Name: 효소와 항 원에 대 한 Nonrecombinant 디스플레이 시스템으로 포자 흡착 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: 배우세요 세균 포자를 이용한 비재조합 단백질 흡착 기법으로 점막 백신 및 생물촉매를 개발하는 방법입니다. 유전자 조작 없이 환경 안전성을 확보하며 효율적인 단백질 고정이 가능합니다.

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이 작품 "Finanziamento 디 검색 디 Ateneo" L. Baccigalupi, 프로젝트 제목에 의해 지원 되었다 "SP-레이: 세균성 포자 단백질 디스플레이 대 한 라이브 플랫폼으로".

1. 흡착 반응
<ol><li>2, 5, 및 10 µ g mRFP의 바인딩 버퍼, 50 m m 나트륨 구 연산 염, pH 4.0 (16.7 m m 구 연산 나트륨이 수화물; 33.3 m m 구 연산 산) 1 h 락 통 (그림 1)에 25 ° C에서의 200 µ L에 B. subtilis 야생-타입 순화 된 포자의 2 x 109 품 어 .</li>
	<li>펠 릿 (P2, P5, P10)과 (S2와 S5, S10) supernatants 충분치에 바인딩 혼합물 (13000 x g 10 분)을 원심. 3.2 단계에서 설명 하는 흡착의 효율성의 간접 평가 supernatants 저장 합니다.</li>
	<li>2 펠 릿을 세척 바인딩 버퍼 및 바인딩 100 µ L에서 버퍼링 및 다음 분석을 위해 그것을 사용 하 여 resuspend의 200 µ L x. 참고: 바인딩 반응이 우선적으로 단백질;의 전자 보다 낮은 pH 값에 발생 일반적으로 1.5 M 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), pH 4.0, 또는 50 m m 나트륨 구 연산 염, pH 4.0, 사용 됩니다.</li>
</ol>2. 직접 흡착 효율 평가
<ol><li>
표면 단백질 및 서쪽 오 점 분석의 추출
	<ol>
<li>MRFP 흡착 포자 물의 resuspension (P2, P5, 및 단계 1.3 P10)의 50 µ L 고 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) x 2의 50 µ L 추가-dithiothreitol (DTT) (0.1 M Tris HCl, pH 6.8; 2 %SDS, 0.1 M DTT) solubilize 포자 표면 단백질을.</li>
		<li>사용 하 여 무료, 순화 mRFP와 동일한 양의 포자는 하지 흡착 단백질에 긍정적이 고 부정적인 컨트롤로 각각의 추출 물.</li>
		<li>65 ° C에 외피의 45 분, 후 원심 (13000 x g 10 분)는 혼합물 및 분석 10 µ L의 추출 된 단백질 (표면에 뜨는) 서쪽 오 점 여는 단일 클로 널과 반대로 그의 항 체는 그의 인식 태그 mRFP ( 의 N 맨끝에 존재 그림 2A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
형광 현미경 관찰 참고: 형광 분리 단백질을 사용 하 여 면역 형광 분석을 수행, 그것은 지역화 하 여 형광 현미경 검사 법에 의해 흡착된 분자를 계량.<ol>
<li>1.3 단계에서 흡착된 포자 물의 resuspension의 5 µ L 고 95 µ L 1 x PBS, pH 4.0 ~ 106 포자 / µ L x 1를의 추가.</li>
		<li>현미경 슬라이드에 현 탁 액의 장소 5 µ L 이전 폴 리-l-리 신 30으로 치료 하는 coverslip로 커버 s, 형광 현미경으로 관찰 하 고.</li>
		<li>각 필드에 대 한 단계 대조 현미경 이미지 및 형광 현미경 이미지 (그림 2B)를 저장 합니다. 참고: 또는, 형광 포자 분석할 수 있습니다 cytofluorimetry에 의해. Resuspend 106 포자의 총 흡착 또는 아닙니다-1 x PBS, pH 4.0의 1 mL에 분리 단백질 흡착 및 분석 흐름 cytometer (그림 2C)를 사용 하 여 정지.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ImageJ를 사용 하 여 데이터 분석
