Name: 배양된 세포에서 기능성된 Nanobodies를 사용 하 여 Trans Golgi 네트워크 Endocytic 통풍 관 및 역행의 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: 학습하세요 기능성 나노바디를 이용한 HeLa 세포의 역행 수송 분석 방법입니다. 이 기술은 세포 표면에서 Golgi 기관으로의 단백질 이동 메커니즘을 연구하여 막 항상성 이해에 기여합니다.

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이 작품은 그랜트 31003A-162643 스위스 국립 과학 재단에 의해 지원 되었다. 우리 니콜 Beuret는 Biozentrum 이미징 핵심 시설 (IMCF) 지원에 대 한 감사합니다.

저자는 공개 없다.

Nanobodies 많은 이점이 기존의 항 체와 단백질 바인더 장비의 신흥 클래스 대표: 그들은 작은, 안정, 단위체, 높은 친 화력과 부족 이황화 채권33,35, 에 선정 될 수 있다 44 , 45. 세포 배양 시스템에 유기 체 개발 생물학46,47,48,49, 결정 화도 보호자를 같은 응용 프로그램의 숫자에 사용 됩니다 억제제 또는 효소54,55의 활동 변조기...

단백질과 지질 세포 표면에서 다양 한 세포내 구획을의 역행 트래픽이 막 항상성 분 비를 균형 잡히게 하 고 참가자 전송 기계1 의 구성 요소를 재활용의 유지 보수에 대 한 중요 한 , 2. 다음 clathrin-또는-독립적인 endocytosis 통해 국제화, 단백질 및 지질 화물은 먼저 일찍 채울 endosomes 어디에서 그들은 더 중 엔 lysosomal 시스템, 플라즈마 막에 재활용 따라 리디렉션 또는 trans Golgi 네트워크 (TGN) 대상. 다양 한 양이온 종속 및 양이온 독립만 노 오 스 6 인산 염 수용 체 (CDMPR 및 CIMPR) 등 참가자 막 횡단 화물 수용 체의 기능 사이클의 일부인는 TGN endosomes 및 셀 표면에서 재활용 제공 새로 합성 늦은 endosomes와 리소좀3,,45, sortilin 및 SorLA6,7, 및 Wntless (WLS) 수송 하는 세포 표면에 Wnt ligands는 TGN에서 lysosomal hydrolases 8 , 9 , 10 , 11. 다시는 TGN에 검색 하는 다른 단백질은 TGN46 및 그것의 관련된 isoforms12,13,14, SNAREs (수용 성 N-ethylmaleimide-민감한 퓨전 요소 첨부 수용 체) 15 , 16 , 17, 녹말 체 선구자 단백질 (APP)18,19, 진보적인 ankylosis (ANK) 단백질20, ATP7A/B 나 DMT121,22, 등 고 막 횡단 금속 전송기 효소 carboxypeptidase D, furin 또는 BACE123,,2425를 포함 하 여 처리. 이러한 내 생 단백질은 그렇다 하 고 박테리아 및 식물 독 소 (예를 들어, 시가 콜레라 독 소, 신은 abrin) 납치 cytosol26,27,에 retrotranslocation에 대 한 응급실에 도달 역행 수송 기계 , 2829.
직접 역행 트래픽 분석, 위해 이전 레이블 및 세포내 구획30화물 단백질을 세포 표면에서 따라 하는 nanobody 기반 툴킷을 개발 했습니다. Nanobodies는 homodimeric 무거운 체인만 항 체 (hcAbs) camelids과 연골 물고기31,32에서 자연스럽 게 발생 하는에서 파생 된 단백질 바인더의 새로운 가족을 나타냅니다. 그들은 hcAbs의 변수 중 체인 도메인 (VHH)를 구성 하 고 기존의 항 체 (예: IgGs)에 비해 많은 장점이 있다: 그들은 단위체, 작은 (~ 15 kDa), 높은 가용성, 이황화 결합, 없는 bacterially 표현 하 고 선정 수 높은 친 화력 바인딩33,,3435,36. 우리의 nanobody 도구를 다양 하 고 광범위 하 게 적용을 하려면 우리는 표면 레이블과 트랙 단백질 그들의 세포 외/lumenal 도메인에서 GFP 태그로 기능성된 안티-GFP nanobodies 고용. MCherry, 하는데 과산화 효소 2와 nanobodies (APEX2)의 기능화에 의해37또는 티로신 sulfation (TS) 시퀀스, 역행 bonafide 막 횡단 화물 단백질의 고정으로 분석 될 수 있다 수송과 라이브 셀 이미징 전자 현미경 검사 법, 또는 화학적. Tyrosylprotein sulfotransferases (TPST1 및 TPST2)에 의해 중재 티로신 sulfation 이기 때문에 trans Golgi 제한 posttranslational 수정/TGN, 우리 수 있다 직접 전송 하 고이 셀 표면에서 관심사의 단백질의 활동 세포내 Golgi 구획38,,3940.
이 방법 문서에서는, 우리는 포유류 세포30의 역행 교통 분석 응용 프로그램의 수에 적합 한 기능성된 nanobodies (VHH-2xTS,-APEX2,-mCherry 및 파생 상품)의 생산의 용이성을 설명 합니다. 우리는 주로 sulfation의 세포 표면에서 세포내 매매의 분석에 대 한 TS 사이트 수정 nanobody의 사용에 초점.

