Name: 포스트스테인링 방법을 통해 폴리아크릴아미드 겔에서 망고 태그RNA의 형광 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: 배우세요 RNA Mango 태그를 사용한 포스트스테이닝 방법으로 폴리아크릴아미드 겔에서 RNA를 형광 시각화하는 기법입니다. 이 민감하고 신속한 방법은 생물학적으로 중요한 RNA 및 RNA 복합체의 추적과 정제를 단순화합니다.

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저자들은 라즈반 코조카루와 아미르 압돌라자데의 기술적 지원과 원고를 증명해 준 레나 돌고시나에게 감사를 표한다. 이 프로젝트에 대한 기금은 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC)가 P.J.U.에 보조금을 운영함으로써 제공되었습니다.

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망고 형광 시스템에 대한 특허출원 중입니다.

망고 형광 태그의 중요한 장점은 단일 태그를 여러 가지 방법으로 사용할 수 있다는 것입니다. 이러한 aptamers의 높은 밝기와 친화력은 세포 시각화2뿐만 아니라 시험관 내 RNA 또는 RNP 정제4에도유용하게 만듭니다. 따라서 젤 이미징은 망고 태그의 다기능성을 간편하게 확장합니다. 망고 겔 화상 진찰 감도는 북부 얼룩14의 그것 보다는 약간 더 작습니다 그러나 RNA 견본의 60-120 fmol를 쉽게 검출할 수 있습니다, 길고 지루한 막 전송 및 탐사 단계를 필요로 하지 않고. 이는 겔15의작은 RNA에 대해 이전에 발견된 혼성화 기반 의 프로빙 효율과 비교할 수 있다. 다른 형광 aptamer 방법론 - 특히, RNA 시금치 - 더 큰 감도와 특이성을 가지고있지만9, 아무도 현재 동시에 단일 RNA 태그를 할...

망고는 티아졸 오렌지(TO1-Biotin, 도 1A)의 단순 유도체에 단단히 결합하는 4개의 작은 형광 RNA aptamers 세트로 구성된 RNA태깅 시스템(TO1-Biotin, 도 1A)1,2,3 . 결합시, 이 리간드의 형광은 특정 압타머에 따라 1,000-4,000배 증가한다. 망고 III에 대한 망고 시스템의 높은 밝기는 향상된 녹색 형광 단백질 (eGFP)을 초과, RNA 망고 aptamers의 나노 몰 바인딩 친화도와 결합, 그것은 이미징 및 RNA의 정제 모두에 사용할 수 있습니다 단지2,4.
망고 I 5, II6및 III7의 X선 구조는 고분해능으로 결정되었으며, 세 압타머 는 모두 RNA 사중 플렉스를 사용하여 TO1-Biotin을 결합합니다 (도1B-D). 세 압타머의 컴팩트 코어는 컴팩트 어댑터 모티프를 통해 외부 RNA 서열로부터 분리됩니다. 망고 I 및 II 둘 다 임의의 RNA 양면에 그들의 망고 코어를 연결하는 유연한 GNRA 같이 루프 어댑터를 이용합니다 (그림1B,C). 대조적으로, 망고 III는 망고 IV의 구조가 현재 알려져 있지 않은 동안, 임의의 RNA 나선 (그림1D,보라색 잔류물)에 코어를 연결하는 단단한 트리플렉스 모티프를 사용합니다. 이들 각 aptamers의 리간드 결합 코어는 이러한 헬리컬 어댑터에 의해 외부 RNA 서열로부터 분리됨에 따라, 그들은 모두 단순히 다양한 RNA에 통합될 수 있는 것으로 보인다. 세균6S 조절 RNA(망고 I), 효모 스플리세오좀(망고 I) 및 인간 5S RNA, U6 RNA 및 C/D scaRNA(망고 II 및 IV)의 성분이 모두 이 방식으로 성공적으로 태그가 지정되어 2,8,많은 것을 시사합니다. 생물학적 RNA는 RNA 망고 압타머 시스템을 사용하여 태그가 지정될 수 있다.
변성 및 네이티브 젤은 일반적으로 RNA를 연구하는 데 사용됩니다. 치수화 겔은 종종 RNA 크기 또는 RNA 처리를 판단하는 데 사용되지만, 전형적으로, 북부 블롯의 경우, 예를 들어, 이미지를 생성하기 위해 몇 가지 느리고 순차적인 단계가 필요하다. RNA 시금치 및 브로콜리와 같은 다른 RNA 형광 압타머는 젤 이미징9에 성공적으로 사용되었지만 현재까지 는 망고 시스템의 높은 밝기와 친화성을 가지고 있지 않으며 상당한 관심을 가지고 있습니다. 망고의 젤 이미징 능력을 조사하기 위해. 이 연구에서는, 우리는 RNA 망고 시스템이 TO1-Biotin의 여기 그리고 방출 파장 (각각 510 nm 및 535 nm)이 대부분의 형광에 일반적인 eGFP 채널에 있는 화상 진찰을 위해 적당하기 때문에, 단순히 젤 화상 진찰에 확장될 수 있었다는 것을 궁금했습니다 겔 스캐닝 계측.
여기에 제시된 포스트 겔 염색 프로토콜은 망고 태그가 달린 RNA 분자를 네이티브 및 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 겔에서 특이하게 검출하는 신속한 방법을 제공한다. 이 염색 방법은 칼륨과 TO1-비오틴을 포함하는 완충제에 젤을 담그는 것을 포함합니다. RNA 망고 압태머는 G-사중플렉스 기반이며 칼륨은 이러한 구조를 안정화하는 데 필요하다. 최소한의 망고 인코딩 DNA 템플릿에서 전사 된 RNA를 사용하여 (프로토콜 섹션 참조), 우리는 간단하고 염색 프로토콜을 사용하여 네이티브 젤에서 RNA의 62.5 fmol과 RNA의 125 fmol을 간단하게 염색하여 간단하게 검출 할 수 있습니다. 일반적인 비특이적 핵산 얼룩과는 대조적으로(본명으로부터 SG라고 하는 물질 표참조), 우리는 총 태그가 없는 RNA의 고농도가 샘플에 존재하는 경우에도 망고 태그가 지정된 RNA를 명확하게 식별할 수 있다.