	<ol>
<li>ImageJ 소프트웨어 (http://rsbweb.nih.gov/ij/) 및 모든 이미지는 8 비트 형식으로 다는 것을 확인 하는 검사와 형광 현미경 이미지를 열고 (이미지 | 유형 | 8 비트).</li>
		<li>필요한 경우 대비를 조정 (이미지 | 조정 | 밝기 대비) 고 규모는 이미지의 픽셀 인지 확인 합니다 (이미지 | 설정 규모).</li>
		<li>분석 메뉴에서 측정 설정선택 합니다. 영역, 통합 밀도및 의미 회색 값 이 선택 되었는지 확인 합니다.</li>
		<li>드로잉/선택 도구를 사용 하 여 관심의 포자 주위 선 그리기 (즉, 원형, 다각형, 자유형 또는) (그림 3).</li>
		<li>분석 메뉴에서 측정값 을 선택 (또는 cmd + M을누르십시오). 이 첫 번째 포자에 대 한 값의 스택 팝업 상자가 나타납니다 (그림 3).</li>
		<li>보기의 필드 측정을 선택에서 적어도 50 다른 포자에 대 한 이러한 두 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>(있는 아무 형광) 포자 없이 여러 영역을 선택 하 고 반복 측정; 이 배경에 있을 것입니다. 참고: 크기는 중요 하지 않습니다. 이러한 배경 형광 값 수동으로 백그라운드를 빼기에 사용 됩니다.</li>
		<li>결과 창에서 모든 데이터를 선택 하 고 스프레드시트에 결과 복사 합니다.</li>
		<li>통합 된 밀도 와 지역 선택 된 포자의 배경 형광 값의 평균을 계산 하 고 수식을 사용 하 여 수정 된 총 당 세포 형광 (CTCF)를 그들을 사용 하 여: CTCF 의미 통합 = 밀도-(평균 면적 평균 배경 형광 x). 참고: 또한 모든 포자 잘 분리 된 경우, 그것은 입자 분석, ImageJ의 명령 다음 함수를 사용 하 여 이미지 필드의 모든 포자를 분석할 수 있습니다. 하지 않도록 소프트웨어 읽고 특정 형광 또는 포자 집계, 입자의 크기는 pixelˆ2에서 설정 = 50-200 (그림 4).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 간접 흡착 효율 평가
<ol><li>순화 된 단백질에 대 한 직렬 희석을 준비 합니다.<ol>
<li>0.5 ng / µ L, 바인딩 버퍼를 사용 하 여의 최종 농도에 순화 mRFP의 250 µ L을 포함 하는 첫 번째 1.5 mL 튜브를 준비 합니다. 이 볼륨은 2 차선 로드 충분 합니다.</li>
		<li>6 이중 직렬 희석 250 µ L (최종 볼륨) 각각의 바인딩 버퍼를 사용 하 여 수행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>두 가지 직렬 희석 (S2와 S5, S10 단계 1.2에서에서) 흡착 반응의 언바운드 mRFP 분수를 포함 하는 표면에 뜨는 샘플에 대 한 준비.<ol>
<li>1.5 mL 튜브에 각 상쾌한의 100 µ L를 넣고 바인딩 버퍼의 100 µ L를 추가. 6 이중 직렬 희석 200 µ L (최종 볼륨) 각각의 바인딩 버퍼를 사용 하 여 수행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>크기 6 (희석 수) 점 x 5 (샘플 수)의 영역을 커버 하는 니트로 막 (0.45 μ m 컷오프), 9 cm x 10 cm를 잘라. 막 점 오 점 장치의 가스 켓의 가장자리를 넘어 확장 되지 한다.</li>
	<li>Prewet 막 점 오 점 장치에 놓습니다. 막과 근육 사이 갇혀 있는 공기 방울을 제거 합니다. 그 우물을 통해 이동에서 공기를 방지 하기 위해 테이프 또는 파라핀 영화과 기구의 미사용된 부분을 커버.</li>
	<li>점 오 점 장치 제조 업체에 의해 설명 된 대로 조립 한다.</li>
