 분석기에 측정 되었다. Falcarindiol는 실험에 사용 되 고 그래서 형광 염료, DiI, 등의 지질 코팅 나노가 했다 비슷한 크기, 즉 74.1 ± 6.7 nm; 그러나, 그들은 상대적으로 monodispersed 것을 발견 했다 고 0.182, PDI는 나노 입자의 크기 분포를 설명 하는 때문에, 작은 입자 크기 분포를 나타내는의 낮은 PDI를 했다. 일반적으로, 0.3 아래 PDI 제약으로 나노 입자를 제조 하는 경우 원하는.
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이 문서에서는 falcarindiol 지질 코팅 74 nm 나노 입자에 캡슐화를 설명합니다. 인간 줄기 세포 지질 작은 물방울에 의해 나노 입자의 세포질 통풍 관 그리고 confocal 형광 이미징에 의해 모니터링 됩니다. 나노 입자 용 매 변화, 급속 한 주입 방법으로 조작 하 고 그들의 크기는 동적 산란 기법으로 측정 된다.

Falcarindiol 인간 중간 엽 줄기 세포에 의해 포함 된 새로운 지질 코팅 나노 입자의

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...

신속한 주입 방법을 이용한 지질 코팅 나노입자의 제조는 암 치료를 위한 안정적인 약물 전달 시스템을 제공한다. 이 기술은 소수성 약물을 캡슐화하는 나노 입자 제조를위한 간단하고 빠르며 확장 가능하며 재현 가능한 기술입니다. 이 기술은 여러 질병 조건에서 효과적으로 사용될 수 있는 소화포빅 물질로부터 진단 및 치료 나노 입자를 제조하는 데 적용됩니다.이 제조 기술은 DLS와 함께 지질, 단백질 및 폴리머와 같은 소수성 물질의 핵 형성 및 성장을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 약물 물질의 물리적 화학적 특성을 아는 것은 나노 입자를 제작하기 전에 중요합니다. 또한 코팅 지질의 정확한 농도를 사용해야 합니다.이 방법의 시각적 데모는 제조 기술의 단순을 보여주고 세포에 나노 입자로 약물의 성공적인 전달을 표시하는 것이 중요합니다. 예방 조치는 클로로폼과 포름알데히드로 작업 할 때 취해야하며 연기 후드 아래에서 작업해야합니다. 시작하려면 250 마이크로몰라 팔카린디올 스톡 용액의 2.4 밀리리터를 신자극 바이알에 70% 에탄올로 용해시한다.시료 농축기를 사용하여, 건조 팔카린디올을 얻기 위해 약 4 시간 동안 액체 분획을 증발. 시료 농축기를 사용하여 실온에서 시료에 가스를 전달하여 시료를 농축합니다. 일단 건조되면, 연기 후드에 반짝임 유리병에 여기에 표시된 구성 요소를 추가, 교차 오염을 방지하기 위해 각 구성 요소를 추가 한 후 클로로 폼으로 주사기를 청소해야합니다.그런 다음 즉시 용매가 증발하지 않도록 지질을 포함하는 바이알을 닫고 농도를 수정합니다. 유리병을 알루미늄 호일로 감싸서 빛으로부터 DiI를 보호하고 시료를 건조기에서 하룻밤 동안 방치하여 클로로폼을 증발시보냅니다. 다음 날, 1.2 밀리리터의 최종 부피를 만들기 위해 절대 에탄올에 건조 된 샘플을 용해.이 솔루션은 유기 상을 나타냅니다. 12 밀리리터 유리 바이알을 가지고 정제 된 물의 9 밀리리터로 채웁니다. 그런 다음 9 밀리리터의 물을 포함하는 유리병에 자기 벼룩을 넣습니다.유리병을 자기 교반기 위에 놓고 500rpm에 저어줍니다. 다음으로 1밀리리터 유리 주사기를 디스펜싱 시스템에 부착하고 유리 주사기 안팎에서 클로로폼을 10회 이상 천천히 당깁니다. 클로로폼을 매번 폐수량에 분배합니다.클로로폼으로 주사기를 청소하면 오염을 방지할 수 있습니다. 이제 에탄올로 주사기를 프라임. 프라이밍은 기존 용매를 대체할 뿐만 아니라 기포를 제거합니다.주사기를 사용하여 유기 상1밀리리터를 흡인하고, 주사기를 유리 바이알에 삽입하여 9밀리리터 워터 마크의 중간까지 삽입합니다. 바이알 의 중간에 안정적으로 유지하고 디스펜싱 시스템의 디스펜스 버튼을 눌러 초당 833 마이크로 리터에서 용액을 주입하십시오. 이것은 10%에 탄올에 있는 falcarindiol의 50 개의 마이크로몰라 지질 코팅 나노 입자의 10 마이크로 리터를 생성합니다.이 사출 속도는 좁은 입자 크기 분포와 최고의 나노 입자를 달성하기 위해 발견되었습니다. 주입 하는 동안, 바늘중앙에 삽입 되어 있는지 확인 하는 것이 중요 하다, 안정적이 고 직선. 주입 직후, 교반기에서 유리병을 제거하고 샘플을 50 밀리리터 둥근 바닥 플라스크로 옮킵니다.플라스크를 회전 증발기로 공격하고 실온에서 유기 용매의 1 밀리리터를 증발시다. 과도한 거품 형성을 피하기 위해 주의하십시오. 플라스크에서 다른 12 밀리리터 유리 바이알로 나노 입자 현탁액을 전달합니다.부피가 9밀리리터인지 확인하고 샘플을 12밀리리터 유리 바이알 2개로 분할합니다. 