Name: 효 모 신경 Proteinopathy 모델에서 특성화 히스톤 포스트 번역 상 수정 변경 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: 배우세요 효모 Saccharomyces cerevisiae를 이용한 신경퇴행성 질환의 후성유전학적 변화 분석 방법을. 히스톤 번역 후 수정 변화를 특성화하여 ALS 및 파킨슨병 관련 진단 마커와 치료 표적을 탐색할 수 있습니다.

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우리 기술 Royena Tanaz, Huda 유세 프 및 Sadiqa Taasen 감사합니다. 우리는 시 약 및 자당 튜닝 실험의 디자인에서 지적 도움의 관대 한 제공에 대 한 교수 제임스 짧은에 매우 감사. 효 모 플라스 미드 교수 아론 Gitler (303 Gal FUS;를 포함 하 여에서 관대 한 선물을 했다 Addgene 플라스 미드 # 29614)입니다. NIH NINDS 고급 박사 전환 수상 (K22NS09131401) 뿐 아니라 고급 과학 연구 센터 (CUNY)와 브루클린 대학 지원 M.P.T.

1. 신경 proteinopathy 관련 단백질 구조와 S. cerevisiae 변형
<ol><li>효 모 추출 물 펩 포도 당 (YPD) 국물 (200 rpm) 30 ° c.에 떨고 함께 하룻밤에 야생 타입 (WT) 303 효 모 성장</li>
	<li>12−16 h의 성장, 후 희석 효 모 600에서 광학 밀도 YPD와 0.25 nm (OD600). 효 모 액체 문화 10 mL 각 변환에 대 한 필요 하 게 됩니다, 효 모 액체 문화 50 mL 해당 FUS, TDP-43, synuclein, a 벡터만 (ccdB) 구조, 뿐만 아니라 부정적인 컨트롤 변환 하는 5 개의 변환 준비 없이 DNA.</li>
	<li>OD600 0.60와 0.80 사이이 때까지 30 ° C에서 동요와 효 모 성장. 이 일반적으로 4−6 h를 걸립니다.</li>
	<li>30 분 전에 효 모 성장 완료, 선형화 플라스 미드 구조. 참고: 플라스 미드 구문을 여기에 사용 되는 게놈에 직접 통합 해야 하며 따라서 선형화 필요 변환 전에.<ol>
<li>계산 플라스 미드의 볼륨 금액 1 µ g 합니다. 빼기가이 볼륨 nuclease 무료 H2O 필요의 양을 계산 하 44 µ L에서 합니다.</li>
		<li>Microcentrifuge 튜브를 nuclease 무료 H2O, 10 x 제한 효소 버퍼 (자료 테이블)의 5 µ L, NheI 제한 효소 (자료 테이블)의 1 µ L 및 플라스 미드 (에서 계산된 단계 1.4.1)의 적절 한 금액을 추가 합니다. 아래로 pipetting으로 철저 하 게 혼합 하 고 15 분 동안 37 ° C에서 품 어. 플라스 미드는 이제 선형화 및 준비 변환입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>효 모 후 문화 0.6-0.8, 50 mL 원뿔 튜브에 스핀 아래로 3 분 삭제 상쾌한 4 ° C에서 850 x g 에서 수확 셀의 OD600 에 도달합니다.</li>
	<li>살 균 H2O 3 분 삭제 상쾌한에 대 한 850 x g 4 ° C에서 원심 분리기의 10 mL에 셀 펠 릿을 세척. 총 4 개의 세척의 3 배를 반복 합니다.</li>
	<li>3 세척의 시작에서 해 동 하 고 연어 정자 DNA가 열 블록에 5 분에 대 한 변환 반응 당 10 µ L를 끓여.</li>
	<li>DH2O 변환 당 100 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 microcentrifuge 튜브의 적절 한 수로 분할. 5 변환, dH2O의 500 µ L에 펠 릿을 resuspend 하 고 5 별도 microcentrifuge 튜브로 균등 하 게 분할 합니다.</li>
	<li>실 온 (RT)에서 850 x g 에 5 분 동안 centrifuge 고 모든 나머지 물을 제거 합니다.</li>
	<li>다음과 같은 순서로 살 균 H2O, 240 µ L의 50% 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG), 1 M LiAc, 연어 정자 DNA의 10 µ L, 선형화 플라스 미드 DNA의 20 µ L (또는 nuclease 무료 물 없는 DNA 컨트롤 변환에 대 한)의 36 µ L의 50 µ L를 추가. 믹스 철저 하 게 각 추가 소용돌이 후 간단히 모든 변환 구성 요소를 추가한 후.</li>
	<li>20 분 동안 42 ° C에 변화 반응을 품 어. 참고: 더 일관 된 온도 제어를 위한 물 욕조에이 부 화를 실시 합니다.</li>
	<li>470 x g RT에 대 한 5 분 삭제 상쾌한에 centrifuge 및 살 균 H2o.의 200 µ L에서 각 셀 펠 릿 resuspend</li>
	<li>효 모 현 탁 액 선택적 미디어 접시에 접시 및 롤링 구슬 또는 스프레더 확산. 30 ° c.에 2−3 일에 대 한 번호판을 품 어 참고: 합성 정의 (SD)-여기에서 설명 하는 플라스 미드에 사용 되는 그의 접시.</li>
</ol>2. 측량 식민지 성장 억제 및 글리세롤 주식에 저장
<ol><li>2% 유 보충 선택적 미디어의 5 mL에 변환 격판덮개에서 단일 식민지 접종 30 ° C에서 통에 밤새 껏 증가 한다. 변환 당 적어도 12 식민지를 선택 합니다. 참고: 없음 식민지 "DNA" 변환 제어 접시에 예상 된다.</li>
	<li>핀-frogger 불타는 다음 에탄올 소독.</li>