<table><tbody><tr><td>항 GFP 항체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>118144600001</td><td>제품은 Sigma-Aldrich에 의해 유통되지만 Roche</td></tr><tr><td>Anti-His6 항체</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>A190-114A</td><td></td></tr><tr><td>항 액틴 항체</td><td>EMD Millipore MAB1501</td><td></td><td></td></tr><tr><td>염소 항 토끼 HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0545</td><td></td></tr><tr><td>염소 항 마우스 HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0168</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>1x PBS/1%BSA</td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드(DMSO)</td>에 용해응용 <td>프로그램</td><td>A3672</td><td></td></tr><tr><td>D-비오틴</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501</td><td>멸균 500mM NaH2PO4 또는 DMSO</td></tr><tr><td>5-aminolevuilnic acid(dALA)에 용해 염산염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3785</td><td>멸균수에 용해</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Applichem</td><td>A3778</td><td>멸균수에 용해</td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18037059001</td><td>제품은 Sigma-Aldrich에 의해 유통되지만 Roche</td></tr><tr><td>Brefeldin A (BFA)</td><td>에서 제조Sigma-Aldrich</td><td>B5936</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pr-1</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>바이오컨셉</td><td>4-01F00-H</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>애플리켐</td><td>A3704</td><td></td></tr><tr><td>둘베코' s 변형 된 독수리' s 매체 (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청 (FCS)</td><td>Biowest</td><td>S181B-500</td><td></td></tr><tr><td>황산 나트륨 -35</td><td>Hartmann Analytics</td><td>ARS0105</td><td>제품에는 5 mCi</td></tr><tr><td>Earle's balanced salts</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6267</td><td></td></tr><tr><td>MEM 아미노산 (50x) 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5550</td><td></td></tr><tr><td>MEM 함유 비타민 용액 (100x)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>M6895</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, Mini Protease 억제제 칵테일</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11836153001</td><td>제품은 Sigma-Aldrich에 의해 유통되지만 Roche</td></tr><tr><td>Isopropyl-beta; -D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>에서 제조합니다.<td>Applichem</td><td>A1008</td>은 <td>멸균수에 용해되고 재고는 1 M</td></tr><tr><td>Carbenicillin disodium salt</td><td>Applichem</td><td>A1491입니다.</td><td>멸균수에 용해, 스톡은 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>Applichem</td><td>A1493</td><td>멸균수에 용해, 스톡은 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Coomassie-R (Brilliant Blue)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-0149</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드 (PFA)</td><td>Applichem</td><td>A3813</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Ni Sepharose 고성능</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5268-01</td><td></td></tr><tr><td>His GraviTrap 컬럼</td><td>GE Healthcare</td><td>GE11-0033-99</td><td></td></tr><tr><td>His 버퍼 키트</td><td>GE Healthcare</td><td>GE11-0034-00</td><td></td></tr><tr><td>일회용 PD10 탈염 컬럼</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean TGX 젤, 4-20%, 15-웰</td><td>바이오-라드</td><td>456-1096</td><td></td></tr><tr><td>둘베코' s 인산염 완충 식염수(DPBS) w/o Ca2+/Mg2+</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>35mm 접시</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>TPP</td><td>92406</td><td></td></tr><tr><td>유리 커버슬립(No. 1.5H)</td><td>VWR</td><td>631-0153</td><td></td></tr><tr><td>페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF)</td><td>Applichem</td><td>A0999.0025</td><td>40% DMSO 60% 이소프로판올에 용해, 500mM</td></tr><tr><td>트립톤</td><td>Applichem</td><td>A1553</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Applichem</td><td>A1552</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘 육수화물</td><td>Merck Millipore</td><td>105833</td><td>멸균수에 용해, 스톡은 1M</td></tr><tr><td>염화칼슘 이수화물</td><td>102382</td><td></td><td>멸균수에 용해, 스톡은 1M</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Merck Millipore</td><td>106404</td><td>멸균수에 용해되며 재고는 5M입니다.</td></tr></tbody></table>