	<li>조립 하는 동안 진공을 사용 하는 경우 항 원의 유니폼 바인딩 및 후광 또는 약한 검출 신호를 방지를 잘 당 1 x PBS의 100 µ L로 막 rehydrate.</li>
	<li>부드럽게 진공에 의해 우물에서 버퍼를 제거 합니다. 최대한 빨리 버퍼 솔루션 모든 우물에서 빼낸, 진공 펌프를 중지 하 고 그것을 분리.</li>
	<li>두 개의 가장 외부 차선에서 표준 중간 (그림 5)에서 샘플을 로드 합니다. 각 희석의 100 µ L로 적절 한 우물을 채우십시오. 동일한 볼륨 각 잘 사용 하는 모든 샘플 우물의 균질 여과 해야 합니다.</li>
	<li>2 분 동안 진공 펌프를 켭니다, 그리고 그것을 중지 하 고, 샘플 중력 흐름에 의해 멤브레인을 통해 필터링 할 수 있도록.</li>
	<li>100 µ L의 PBS와 세척 버퍼 후 또 다른 5 분 동안 실행 하는 진공 펌프는 완전히 배수 장치에서 x 1으로 모든 웰 스 워시.</li>
	<li>에 진공, 나사, 하 고 조심 스럽게 점 오 점 장치를 엽니다.</li>
	<li>진공, 멤브레인, 걸릴 끄고 서쪽 오 점 프로토콜에 따라 처리.</li>
	<li>ImageJ 같은 적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 필터의 densitometric 분석을 수행 합니다.<ol>
<li>같은 영역의 원이 그들을 요약 하 고 분석/측정 명령을 사용 하 여 각 도트의 통합된 밀도 측정 합니다.</li>
		<li>빈 영역에 동그라미를 그리기 및 통합된의 밀도 측정 또는 과정/빼기 배경 명령을 사용 하 여 이미지의 배경 보정을 확인 합니다.</li>
		<li>로드 된 단백질의 양을 표준 점의 통합된 밀도 연관 하 고 교정 라인 (R2 값 보정 곡선 0.95 이상 이어야 한다).</li>
		<li>보정 곡선을 사용 하 여 각 샘플 점의 mRFP의 농도 추정.</li>
		<li>MRFP는 언바운드 분수에 남아의 농도 계산 합니다. 참고: 정확한 종료 점 오 점 기구 및, 따라서, 주제를 위해 균일 한 압력을 막 대각선 교차 체계에 따라 나사를 조여 고, 다음, 엽니다 나사를 조입니다 더 강하게 진공 펌프.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 포자 수집 및 재사용
<ol><li>흡착된 포자의 재활용에 대 한 정화 GH10 XA xylanase의 10 µ g 또는 정제 GH3 XT β-xylosidase, (그림 6A) 1.1-1.3 단계에서 설명한 대로 10 µ g 109 정화 포자 x 2.0의 두 흡착 반응을 수행 합니다.</li>
	<li>효소 흡착 포자를 포함 하는 알 약을 수집, (50 m m 나트륨 인산 버퍼 pH 6.5에서; 2.48689 g/L Na2HPO4, 4.88991 g/L NaH2포4), 효소 반응 분석 결과 대 한 최적의 버퍼의 50 µ L에서 resuspend 와 adsorbing GH10 XA 또는 GH3 XT 포자의 100 µ L 혼합물을 얻기 위해 함께 그들을 섞는다.</li>
	<li>기판 (5 mg/mL 4-O-methyl-d-glucuronod-xylan [MGX])을 추가 하 고 16 h 65 ° c.에 대해 수행 하는 효소 반응 하자</li>
	<li>(13000 x g에서 15 분)에 대 한 반응 혼합물을 원심 고 상쾌한 효소 반응 제품에 포함 된 저장 합니다.</li>
	<li>신선한 50 mM 나트륨 인산 버퍼 pH 6.5 새로운 기판 (MGX) (그림 6B) 존재의 100 µ L에 펠 릿을 resuspend. 참고: 개 이상의 효소를 Adsorb 아니에요 둘 다 함께 흡착 수 또는 하나에 의해 독립적으로. 후자의 가능성의 흡착 효율성과 반응에 필요한 각 효소의 화학 량 론 균형을 수 있도록 각 효소의 활동의 정량 분석을 촉진 한다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

