تصوير [كنفوكل] الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل ونمط الاعتراف مستقبلات في الإصابة بفيروسات الرنا الشعور السلبي
يناير 26, 2019
يمكن التعرف عليه المنتجة أثناء النسخ المتماثل فيروسات الرنا الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل بنمط الاعتراف مستقبلات للحث استجابة المناعية فطرية. للبحث عن فيروسات الحمض النووي الريبي الشعور السلبي، التفاعل بين دسرنا ذات المستوى المنخفض وبرس مازال غير واضح. قمنا بتطوير أسلوب الفحص المجهري [كنفوكل] لتصور دسرنا أرينافيروس وبر في الخلايا الفردية.
التقليدية مزدوجة حبلا الحمض النووي الريبي الكشف عن مقولا عادة ليست حساسة بما يكفي للكشف عن مزدوجة حبلا الحمض النووي الريبي شكلت في عدوى فيروس الحمض النووي الريبي سلبية. ولذلك فإن التفاعل بين الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل ومستقبلات التعرف على نمط المضيف ظلت بعيدة المنال إلى حد كبير لهذه الفيروسات. الاستفادة من هذا البروتوكول ونحن قادرون على تصور وتوصيف التفاعل بين البروتين النووي الفيروسي، RNA مزدوج حبلا واستضافة PRR على مستوى خلية واحدة لفيروس الحمض النووي الريبي السلبي. هذا هو مقايسة متعددة التي تسمح للتلوين في وقت واحد من الحمض النووي الريبي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل واثنين من أهداف البروتين الفيروسي أو المضيف في الخلايا الفردية. على عكس RNA-FISH فحص هذه التقنية هي تسلسل الحمض النووي الريبي مستقلة ومتوافقة عادة مع الكشف عن الأجسام المضادة من أهداف البروتين. تبدأ 24 ساعة قبل العدوى عن طريق بذر 200، 000 الإنسان ظهار الرئة A549 الخلايا الظهارية على بولي د-ليسين غطاء زجاجي مغلفة زلات في لوحات 12-جيدا وزراعة لهم في 37
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تبحث هذه الدراسة في كيفية تعرف مستقبلات التعرف على الأنماط (PRRs) على الرنا مزدوج السلاسل (dsRNA) الذي يتم إنتاجه أثناء تضاعف الفيروسات الرناوية لتحفيز استجابة مناعية فطرية. وينصب التركيز على الفيروسات الرناوية ذات الاتجاه السالب، حيث لا يزال التفاعل بين مستويات منخفضة من dsRNA ومستقبلات PRRs غير مفهوم بشكل كافٍ. وقد تم تطوير طريقة باستخدام المجهر البؤري لتصوير dsRNA الخاص بالفيروسات الرملية (arenavirus) ومستقبلات PRRs في الخلايا الفردية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم المناعة
- علم الفيروسات
خلفية علمية
- يُعد الحمض النووي الريبوزي مزدوج السلسلة ناتجاً ثانوياً لتكاثر الفيروسات ذات الحمض النووي الريبوزي.
- تلعب مستقبلات التعرف على الأنماط دوراً محورياً في الاستجابة المناعية الفطرية.
- إن التفاعل بين dsRNA ومستقبلات PRRs في الفيروسات ذات الحمض النووي الريبوزي سالبة الاتجاه غير مفهوم بشكل كافٍ.
- يمكن أن يؤدي تصور dsRNA وPRRs إلى تعزيز فهم الآليات التي تستخدمها الفيروسات للإفلات المناعي.
الغرض من الدراسة
- توضيح التفاعل بين dsRNA ومستقبلات التعرف على الأنماط (PRRs) في الفيروسات ذات الرنا أحادي السلسلة سالب الاتجاه.
- تطوير طريقة لتصوير هذه التفاعلات في الخلايا الفردية.
- المساهمة في فهم الاستجابة المناعية الفطرية للفيروسات ذات الرنا.
الطرق المستخدمة
- المجهر البؤري (Confocal microscopy) لتصور dsRNA ومستقبلات التعرف على الأنماط (PRRs).
- المقايسات الخلوية لتقييم الاستجابة المناعية.
- تحليل مستويات dsRNA أثناء التضاعف الفيروسي.
- دراسات مقارنة مع فيروسات RNA مختلفة.
النتائج الرئيسية
- التصوير الناجح لـ dsRNA الخاص بفيروسات arena والـ PRRs في الخلايا الفردية.
- تحديد التفاعلات النوعية بين dsRNA وPRRs.
- فهم آليات الاستجابة المناعية التي يحفزها dsRNA.
- توضيح دور dsRNA في الإمراض الفيروسي.
الاستنتاجات
- تعد طريقة المجهر البؤري المطورة فعالة لدراسة التفاعلات بين dsRNA وPRR.
- قد يؤدي فهم هذه التفاعلات إلى استراتيجيات علاجية جديدة ضد الفيروسات ذات الحمض النووي الريبي (RNA viruses).
- يساهم هذا البحث في المجال الأوسع للمناعة الفيروسية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في الصناعة
إن تصوير الحمض النووي الريبوزي مزدوج السلسلة (dsRNA) منخفض الوفرة في عدوى الفيروسات ذات الحمض النووي الريبوزي أحادي السلسلة سالب الاتجاه يسد فجوة حرجة في فهم تنشيط المناعة الفطرية والهروب المناعي الفيروسي. وتدعم هذه القدرة التحقق من الأهداف وتقليل المخاطر الميكانيكية في اكتشاف مضادات الفيروسات من خلال تمكين الملاحظة المباشرة لارتباط مستقبلات التعرف على الأنماط (PRR) بالوسائط التكرارية الفيروسية. وتعزز هذه الطريقة الثقة التنبؤية في اختيار الأهداف في المراحل المبكرة لفيروسات arena-virus والممرضات ذات الصلة، مما يوجه تحديد أولويات المحافظ البحثية في برامج الممرضات ذات الاحتواء العالي.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استجواب الفرضيات العلاجية من خلال تصور تفاعلات dsRNA-PRR بدقة الخلية الواحدة في نماذج الفيروسات المسببة للأمراض.