<table><tbody><tr><td>0.8mm 두께의 빗 14 웰 30 mL PAGE 젤</td><td>LabRepCo</td><td>11956042</td><td></td></tr><tr><td>101-1000 &micro; 엘&nbsp; 팁</td><td>Fisher</td><td>02-707-511</td><td></td></tr><tr><td>20-200 &micro; L 낮은 유지&nbsp; 팁</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-717-143</td><td></td></tr><tr><td>아크릴 아미드 : N, N'- 메틸렌 비스 아크릴 아미드 (40 % 19 : 1)</td> <td>생물 시약</td><td>BP1406-1</td><td>급성</td></tr><tr><td>독성 아크릴 아미드 : N, N'- 메틸렌 비스아크릴 아미드 (40 % 29 : 1)</td> <td>Fisher</td><td>BP1408-1</td><td>급성 독성</td></tr><tr><td>한천</td><td>아나케미아</td><td>02116-380</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 백업 TLC 플레이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>1164840001</tr><tr><td>Amersham Imager 600</td><td>GE Healthcare Lifesciences</td><td>29083461</td><td></td></tr><tr><td>과황산암모늄</td><td>Biorad</td><td>161-0700</td><td>유해한</td></tr><tr><td>BL21 세포</td><td>NEB</td><td>C2527H</td><td></td></tr><tr><td>붕산</td><td>ACP</td><td>B-2940</td><td></td></tr><tr><td>브로모페놀 블루 나트륨 염</td><td>시그마</td><td>B8026-25G</td><td></td></tr><tr><td>Chloloform</td><td>ACP</td><td>C3300</td><td></td></tr><tr><td>디티오트레이톨</td><td>시그마 알드리치 알코올</td><td>D0632-5G</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>ThermoFisher</td><td>EN0525</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 디소듐 솔</td>트 <td>ACP</td><td>E-4320</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>커뮤리얼&nbsp;</td><td></td><td></td>P016EAAN</tr><tr><td>플랫 젤 로딩 팁</td><td>Costar</td><td>CS004854</td><td></td></tr><tr><td>Formamide 99 %</td> <td>Alfa Aesar</td><td>A11076</td><td></td></tr><tr><td>스페이서 및 빗 세트</td><td>LabRepCo</td><td>41077017</td><td></td></tr><tr><td>유리 접시 플라스틱 뚜껑</td><td>Pyrex</td><td>1122963</td><td>젤 조각에 맞을만큼 충분히 커야합니다</td></tr> 글리<tr><td>세롤</td><td>Anachemia</td><td>43567-540</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>아나케미아</td><td>464140468</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuanTL</td><td>GE Healthcare Lifesciences</td><td>29000605</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Invitrogen</td><td>15529-019</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>ACP</td><td>P-2940</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Caledron</td><td>4903-01</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3409</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>ACP</td><td>S-2830</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>BDH</td><td>BDH9292</td><td></td></tr><tr><td>궤도 회전 장치</td><td>실험실 라인</td><td></td><td></td></tr><tr><td>페놀</td><td>Invitrogen</td><td>15513-039</td><td></td></tr><tr><td>라운드 젤 로딩 팁</td><td>Costar</td><td>CS004853</td><td></td></tr><tr><td>인산 나트륨 이염기성</td><td>칼레드 론</td><td>8120-1</td><td></td></tr><tr><td>인산 나트륨 일 염기성</td><td>칼레드 론</td><td>8180-01</td><td></td></tr><tr><td>SYBRGold</td><td>ThermoFisher</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA 중합효소</td><td>ABM</td><td>E041</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7024-50 ml</td><td></td></tr><tr><td>TO1-3PEG-비오틴 형광단</td><td>ABM</td><td>G955</td><td></td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>Fisher</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>트립톤</td><td>Fisher</td><td>BP1421-500</td><td></td></tr><tr><td>트윈-20</td><td>시그마</td><td>P9496-100</td><td></td></tr><tr><td>요소</td><td>피셔</td><td>U15-3</td><td></td></tr><tr><td>크실렌 시아놀</td><td>시그마</td><td>X4126-10G</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Bioshop</td><td>YEX401.500</td><td></td></tr></tbody></table>