이 포자 흡착 프로토콜은 매우 단순 하 고 간단. 반응이 반응 버퍼의 pH에 엄격 하 게 의존 하 고 흡착 효율은 산 성 pH 값 (pH 5.0 또는 더 낮은)에서 최적의. 중립 pH 조건에서 흡착 효율은 낮은, 그리고 알칼리 성 pH 값에서 흡착 하지 발생할 수 있습니다. 최적의 흡착 락 통에 1.5 mL 튜브 (또는 비슷한 비율을 유지)에 200 µ L의 볼륨을 사용 하 여 얻을 수 있습니다.
흡착이 매우 빡 빡 이며, 반응 버퍼의 동일한 pH buffer로 세척 흡착된 단백질의 어떤 버전을 발생 하지 않습니다. 알칼리 성 버퍼와 세척 최소화 될 수 있습니다 (일반적으로 미만의 1526) 흡착된 단백질의 릴리스.
단백질을 순화 하 고 해방의 여러 희석 분석 하 고 densitometric 분석 제대로 수행 점 blotting에 의해 흡착 효율의 간접 평가 안정적입니다. 분리 단백질의 ...

디스플레이 시스템 미생물의 표면에 생물 학적 활성 분자를 제시 하 고 다양 한 분야, 의료 및 환경 바이오를 산업에서 응용 프로그램을 찾는 겨냥 된다. 페이지1의,2 와 셀의 다양 한 그람 음성 및 긍정적인 종3,,45,,67, 세균성 포자도 있다 두 가지 방법8,9에의해 디스플레이 시스템으로 제안 했다.
독특한 구조, 즉 탈수 세포질 둘러싸여 보호 레이어10의 시리즈 때문에 포자는 몇 가지 이점을 살 균 소 및 셀 기반 디스플레이 시스템8,9를 제공 한다. 첫 번째 장점은 모든 다른 셀10,11해로운 것 조건에서 포자의 안정성과 극단적인 견고성에서 비롯 됩니다. 포자 표시 된 항 원 및 효소는 안정 후 실 온12 에서 스토리지를 연장 및 낮은 pH와 높은 온도13저하에서 보호. 포자의 두 번째 장점은 많은 포자 형성 종의 안전입니다. B. subtilis, B. clausii, B. coagulans, 그리고 다른 여러 종의 probiotics로 사용 되 고 수십 년간14,15인간 또는 동물 사용에 대 한 시장에 왔다. 이 뛰어난 안전 기록 표면 디스플레이 시스템에 대 한 분명 일반적인 요구 사항 이며 때 시스템은 인간 또는 동물 사용16를 위한 특정 한 관련성의 이다. 세 번째, 중요 한 포자 기반 디스플레이 시스템의 장점은 노출 되는 분자의 크기에 대 한 한계는 없습니다. 페이지 기반 시스템에서 분리 단백질이 큰 영향을 미칠 수 구조는 capsid의 셀 기반 시스템에 (서) 동안 그것은 막의 구조에 영향을 미칠 수 있습니다 또는 저하 될 수 있습니다 제한/막 전 단계17. 포자를 둘러싼 보호 계층 이상의 70 다른 단백질10 으로 구성 되며 분명 구조적 결함 또는 기능 장애8없이 큰 외국 단백질을 받아들일 수 있도록 유연. 또한, 두 포자 기반 디스플레이 시스템과 분리 단백질의 막 전은 하지 필요한8,9. 실제로, 분리 단백질 중 어머니 세포 세포질에서 생산 되며 동일한 세포질에 형성 또는 성숙한 포자8,9에 흡착 하는 포자에 조립.
포자 디스플레이 처음 포자 표면18를 유전자 시스템을 개발 하 여 얻은 했다. 이 유전자 시스템에 근거 했다) (캐리어로 사용) 포자 외 투 단백질을 위한 유전자 코딩 하 고 되도록 단백질을 위한 유전자 코딩 사이의 유전자 융합 건설 표시-는 내 생의 transcriptional 변환 신호 존재 유전자 융해, 및 ii의 식을 제어) 유전적 안정성을 부여 하는 B. subtilis 염색체에 공상 유전자의 통합. 항 원 및 효소의 다양 한 항공사와 다양 한 잠재적인 응용 프로그램을 겨냥, biocatalyst, 바이오 센서, bioremediation, 점 막 백신에서까지 다양 한 포자 표면 단백질을 사용 하 여이 재조합 형 접근 방식에 의해 표시 되었습니다 또는 생물 도구8,13.
더 최근에, 포자 디스플레이의 다른 접근 방식이 개발된19되었습니다. 이 두 번째 시스템은 nonrecombinant 고9포자 표면 분자의 자연과 매우 엄격한 흡착 한다. 항 원19,20 및 효소13,21 효율적으로 표시 되었습니다 그리고이 방법은 재조합 형 보다 훨씬 더 효율적 이다 하는 것을 계시 했다. Nonrecombinant 이렇게 네이티브 양식20 에서 단백질의 디스플레이 허용 하 고 사용할 수 있습니다 또한 압력가, 죽음 포자19. 흡착의 분자 메커니즘은 하지 되었습니다 완전히 명백 하 게 아직. 네거티브 차지 하 고 있는 포자의 hydrophobicity 흡착13,,1922에 대 한 관련 속성으로 제안 되었습니다. 최근에, 그것은 모델 단백질, 빨간 autofluorescent 단백질 (mRFP)는 산호 Discosoma, 포자에 흡착 할 때의 내부 코트23에 지역화 표면 레이어를 통해 침투 수 있었습니다 표시 되었습니다. 다른 단백질에 대 한 사실 증명, 분리 단백질의 내부 지역화 포자23에 흡착 될 때 그들의 증가 한 안정성을 설명할 수 있었다.
최근 연구에서 두 효소 catalyzing xylan 저하 통로의 2 개의 연속적인 단계 B. subtilis 의 포자에 독립적으로 표시 했다 고, 함께 알을 품을 때 모두 저하 단계21를 수행 수 있었다. 포자 수집 후 반응 했다 여전히 적극적이 고 신선한 기판21의 추가 따라 xylan 저하를 계속할 수 있습니다. 경우에 최종 제품의 약 15%의 손실 두 번째 반응21에서 관찰 되었다, 다단계, 뿐만 아니라, 단일 반응에 대 한 흡착된 효소의 재사용은 포자 디스플레이 시스템의 추가 중요 한 이점이 다.
팬 외.24 보고 포자 표면에 분리 단백질을 표시 하는 추가 접근: 포자 형성 동안 어머니 셀에서 생산 분리 단백질 (endoglucanase 단백질 및 베타-galactosidase 하나) 자발적으로 했다 운반대의 필요 없이 형성 포자 외 투에 쌌 다. 이 추가 포자 디스플레이 시스템은 지금까지 설명 된 두 가지 방법의 조합. 사실, 그것은 재조합 이후 분리 단백질 코트 내 자신의 어셈블리 자발적인 동안 포자 형성, 동안 어머니 세포에 표현 될 설계 했다 및, 따라서, nonrecombinant24. 그러나,이 추가적인 접근의 표시의 효율성을 테스트 하 고 동일한 분리 단백질을 사용 하 여 다른 두 방법에 비해 남아 있다.
현재 프로토콜 포자 생산의 프로세스를 제외 하 고 정화 되었습니다 설명 되어 광범위 하 게24. 흡착 반응, 도트 blotting과 형광 현미경에 의해 흡착 효율 평가 및 라운드 추가 반응에 대 한 흡착된 효소의 재활용.