배양된 세포에서 기능성된 nanobodies를 사용 하 여 trans golgi 네트워크 endocytic 통풍 관 및 역행의 분석

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

수송 단백질은 골을 넘어 셀 표면에서 막의 항상성, 세포 기관이 정체성과 생리학에 대 한 필수적입니다. 공부 하 고 퇴행 성 단백질 트래픽, 최근 고정 및 라이브 셀 이미징, 전자 현미경, 또는 화학적 여 골 복잡 한 세포 표면에서 수송 분석을 다양 한 nanobody 기반 툴킷을 개발 했습니다. 우리 설계 기능성된 안티 녹색 형광 단백질 (GFP) nanobodies-작고, 단위체, 높은 선호도 단백질 바인더-셀 라인 막 단백질 extracellular GFP moiety와 관심의 표현에 적용 될 수 있는. Derivatized nanobodies GFP 기자에 바인딩된 특별히 내 면 고 기자 정렬 경로 따라 피기백을 수송. Nanobodies은 기능성을 형광 현미경 검사 법에 의해 역행 수송을 따라 하는데 과산화 효소 2 전자에 의해 기자 nanobody 복합물의 ultrastructural 지역화를 조사 (APEX2)와 영상 살 fluorophores와 현미경 검사 법, 그리고 trans Golgi 네트워크 (TGN) 도착의 활동을 평가 하기 위해 티로신 sulfation (TS) 모티브. 이 방법론 문서에서는, 우리는 bacterially 표현 하 고 기능성된 nanobodies 정화 일반 절차 개요. 우리는 mCherry 및 TS 수정 nanobodies endocytic 통풍 관 및 TGN 도착 화물 단백질의 분석을 사용 하 여 우리의 도구를 사용 하 여를 강력한를 보여줍니다.

다양 한 세포내 목적지 역행 단백질 교통 조사, 우리는 최근 레이블 및 셀 표면30에서 재조합 융합 단백질을 따라 하는 안티-GFP nanobody 기반 도구를 설립 했습니다. 여기, 그러한 세균 생산 nanobodies derivatized 그리고 TGN 도착 sulfation 분석 조사를 그들의 사용 뿐만 아니라 형광 현미경 검사 법 및 immunoblotting, endocytic 통풍 관 공부를 그들의 응용 프로그램을 보여 보여 줍니다. 후자의 응용 프로그램은이 프로토콜의 방법론 초점.
우리는 표준 분자 복제30일반적인 기능을 가진 다른 공업화 안티-GFP nanobodies의 도구 상자를 생성. 우리의 간단한 (표준) nanobody, VHH-성병, VHH 도메인, 포함...

Golgi 세포 표면에서 단백질의 역행 수송 막 항상성 유지에 필수적 이다. 여기, 우리는 화학적 HeLa 세포에서 기능성된 nanobodies를 사용 하 여 재조합 단백질의 세포 표면에 골 교통을 분석 하는 방법을 설명 합니다.

배양된 세포에서 기능성된 Nanobodies를 사용 하 여 Trans Golgi 네트워크 Endocytic 통풍 관 및 역행의 분석

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

이 방법은 세균발현, 기능성 나노 바디의 생산 및 적용을 가능하게 하여 세포 표면에서 세포 간 구획으로 의 역행단백질 수송을 분석할 수 있다. 특히 트랜스 골기 네트워크. 이 기술의 주요 장점은 황양의 사용입니다. DTN 구획에 기자 나노 바디 복합 도착을 평가하기 위해 매우 구체적이고 구획화되고 민감한 번역 후 수정. 생명 세포 이미징 및 전자 현미경 검사법을 위한 다른 파생된 나노 바디와 병용이 방법은 또한 질병 관련 세포 표면 수용체의 내막 과정을 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다. 기능성 나노 바디의 우리의 레퍼토리는 배양된 세포에 있는 역행 수송을 공부하기 위하여 디자인되었습니다. 그러나, 이러한 도구는 또한 다세포 유기체에서 적용될 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면, 플레이트에서 관심의 벡터를 포함하는 세균 성 식민지를 선택하고 항생제로 보충 된 LB 배지의 20 밀리리터를 포함하는 플라스크를 접종. 37에서 하룻밤 인큐베이션

analysis-endocytic-uptake-retrograde-transport-to-trans-golgi-network

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 비디오는 세포 내 이동 경로를 이해하기 위해 기능화된 나노바디의 흡수 및 역행 수송을 연구하는 방법을 보여줍니다. 방사선 표지된 황산염을 도입하고 분리 및 검출 기술을 활용함으로써 이 방법은 화물 단백질의 내포세포 흡수 및 트랜스 골지 네트워크 도착에 대한 연구를 가능하게 합니다.