	<li>각 문화는 96 잘 접시의 첫 번째 행에서 포화 세포 현 탁 액의 aliquot 100 µ L에 대 한. 인접 한 잘 열의 모든 스에서 살 균 H2O의 200 µ L를 추가 합니다. 1:5 직렬 희석에 대 한 멀티 채널 피펫으로 뒤에 인접 한 열에 첫 번째 열에서 50 µ L을 추가 합니다. Pipetting으로 철저 하 게 혼합. 다음 50 µ L 두 번째 열에서 세 번째 열과 혼합 하 여 추가 pipetting 합니다. 이 접시의 나머지 부분에 대 한 반복 합니다.</li>
	<li>Frogger 96 잘 접시에 놓고 다음 눌러 부드럽게 하 고 균등 하 게 내려와 갈 락 토스 없이 선택적 미디어 접시에 스탬프 플레이트 효 모. 2−3 일 30 ° C에서 품 어. 참고: SD-그의 SGal 그의 접시는 여기에서 설명 하는 플라스 미드 사용 됩니다.</li>
	<li>FUS, TDP-43, 그리고-synuclein 변환, 갈 락 토스의 대부분 성장 억제를 표시 하는 식민지를 식별 합니다. SD-그의 격판덮개에서이 식민지를 선택 하 고 선택적 미디어 하룻밤 성장 위한 2% 유 보충의 10 mL에 접종. 벡터 제어에 대 한 갈 락 토스의 존재 없는 성장 억제를 표시 하는 식민지를 선택 하십시오.</li>
	<li>글리세롤 주식 준비, 50% 글리세롤의 0.5 mL와 포화 액체 문화의 0.5 mL을 결합. 아래로 pipetting으로 혼합 하 고-80 ° c.에 동결 참고 사항: 글리세롤 주식 저장할 수 있습니다-80 ° c.에서 1 년까지</li>
</ol>3. 신경 proteinopathy의 overexpression S. cerevisiae 에서 단백질 관련
<ol><li>냉동된 글리세롤 주식, 히스티딘, 효 모 다시 행진에서 2% 포도 당 한 천 선택적 미디어 격판덮개 그리고 2−3 일 30 ° C에서 품 어.</li>
	<li>Overexpression 모델 및 제어 2% 유 보충 히스티딘 선택적 액체 미디어의 5 ml에서의 각 단일 식민지를 예방. 하룻밤에 30 ° C (200 rpm)를 떨고 함께 성장.</li>
	<li>액체 문화의 100 mL의 overexpression 모델과 컨트롤 각각에 대 한 성장 (FUS, TDP-43, 및 벡터 제어;-synuclein 및 벡터 제어).<ol>
<li>2% 갈 락 토스와 보완 하는 선택적 미디어에서 문화의 100ml 준비 합니다.</li>
		<li>OD600 의 숙박 문화를 측정 하 고 하룻밤 문화의 시작 OD600 0.3의 overexpression 문화를 렌더링 하는 데 필요한 금액을 계산. 일반적으로, 야간 문화 0.9−10, 약 5 mL 100 mL 신선한 문화의 시작을 하룻밤 문화 요구의 OD600 에 도달 한다.</li>
		<li>5 h (FUS 및 TDP-43) 또는 8 h (-synuclein) 30 ° c.에 떨고와 갈 락 토스 미디어 (3.3.1 단계 참조)에 효 모 성장 하 여 단백질 overexpression를 유도</li>
	</ol>
</li>
	<li>유도 기간의 끝에 각 문화권의 OD600 를 측정 합니다. OD600 최소값을 모든 셀 수를 표준화. 4 ° c.에서 5 분 동안 850 x g 에서 centrifuging 여 50 mL 튜브에 문화를 수확 상쾌한을 삭제 합니다. 참고: 경우 유도의 끝에 측정 된 OD600 값 0.654 0.984, 각각,-synuclein 문화 100 mL 및 100 mL의 제어 문화, 95 mL-synuclein 문화 및 제어 문화의 67.1 mL 수확.</li>
	<li>살 균 dH2O 성장 문화의 모든 10 ml의 1 mL에 펠 릿을 resuspend. Aliquoting 셀 물의 resuspension의 1 mL microcentrifuge 튜브에 의해 펠 릿을 균등 하 게 분할 합니다. 예를 들어 100 mL의 문화에서 시작 해 서, 살 균 dH2O 10 mL에 펠 릿을 resuspend 그리고 10 microcentrifuge 튜브로 그것을 분할.</li>
	<li>4 ° C에서 5 분 동안 850 x g 에서 centrifuge 다음 상쾌한을 제거 합니다. 스냅 액체 질소와-80 ° c.에 게에 셀 펠 릿을 동결 참고: 셀 펠 릿 저장할 수 있습니다-80 ° C에서 최대 1 년.</li>
</ol>4. 세포 세포의 용 해 및 히스톤 포스트 번역 상 수정을 검출 하 부 럽
<ol><li>세포 세포의 용 해<ol>
<li>효 모 세포 알갱이 얼음에 녹여와 dH2o.의 100 µ L에서 셀 펠 릿 resuspend</li>
		<li>셀 물의 resuspension를 0.2 M NaOH의 300 µ L 2-mercaptoethanol의 20 µ L을 추가. 아래로 pipetting으로 resuspend.</li>
		<li>10 분 동안 얼음에 셀을 품 어 고 다음 30 탁상 원심 분리기에 3200 x g 에서 원심에서 실시간 삭제 상쾌한 s.</li>
		<li>염료와 10 분이 열 블록에 대 한 종 로드 x 1의 100 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend. 참고: 로드 염료 x 6에 대 한 제조 법 재료의 테이블에서에서 찾을 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 그리고 막 전송<ol>
<li>두 젤 젤 홀더 및 충전 내부 챔버에 버퍼를 실행 하 고 2-젤 라인 마크를 외부 챔버를 작성 상단에 배치 하 여 젤 챔버를 준비 합니다.</li>
		<li>10 잘 12 %polyacrylamide 젤으로 잘 당 4.1.4 단계에서 15 µ L의 샘플을 로드 합니다. 단백질 사다리 레인 5 µ L 로드.</li>