- القيمة التشغيلية: توفر طريقة كشف حساسة وغير معتمدة على التسلسل، ومتوافقة مع صبغ البروتينات المتعددة لتوضيح المسارات.
- القيمة التنبؤية: تدعم تقليل المخاطر البيولوجية لأهداف PRR من خلال تأكيد ارتباط الربيطة في سياقات العدوى ذات الصلة.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: تولد قراءات كمية ومحددة مكانيًا للتوضع المشترك لـ dsRNA و PRR لغرض توحيد المقايسة.
- أهمية الفرز: تُجهز أنظمة بيولوجية مصادق عليها لعمليات فرز المركبات اللاحقة من خلال وضع مقاييس أساسية للتنشيط المناعي.
- فائدة المنصة: متوافقة مع الكشف القائم على الأجسام المضادة، مما يتيح إعادة الاستخدام عبر الأهداف الفيروسية وبروتينات المضيف في سير عمل التصوير.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- الاستمرارية الترجمية: يربط ملاحظات الاكتشاف بالتحقق قبل السريري من خلال رسم خريطة توزيع dsRNA وتجنيد PRR في الأنظمة ذات الصلة بالمرض.
- البصيرة الآلية: يوضح الديناميكيات المكانية والزمانية لإشارات المناعة الفطرية، مما يوجه عملية اختيار المؤشرات الحيوية لتعديل المسار.
- التقدم المعدل حسب المخاطر: يتيح اتخاذ قرارات المتابعة أو التوقف القائمة على البيانات، وذلك بناءً على التأكيد المرئي لارتباط الهدف في نماذج الإمراضية العالية.
تكامل مسار العمل وسير العمل
تندرج هذه الطريقة ضمن تسلسل عمليات الاكتشاف، بدءاً من اختبار فرضية الهدف، مروراً بتحديد المركبات الرائدة، وصولاً إلى التحقق قبل السريري، ولا سيما بالنسبة لمضادات الفيروسات المعدلة للمناعة التي تستهدف مسارات PRR.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات المتعلقة بآليات عمل محفزات أو مثبطات مستقبِلات التعرف على الأنماط (PRR) من خلال تصوير الـ dsRNA باعتباره الربيطة الداخلية في الخلايا المصابة.
- الفحص: تقدم مخرجات تصوير كمية وقابلة للتكرار تتيح مقارنة تأثيرات المركبات على التفاعلات بين الـ dsRNA وPRR.
- التحليلات: توفر قراءات فلورية متعددة (dsRNA، والبروتين الفيروسي، وPRR) للتحليل عالي المحتوى لحالات التنشيط المناعي.
- الأبحاث الانتقالية: تربط الملاحظات المختبرية (in vitro) بالاستمرارية قبل السريرية من خلال تأكيد تنشيط PRR في نماذج الخلايا الظهارية الرئوية الأولية أو المشتقة من الخلايا الجذعية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة تصوير معيارية قابلة للتطبيق على العديد من فيروسات RNA سالبة الاتجاه والأهداف المضيفة بما يتجاوز فيروسات الرنا (arenaviruses).
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة في التحقق من الهدف عن طريق تقليل الغموض الميكانيكي في التفاعلات بين PRR والرابط (ligand).
- القيمة التشغيلية: تعزز إمكانية تكرار المقايسة وقابليتها للتوسع من خلال بروتوكولات مجهرية بؤرية (confocal) موحدة وكشف حساس لـ dsRNA.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن جودة قرارات المضي قدماً أو التوقف (go/no-go) من خلال تقديم دليل بصري مباشر على تعديل المسار، مما يقلل من معدلات الفشل في المراحل المتأخرة.
- التأثير على المحفظة: تتيح ترتيب أولويات المرشحات المعدلة للمناعة بناءً على مخاطر مدروسة، وذلك استناداً إلى الارتباط المؤكد بالهدف في سياقات الفيروسات المسببة للأمراض.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في المجهر البؤري (confocal microscopy)، والتلوين المناعي الفلوري، وتقنيات علم الفيروسات المناسبة لمستوى السلامة البيولوجية.
- يعتمد على توفر أجسام مضادة عالية الحساسية لـ dsRNA (مثل النسيلة 9D5) وبنية تحتية متوافقة للتصوير الفلوري.
- يستلزم التقييس عبر المختبرات لضمان اتساق كمية إشارة dsRNA وتحليل التوضع المشترك (colocalization analysis).
- يجب مراعاة التباين في نماذج الخلايا (على سبيل المثال، A549 مقابل ظهارة الممرات الهوائية الأولية) في إنتاج dsRNA ومستويات تعبير PRR.
- تشمل القيود العملية احتمالية التفاعل المتقاطع للأجسام المضادة والحاجة إلى التحسين في بيئات الاحتواء العالي (BSL-3/BSL-4).
الأسئلة الشائعة حول الصيدلة الحيوية
Chapters in this video
0:04
Title
1:05
Preparation of A549 Cells and JUNV (Junn virus) Infection
2:09
Fixation and Immunostaining
5:10
Results: Distribution and Colocalization Between the Retinoic Acid Like Receptors RLRs (RIG-I and MDA-5) and dsRNA in JUNV-infected Cells
5:52
Conclusion