포스트스테인링 방법을 통해 폴리아크릴아미드 겔에서 망고 태그rna의 형광 시각화

Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method

네이티브 및 변성 폴리아크릴아미드 겔은 리보뉴클레오프로테인(RNP) 복합 이동성을 특성화하고 RNA 크기를 측정하기 위해 일상적으로 사용됩니다. 많은 젤 이미징 기술이 비특이적 얼룩 또는 고가의 형광공 프로브를 사용하므로 민감하고 차별적이며 경제적인 젤 이미징 방법론이 매우 바람직합니다. RNA 망고 코어 서열은 임의RNA 줄기에 의해 폐쇄될 때, 관심 있는 RNA에 간단하고 저렴하게 추가될 수 있는 작은(19-22 nt) 서열 모티프이다. 이 망고 꼬리표는 TO1-Biotin에게 불린 티아졸 오렌지 형광공 리간드에 높은 친화력 및 특이성과 결합합니다, 결합시 수천 배 더 형광이 됩니다. 여기서 우리는 망고 I, II, III 및 IV가 고감도를 가진 겔에서 RNA를 구체적으로 이미지화하는데 사용될 수 있음을 보여준다. 네이티브 겔에서 RNA의 62.5 fmol과 변성 겔에서 RNA의 125 fmol만큼 적은 30 분 동안 칼륨 및 20 nM TO1-비오틴을 포함하는 이미징 버퍼에 겔을 담가 검출 할 수 있습니다. 우리는 총 세균 RNA의 복잡한 혼합물의 맥락에서 망고 태그가 달린 6S 세균 RNA를 이미징함으로써 망고 태그가 지정된 시스템의 특이성을 입증합니다.

짧은 망고 태그RNA는 프로토콜 섹션에 기재된 바와 같이 제조되었다. 변성 조건에서 형광이 젤에 있는 우레아의 존재 때문에 관찰하기 위하여 가장 어려울 것이라는 점을 가정하는, 우리는 먼저 핵산 denaturant로 작용하는 우레아에 망고 aptamers의 저항을 공부했습니다. 우리는 망고 aptamers가 대략 1 M (그림 2A)의 우레아농도까지 변성에 실질적으로 저항한다는 것을 것을을 발견했습니다. 변성 겔에 겔 염색 용액을 첨가하기 전에, 겔내의 우레아의 최종 농도는 6M. 이 농도를 1M로 감소시키기에 충분한 염색 용액을 첨가하면, 따라서, 4개의 압타머 모두에 대해 완전한 망고 형광을 보장하기에 최적이될 것이다. 실제로, 염색 프로토콜은 이 완전히 최적의 결과보다 적게 달성되었지만, 더 많은 염색 용액을 사용하거나 염색 중에 한 번 솔루션을 변경하는 간단한 편의에 의해 필요한 경우 이를 간단히 해결할 수 있습니다.
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여기서 우리는 RNA 망고 aptamers I, II, III, 또는 IV로 태그된 RNA를 이미지화하기 위해 민감하고, 신속하며, 차별적인 포스트 겔 염색 방법을 제시하고, 네이티브 또는 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 겔을 사용한다. 표준 PAGE 젤을 실행한 후 망고 태그RNA는 TO1-Biotin으로 쉽게 염색한 다음 일반적으로 사용할 수 있는 형광 리더를 사용하여 분석할 수 있습니다.