		<li>150 V, 또는 젤의 하단에 도달 하면 염료 전면 로드 될 때까지 약 45 분 젤을 실행 합니다.</li>
		<li>젤을 실행 하는 동안 전송 버퍼 (자료 테이블)에 (젤 당 2) 섬유 패드를 몸을 담글 하 고 메탄올에 polyvinylidene 불 소 (PVDF) 멤브레인을 몸을 담글 하 여 막 전송을 위해 준비 합니다. 전송 하기 전에 전송 버퍼에 막을 헹 구 십시오. 참고: PVDF 막 젤의 크기에 절단 해야 하 고 전송 되는 모든 젤 한 PVDF 막 사용 합니다.</li>
		<li>조립, 세미 드라이 전송 장치 셀에 전송 '샌드위치': 하단 전극에서 장소 (1) presoaked 섬유 패드, (2) presoaked 및 씻어 서 PVDF 막, (3) 단계의 4.2.3, 젤 및 (4) 두 번째 presoaked 섬유 패드. 참고: 전송 '샌드위치'에 공기 방울을 피하기 위해 있는지 확인 부드럽게 '샌드위치' 거품 밖으로 강제로 serological 피펫으로 롤. 일단 젤 PDVF 막 위에 배치 되었습니다, 그것을 이동 하지 않도록 확인 합니다.</li>
		<li>단백질 전송 150 파워 팩을 설정 하 여 수행 (1 ' 샌드위치')에 대 한 1 시간 mA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>히스톤 PTMs 수정 특정 항 체를 검출<ol>
<li>전송 장치에서 멤브레인을 제거 합니다. 짧게 dH2O. 린스<ol>
<li>필요에 따라 작은 플라스틱 상자에서 막 커버 하 고 30−60 s. 제거 Ponceau S에 대 한 부드러운 떨고와 RT에 잠복기 얼룩 배경 얼룩 때까지 지명 타자2O로 씻어 충분히 Ponceau S 얼룩을 붓는 의해 Ponceau S 얼룩과 단백질의 전송 확인 사라집니다 및 단백질 밴드 육안으로 볼 수 있습니다. DH2O 린스 모든 얼룩 막에서 제거 될 때까지 계속 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>작은 얼룩 상자에서 막 tris 버퍼 염 분 (TBS) 블로킹 버퍼 (테이블의 재료)과 함께 부드러운 락와 RT에 1 시간을 위한 얼룩을 배양 하 여 차단 합니다. 충분 한 차단 버퍼를 사용 하 여 얼룩을 커버. 참고: 배치 막 직 립 착 색 상자에서 그렇게 막 쪽에 단백질 거짓말 하지 향하게 주의 해야 합니다.</li>
		<li>품 어 하룻밤 4 ° c.에 효 모 쪽으로 반응 한 히스톤 수정 특정 항 체와 착 상자에 오 점 제조업체 사양에 따라 TBS 블로킹 버퍼에서 항 체 희석. 또한 안티 총 H3 수정 특정 항 체에서 다른 호스트 종에서와 같은 적절 한 핵 로드 컨트롤을 포함 합니다. 예를 들어, 토끼에서 안티-H3S10ph 항 체와 H3S10ph에 대 한 탐색 하는 경우 로드 컨트롤 마우스에서 안티 총 H3 항 체를 사용 합니다. 필요에 따라 모든 오 점을 위해 이것을 반복 합니다. 참고: 항 체 희석 한 달에서 세 번의 총 다시 수 있습니다. 4 ° c.에서 그들을 저장합니다</li>
		<li>막 4 워시 x 집 만든 TBS + 0.1% 폴 20 (TBST) 실시간에서 락으로 5 분</li>
		<li>제조 업체 지정 된 희석 (당나귀 안티 토끼 680와 당나귀 안티 마우스) 실시간에서 1 h에서 형광 이차 항 체와 오를 품 어 참고: 보조 형광 항 체 보호 되어야 합니다에서 저장 및 사용 하는 동안. 어두운 플라스틱 상자에서 인큐베이션을 카 리 또는 알루미늄 호 일 커버.</li>
		<li>막 4 워시 x TBST 가진 5 분을 실시간에 락 하는 동안 5 분 TBS로 세척</li>
		<li>형광 서쪽 오 점 2 분에 대 한 시스템 이미징에 시각화 오 시각화 안티 토끼 680와 반대로 마우스 800 2 차 항 체는 800 nm와 700 nm 채널, 각각. 참고: 복제는 독립적으로 실시 하지 섹션 1에서에서 시작 합니다. 그것은 항 체 신호 응답은 신호 응답은이 실험에서 적절 한 데이터 해석에 대 한 선형 범위 이내 인지 확인 해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 데이터 분석 및 통계
<ol><li>오픈 이미지 이미징 소프트웨어 (자료 테이블)에서 오 점입니다. 프레임 분석 모드에서 밴드 사각형을 그려서 벡터 제어, TDP-43, FUS (또는 벡터 제어 및 synuclein) 수정 특정 밴드 샘플의 원시 밀도 취득 합니다.</li>
	<li>컨트롤 밴드를 로드 하기 위한 5.1 단계를 반복 합니다. 참고: 있을 것 이다는 로드 제어 밴드와 각 샘플에서 수정 특정 밴드.</li>
	<li>벡터 제어 샘플에서 해당 밴드의 밀도 의해 각 밴드를 나누어 수정 특정 밴드의 상대 밀도 계산 합니다. 이 데이터는 벡터 제어를 정규화합니다.</li>
	<li>로드의 상대 밀도 계산 해당 로드의 밀도 의해 각 밴드를 나누어 컨트롤 밴드 벡터 제어 샘플에서 컨트롤 밴드.</li>
	<li>로드의 상대 밀도 통해 수정 특정 밴드의 상대 밀도 분할 하 여 각 밴드의 조정된 상대 밀도 계산 각 샘플에 대 한 컨트롤 밴드. 이제, 데이터 히스토그램 형태로 구상 될 수 있다. 참고: 처리의 용이성, 단계 5.3-5.5 스프레드시트 (보충 파일)에서 할 수 있습니다.</li>
	<li>중요성에 대 한 구분으로 후 여러 독립 복제, 두 개의 샘플 및 적절 한 proteinopathy 사이 실행된 웰 치의 T-테스트 모델 (FUS 대 제어, TDP-43, 대 제어 및 제어-synuclein 대) p = 0.05 .</li>
</ol>