<table><tbody><tr><td>0.1% 폴리-L-라이신 용액</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &마이크로; m 니트로셀룰로오스 블로팅 멤브레인</td><td>Sartorius</td><td>M_Blotting_Membranes</td><td></td></tr><tr><td>100회; 목표 UPlanF1&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>현미경 장비</td><td></td></tr><tr><td>Bacillus subtilis&nbsp; 균주 NCIB3610</td><td>Bacillus Genetic Stock Center</td><td>3A1</td><td></td></tr><tr><td>BD ACCURI C6 PLUS</td><td>BD</td><td>유세포 분석기</td><td></td></tr><tr><td>BX51</td><td>Olympus</td><td>형광 현미경</td><td></td></tr><tr><td>Clarity</td><td>Biorad</td><td>1705060</td><td></td></tr><tr><td>DP70 디지털 카메라 Olympus</td><td></td><td>현미경 장비</td><td></td></tr><tr><td>염소 항 토끼 IgG (H + L) 교차 흡착 2 차 항체, FITC</td><td>써모 피셔</td><td>F-2754</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 토끼 IgG H& L (HRP)&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab6721</td><td></td></tr><tr><td>단클론 항폴리히스티딘&마이너스; 과산화효소 항체</td><td>Sigma</td><td>A7058-1VL</td>은 <td>C- 또는 N- 말단에서 6xhistidine-tag를 나타내는 흡착된 단백질을 검출하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>시큐어슬립&nbsp; 유리 커버슬립</td><td>Sigma</td><td>S1815-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Superwhite 비충전 현미경 슬라이드</td><td>VWR</td><td>75836-190</td><td></td></tr><tr><td>U-CA 확대 변환기</td><td>Olympus</td><td>현미경 장비</td><td></td></tr></tbody></table>

효소와 항 원에 대 한 nonrecombinant 디스플레이 시스템으로 포자 흡착

Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens

세균성 포자 탈수 세포질을 둘러싼 보호 계층의 시리즈에 의해 형성 된 metabolically 무부하 셀입니다. 이 독특한 구조는 매우 안정적이 고 저항 하는 포자를 만드는 하 고 분리 분자를 표시 하는 플랫폼으로는 포자를 사용 하 여 제안 했다. 처음에 의해 재조합 접근 그리고, 간단 하 고 효율적인 nonrecombinant 방법에 의해 지금까지, 다양 한 항 원 및 효소 새 균의 subtilis 와 다른 몇 가지 종류의 포자에 표시가 되었습니다. Nonrecombinant 디스플레이 시스템 재조합 종자의 구조와 유전자 변형된 박테리아는 환경에의 릴리스를 피하고 포자 표면에 분자를 분리의 직접 흡착을 기반으로 합니다. 흡착된 분자는 안정 하 고 항 원의 급속 한 저하와 불리 한 조건에서 효소 활동의 손실을 제한 하 포자와 상호 작용에 의해 보호. 활용 하 고, 일단 포자 흡착 효소 활동의 최소한의 감소와 함께 쉽게 수집 고 추가 반응 라운드에 대 한 다시 사용할 수 있습니다. 이 종이에 B. subtilis의 순화 된 포자를 모델 분자를 흡착 하는 방법, 흡착의 효율성을 평가 하는 방법 및 새로운 반응에 대 한 재활용 사용된 포자를 수집 하는 방법 표시 됩니다.