그런 다음 바이알 중 하나에 초순수 수분 0.5 밀리리터를 추가하고 다른 유리병에 10X 인산염 완충식식염의 0.5 밀리리터를 추가합니다. 디지털 라이트 산란 기기를 켜고 안정될 때까지 원하는 온도를 섭씨 20도로 설정합니다.그런 다음 여기에 표시된 대로 계측기 매개 변수를 설정합니다. 플라스틱 큐벳을 나노입자 서스펜션 1밀리리터로 채우고 측정을 시작합니다. 사용된 용매에 따라 측정된 크기를 보고합니다.약 50, 000세포를 멸균1.5개의 커버 슬립을 6웰 플레이트에 배치하여 약 30%의 세포 밀도를 얻은 다음 각 웰에 3개의 밀리리터의 최종 부피를 갖기 위해 배양 배지를 첨가한다. 표준 배양 조건하에서 24시간 동안 세포를 배양한다. 다음 날, 5 마이크로 몰러의 최종 팔카린디올 농도에 대한 나노 입자 용액의 3 마이크로 리터를 추가합니다.그런 다음 세포를 인큐베이터로 24시간 동안 되돌려 보입니다. 24 시간 의 치료 후, PBS로 두 번 세포를 세척한 다음 실온에서 10 분 동안 4 %의 포름알데히드로 고정하십시오. 고정 후, 30 분 동안 0.1 % 트리톤 X-100으로 세포를 과미화하십시오.그런 다음 PBS로 두 번 씻고 빛으로부터 보호되는 300 나노 몰러 DAPI의 250 마이크로 리터로 얼룩지게합니다. PBS 한 방울을 사용하여 커버 슬립을 슬라이드에 놓습니다. 150x 주관적인 것으로 전환하고, 전자곱된 CCD 카메라를 장착한 광야 형광 현미경의 단계로 슬라이드를 전달한다.GFP-LP 채널을 사용하는 이미지 셀입니다. 또한, 1.4의 수치 조리개와 함께 63배 오일 목표를 사용하여 공초점 현미경 이미지를 사용하여 나노입자의 세포 내 섭취를 검증한다. 780 나노미터에서 2광자 레이저를 사용하여 514 나노미터 및 DAPI에서 아르곤 레이저를 사용하는 이미지 DiI.물에서 형성되고 PBS에서 측정된 팔카린디올의 코팅되지 않은 나노입자는 PD 지수 0.571로 높은 다각형성을 보였다. 이 값은 파티클 크기의 광범위하고 균일하지 않은 분포를 나타냅니다. 대조적으로, 이 비디오에서 제조된 팔카린디올의 지질 코팅 나노입자는 0.182의 다분산지수를 가진 74.1나노미터였으며, 입자 크기의 비교적 단분산 및 균일한 분포를 나타냈다.세포 내부의 나노 입자의 첫 번째 관찰로, 상피 현미경 이미지는 치료 24 시간 후에 획득되었다. 나노 입자는 흰색, 밝은 점으로 시각화되었으며, 나노 입자가 핵을 둘러싼 세포 내부에 위치했다는 가설이 될 수 있습니다. 팔카린디올 나노 입자가 세포에 들어갔다는 것을 확인하기 위해, 공초점 현미경 검사법은 또한 세포에 수행되었다.많은 수의 나노 입자가 여기에 표시되어 모든 세포에서 세포질에 흩어져 있습니다. 이러한 결과는 나노 입자가 팔카린디올에 대한 안정적인 약물 전달 시스템으로 작용한다는 것을 보여줍니다. 이 절차를 시도하는 동안, 적절한 혼합을 보장하기 위해, 중앙에, 안정적으로 시드를 유지, 오른쪽 주입 속도로 솔루션을 주입하는 것이 중요합니다.이 절차는 치료 나노 입자를 공식화하거나 암과 같은 다양한 질병 조건에서 사용될 수있는 진단 나노 입자를 공식화하기 위해 모든 소수성 약물에 사용할 수 있습니다. 이 기술은 나노 입자가 세포에 의해 채택되는 메커니즘에 더 많은 연구를 가능하게, 뿐만 아니라 그것의 살아있는 세포 화상 진찰 및 약의 항암 효과 공부에.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

프레 젠 테이션의 목표는 MR 영상과 시각 수있는 연골의 결함에 매트릭스 관련 줄기 세포 이식을 생성하는 높은 재현성 방법을 입증하는 것입니다. 줄기 세포는 아가로 오스와 혼합 FDA 승인 Ferumoxides, 연골의 결함에 심어 및 7T MR 스캐너와 함께 몇 군데으로 표시됩니다.

Ferumoxides의 이식은 연골의 결함에 인간 Mesenchymal 줄기 세포로 표시

우리는 FDA 승인, superparamagnetic 철 산화물 (SPIO), ferumoxytol (Feraheme)와 줄기 세포를 라벨링 및 추적을위한 기술을 설명합니다. 시각화에 대한 자기 공명 (MR) 영상을 이용하여이 세포 이미징 기술은 환자의 성공 여부에 줄기 세포 engraftments의 장기 모니터링 및 진단을 위해 쉽게 액세스할 수 있습니다.

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유전자 전달 증진을 위한 간엽 줄기세포 막 감싸 나노소포 개발

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Falcarindiol 인간 중간 엽 줄기 세포에 의해 포함 된 새로운 지질 코팅 나노 입자의

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