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<li>Daniele, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+Modifications+of+the+%CE%B1-Synuclein+Gene+and+Relative+Protein+Content+Are+Affected+by+Ageing+and+Physical+Exercise+in+Blood+from+Healthy+Subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Oxidative+Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">Epigenetic Modifications of the α-Synuclein Gene and Relative Protein Content Are Affected by Ageing and Physical Exercise in Blood from Healthy Subjects.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 3740345(2018).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

여기에 설명 된 프로토콜의 게놈 넓은 히스톤 PTM 변화 신경 proteinopathies 연관 분류, 편법, 간단 하 고 비용 효율적인 방법을 제공 합니다. 그러나 거기에 다른 모델의 ALS 및 PD, 등 생체 외에서 인간 세포 선 및 murine 모델32, S. cerevisiae 남아 사용의 용이성 때문에 매력적인. 예를 들어, 효 모 모델 살 균 후드의 사용을 요구 하지 않습니다 없으며 그들은 필요로 할 교육 집중 셀 문화 작업 함께 간다. 또한, 효 모 배양에 대 한 시 약 포유류 세포 배양 공급 보다 훨씬 더 저렴 한 있습니다. 효 모 모델 공개 도메인 결정 단백질 집계22,23,,2425,<sup...

신경 퇴행 성 질환 거의 아무 치료 옵션을 사용할 수 있는 치명적인 질병이 있습니다. 이러한 가운데, 루 경화 증 (ALS) 및 파 킨 슨 병 (PD)는 특히 무서운. ALS와 PD의 경우의 약 90% 산발적, 나머지 경우 가족에서 실행 하 고 일반적으로 특정 유전자 돌연변이1,2에 연결 하는 동안, 질병의 가족 력이 없이 발생으로 간주 됩니다. 흥미롭게도,이 질병의 두 단백질 mislocalization 및 집계3,4,,56와 연결 됩니다. 예를 들어, 육 (FUS)에 융합 및 타르 DNA 묶는 단백질 43 (TDP-43)는 세포질에 mislocalize ALS7,,89,10에서 집계 하는 RNA 의무적인 단백질 11,12, α-synuclein는 배치할 PD5,13,,1415Lewy 몸 불리의 원리 구성 요소.
대형 환자 집단에서 광범위 한 게놈 넓은 협회 노력에도 불구 하 고 압도적인 대부분의 ALS 및 PD 경우 남아 설명할 수 없는 유전자. Epigenetics는 신경 질환에 역할을 할 수 있습니다.? Epigenetics는 원본 DNA 시퀀스16변경 없이 발생 하는 유전자 발현에서 변화 구성 되어 있습니다. 주요 epigenetic 메커니즘 히스톤 단백질16의 포스트 번역 상 수정을 (PTMs)를 포함 한다. 진 핵 세포에서 유전 물질 염색 질으로 단단히 싸여 있다. Chromatin의 기본 단위는 DNA는 히스톤 octamer 감싸의 146의 기본적인 쌍의 구성 된 nucleosome 히스톤 (2 부 각 히스톤 H2A, H2B, H3, H4)17의 4 쌍의 구성입니다. 각 히스톤이 있다 N 맨끝 꼬리는 nucleosome 중 돌출 하 리 신과 아르기닌 잔류물18에 일반적으로 다양 한 화학 moieties의 추가 의해 수정할 수 있습니다. 이러한 PTMs 이므로 동적, 그들은 쉽게 추가 될 수 있습니다 및 제거, 그룹 acetylation, 메 틸 화, 인 산화 등을 포함. PTMs transcriptional 기계, DNA의 접근을 제어 하 고 따라서 제어 유전자 식18도움. 예를 들어 histone acetylation 매우 기본적인 히스톤 단백질 및 유전자 더 액세스할 수 acetylated 히스톤에 의해 포장 수 있도록 부정 청구 DNA 등뼈 사이 정전기 상호 작용의 힘을 감소 따라서 매우 19를표현 했다. 최근에, 특정 히스톤 PTMs 및 그들의 조합의 놀라운 생물 특이성 히스톤 코드 가설20,21 어떤 단백질에서을 작성, 삭제, 및 읽기 히스톤 PTMs 모든 콘서트에서 행동을 주도하 고 있다 유전자 발현 조절
효 모 neurodegeneration 공부에 매우 유용한 모델 이다. 중요 한 것은, 많은 신경 세포 통로 인간22,,2324누 룩에서 보존 됩니다. 효 모 세포 독성 고기 및 FUS, TDP-43, 또는 α-synuclein22,,2324,,2526의 overexpression에 단백질 포함 정리. 사실, ALS의 Saccharomyces cerevisiae 모델 인간27에서 유전 위험 요소를 식별 하기 위해 사용 되었습니다. 또한, 인간의 α-synuclein ameliorate α-synuclein 독성 신경28,29druggable 대상으로 Rsp5 네트워크의 특성에 대 한 허용 overexpressing 효 모.