포스트스테인링 방법을 통해 폴리아크릴아미드 겔에서 망고 태그RNA의 형광 시각화

Native and denaturing polyacrylamide gels are routinely used to characterize ribonucleoprotein (RNP) complex mobility and to measure RNA size, ...

여기에서 입증된 망고 태그겔 화상 진찰 방법론은 견고하고 감도 및 특이성의 관점에서 단순히 확장될 수 있을 것으로 예상됩니다. 이것은 관심있는 RNA에 망고 태그를 추가하는 간단한 편법으로 생물학적으로 중요한 RNA 및 RNA 복합체의 일상적인 정화를 더욱 단순화할 것입니다. RNA는 점점 더 많은 질병에 연루되고 있으며, 이 포스트 데이트 방법은 RNA를 추적하고 시각화할 수 있는 쉽고 빠른 방법입니다.젤이 깨지기 쉽고 깨지기 쉽기 때문에 젤을 한 곳에서 다른 곳으로 옮기는 데 추가주의가 필요합니다. 30 밀리리터 데나딩 젤을 준비하려면 먼저 적절한 브로모페놀 블루와 함께 폴리아크릴아미드 백분율을 선택하고, 높은 대역 분리를 보장하기 위해 관심 있는 RNA에 비해 자일렌 시안올 염료를 선택한다. 그런 다음 표 하나에 따라 솔루션 A, B 및 C를 혼합하고 APS 및 timud를 추가합니다.즉시 적절한 젤 주조 장치에 젤 용액을 부어. 원하는 콘을 삽입하고 약 30 분 동안 중합체에 젤을 둡니다. 1 개의 XTBE 용액을 사용하여 젤 탱크를 구성하고 조심스럽게 콘을 제거하십시오.젤을 조심스럽게 들어 올리고 젤 장치에 장착하고 바인더 클립을 사용하여 안전합니다. 주사기를 사용하여 시료 적재 직전에 우물을 흡인합니다. 관심 있는 RNA 샘플에 2X 데나링 젤 로딩 솔루션을 추가하여 1X RNA 샘플을 준비합니다.열순환기를 사용하여 샘플을 섭씨 95도에서 5분간 가열합니다. 그런 다음, 냉각 된 샘플을 젤 로딩 팁을 사용하여 각 우물의 바닥에 로드합니다. 그리고 음실 온도에서 젤은 전력이 효과적으로 낮은 겔 장치의 유리 판을 균열하지 않습니다 보장합니다.젤에 편안하게 맞을 수 있을 만큼 넓은 깨끗한 유리 용기에 원고에 따라 1X 젤 염색 용액을 준비합니다. 용기에 충분한 1X 젤 염색 용액을 추가하여 궤도 회전기에 젤이 완전히 가려지도록 합니다. 젤이 실행이 끝나면 장치에서 젤을 제거하고 우물을 잘라내고 겔 모서리를 잘라 방향을 결정하십시오.그런 다음 젤을 1X 젤 염색 용액으로 조심스럽게 전달합니다. 이미징을 수행하려면 염색 용액을 조심스럽게 데칭하고 물로 젤을 빠르게 헹구습니다. 마지막으로, 젤을 트레이에 조심스럽게 전달하여 이미저에 넣습니다.갇힌 거품과 과도한 액체를 제거하기 위해 젤 위에 유리 파이펫을 굴립니다. 그리고 젤 이미지를 복용진행. 망고 압타머 1, 2, 3, 4는 약 1 개의 어류 농도까지 데우라에 실질적으로 저항했다.20~40분 염색 시간은 최대 젤 플로레시언에 충분했다. 그들은 젤에서 확산하기 시작으로 더 긴 시간은이 연구에서 사용되는 작은 RNA에 적합하지 않았다. 불소계 분석에 따르면 우레아가 있는 망고 약층은 1, 2, 3명이 4점보다 더 빠르게 접을 수 있는 것으로 나타났다.우레아가 없을 때, 접는 것이 예상대로 훨씬 빨랐습니다. 포스트 염색 방법의 감도는 네이티브 및 데니밍 젤의 각각에 대해 잘 접힌 RNA에 대응하는 단일 밴드에 의해 표시되었으며, 나중에 약간 덜 민감성을 갖는다. 네이티브 젤의 정량화는 망고 1, 2, 4가 망고 3보다 더 선형적인 방식으로 행동하면서 약 1배 이상의 크기로 선형으로 기록되었다.데마잉 젤의 정량화는 데니밍 젤에 우레아의 존재가 TO1 비오틴 염색 용액에 배치되면 aptamers를 접는 보다 균일한 방법을 제공할 수 있음을 시사하는 보다 선형적이었습니다. 망고 태그 RNA는 SG 염색에 비해 TO1 비오틴 염색을 사용하여 총 RNA의 존재에서 검출될 수 있다. 젤 염색 용기가 젤에 맞을 만큼 충분히 크지 않도록 주의하십시오.RNA 샘플은 한 곳에서 다른 곳으로 전달됩니다. 데니어링 젤과 유사하게, 이 방법은 네이티브 젤을 위해 수행될 수 있다. 기본 조건을 유지하기 위해 낮은 와트에서 차가운 방에서 젤을 실행합니다.