성공적인 흡착 부 blotting에 의해 평가 될 수 있다. 반응, 시 혼합물은 원심 분리에 의해 분류 한, 그리고 펠 릿 분수 (그림 1)은 표면 단백질을 추출 하는 데 사용 됩니다. 추출은 SDS polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지), polyvinylidene 불 소 (PVDF) 막에 electrotransferred에 의해 분류 한 고 1 차 및 이차 항 체에 대 한 반응. 흡착된 포자를 추출 하 여 로드 레인에만 예상 되는 크기의 단백질의 존재 성공적인 흡착 반응 (그림 2A)의 지표 이다.
직접 및 간접 방법에 의해 흡착 반응의 효율성을 평가할 수 있습니다. 흡착 효율의 직접 평가 분리 단백질을 사용...

이 프로토콜은 다양 한 생물 학적 활동 분리 분자를 흡착 하는 "라이브" nanobiotechnological 도구로 세균성 포자의 사용에 초점을 맞추고. 흡착의 효율성을 측정 하는 방법도 표시 됩니다.

효소와 항 원에 대 한 Nonrecombinant 디스플레이 시스템으로 포자 흡착

The bacterial spore is a metabolically quiescent cell, formed by a series of protective layers surrounding a dehydrated cytoplasm. This peculiar structure ...