여기, 우리가 Saccharomyces cerevisiae 신경 proteinopathies (그림 1)과 관련 된 게놈 넓은 히스톤 PTM 변화를 감지를 악용 하는 프로토콜을 설명 합니다. S. cerevisiae 의 사용 때문에 그것의 사용의 용이성, 저렴 한 비용과 속도 neurodegeneration의 다른 시험관 및 동물 모델에 비해 매우 매력적 이다. ALS와 PD 모델22,23,,2526개발 이전 활용, 우리 인간의 FUS, TDP-43, 및 효 모에 발견된 고유 히스톤 PTM 변화에서 발생 하는 α-synuclein overexpressed 있다 각 proteinopathy30와 연결입니다. 우리가 여기에 설명 하는 프로토콜은 데이터 분석에 변환에서 2 주 미만에 완료할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>-His DO 보충제</td><td>클론텍</td><td>630415</td><td></td></tr><tr><td>10x 러닝 버퍼</td><td></td><td></td><td>믹스: 글리신 141.65g(ThermoFisher BP381-1), 티즈마 염기(시그마-알드리치 T6066) 30.3g, 황산나트륨(시그마-알드리치 L3771) 10g, 탈이온수 1L, pH 8.8.</td></tr><tr><td>12% 폴리아크릴아미드 겔</td><td>BIO-RAD</td><td>456-1041</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>시그마-알드리치</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>항아세틸-히스톤 H3(Lys14) 1차 항체</td><td>MilliporeSigma</td><td>07-353(로트 번호 2762291)</td><td>희석: 1/1000</td></tr><tr><td>항아세틸-히스톤 H4(Lys 16) 1차 항체</td><td>Abcam</td><td>ab109463(로트 번호. GR187780)</td> <td>희석 : 1/2000</td></tr><tr><td>안티 아세틸 히스톤 H4 (Lys12) 1 차 항체</td><td>Abcam</td><td>ab46983 (로트 번호. GR71882)</td> <td>희석 : 1/5000</td></tr><tr><td>안티 디메틸 히스톤 H3 (Lys36) 1 차 항체</td><td>Abcam</td><td>ab9049 (로트 번호. GR266894, GR3236147)</td><td>희석: 1/1000</td></tr><tr><td>Anti-Histone H3 Primary Antibody</td><td>Abcam</td><td>ab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335)</td> <td>핵 적재 제어; 희석 : 1/2000</td></tr><tr><td>Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) 1 차 항체</td><td>Abcam</td><td>ab188292 (Lot No. GR211874)</td> <td>희석 : 1/1000</td></tr><tr><td>안티 포스포 - 히스톤 H3 (Ser10) 1 차 항체</td><td>Abcam</td><td>ab5176 (로트 번호. GR264582, GR192662, GR3217296)</td><td>희석액: 1/1000</td></tr><tr><td>BioPhotometer D30</td><td>Eppendorf</td><td>6133000010</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Dish (100 x 20 mm)</td><td>Eppendorf</td><td>30702118</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Plate, 96 well</td><td>Eppendorf</td><td>30730011</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>22625501</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW</td><td>LI-COR</td><td>926-32212 (로트 번호 C60301-05, C61116-02, C80108-05)</td><td>희석액: 1/5000</td></tr><tr><td>당나귀 안티-래빗 IRDye 860 RD</td><td>LI-COR</td><td>926-68073 (로트 번호 C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07)</td><td>희석액: 1/2500</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>시그마-알드리치</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>매우 두꺼운 오점지(여과지)</td><td>BIO-RAD</td><td>1703968</td><td></td></tr><tr><td>갈락토오스</td><td>시그마-알드리치</td><td>G0750</td><td>20% w/v 원액을 준비합니다.</td></tr><tr><td>포도당</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>20% w/v 원액을 준비합니다.</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마-알드리치</td><td>G5516</td><td>50% w/v 용액을 준비합니다.</td></tr><tr><td>Immobilon-FL 전사막</td><td>MilliporeSigma</td><td>IPFL00010</td><td></td></tr><tr><td>리튬 아세테이트 이수화물(LiAc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4158</td><td>1m 용액을 준비합니다.</td></tr><tr><td>로딩 염료</td><td></td><td></td><td>혼합물: 도데실황산나트륨 1.2g, 브로모페놀 블루(시그마-알드리치 B8026) 6mg, 글리세롤 4.7mL, pH 6.8 0.5M 트리즈마 염기 1.2mL, DL-디티오트레이톨(시그마-알드리치 D0632) 0.93g 및 탈이온수 2.1mL.