fluorescent-visualization-mango-tagged-rna-polyacrylamide-gels-via

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

형광에 의한 바이러스성 RNA의 탐지<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드화 (물고기)

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이 방법을 사용 하면 선택적 얼룩이 지 고 젤에서 DNA의 정량화 SYBR 녹색에서 젤을 몸을 담글 하 여 난 / 니트로 블루 Tetrazolium 솔루션 및 다음 햇빛 또는 파란색 광원을 노출. 이 보이는 침전 생성 하 고 필드 사용에 대 한 이상적 거의 장비가 필요 합니다.

DNA 방법 Formazan 강 수 푸른 빛의 노출에 의해 유도에 따라 얼룩

여기, 우리는 새로운 형광 얼룩 polyacrylamide 젤에서 총 단백질 검출에 대 한 기술 개요는 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜 활용 Ag+를 감지 하는 실버 이온 전용 형광 턴 온 프로브-단백질 복합물, 전통적인 발은 얼룩의 특정 한계를 제거 하 고.

Polyacrylamide 젤에 단백질의 형광은 얼룩

여기에서 우리는 RNA의 DNAzyme 의존적인 절단을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이를 통해 RNA 2'-O-메틸화의 신속하고 현장 의존적인 분석을 가능하게 합니다. 이러한 접근법은 스노RNA 활성의 예비 또는 주요 평가를 위해 사용될 수 있다.

RRNA 2'-O-메틸화의 DNAzyme 의존분석

이 프로토콜은 플루오로 생성 RNA 압타머 시금치2 및 브로콜리의 동역학을 결정하는 두 가지 방법을 제시합니다. 첫 번째 방법은 플레이트 리더로 시험관 내에서 형광 발생 압타머 역학을 측정하는 방법을 설명하는 반면, 두 번째 방법은 유세포 분석에 의한 세포의 형광 발생 압타머 역학 측정을 자세히 설명합니다.

플루오로겐 RNA 압타머에 대한 시험관 내 및 세포 턴온 역학 결정

마이크로어레이 폴리머 프로파일링(MAPP)은 생물학적 샘플에서 글라이칸의 조성 분석을 위한 고처리량 기술입니다.

고처리량 글라이칸 분석을 위한 마이크로어레이 폴리머 프로파일링(MAPP)

이 기사에서는 말단 위치에서 long RNA의 이중 색상 라벨링과 단일 분자 FRET TIRF 현미경 응용 분야를 위한 인지질 소포의 캡슐화를 통한 표면 고정화에 대해 설명합니다. 이러한 기술을 결합하면 단일 분자 수준에서 RNA 역학을 정밀하게 시각화하고 분석할 수 있습니다.

Fluorescent end-labeling and encapsulation of long RNAs for single-molecule FRET-TIRF microscopy(단일 분자 FRET-TIRF 현미경을 위한 Long RNA의 형광 말단 라벨링 및 캡슐화)

배우세요 RNA Mango 태그를 사용한 포스트스테이닝 방법으로 폴리아크릴아미드 겔에서 RNA를 형광 시각화하는 기법입니다. 이 민감하고 신속한 방법은 생물학적으로 중요한 RNA 및 RNA 복합체의 추적과 정제를 단순화합니다.

포스트스테인링 방법을 통해 폴리아크릴아미드 겔에서 망고 태그RNA의 형광 시각화

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