항원 또는 효소를 표시하는 살아있는 세균성 포자는 점막 백신 또는 생물 촉매로 사용될 수 있는 기능적으로 활성 나노입자입니다. 원칙적으로 모든 단백질은 포자에 효율적으로 흡착될 수 있습니다. 이 기술은 간단하고 어떤 유전 조작을 필요로하지 않습니다.따라서 재조합 유기체가 환경에 방출되지 않는다. 인간과 동물을 위한 점막 백신학 이외에, 효소를 표시하는 포자는 재사용 가능한 biocatalyzers로 개발될 수 있습니다. 먼저 10~9회 B.subtilis 야생식 정제 포자를 2-5 또는 10마이크로그램의 모델 RFP 농도로 200마이크로리터의 결합 완충제20마이크로리터에 흔들 셰이커에서 섭씨 25도에서 1시간 동안 보충합니다.인큐베이션의 끝에서, 원심분리에 의한 결합 혼합물을 펠렛하고, 후속 흡착 효율 분석을 위해 새로운 원판 튜브로 슈퍼네이션을 전송한다. 이어서, 포자 펠릿을 세척당 200 마이크로리터의 결합 버퍼로 두 번 세척하고, 두 번째 세척 후 신선한 결합 버퍼100 마이크로리터로 펠릿을 재연한다. 표면 단백질 추출의 경우, 각 흡착 포자 리서스펜션 50마이크로리터를 2X 나트륨 도데실 황산염-디티오트리톨 50마이크로리터에 추가하여 표면 포자 단백질을 용해시합니다.섭씨 65도에서 45분 후, 원심분리에 의한 혼합물을 수집하고, 서쪽 블롯에 추출된 단백질의 각 부피의 10마이크로리터를 실행하여, 단클론 항-그의 항체를 사용하여 mRFP의 N 단부에서 존재하는 그의 태그를 인식하여 표지된 표면 단백질을 식별한다. 형광 현미경 검사법에 의해 흡착 된 분자를 국소화하고 정량화하려면 흡착 된 포자 재서스펜션 5 개를 PBS의 95 마이크로 리터에 추가하고 각 결과 현탁액5 마이크로 리터를 개별 현미경 슬라이드에 추가합니다. 폴리 L-리신 처리 커버슬립을 각 슬라이드에 놓고 한 슬라이드를 형광 현미경 단계에 놓습니다.그런 다음 각 필드에 대해 위상 대비 및 형광 현미경 이미지를 저장합니다. 이미지 분석을 위해 ImageJ에서 형광 현미경 이미지를 열고 이미지 및 유형을 선택하여 모든 이미지가 8비트 형식으로 되어 있는지 확인합니다. 분석 메뉴에서 측정 설정을 선택하고 영역, 통합 밀도 및 평균 회색 값이 선택되어 있는지 확인합니다.도면 또는 선택 도구를 사용하여 관심 있는 포자 주위에 선을 그리고 분석 메뉴에서 측정을 선택합니다. 선택한 포자에 대한 값 스택이 있는 팝업 상자가 나타납니다. 적어도 50개의 포자가 선택된 후, 포자 없이 여러 영역을 선택하고, 측정을 반복하여 배경 형광에 대한 판독값을 얻습니다.여러 배경 측정을 얻은 후 결과 창내의 모든 데이터를 스프레드시트에 복사하고 선택한 포자 및 배경 형광 값영역에서 통합 밀도의 평균을 계산하여 수정된 셀당 형광을 얻습니다. 간접 흡착 효율 평가를 위해, 결합 버퍼에서 희석당 250 마이크로리터의 최종 부피와 각 예약 된 미신탄 시료 100 마이크로리터의 적절한 실험 수에 대한 0.5 나노그램 당 마이크로리터 농도에서 정제 된 mRFP의 6 배 연속 희석을 수행 하여 10 개의 미바운드 mRFP 분획을 포함하는 각 예약 된 미신 탄성 샘플의 100 마이크로 리터의 적절한 실험 적 수10 마이크로리터. 다음으로, 0.45 마이크로미터 컷오프로 니트로셀룰로오스 멤브레인을 9-10센티미터 크기로 자르고, 도트 블롯 장치의 개스킷 가장자리를 넘어 연장하지 않고 5개의 시료-6점 희석 영역을 덮는다.도트 블롯 장치에 전습 멤브레인을 배치합니다. 멤브레인의 정확한 크기를 확인하고 멤브레인과 개스킷 사이에 갇힌 기포를 제거하십시오. 제조업체에 의해 설명된 바와 같이 도트 블롯 장치를 조립하고, 공기가 그 우물을 통해 이동하는 것을 방지하기 위해 장치의 미사용 부분을 커버한다.장치가 준비되면, 두 개의 가장 외부 차선과 중간 차선의 샘플을 잘 당 각각의 100 마이크로리터로 적재한다. 모든 시료가 적재되면 진공 펌프를 2분 동안 켜고 진공을 멈추고 시료가 중력에 의해 멤브레인을 통과할 수 있도록 합니다. 10분 후, PBS 100마이크로리터로 각 웰을 씻으시면 됩니다.진공 펌프를 5분간 더 실행합니다. 세척 버퍼가 장치에서 완전히 배수되면 진공이 켜져있는 동안 나사를 느슨하게하고 조심스럽게 도트 블롯 장치를 엽니 다. 그런 다음 표준 서부 블롯 프로토콜에 따라 멤브레인을 처리합니다.필터의 밀도 측정 해석의 경우 ImageJ를 열고 각 점을 윤곽을 잡아 분석, 측정 명령을 사용하여 통합 밀도를 측정합니다. 이미지를 배경 보정하려면 빈 영역에 원을 그리고 설명한 대로 통합 밀도를 측정합니다. 표준 도트의 통합 밀도를 적재된 단백질의 양과 상관관계를 맺고 교정 곡선을 사용하여 각 샘플 점의 mRFP 농도를 추정한다.그런 다음 언바운드 분획에 남아있는 mRFP의 농도를 계산할 수 있습니다. 흡착 포자의 추출물이 적재된 차선에서만 예상되는 크기의 단백질의 존재는 성공적인 흡착 반응을 나타낸다. 흡착 효율의 직접적인 평가는 사용되어 온 이종 단백질에 따라 달라지며 흡착 반응의 분획 후 펠릿 분획의 형광 현미경 검사법과 세포성불피계에 의해 수행될 수 있다.포자에 존재하는 형광 신호의 정량화는 시연된 대로 ImageJ를 사용하여 수행될 수 있다. 흡착 효율의 간접분석은 언바운드 단백질을 함유하는 미상부 분획의 도트 블로팅 분석에 의해 수행될 수 있으며, 결합되지 않은 단백질의 후속 밀도 측정 분석을 통해 포자에 흡착된 단백질의 양을 간접적으로 계산할 수 있다. 비록, 원칙적으로, 어떤 단백질은 점막 백신 또는 생물 촉매로 사용하기 위해 흡착 될 수 있지만, 실제로 흡착의 효율성은 단백질 사이트 및 화학 적 특성에 따라 달라집니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

파지 디스플레이는 그 고정 된 분자와 상호 작용하는 단백질이나 단백질 부분을 캡처 할 수있는 강력한 기술이다. 생성하는 파아지 cDNA 라이브러리의 형식과 스크린의 결정이 제작되면, 여기에 설명 된 프로토콜 인터랙의 식별에 이르는 효율 선호도 선택을 허용한다.