</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>ThermoFisher</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra 수직 전기영동 셀</td><td>BIO-RAD</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>다채널 피펫</td><td>Eppendorf</td><td>2231300045</td><td></td></tr><tr><td>NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10x</td><td>New England Bio Labs</td><td>102855-152</td><td></td></tr><tr><td>Nhe I Restriction Enzyme</td><td>New England Bio Labs</td><td>101228-710</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease Free Water</td><td>Qiagen</td><td>129114</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Fc 이미징 시스템</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>2800-03</td><td></td></tr><tr><td>OmniTray 세포 배양 처리 w/뚜껑 멸균, PS (86 x 128 mm)</td><td>ThermoFisher</td><td>165218</td><td></td></tr><tr><td>pAG303GAL-a-synuclein-GFP</td><td>A. Gitler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pAG303GAL-ccdB</td><td>Addgene</td><td>14133</td><td></td></tr><tr><td>pAG303Gal-FUS</td><td>Addgene</td><td>29614</td><td></td></tr><tr><td>pAG303GAL-TDP-43</td><td>A. Gitler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly(ethylene glycol) (PEG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4338</td>의 선물 <td>50% w/v 용액을 준비합니다.</td></tr><tr><td>Ponceau S Stain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3504</td><td>Mix: 0.5 g 0.1% w/w Ponceau S 염료, 5 mL 1% v/v 아세트산(Sigma-Aldrich 320099) 및 500 mL 탈이온수.</td></tr><tr><td>PowerPac 기본 전원 공급 장치</td><td>BIO-RAD</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>라피노스 펜타하이드레이트</td><td>시그마-알드리치</td><td>R7630</td><td>10% w/v 스톡 용액을 준비합니다.</td></tr><tr><td>연어 정자 DNA</td><td>애질런트 테크</td><td>201190</td><td></td></tr><tr><td>SD-His 플레이트</td><td></td><td></td><td>믹스: 한천 20g(Sigma-Aldrich A1296), 0.77g -His DO 보충제, 아미노산 없는 효모 질소 염기 6.7g(ThermoFisher 291920) 및 900mL 탈이온수.</td></tr><tr><td>SGal-His 플레이트</td><td></td><td></td><td>믹스 : 한천 20g, His DO 보충제 0.77g, 효모 질소 염기 (아미노산 제외), 갈락토오스 용액 100mL 및 탈이온수 900mL</td></tr>.<tr><td>나트륨 도데 실 설페이트 로딩 버퍼</td><td></td><td></td><td>-20 oC에서 보관하십시오. 6X, 혼합 : 1.2g 나트륨 도데 실 설페이트, 6mg 브로 모페놀 블루, 0.93g DL- 디티 오 트레이톨, 2.1 mL 탈 이온수, 4.7 mL 글리세롤 및 1.2 mL 0.5 M 트리즈마 염기, pH 6.8.</td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>221465</td><td>0.2m 용액을 준비합니다.</td></tr><tr><td>설탕</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td>20% w/v 원액을 준비합니다.</td></tr><tr><td>TBS + 0.1% 트윈 20(TBST)</td><td></td><td></td><td>혼합: 100mL 10X TBS, 1mL 트윈 20(Sigma-Aldrich P7949) 및 900mL 탈이온수.</td></tr><tr><td>TBS 차단 버퍼</td><td>LI-COR</td><td>927-5000</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD 반건조 전기영동 전달 셀</td><td>BIO-RAD</td><td>170-3940</td><td></td></tr><tr><td>전달 버퍼</td><td></td><td></td><td>혼합물: 글리신 22.5g, 티즈마 염기 4.84g, 메탄올 400mL, 도데실황산나트륨 1g 및 탈이온수 1.6L.</td></tr><tr><td>트리스 완충 식염수(TBS)</td><td></td><td></td><td>10X, 7.6 pH, 용액: 트리즈마 염기 24g과 염화나트륨 88g(Sigma-Aldrich S7653)을 혼합합니다. 탈이온수를 1L까지 채웁니다.</td></tr><tr><td>WT 303 S. cerevisiae 효모</td><td>J. 쇼터</td><td></td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물 펩톤 포도당(YPD)</td><td>의 선물Sigma-Aldrich</td><td>Y1375</td><td></td></tr></tbody></table>