기능화된 나노바디를 사용하여 GFP 표지된 표면 단백질이 골지횡단 네트워크에 도착하는 모니터링

막 이동은 원형질막에서 세포 내부로 단백질을 운반한 다음(즉, 세포내이입), 분해를 위해 리소좀으로 또는 재활용을 위해 원형질막으로 이동하는 것을 포함합니다. 이 기사에 설명된 방법은 원형질막 단백질의 세포내이입 및 재활용을 연구하기 위해 고안되었습니다.

세포 기반 L-글루타티온 보호 어세이는 원형질막 단백질의 세포내이입 및 재활용을 연구합니다.

우리는 특정 폴리 클로 날 항체를 세포 에피토프를 사용하여 신경을 생활의 표면에 단백질을 레이블하는 방법을 설명합니다. 세포 표면에 결합 된 항체에 의해 연속적 endocytosis를 통해 내부화 단백질은 단백질의 나머지와 구별 또는 배양 중에 표면에 매매 될 수있다.

라이브 배양 된 신경 세포의 항체 수유 후 세포 표면과 내면 단백질의 차등 라벨링

이 문서에서는 합성 및 나노 입자의 형광 라벨 NPS ()하는 방법을 설명합니다. NPS는 진핵 세포의 엔도 - 리소좀 시스템에 레이블을 펄스 - 체이스 실험에 적용되었다. 세포 내 병원균 살모넬라 엔테의 활동에 의한 엔도 - 리소좀 시스템의 조작은 라이브 세포 이미징 및 정량화 따랐다.

형광 나노 입자의 응용 프로그램은 세포 내 세균에 의해 엔도 - 리소좀 시스템의 리모델링을 연구하기 위해

수용체는 리간드 매매 시그널링 및 세포 반응성을 조절하고, 그 자체의 리간드 - 유도 된 세포 신호 전달을 포함한 조건에 응답한다. 여기, 우리는 양적 immunolabeling 및 colocalizational 분석을 사용하여 약물 유발 수용체 인신 매매를 평가하기위한 강력하고 유연한 기술을 설명합니다.

Colocalizational 분석에 의한 수용체 후 국제화 인신 매매에 약물 유발의 이동을 추적

막 인신 매매에 대한 조사는 신경 기능을 이해하는 데 중요합니다. 여기서는 뉴런에서 소포 운동성을 정량화하는 방법을 소개합니다. 이것은 신경계에서 막 인신 매매의 정량화에 적용 할 수있는 편리한 방법입니다.

형광 프로브를 이용한 배양 된 뉴런의 엔도 좀과 리소좀 기능의 정량화

혈장 막에서 발현 된 단백질의 세포 표면 발현 및 endocytic 속도를 결정하기 위해 고안된 두 가지의 바이오 티 닐화 기반 방법이이 보고서에 제시되어있다.

Biotinylation을 사용하여 기본 Astrocyte 문화에서 단백질의 세포 표면 표현 및 Endocytic 속도를 결정

우리는 교양된 뉴런에 재활용 시 냅 스 소포 (SV)에 대 한 광학 분석 결과 설명 합니다. 더블 transfection는 연 접 마커 관심사의 단백질을 표현 하는이 프로토콜을 결합 연 접 사이트를 그들의 시 냅 스 소포 용량, 재활용 찾아서 관심사의 단백질의 역할을 결정할 수 있습니다.

시 냅 스 소포 교양된 신경 연 접 단백질 Overexpressing에 있는 재활용에 대 한 광학 분석 결과

재활용 내분은 내피 관 네트워크의 일부입니다. 여기서는 GFP-STX13을 세포구마커로 사용하여 재활용 내종의 역학을 정량화하는 방법을 제시합니다.

SNARE 인신매매를 사용하여 재활용 내시경을 연구하고 분석하는 현미경 기반 분석

원형질막에서 트랜스-골지체 네트워크로의 단백질의 엔도사이틱 및 역행성 수송은 막 항상성을 유지하고 신호 전달을 조절하는 데 필수적입니다. 여기에서는 HeLa 세포에서 유도체화된 항-GFP 나노바디를 사용하여 살아있는 세포 현미경으로 막관통 화물 단백질의 엔도사이틱 수송을 이미지화하고 정량화하는 방법을 설명합니다.

배양 세포에서 기능화된 나노바디를 사용한 엔도사이틱 수송의 생세포 이미징

학습하세요 기능성 나노바디를 이용한 HeLa 세포의 역행 수송 분석 방법입니다. 이 기술은 세포 표면에서 Golgi 기관으로의 단백질 이동 메커니즘을 연구하여 막 항상성 이해에 기여합니다.

배양된 세포에서 기능성된 Nanobodies를 사용 하 여 Trans Golgi 네트워크 Endocytic 통풍 관 및 역행의 분석

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