재조합 단백질의 미끼를 사용 파지 디스플레이와 궁합 선택을위한 프로토콜

숙주 세포에 대한 박테리아 부착은 숙주 집락화 및 감염 과정에서 중요한 단계입니다. 이 프로토콜은 폴리머 결합 재조합 애착체의 생성을 생체 모방 물질로 설명하며, 이를 통해 다른 박테리아 요인과 독립적으로 이러한 과정에 대한 개별 애착체의 기여도를 분석할 수 있습니다.

박테리아 - 호스트 상호 작용의 특성을 생체 모방 재료

세포 내 단백질 접힘에 대한 고유한 품질 관리 메커니즘을 가진 Escherichia coli twin-arginine translocation pathway를 사용하여 항체 단편 라이브러리에서 결합 친화도 및 세포질 용해도를 동시에 스크리닝하여 내막에 항체 단편을 표시하는 방법을 제공합니다.

항체 단편의 라이브러리를 스크리닝에 대한 세균 내부 멤브레인 디스플레이

Biopanning 세균 디스플레이 라이브러리는 항 체에 대 한 강력한 대안 펩 티 드 선호도 시 약의 발견에 대 한 검증 된 기술입니다. 여기에 반자동된 정렬 방법 biopanning 잘못 된 반응의 발생을 감소 간소화 했다. 여기 우리가 생각 과정 및 후보자를 평가 하 고 최소화 다운스트림 분석에 적용 되는 기술을 설명 합니다.

펩 티 드 선호도 시 약 검색 및 분석 결과 분리의 세균성 디스플레이 라이브러리의 반자동된 Biopanning

세균성 표면에 급속 한 항 원 디스플레이 대 한 새로운 기술, 표면 biotinylation 단위체 avidin와 퓨전에 관심사의 단백질에 노출에 의해 다음을 포함 하 제공 됩니다. 선택 된 항으로 BCG를 성공적으로 로드 표면 장식 전통적인 유전 접근을 대체할 수 있는 제안 그것의 immunogenicity를 향상 시킵니다.

외 인 항 원 비 유전 표면 장식 Avidin 비타민 b 복합체 시스템을 통해 진 균 bovis BCG 백신에의 표현

여기서 우리는 특정 표적 펩티드를 바이오티게팅하는 대장균 비오틴 단백질 리가제 BirA의 신규한 변이체를 선택하는 방법을 제시한다. 프로토콜은 표적 펩티드의 세균 디스플레이를 위한 플라스미드의 생성, BirA 라이브러리의 생성, BirA 변이체의 선택 및 특성화에 대해 설명한다.

새로운 생물항제 효소 선택을 위한 박테리아 펩타이드 디스플레이

본 프로토콜은 외막 소포의 생명공학을 생산, 정제, 생체접합 및 특성화를 포함하는 "플러그 앤 디스플레이" 백신 플랫폼으로 설명합니다.

SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인을 표시하는 외막 소포를 기반으로 하는 "플러그 앤 디스플레이" 나노입자 백신 플랫폼

이 프로토콜은 유세포 분석 및 카운팅 비드를 사용하여 에티듐 브로마이드로 표지된 박테리아 포자를 정량화하는 데 중점을 둡니다. 이 방법은 또한 온전한 포자의 표면에서 단백질의 공유 결합을 분석하는 데 효율적입니다.

Bacillus subtilis 포자 계수 및 유세포 분석의 표지 분석 개선

이 프로토콜은 관심 항원에 결합하는 단백질 변이체를 풍부하게 하기 위해 효모 표면 디스플레이 선택 캠페인을 수행하기 위한 필수 단계를 설명합니다.

효모 표면 디스플레이에 의한 단백질 공학

여기에서는 효소 변형 분석을 위해 효모 표면 표시 기질을 사용하기 위한 프로토콜을 소개합니다. 이 플랫폼은 대표적인 효소 변형 분석법으로 기질 중 하나에 대한 티로신 인산가수분해효소 SHP-2의 탈인산화 활성 분석을 사용하여 시연되었습니다.

효모 표면에 표시된 단백질의 Enzymatic modification and flow cytometry assessment (효소 변형 및 유세포 분석 평가)

배우세요 세균 포자를 이용한 비재조합 단백질 흡착 기법으로 점막 백신 및 생물촉매를 개발하는 방법입니다. 유전자 조작 없이 환경 안전성을 확보하며 효율적인 단백질 고정이 가능합니다.

효소와 항 원에 대 한 Nonrecombinant 디스플레이 시스템으로 포자 흡착

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