효 모 신경 proteinopathy 모델에서 특성화 히스톤 포스트 번역 상 수정 변경

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

신경 퇴행 성 질환, 파 킨 슨 병 (PD), 루 경화 증 (ALS) 등 생활 매년 수천의 수백의 손실. 효과적인 치료 옵션 수 질병의 진행을 중단 하는 부족. 대형 환자 집단에서 광범위 한 시퀀싱 노력에도 불구 하 고 대부분의 ALS 및 PD 경우 혼자 유전자 변이 의해 설명할 수 없는 남아 있습니다. Epigenetics 메커니즘, 히스톤 단백질의 포스트 번역 상 수정 같은 신경 퇴행 성 질환 병 인 및 진행에 관련 되어있을 수 있습니다 고 제약 개입에 대 한 새로운 목표. ALS와 PD의 포유류 vivo에서 그리고 생체 외에서 모델은 비용이 많이 드는 연장과 힘 드는 실험 프로토콜 요구. 여기, 우리는 게놈 넓은 변경 Saccharomyces cerevisiae 를 사용 하 여 모델 시스템으로 하는 히스톤 수정 레벨을 결정 하는, 빠르고, 실용적이 고 비용 효율적인 접근을 개설 한다. 크게의 우리의 지식을 확대 하는 동안 다른 모델 시스템에서 이전 연구 결과 확증 신경 proteinopathies에 연결 하는 epigenetic 변화에 포괄적인 수사를 위해이 프로토콜을 사용 하는 신경 퇴행 성 질병 epigenome입니다.

이 방법을 설명 하기 위해 우리는 최근에 출판 된 결과30의 활용 것입니다. 동안 WT α-synuclein는 8 h overexpressed WT 인간의 FUS 및 TDP-43 5 h overexpressed 했다. CcdB 구문 벡터 부정적인 제어로 사용 되었다. 그림 2 는 고체와 액체 문화에서 성장 억제를 보여준다. 효 모는 설명 된 대로 수확 했다 하 고 수행한 수정-특정 항 체로 서 부 럽. 반대로 총 H3 로드 제어로 사용 되었다. H3S10ph와 H3K14ac의 수준에서 크게 감소 FUS overexpression 모델 (그림 3ab)에서 분명 하다. 나타나지 않으면에 FUS TDP-43 overexpression 모델 또는 α-synuclein overexpression 모델 ...

이 프로토콜의 히스톤 포스트 번역 상 수정 (PTM) ALS와 파 킨 슨 병에 관련 된 단백질의 overexpression 관련 하 여 발생 하는 수준에서 게놈 넓은 변화 하는 실험 절차 설명 Saccharomyces cerevisiae 모델입니다. SDS 페이지 분리 후 개별 히스톤 PTM 수준은 통해 서 부 럽 수정-특정 항 체와 검색 됩니다.

효 모 신경 Proteinopathy 모델에서 특성화 히스톤 포스트 번역 상 수정 변경

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

이 프로토콜은 우리가 쉽게 신경 퇴행성 질환의 후생 유전학 적 특징을 탐구 할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 효모를 모델 시스템으로 악용하여 신경 퇴행성 질환의 다른 세포 및 동물 모델에 비해 효모가 편리하고 비용 효율적이라는 것입니다. 이 기술은 우리가 진단을 위한 새로운 마커로 이끌어 낼 수 있는 신경 퇴행성 질병에서 생기는 후성 유전학 적인 변경, 뿐만 아니라 치료를 위한 새로운 표적으로 지도할 수 있습니다.이 방법은 신경 퇴행성 질환에서 후성 유전학 마크의 역할에 대한 추가 조사를 허용하고 인간의 섬유 아세포 및 유도 된 다능성 줄기 세포의 평가를 위해 수정 될 수있다. 이 특정 방법은 서양 블롯 장치의 적절한 하중과 같은 시각적으로 입증해야 하는 여러 가지 세부 사항을 포함합니다. 절차를 시연하는 것은 미셸 팔라와 나빈 라나, 토런트 실험실에서 두 학부 연구원이 될 것입니다.먼저 냉동 글리세롤 주식에서 효모를 히스티딘 2%의 포도당 화고 선택형 중간 플레이트로 리스트하여 섭씨 30도에서 2~3일 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 히스티딘 선택적 액체 배지의 5밀리리터에서 각 오버 발현 모델에 대한 효모를 접종하고 제어한다. 섭씨 30도, 분당 200회전으로 하룻밤 사이에 2%의 라피노스를 보충합니다.다음 날 아침, 각 과발현 모델에 대해 100밀리리터의 액체 배양을 키우고 하룻밤 사이에 2%의 갈라토스를 보충하는 선택적 매체의 제어기능을 제공합니다. 그리고 600 나노미터 또는 OD600의 광학 밀도를 측정하여 0.3의 시작 OD600에서 발현 배양을 통해 렌더링하는 데 필요한 야간 배양의 양을 결정한다. 단백질 과발현을 유도하기 위해, 적절한 실험 기간 동안 섭씨 30도에서 흔들면서 갈라토제 배지에서 효모를 자랍한다.그런 다음 유도 기간이 끝날 때 각 배양의 OD600을 측정합니다. 그리고 모든 셀 수를 가장 낮은 OD600 값으로 표준화합니다. 원심분리로 50밀리리터 원심분리기 튜브에서 배양을 수확하고 재배된 10밀리리터당 1밀리리터의 멸균 스틸워터 1밀리리터로 펠릿을 재보냅니다.Aliquot 1 밀리리터의 세포 재서스펜션을 개별 미세 원심 분리 튜브로 하여 추가 원심분리및 수퍼나티를 흡인시합니다. 그런 다음 스냅은 영하 80도에서 저장을 위해 액체 질소에 세포 펠릿을 동결. 서양 얼룩 분석을 위해 세포를 lyse하려면 증류수 100 마이크로 리터에서 재서스펜션하기 전에 얼음에 효모 세포 펠

characterizing-histone-post-translational-modification-alterations

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

이 인터뷰에서 박사 린드 퀴 스트는 단백질 접힘, 프리온 질환과 neurodegenerative 질환 사이의 관계를 설명합니다. 단백질 폴딩의 문제는 현대 생물학의 핵심에 있습니다. 그들의 전통적인 생화 학적 기능 이외에, 단백질은 생물 학적 정보의 전송을 중재하고 따라서 유전 물질로 간주 될 수 있습니다. 단백질의이 최근에 발견된 기능은 인간의 장애 연구에 중요한 의미가 있습니다. 린드 퀴 스트 박사는 또한 모델 생물의 유전 연구를 기반으로 neurodegenerative 질병의 메커니즘을 조사하기 위해 현재의 실험 방법을 설명합니다.

인터뷰 : 단백질 폴딩과 Neurodegenerative 질병의 연구

여기에 플라스미드 overexpression 화면...

높은 처리량 효모 플라스미드 Overexpression 화면

본 원고는 효모에 polyglutamine의 독성 (polyQ) - 확장 단백질을 평가 삼 보완적인 프로토콜을...

성장 Assays은 효모에서 Polyglutamine 독성을 평가하기 위해

출처: Bennett, S. A., et al., 효모 신경퇴행성 단백질병증 모델에서 히스톤 번역 후 변형 특성화. J. Vis. 특급 (2019). 이 비디오는 신경퇴행성 단백질을 과발현하는 효모 세포의 히스톤 변형을 평가하는 절차를 보여줍니다. 이 단계에는 세포 용해, 원심분리, 전기영동, 멤브레인 전달 및 변형된 히스톤의 항체 기반 검출이 포함됩니다.

Neurodegenerative Protein Overexpression을 이용한 효모 세포의 히스톤 변형 검출(Detecting Histone Modifications in Yeast Cells with Neurodegenerative Protein Overexpression)

효모 단백병증 모델은 질병과 관련된 단백질의 독성 및 응집을 평가하는 데 유용한 도구입니다. 여기에서는 Hsp104 변이체 라이브러리에서 독성 억제제를 스크리닝하는 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 효모에서 독성이 있는 단백질의 독성 억제자에 대해 모든 단백질 라이브러리를 스크리닝하는 데 적용할 수 있습니다.

효력을 더 Hsp104 변종 사용 효모 Proteinopathy 모델을 분리

초파리 널리 신경 퇴행을 연구하기위한 모델 시스템으로 사용된다. 이 프로토콜은, 뇌의 공포 형성에 의해 결정된 바와 같이, 정량 할 수있는 변성하는 방법을 설명한다. 또한 인해 하나의 샘플로 처리 및 절편 제어 및 실험 파리에 의해 실험 절차에 효과를 최소화 할 수 있습니다.

질량 조직학은에 신경 퇴행을 정량화하기<em&gt; 초파리</em

Saccharomyces cerevisiae의 내인성 위치에서 히스톤 유전자의 돌연변이를 생성하는 전략이 제시됩니다.

대상<em&gt; 현장에서</em신진 효모에서&gt; 돌연변이 유발 히스톤의 유전자

이 문서는 기준점과 플라스 미드 라이브러리를 사용 하 여 신진 효 모에 overexpression 심사를 용이 하 게 하 짝짓기 기반 메서드를 제공 합니다.

효 모에 짝짓기 기반 Overexpression 라이브러리 심사

이 프로토콜은 입체 세포 배양 시스템이 거의 생리적 인 상태에서 염색질 변형을 모델링, 치료 및 분석하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 설명합니다.

간 조직의 3D 세포 배양 모델에서 히스톤 번역 후 변형의 글로벌 수준 정량화

α-시누클레인의 생체 내 생리학적 모델은 파킨슨병의 발병기전을 연구하고 이해하는 데 필요합니다. 인간화 효모 모델을 사용하여 α-synuclein의 세포 독성 및 응집체 형성을 모니터링하는 방법을 설명합니다.

인간화 효모 모델을 이용한 α-시뉴클레인 독성 및 응집을 연구하는 방법

여기에서는 인간 γ-세크레타아제를 재구성하는 효모 시스템에 대해 설명합니다. 이 시스템을 통해 활성에 영향을 미치는 돌연변이를 식별 및 연구하고 γ-secretase 억제제(GSI)를 스크리닝할 수 있습니다. 가족성 알츠하이머병 돌연변이의 기능 상실 특성을 활용하여 γ-secretase 조절제(GSM)를 스크리닝할 수 있습니다.

Saccharomyces cerevisiae γ-Secretase에 의한 아밀로이드 베타 생산에 영향을 미치는 유전자, 돌연변이 및 화학 물질을 스크리닝하는 알츠하이머병 모델

배우세요 효모 Saccharomyces cerevisiae를 이용한 신경퇴행성 질환의 후성유전학적 변화 분석 방법을. 히스톤 번역 후 수정 변화를 특성화하여 ALS 및 파킨슨병 관련 진단 마커와 치료 표적을 탐색할 수 있습니다.

효 모 신경 Proteinopathy 모델에서 특성화 히스톤 포스트 번역 상 수정 변경

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